CN104569441B - 大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 - Google Patents

大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大熊猫尿液促黄体素(LH)酶联免疫方法的建立与应用，属于ELISA检测方法领域。为解决目前缺乏大熊猫尿液促黄体素(LH)的检测方法，对大熊猫繁育缺乏科学指导等问题，本发明以制备得到两种抗大熊猫LH抗体，对两种抗体进行配对组合和筛选，包被抗体和酶标抗体，以合成的LH特异肽段作为标准品，开发了大熊猫尿液促黄体素(LH)检测方法。此方法通过对大熊猫发情期尿液促黄体素的测定，可对大熊猫发情、排卵进行监测，为大熊猫的人工授精或自然交配提供时间指导。

Description

大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用
技术领域
本发明属于ELISA检测方法领域，具体涉及大熊猫尿液中促黄体素的酶联检测方法及其在大熊猫尿液组黄体素(LH)的检测应用，进一步掌握大猫发情排卵及妊娠规律。
背景技术
促黄体素(LH)是脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素,由α和β两个亚基组成，β亚基决定激素的特异抗原性和特异功能，但需与α亚基结合才具有生物学活性。LH的产生受下丘脑促性激素释放激素(GnRH)的控制，同时受卵巢的正反馈和负反馈调控。目前，大量的研究表明，LH对卵泡发育成熟的完成和卵母细胞发育潜力的获得有重要作用。卵泡由一个居于核心的卵细胞及周围的颗粒细胞和卵泡膜细胞组成。卵泡形成是一个高度协调的生理过程，受多种因素调控。FSH和LH是调控卵泡生长发育的主要因素。雌激素的产生依赖LH和FSH的协同作用，最后成熟和排卵都与LH密切相关。
在人类中的研究表明：青春期前儿童促性腺激素处于低水平，青春期受下丘脑GnRH的调控，FSH先于LH上升，青春期后期白天亦出现脉冲分泌，随青春发育的成熟，LH分泌逐渐增加，在生育年龄，FSH和LH的分泌随月经周期而出现周期性变化。FSH在卵泡早期维持较低水平，随卵泡发育至晚期，雌激素水平升高，FSH略下降，至排卵前24小时达最低，随即迅速升高，排卵后24小时又下降，黄体期维持低水平。LH在卵泡早期处于较低水平，以后逐渐上升，至排卵前24小时左右达高峰，24小时后迅速下降，黄体后期逐渐下降。就卵泡发育而言，FSH作用在早卵泡期，而LH作用在中、晚卵泡期，FSH和LH的协同作用促进卵泡发育和排卵，形成黄体并分泌孕激素。
大熊猫是我国最稀有濒危的物种之一，目前，野生和圈养种群数量不到2000只。由于野生大熊猫栖息地及种群生存状况持续恶化，提高圈养种群数量，在人工环境条件下建立一个能自我维持的种群，是为我们濒临灭绝的大熊猫的生存繁衍提供的最后保障。近年来，为提高圈养种群数量，全国各大熊猫饲养单位协同攻关，在大熊猫圈养繁殖中遇到的“配种难、受孕难、幼仔成活难”等难题上取得重大进展，圈养环境下大熊猫幼仔成活率得以大幅度提高，圈养种群规模不断扩大，目前圈养种群总数已达300多只，为以后圈养大熊猫经野化训练后放归自然、复壮野生种群的个体来源奠定了基础。
但是，大熊猫人工繁殖难度大的现状并未得到有效解决。大熊猫在一年中只有一次排卵机会，并且对于雌性个体来讲能接受自然交配的时间也非常短，最短的只有几个小时，如果在不恰当的时机将雌雄个体配对进行自然交配将会导致动物间激烈的打斗，引起动物的伤亡；而若采用人工授精，对人工授精时机的把握同样非常重要，由于大熊猫人工授精需要在麻醉状态下进行，已有的研究结果证明，若在排卵前对动物实施麻醉，可导致排卵抑制与延迟，而卵子维持授精能力的时间相对于精子而言要短得多，因此确定大熊猫确切排卵与配种以及人工授精时机是大熊猫成功繁育的关键技术。由于大熊猫物种的特殊性，无法获得大熊猫各个时段的血液，适时监测血清中的激素变化是不现实的。目前，对大熊猫发情和排卵规律的认识上，主要通过监测发情期尿液中雌激素与孕激素水平变化情况以及发情行为观察加上经验进行综合判断。但是，LH作为动物诱发排卵的主要激素，对其精确的变化规律的认识是确定适时人工授精与适时自然交配指标的有效手段。由于种属差异的原因，因缺乏特异的抗大熊猫LH抗体，无法建立大熊猫特异的LH检测方法，目前还没有大熊猫LH变化规律的研究报道。
综上所述，如何开发特异的抗大熊猫LH抗体，建立一种大熊猫尿液中LH激素代谢产物的检测方法，并通过此检测方法进一步掌握大熊猫发情排卵及妊娠规律，是一个亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供两种特异的抗大熊猫促黄体素抗体，并利用这两种抗体制备大熊猫尿液促黄体素的检测试剂盒，可以对大熊猫发情排卵及妊娠规律进行监测，为大熊猫的人工授精或自然交配提供时间指导。本发明采用如下技术方案：
