CZ20022856A3

CZ20022856A3 - Způsob vyčiątění luteinizačního hormonu a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ20022856A3
Application number: CZ20022856A
Authority: CZ
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2003-01-15
Also published as: AU780377B2; HUP0301814A2; DK1261622T3; EA200200893A1; JP2003532636A; BR0108553A; IL151309A0; SI1261622T1; SK287041B6; BRPI0108553B8; JP4959898B2; KR100808149B1; PT1261622E; WO2001062774A2; HK1052014A1; HRP20020651B1; UA78676C2; CA2399100C; YU60302A; BG107001A

Description

Způsob vyčištění luteinizačního hormonu a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu vyčištění luteinizačního hormonu (LH), zejména vyčištění rekombinantního luteinizačního hormonu (r-LH) ze vzorku surového rekombinantního LH, který zahrnuje kombinované použití iontově výměnné chromatografie a vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi.

Dosavadní stav techniky

Luteinizační hormon (LH) je gonadotropin, vylučovaný předním lalokem hypofýzy společně s jiným gonadotropinem, hormonem stimulujícím folikuly (FSH). Tyto hormony jsou heterodimery, sestávající z podjednotek alfa a beta, nekovaientně vázaných.

Tyto gonadotropiny stimulují normální funkci pohlavních žláz (gonád) a sekreci sexuálních hormonů jak u mužů, tak i u žen. U žen stimuluje hormon stimulující folikuly (FSH) vývoj a zrání folikulů a vajíčka. Během vývoje folikulu tento produkuje v rostoucích množstvích estrogen, který v polovině cyklu stimuluje uvolnění luteinizačního hormonu. LH vyvolává prasknutí folikulu s ovulací a přeměňuje folikul na žluté tělísko, corpus luteum, které vylučuje progesteron. U mužů stimuluje luteinizační hormon intersticiální buňky varlat k sekreci testosteronu, který má naopak přímý účinek na semenotvorné tubuly. Gonadotropní látky s luteinizační aktivitou či s aktivitou stimulující folikuly, nebo s oběma aktivitami, jsou používány při léčbě poruch plodnosti, zejména u žen, ale rovněž u mužů. Takové látky zahrnují chorionní gonadotropin, který vykazuje aktivitu LH a lidské menopauzové gonadotropiny, které vykazují jak aktivitu LH, tak i FSH. Z

- 2 • · rekombinantní DNA získaný lidský luteinizační hormon (rechLH) se nyní testuje jako alternativa chorionního gonadotropinu nebo pro podávání spolu s FSH.

K izolaci a vyčištění luteinizačního hormonu byly používány různé metody, jako iontově výměnná chromatografie, imunoafinitní chromatografie a gelová filtrace (G. W. Jack, R. Blažek, K. James, J.E. Boyd a L. R. Micklem; The automated production by immunoaffinity chromatography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and lutropin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987).

K izolaci těchto hormonů byla používána iontově výměnná chromatografie, ovšem tato metoda se zdá mít několik souvisejících problémů, způsobených značnou heterogenitou náboje luteinizačního hormonu v tkáni hypofýzy. Za prvé, vzhledem k tomu, že tyto glykoproteiny a FSH mají přečnívající náboje, je jejich úplné oddělení obtížné a pracné. Za druhé, vyčištění těchto hormonů jako jediného podílu může být značně obtížné (A.Stockell Hartree; M. Thomas, Β. E. Furnival, T. W. Bums a P. Langley; Thyroid-stimulating and lípolytic activities of purified preparations of human thyroid-stimulating hormone; Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972).Výsledkem je, že během čištění mohou být vybrány určité nabité formy hormonu, jak je uvedeno v případě LH (P. L. Storring, A. A. Zaidi, Y. G. Mistry, M. Lindberg, Β. E. Sterning a E. Diczfalusy; Comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: differences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays, in vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339-347, 1982). Selektivní vyčištění bude dále komplikovat charakterizaci těchto heterogenních forem včetně strukturní analýzy jejich cukerných složek. Různý obsah aniontových oligosacharidů, které obsahují sialylové

sulfátové skupiny, může být hlavní příčinou heterogenity náboje u luteinizačního hormonu.

Metody tradiční frakcionace byly popsány pro přípravu lidského močového luteinizačního hormonu (LH) s účinností 982 lU/mg pomocí biologického stanovení a 1 166 IU pomocí radioimunoassaye (S.Donini a P. Donini, Acta endocrin., Kodaň, 63, dodatek 142, 257-277, 1969). K vyčištění luteinizačního hormonu z hlavního podílu a z vedlejších podílů, získaných během preparace hormonu stimulujícího folikuly z menopauzální moči, byl použit imunoabsorbent králičího antiséra vůči vyčištěnému lidskému chorionnímu gonadotropinu (HCG) (H. van Hell, A. H. W. M. Schuurs a F. C. Hollander; In Symposium on gonadotrophins, New York, 17.6. 1971. Vydavatelé Β. B. Saxena, C. G. Beling a Η. M. Gandy. New York: John Wiley a syn, lne, 1972). Získaný preparát měl vyšší potenciál LH, ale rovněž vyšší poměry FSH:LH, než tomu bylo u preparátu, které připravili Donini a Donini (1969).

Rekombinantní luteinizační hormon má tu výhodu, že je zbaven ostatních gonadotropních hormonů, jako FSH a TSH (hormon stimulující štítnou žlázu, thyroid stimulating hormone). Surový preparát rekombinantního LH ovšem obsahuje veškeré ostatní proteiny a znečišťující látky z buněk, použitých v jeho rekombinantní výrobě a proto je vysoce žádoucí způsob, který umožňuje dosáhnout absolutní čistoty rekombinantního luteinizačního hormonu.

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu nyní zjistili, že surový preparát LH, získaný ze vzorku kultivačního média, získaného po procesu rekombinace nebo z surového koncentrátu moči po menopauze, může být vyčištěn do takového stupně, že výsledný luteinizační hormon prakticky neobsahuje proteiny a/nebo jiné znečišťující látky, obsažené v surovém preparátu • · · · ·· ·· ·· • · · to · to · ♦ « · • > « · · · · ·· to····· ··· ··· ·· ·· · · · ·

LH. V závislostí na výchozím materiálu jsou protein a jiné znečišťující látky lidského původu (výchozí materiál: lidské menopauzální gonadotropiny) nebo původem z hostitelské buňky, například CHO, v případě hostitelské buňky CHO (vaječníkové buňky čínského křčka, chinese hamster ovary ceils).

Způsob vyčištění je založen na použití iontově výměnné chromatografie a HPLC na reverzní fázi. Další volitelné použití gelového filtračního sloupce umožňuje odstranění jakýchkoliv zbytkových stop příměsí z čistého preparátu LH. Optimální výsledky se získají při použití dvou stupňů iontově výměnné chromatografie a dvou stupňů HPLC na reverzní fázi.

Způsob podle vynálezu může být použit k vyčištění rekombinantního LH, při němž se vychází ze vzorku kultivačního média, získaného po procesu rekombinace, tak, že výsledný, vysoce vyčištěný LH prakticky neobsahuje například proteiny z fetálního hovězího séra, FBS, které jsou často obsaženy v kultivačním médiu, ani nukleové kyseliny nebo jiné znečišťující látky, přítomné v hostitelských buňkách, použitých v procesu rekombinace.

Způsob podle vynálezu může být použit jak pro vyčištění močového LH, přičemž se vychází ze surového koncentrátu moči po menopauze, tak i pro vyčištění LH jiných druhů, zvláště savčích, včetně například hovězího, koňského, prasečího, ovčího, krysího, myšího a opičího LH.

Předmětem předkládaného vynálezu je proto poskytnutí způsobu vyčištění luteinizačního hormonu ze vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje kombinované použití iontově výměnné chromatografie a HPLC na reverzní fázi. Způsob zahrnuje kroky, v nichž je vzorek (pokud je to nezbytné, zahuštěný) podroben iontově výměnné chromatografii a eluát

je podroben HPLC na reverzní fázi. Kromě toho může být prováděn další krok, v němž je eluát nanášen na gelový permeaóní sloupec (pro gelovou filtraci).

V závislosti na čistotě výchozího preparátu se iontově výměnná chromatografie a HPLC na reverzní fázi pro získání optimálních výsledků procesu vyčištění s výhodou provádějí dvakrát. Takový proces může zahrnovat kroky, v nichž:

(a) se vzorek podrobí eluci na sloupci DEAE Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii;

(b) následně se podrobí eluci na sloupci Q-Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii;

(c) poté se podrobí eluci na sloupci Silica C18 pro HPLC na reverzní fázi;

(d) opět se podrobí eluci na sloupci Silica C18 pro HPLC na reverzní fázi [volitelně spolu s odlišným eluentem z kroku (c)]; a (e) následně se podrobí eluci na gelovém permeačním sloupci.

V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu se eluce na DEAE Sepharose při iontově výměnné chromatografii provádí v sodném fosforečném pufru při pH 8.

Eluce na Q-Sepharose při iontově výměnné chromatografii se s výhodou provádí v amonném acetátovém pufru při pH 7,5.

Krok (c) HPLC na reverzní fázi se s výhodou provádí se soustavou 2-propanol/acetát amonný jako mobilní fází.

Krok (d) HPLC na reverzní fázi se s výhodou provádí se soustavou 2-propanol/Tris-HCI jako mobilní fází.

• · · · · · ·· ·· ·· • ·· »4·· · · ·

4 44444 · „θ-·4 4 · · · 4 4 · ·· ··· ··· ·· 4· 444 ·

Luteinizační hormon podle předkládaného vynálezu je s výhodou lidský LH a nejvýhodněji je to rekombinantní lidský LH, získaný z kultivačního média savčích buněk (s výhodou buněk CHO), použitého v procesu rekombinace.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí farmaceutického prostředku, který obsahuje léčebně účinné množství rekombinantního LH, připraveného rekombinantním postupem, jak byl popsán výše, spolu s vhodnými přídavnými látkami, jako je sacharóza, které jsou nezbytné pro stabilizaci lyofilizovaného produktu. Farmaceutický prostředek rekombinantního LH je zvláště vhodný pro podkožní podávání.

Vynález poskytuje způsob vyčištění (výroby) luteinizačního hormonu, zvláště pak vyčištění rekombinantního LH ze surového preparátu kultivačního média z procesu rekombinace. Získá se tak r-hLH o vysokém stupni čistoty a vysoké specifické aktivitě, který prakticky neobsahuje proteiny fetálního hovězího séra (FBS), které mohou být přítomny v kultivačním médiu a neobsahuje ani nukleové kyseliny nebo jiné znečišťující látky, obsažené v hostitelských buňkách, užívaných v procesu rekombinace.

Vynález je určen pro využití biologických materiálů, zvláště surových směsí s obsahem LH a jiných příměsových proteinů, které zde byly zmíněny, jako vzorků výchozího materiálu. Příklady, které jsou podrobněji popsány níže, používají vzorky výchozího materiálu s obsahem r-hLH, získané z média kultivačního supernatantu z bioreaktoru. Alternativně je vzorkem lidský menopauzový gonadotropin (hMG), surový koncentrát moči po menopauze.

Vzorek je tvořen čerstvě shromážděným supernatantem média buněčné kultury, vymytým z bioreaktoru. S výhodou se pročistí filtrací.

• · · · ·· ·· ♦ · • · .9 · · · · »

- Ύ -· · · · · ·*· ·· ' ·· ··· ··· »· ·· ··.·

Surový roztok pak může být zahuštěn, pokud je to nezbytné a podroben ultrafiltraci k odstranění materiálu, majícího molekulové hmotnosti nižší než 10. Ultrafiltrace také umožňuje změnu pufru na fosforečnan sodný o pH 8.

Po předběžných krocích je vzorek podroben iontově výměnné chromatografii a HPLC na reverzní fázi, které se s výhodou provádějí každá metoda dvakrát. První iontově výměnný krok se s výhodou provádí na DEAE Sepharose. To je zásadní flow-through krok pro LH, (což znamená, že r-hLH se nachází v proteklém podílu), v němž se odstraní značný podíl proteinů odlišných od LH. Druhý iontově výměnný krok se s výhodou provádí na sloupci Q-Sepharosy. Jedná se rovněž o flow-through krok pro LH a slouží k odstranění možné DNA a proteinových znečišťujících látek z hostitelských buněk nebo média. V upřednostňovaném ztělesnění se tento krok provádí při teplotě přibližně 5 °C za použití acetátu amonného jako elučního pufru o pH 7,5.

Chromatografie na reverzní fázi Silica C18 se s výhodou rovněž provádí dvakrát a je účinná k odstranění stopových množství znečišťujících látek pocházejících z FBS, buněčného proteinu a endotoxinu. Krok první HPLC se s výhodou provádí za použití soustavy 2-propanol/acetát amonný jako mobilní fáze. Krok druhé HPLC na reverzní fázi se s výhodou provádí za použití soustavy 2-propanol/Tris-HCI jako mobilní fáze. Zadržovaný roztok se poté zahustí a může být zpětně získán za použití hydrogenuhličitanu amonného o pH 8. Zahuštěný produkt se s výhodou podrobí gelově permeační chromatografii (gelově filtraci) na sloupci Sephacryl S100 HR. V tomto kroku se provádí rozdělení na základě molekulové hmotnostiza použití hydrogenuhličitanu amonného o pH 8 jako eluentu.

Eluát se pak podrobí filtraci k odstranění virových příměsí a následně ultrafiltraci na membránách, oddělujících částice o menší

- 8 9· ··

9 9 • 9

9 9 » 99 9 9 molekulové hmotnosti než 10, v sodném forforečném pufru o pH 8. Po filtraci se vyčištěné množství (šarže) luteinizačního hormonu s výhodou skladuje v sterilních lahvích při nízké teplotě.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Reakční činidla kyselina octová (ledová), v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) acetát amonný, v analytické čistotě hydrogenuhličitan amonný, v analytické čistotě (dle brit.lékopisu) fosforečnan sodný, dvojsytný, v analytické čistotě kyselina chlorovodíková, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) kyselina fosforečná, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) 2-propanol, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) chlorid sodný, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) hydrogenfosforečnan sodný, jednosytný, v analytické čistotě pelety hydroxidu sodného, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) kyselina trifluoroctová (TFA), v čistotě pro HPLC Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, v analytické čistotě voda pro injekce (WFI), (dle evr. lékopisu)

Souhrnné blokové schéma postupu čištění

Tabulka 1 je blokovým schématem, které sumarizuje postup čištění r-hLH, přičemž zdůrazňuje operační principy každého z jednotlivých kroků.

Tabulka 1: Blokové schéma, shrnující postup čištění r-hLH ♦ · > ♦ ·

Kultivační médium z bioreaktoru krok

Ultrafiltrace (10 kD)

SHROMÁŽDĚNI ZAHUŠTĚNÉHO SUROVÉHO r-hLH krok

Spojený, zahuštěný, surový shromážděný r-hLH

DEAE SEPHAROSE CL-6B nenavázaný podíl obsahuje r-hLH

Ultrafiltrace (100 kD) i

Ultrafiltrace (10 kD) krok II

Q-SEPHAROSE FF nenavázaný podíl obsahuje r-hLH krok IV

PRVNÍ H

PLC NA REVERZNÍ FÁZI eluát obsahuje r-hLH krok V

DRUHÁ HPLC NA REVERZNÍ FÁZI eluát obsahuje r-hLH krok VI

Ultrafiltrace (10 kD) i

SEPHACRYL S100 HR nenavázaný podíl obsahuje r-hLH

Ultrafiltrace (10 kD) zadržený podíl obsahuje r-hLH šarže ROZTOKU r-hLH

Vyčeření, zahuštění, dialyza a filtrace shromážděných množství (krok I) •i J

-10-..·

· ·

9 ··· ·

V tomto kroku (krok I) se změní pufr tak, aby odpovídal kontrolovanému složení a dosáhne se předběžné koncentrace. Tento krok se provádí přibližně při 5 °C a opakuje se jednotlivě pro každé množství, shromážděné během produkčního cyklu bioreaktoru. Upřednostňované rozmezí teplot je 5 ± 3 °C.

(i) vyčeření shromážděných množství

Po každém získání čerstvě shromážděného kultivačního média z bioreaktoru se materiál s výhodou zpracovává nejprve vyčeřením roztoku supernatantu prostřednictvím filtrace.

(ii) zahuštění/dialýza shromážděných množství

Membrány, uchovávané mezi jednotlivými šaržemi v 0,05 mol x I'¹ roztoku hydroxidu sodného, se promývají vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH neklesne na hodnotu přibližně 8.

Vodu nahradí ekvilibrační pufr, 0,025 mol x I'¹ roztok fosforečnanu sodného o pH 8. Jednou upravený surový roztok r-hLH z bioreaktoru se zahustí a dialyzuje se k odstranění materiálu, majícího molekulovou hmotnost menší než 10 (za použití membrány, odstraňující podíl o molekulové hmotnosti menší než 10).

Výsledný koncentrát se uchovává při teplotě přibližně -15 °C.

Iontově výměnná chromatografie na DEAE SEPHARQSE CL-6B (krok II).

Chromatografický krok je pro r-hLH krokem flow-throuhg, zatékání, ve kterém se eliminuje velký podíl proteinů odlišných od r-hLH a roztok se dále zahustí a dialyzuje. Chromatografické kroky, při nichž produkt prochází sloupcem, se provádějí v chlazené místnosti.

(i) iontově výměnná chromatografie na DEAE SEPHAROSE CL-6B

Sloupec je naplněn slabě nabitou aniontově výměnnou pryskyřicí, diethylaminoethan Sepharosou (DEAE Sepharosou), ekvilibrovanou (uvedenou do rovnovážného stavu) nejprve 0,15 mol x I'¹ roztokem fosforečnanu sodného o pH 8. Upřednostňovaným rozmezím pH je 8 ± 0,3.

Poté se sloupec upraví elučním pufrem, 0,025 mol x I’¹ roztokem fosforečnanu sodného o pH 8. Upřednostňovaným rozmezím pH je 8 ± 0,3.

Na sloupec se nanese roztok r-hLH prostřednictvím filtračního zařízení, které je na sloupci umístěno jako ochrana.

Sloupec see naplní 0,025 mol x I'¹ roztokem fosforečnanu sodného o pH 8. Upřednostňovaným rozmezím pH je 8 ± 0,3. Chromatografický proces je monitorován spektrofotometricky při vlnové délce 280 nm.

Čelní část eluentu se odstraňuje tak dlouho, dokud základní čára (baseline) nedosáhne značky 5% absorbance.

Nenavázaný podíl, obsahující r-hLH, se shromažďuje tak dlouho, dokud základní čára neklesne na hodnotu 10% absorbance.

(ii) Ultrafiltrace

Ultrafiltrační zařízení, které je vybavené membránou, odstraňující podíly o menší molekulové hmotnosti než 100, uchovávané v 0,05 mol x I’¹ roztoku NaOH, se promývá vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH proteklé kapaliny nemá hodnotu přibližně 8.

Voda se nahradí ekvilibračním pufrem, 0,08 mol x I’¹ roztokem acetátu amonného o pH 7,5. Upřednostňované rozmezí pH je 7,5 ± 0,3.

• ·Φ· φ

·· · » ·♦

Roztok r-hLH, získaný z kroku iontově výměnné chromatografíe, se ultrafiltruje přes membránu, oddělující podíly o menší molekulové hmotnosti než 100 a shromažďuje se proteklý podíl.

(iii) Zahuštění/dialýza

UItrafiltrační zařízení, které je vybavené membránou, odstraňující podíly o menší molekulové hmotnosti než 10, uchovávané v 0,05 mol x I'¹ roztoku NaOH, se promývá vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH proteklé kapaliny nemá hodnotu přibližně 8. Voda se nahradí ekvilíbračním pufrem, 0,08 mol x i'¹ roztokem acetátu amonného o pH

7,5.

Roztok r-hLH se zahustí. K zadrženému objemu se přidává acetát amonný (0,08 mol χ I¹, pH 7,5) a roztok se zahustí. Dialýza pokračuje do té doby, dokud hodnota pH a vodivost zadrženého podílu nejsou stejné jako hodnoty, které vykazuje dodávaný pufr. Výsledný zadržený podíl se zachycuje.

Iontově výměnná chromatografíe na Q-SEPHAROSE FF (krok III)

Tento krok je rovněž krokem typu r-hLH flow-through, to znamená, že r-hLH se nachází v proteklém podílu. Uvedený krok je určen k odstranění případné DNA a hostitelských buněk nebo proteinů z média jako znečišťujících látek.

(i) Ekvilibrace sloupce

Úprava sloupce se provádí elučním pufrem, 0,08 mol χ I’¹ acetátem amonným o pH 7,5. Upřednostňované rozmezí pH je 7,5 ± 0,3.

(ii) Krok vyčištění r-hLH na Q-Sepharose FF ·* ί

• ·· ·· ϊ :

Roztok r-hLH se nanese prostřednictvím filtračního zařízení, které je umístěno na sloupci Q-Sepharosy jako ochrana.

Sloupec se dále promývá 0,08 mol χ I'¹ acetátem amonným o pH

7,5.

Protékající eluent se odstraňuje tak dlouho, dokud základní čára nedosáhne značky 5% absorbance.

Nenavázaný podíl, obsahující r-hLH je shromažďován tak dlouho, dokud základní čára neklesne na hodnotu 10% absorbance.

Roztok r-hLH z kroku III může být pro následné použití skladován zamražený. Pokud je skladován při teplotě -15 °C nebo nižší, meziprodukt r-hLH se rozmrazí při +5 + 3 °C, typicky během 24 ± 8 hodin před prováděním HPLC na reverzní fázi (krok IV).

První preparativní HPLC na reverzní fázi (krok IV)

Tento krok, prováděný při teplotě místnosti, je účinný pro odstranění stopových množství příměsi proteinu FBS/CHO a endotoxinových příměsí.

(i) Plnění sloupce a aktivace pryskyřice

Sloupec je naplněn C18 silikou (oxidem křemičitým) se širokými póry a pokud je nový, je pryskyřice C18 upravena pomocí 2-propanolu.

(ii) Ekvilibrace sloupce

Sloupec se ekvilibruje 12,4% (hmotnost/hmotnost) 2-propanolem v 0,05 mol χ I'¹ amonném acetátovém pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.

»♦·· · A A· A A	• AA AAA 9 · A	• A A· A A A
14·-· · ¹ ·♦ AAA	A Á Á AAA AA	« A « A A AAA A

(iii) Úpravy pH a objemu roztoku r-hLH z kroku III.

Roztok r-hLH se upraví na pH 7 koncentrovanou kyselinou octovou. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.

Objem roztoku r-hLH se poté upraví přidáním 2-propanolu k získání konečné koncentrace 2-propanolu, rovnající se 12,4 % (hm./hm.).

(iv) Filtrace a úprava roztoku r-hLH

Filtrační zařízení, vybavené filtrem o velikosti pórů 0,22 μιτι, se promyje 2-propanolem (12,4%; hm./hm.) v 0,05 mol χ I'¹ amonném acetátovém pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí je 7 ± 0,2.

Upravený roztok r-hLH se zfiltruje.

Recipient se promyje alikvotními částmi 2-propanolu (12,4%; hm./hm.) v 0,05 mol χ I'¹ amonném acetátovém pufru o pH 7, zfiltruje se a promývací roztoky se připojí k roztoku r-hLH. Upřednostňované rozmezí je 7 ± 0,2.

(v) Krok vyčištění r-hLH na prvním sloupci C18 RP-HPLC.

Roztok r-hLH se nanese na sloupec a průběh chromatografie se monitoruje prostřednictvím UV spektrofotometrie při 280 nm.

Na sloupec se nanáší 2-propanol (12,4%; hm./hm.) v pufru, 0,05 mol χ I'¹ acetátu amonném o pH 7, až do té doby, než se absorbance při 280 nm (A₂₈₀) vrátí na základní linii, přičemž se nenavázaná frakce odstraňuje.

Eluce r-hLH se následně provádí mobilní fází, jíž je soustava 2-propanol/acetát amonný (0,05 mol χ I’¹) s lineárním gradientem od 14,7% do 27,7% (hm./hm. 2-propanolu).

> φ •φφφφ · ·· φφφ φφφ φ φ φ φφφ r-hLH se frakcionuje, jakmile A_28o začne vzrůstat. Veškeré podíly r-hLH, vykazující vyšší maxima než 20 % plné škály, se spojují.

Druhá preparativní HPLC na reverzní fázi (krok V)

Tento krok, prováděný při teplotě místnosti, je účinný pro odstranění stopových množství proteinu FBS/CHO a endotoxinu jako znečišťujících látek.

(i) Plnění sloupce a aktivace pryskyřice

Sloupec je naplněn C18 silikou se širokými póry a pokud je nový, je pryskyřice C18 upravena pomocí 2-propanolu.

(ii) Ekviíibrace sloupce

Sloupec se ekvilibruje 14,7% (hmotnost/hmotnost) 2-propanolem v 0,5 mol χ I'¹ Tris-HCI pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.

(iii) Úprava objemu a pH r-hLH roztoku z kroku IV mol χ I'¹ Tris-HCI pufr o pH 7 se přidá ke vzorku r-hLH ke snížení koncentrace 2-propanolu na přibližně stejnou hodnotu, jakou má ekvilibrační pufr sloupce (14,7 % hm./hm.).

Roztok r-hLH se upraví na pH 7 prostřednictvím 12 mol χ I'¹ HCl. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.

(iv) Krok čištění r-hLH na druhém sloupci pro C18 RP-HPLC

Na sloupec se přivádí 14,7% (hm./hm.) 2-propanol v 0,5 mol χ I'¹Tris-HCI pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2. Nenavázaný podíl se odstraňuje.

·♦ · · · *· ί· · · · · • * « · · » ♦ · · » · · ·

999 999 99 tt 99*9

Eluce r-hLH se následně provádí mobilní fází, jíž je 2-propanol/0,5 mol x I'¹ Tris-HCl s lineárním gradientem od 14,7 % do 20,7 % (hm./hm.) 2-propanolu.

r-hLH se frakcionuje, jakmile A₂₈₀ začne vzrůstat. Veškeré podíly r-hLH, vykazující vyšší maxima než 20 % plné škály, se spojují.

(v) Dialýza

Roztok r-hLH z druhého kroku C18 RP-HPLC se naředí vodou pro injekce; s výhodou se používá 8 objemů vody pro injekce.

Zředěný roztok r-hLH se dialyzuje ultrafíltraci na membráně 10 kD (viz blokové schéma, krok V) vůči vodě pro injekce. Následně jsou přidávány alikvotní části 0,5 mol x I'¹ hydrogenuhličitanu amonného o pH 8 a dialýza pokračuje, dokud není dosaženo charakteristik amonného hydrogenuhličitanového pufru.

Zadržovaný roztok se zahustí na konečný objem přibližně 1litr a uschová. Ultrafiltr se promyje 0,5 mol x I’¹ hydrogenuhličitanem amonným o pH 8 a podíly z promytí jsou spojeny se zahuštěným roztokem. Volitelně mohou být dále zahuštěny. Toto další zahuštění je závislé na velikosti sloupce, použitého v dalším kroku, tj. kroku VI.

Gelová permeační chromatografie na Sephacrylu S100 HR a uItrafiItrace (krok VI)

V tomto kroku se dosáhne rozdělení na základě molekulové hmotnosti a roztok podstoupí ultrafíltraci. Veškeré operace, prováděné v tomto kroku, probíhají při teplotě přibližně 5°C. Upřednostňované rozmezí teploty je +5 ± 3 °C.

(i) Gelová permeační chromatografie na Sephacrylu S100 HR

• 44« • •	4 4 4 4	• a·· 4 4 * 4 4	4 4	··	44 4 4
• 4	4 4
1 ·	4	4 4	4	4	4	4
• 4	4 44	444 4-4		4 4		4444

Sloupec se naplní Sephacrylem S100 HR a nejprve se ekvilibruje vodou pro injekce.

Poté se sloupec ekvilibruje 0,5 mol χ Γ¹ hydrogenuhličitanem amonným o pH 8,0.

Na sloupec se přivádí 0,5 mol χ I'¹ hydrogenuhličitan amonný o pH 8. Průběh chromatografie se monitoruje prostřednictvím spektrofotometrie při 280 nm.

Roztok r-hLH, eluovaný ze sloupce Sephacryl S100 HR, se poté s výhodou zfiltruje např. přes filtr Virosolve™ k odstranění virových znečišťujících látek.

(ii) Dialýza a zahuštění r-hLH

Membrány (ultrafiltrační membrány pro velikost 10 kD), uchovávané mezi jednotlivým čištěním v 0,05 mol χ I'¹ roztoku hydroxidu sodného, jsou promývány vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH neklesne na hodnotu přibližně 8.

Zředěný roztok r-hLH se dialyzuje (ultrafiltrací na membráně o velikosti 10 kD) proti vodě pro injekce. Následně jsou přidávány alikvotní části 0,01 mol χ I'¹ sodného fosforečného pufru o pH 8 a dialýza pokračuje, dokud není dosaženo charakteristik tohoto fosforečného pufru.

Pokud je to nezbytné, zadržovaný roztok se zahustí na konečný objem přibližně 500 ml a poté se schová. Ultrafiltr se promyje 0,01 mol x I'¹ sodným fosforečným pufrem o pH 8 a objemy z promytí ultrafiltrace se připojí k uschovanému roztoku.

·#*· · to ·· • t

- j 8 *· · · ’·· ··· • ·· to· · · • · · • · · ··· ·· ·· ·· ♦ to· • to to to·· ·*· to· toto··

Další volitelný krok zahuštění LH se může být provádět v závislosti na podmínkách, které byly zvoleny pro skladování.

Roztok r-hLH se zfiltruje a filtrát se shromáždí do sterilní nádoby. Vyčištěné množství r-hLH se s výhodou skladuje ve sterilních lahvích při teplotě přibližně -15 °C.

Reakční činidla, pufry, eluenty a chemikálie

Chromatografické pryskyřice

Ve způsobu vyčištění se běžně používají následující chromatografické pryskyřice. Stejně tak mohou být ve způsobu vyčištění použity i jiné odpovídající pryskyřice.

Krok II:	DEAE Sepharose CL-6B	(Pharmacia)
Krok III:	Q-Sepharose Fast Flow	(Pharmacia)
Krok IV:	C18 Silica RP-HPLC	(Waters)
Krok V:	C18 Silica RP-HPLC	(Waters)
Krok VI:	Sephacryl S100 HR	(Pharmacia)
Dodavateli	jsou: Amersham Pharmacia	Biotech, Bjorkgatan 30, S-

751 84, Uppsala, Švédsko, a Waters Corporation, 34 Maple Street, Milford, MA 01757, USA.

Výsledky

Biologická aktivita

Biologická aktivita různých šarží r-LH po vyčištění způsobem podle předkládaného vynálezu je uvedena v tabulce 2. Koncentrace proteinu (mg proteinu LH/ml) byla stanovena spektrofotometricky při 276,5 nm, za použití pokusně získané absorptivity (na základě analýzy aminokyselinových sekvencí) a = 0,812.

« ·· ·· ·* ·· ♦ · · · · » · · · · ♦

• · « · · · • ·· ·· · · ····

Průměrná specifická aktivita preparátu r-LH je zvláště vysoká, dosahující přibližně 25 000 lU/mg (proteinu LH).

Tabulka 2

Specifická aktivita r-hLH objemových šarží

číslo šarže	specifická aktivita
	[lU/mg]
BLCA 9802	28173
BLCA 9803	25819
BLCA 9804	27472
BLCA 9805	31229
BLCA 9806	26995
BLCA 9808	26279
BLCA 9809	20522
BLCA 9810	22275
BLCA 9811	27642
BLCA 9812	29941
BLCA 9813	28345
BLCA 9814	27581
BLCA 9815	24541

Prostředky

Vyvinuty byly lyofilizované prostředky s vysoce vyčištěným rekombinantním luteinizačním hormonem podle předkládaného vynálezu.

Jako typický příklad byl za použití sacharózy jako přídavného činidla připraven lyofilizovaný prostředek o síle 75 IU v lahvičkách DIN

2R (tabulka 3), který byl stálý několik měsíců při teplotě 4 °C.

.

»4 44 »4 • 4 4 4«

4 4 4 4

4 4 · 4 4

444 44 44 4 4 4 4

Tabulka 3

přísady	jednotkové množství
aktivní přísada: rekombinantní lidský LH	3,4 μρ (75 IU)
další přísady:
sacharóza	47,75 mg
Tween 20	0,05g
dihydrát fosforečnanu dvojsodného	0,825 mg
monohydrát fosforečnanu sodného	0,052 mg

Tween 20 = monolaurát polyoxyethylensorbitanu

Zastupuje:

99··	•	9 99		• 9	99
•	9 »	• 9 9	9	9	•	9
•	9	9 9	9	9 9	9
9 9	9	9 9	9	9		9
“99	999	>99 99		»9	9999

Ve ztvz-zerz

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob vyčištění luteinizačního hormonu ze vzorku, vyznačující se t í m, že zahrnuje použití iontově výměnné chromatografie a vysoce účinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi.
2. Způsob vyčištění podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kroky, v nichž:

(a) se vzorek podrobí iontově výměnné chromatografií k vytvoření prvního eluátu;

(b) první eluát se podrobí vysoce účinné kapalinové chromatografií na reverzní fázi k vytvoření druhého eluátu; a (c) druhý eluát se podrobí gelové permeační chromatografií.
3. Způsob vyčištění podle nároku 1a 2, vyznačující se t í m, že se iontově výměnná chromatografie a vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi provádějí dvakrát.
4. Způsob vyčištění podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se tím, že se iontově výměnná chromatografie a vysoce účinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi provádějí dvakrát s odlišným matrixem a/nebo za odlišných podmínek.
5. Způsob vyčištění podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačuj í c í se t í m, že krok iontově výměnné chromatografie se provádí za použití DEAE Sepharosy jako pevného nosiče.
6. Způsob vyčištění podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, v y z n a č u j í c í se t í m, že krok iontově výměnné chromatografie se provádí za použití Q-Sepharosy jako pevného nosiče.

• • ·· > ·« · • * · • • • · • • • • • « · • « • • 3 * «·· ·· ·«··
7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m, že krok vysoce účinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi se provádí za použití siliky C18 jako pevného nosiče.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se t í m, že zahrnuje kroky, v nichž:

(a) se eluuje vzorek ze sloupce DEAE Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii;

(b) dále se eluuje ze sloupce Q-Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii; a (c) poté se eluuje ze sloupce Silica C18 pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že zahrnuje přídavný krok, v němž se:

(d) vzorek opět eluuje ze sloupce Silica C18 pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 9, vyznačující se t í m, že eluce ze sloupce DEAE-Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii se provádí v sodném fosfátovém pufru při pH přibližně 8.
11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 10, v y z n a č u j í c í se t í m, že eluce ze sloupce Q-Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii se provádí v amonném acetátovém pufru při pH přibližně 7,5.
12. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že krok (c) se provádí za použití soustavy 2-propanol/acetát amonný jako mobilní fáze.

00·· ·«

• e* 00 04 • 0 · 0 • · 0 0 4 · 4 0 4 • · 0 • 4 0 00 «»· 00 • 0 00 0 0
13. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že krok (d) se provádí za použití soustavy 2-propanol/Tris-HCI jako mobilní fáze.
14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, v y z n a č u j íc í se t í m, že luteinizačním hormonem je lidský luteinizační hormon.
15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, v y z n a č u j íc í se t í m, že luteinizačním hormonem je rekombinantní luteinizační hormon.
16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se t í m, že vzorkem je kultivační medium z vaječníkových buněk čínského křečka.
17. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje léčebně účinné množství rekombinantního luteinizačního hormonu, připraveného způsobem podle nároku 15 a vhodné pomocné látky.
18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se t í m, že pomocnou látkou je sacharóza.
19. Farmaceutický prostředek podle nároků 17 a 18, vyznačují c í se t í m, že je určen pro podkožní podávání.