一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的抗大熊猫促黄体素抗体的制备方法，其特征在于，包括以下内容：
(1)特异多肽片段的设计与合成：分别设计并合成大熊猫LHβ亚基的两条特异多肽片段，记为LHβ-1和LHβ-2；所述LHβ-1的编码序列是序列表中的SEQIDNo.1，所述LHβ-2的编码序列是序列表中的SEQIDNo.2；将所述的LHβ-1和LHβ-2两条多肽片段分别与匙孔血蓝蛋白偶联，得到两种偶联免疫原，分别记为LHβ-KLH-1和LHβ-KLH-2；
(2)抗大熊猫促黄体素抗体的制备：将步骤(1)中所述的偶联免疫原LHβ-KLH-1免疫兔，对免疫后的兔进行心脏采血，并分离血得到血清，将得到的血清通过亲和层析，分步收集高浓度的纯化产物，然后通过超滤离心管进行浓缩，即得浓缩后第一种抗大熊猫促黄体素抗体；同时，将步骤(1)中所述的偶联免疫原LHβ-KLH-2免疫兔，并进行上述相同的操作后，得到浓缩后第二种抗大熊猫促黄体素抗体。
进一步地，所述步骤(2)中将偶联免疫原免疫兔包括以下内容：首次免疫剂时，是将500ug偶联免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；两周后进行第一次加强免疫，将250ug偶联免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；一周后进行第二次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同；待兔耳缘静脉血清效价达1:10000倍后，进行第三次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同。
进一步地，步骤(2)中所述的心脏采血是在第三次加强免疫3天后进行。
作为优选，步骤(2)中所述的亲和层析的填料为蛋白G琼脂糖。
一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的大熊猫促黄体素检测试剂盒，其特征在于，包括以下内容：上面所述的第一种抗大熊猫促黄体素抗体包被的96孔酶标板、生物素标记的上面所述的第二种抗大熊猫促黄体素抗体、抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶复合物、标准品、样品缓冲液、洗涤缓冲液、色原底物溶液和色原终止液；
所述的标准品为一条共计38个氨基酸的多肽片段，此多肽片段的编码序列为序列表中SEQIDNo.3。
作为优选，所述的色原底物溶液为TMB显色液；所述的色原终止液为浓度1M的硫酸溶液。
上面所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，在大熊猫尿液促黄体素检测中的应用。
本发明的有益效果如下：
1.本发明提供抗大熊猫促黄体素抗体的制备方法，并将制得的两种特异的抗体运用到大熊猫尿液促黄体素的检测试剂盒中，可对大熊猫发情、排卵及妊娠规律进行监测，为大熊猫的人工授精或自然交配提供时间指导，解决大熊猫受孕难的问题。
2.本发明利用大熊猫LH特异的抗体建立了大熊猫尿液中LH代谢产物的夹心式酶联免疫检测试剂盒，此检测试剂盒灵敏度高，可达10ng/ml；此检测试剂盒重复性高，批内和批间误差均小于10％；此检测试剂盒的准确性高，其回收率可高达99.5％。
附图说明
图1表示本发明中大熊猫LH检测试剂盒的标准曲线；
图2表示本发明中大熊猫LH检测试剂盒的平行试验结果；
图3表示大熊猫发情期LH与雌激素变化趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，但不用于限制本发明的范围。
下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法；下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的抗大熊猫促黄体素抗体的制备方法，具体操作如下：
(1)特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库大熊猫LHβ亚基氨基酸序列，登陆号：XP_002917900.1，序列为
MEMFQGLLLWLLLNTGGAWASRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVCITFTTTICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQPVCTYHELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCRCGPCRLSNSDCGGPRAQPLACDRPPLPGLLFL，并参考其它物种序列分析，设计了大熊猫LHβ亚基两条特异的序列，RPLCRPINATLAAENEAC(序列表中的SEQIDNo.1)和CGGPRAQPLACDRPPLPGLL(序列表中的SEQIDNo.2)，分别合成2段特异的多肽片段(LHβ-1和LHβ-2)，并与KLH(匙孔血蓝蛋白)偶联，作为生产特异性抗体的免疫原(LHβ-KLH-1和LHβ-KLH-2)。
对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生产出多肽片段(LHβ-1和LHβ-2)以及免疫原(LHβ-KLH-1和LHβ-KLH-2)。
(2)抗多肽抗体的制备：采用常规的动物免疫方法，选取6只新西兰大白兔，分别标记为1-6号兔；免疫动物之前,预采取1-6号兔的血液,分离后得血清。将免疫原LHβ-KLH-1分别免疫1-3号兔，将免疫原LHβ-KLH-2分别免疫4-6号兔。具体的免疫方法如下：
首次免疫剂量为每只500ug偶联多肽，与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀，颈部皮下多点注射；两周后进行第一次加强免疫，免疫剂量减半为250ug，与等体积的复式不完全佐剂充分混匀。第一次加强免疫后一周进行第二次加强免疫，方法同前。在第三次加强免疫前，耳缘静脉少量采血，用于血清效价鉴定，待血清效价达1:10000倍后，进行第三次加强免疫，第三次加强免疫3天后，对兔进行心脏采血，分离得血清，将血清冻存备用。
(3)抗体效价的鉴定：将多肽片段LHβ-1和LHβ-2分别溶解于0.05mol/L、pH9.6的碳酸氢钠包被缓冲液,肽片段的浓度为1ug/ml,按50ul每孔分别将多肽片段加入到96孔ELISA检测板中,4℃孵育过夜,使多肽抗原能稳定地吸附并包被在样品测定孔中，洗涤后在每个样品孔中加入含有2％BSA(牛血清白蛋白)的PBS封闭缓冲液，常温封闭5h，洗涤,每孔分别加入50ul梯度稀释的免疫前和免疫后的血清(血清的稀释倍数分别为：1:100，1:500，1:2000，1:5000,1:10000，1:20000和1:40000),37℃孵育30min,洗涤,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗,37℃温育30min,洗涤,加入TMB显色底物,室温反应10min,加终止液终止反应，酶标仪检测450nm波长下吸光值。
由免疫原LHβ-KLH-1免疫兔生产的抗体的效价结果见表一；由免疫原LHβ-KLH-2免疫兔生产的抗体的效价结果见表二。
表一：血清效价检测结果1
表二：血清效价检测结果2
由表一和表二可以看出：利用本发明提供的两种抗原(LHβ-KLH-1和LHβ-KLH-2)分别免疫兔子后，均检测到效价达1:20000倍以上的高效价血清。
(4)抗体的纯化与浓缩：利用Pierce公司的纯化填料Protein-GAgarose，亲和层析纯化高免血清(方法按试剂说明书进行)，收集高浓度的纯化产物，以millipore超滤离心管浓缩收集Protein-G纯化的高免血清。
如果纯化浓缩的血清是利用偶联免疫原LHβ-KLH-1免疫后得到的血清，则浓缩后得到的抗体记为第一种抗大熊猫促黄体素抗体；如果纯化浓缩的血清是利用偶联免疫原LHβ-KLH-2免疫后得到的血清，则浓缩后得到的抗体记为第二种抗大熊猫促黄体素抗体。由于偶联免疫原LHβ-KLH-1免疫的是1-3号兔，则1-3号兔的血清纯化浓缩后的抗体分别记为A-1号、A-2号、A-3号；由于偶联免疫原LHβ-KLH-2免疫的是4-6号兔，则4-6号兔的血清纯化浓缩后的抗体分别记为B-4号、B-5号、B-6号。
实施例2
对实施例1得到的两种抗大熊猫促黄体素抗体进行包被抗体与标记抗体的配对选择，具体方法如下：
将纯化浓缩后的A-1号、A-2号、A-3号、B-4号、B-5号、B-6号抗体分别取500ul，经0.01mol，pH＝7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)透析3遍后，以Pierce公司的生物素(Biotin)标记试剂盒(EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-BiotinylationKit)分别标记上述6种抗体，经ELISA鉴定，标记抗体的最佳稀释度为1:4000倍。
将纯化浓缩后的A-1号、A-2号、A-3号、B-4号、B-5号、B-6号抗体分别包被于ELISA检测板中，包被浓度为10ug/ml，每孔加50ul，4℃孵育过夜,使抗体能稳定地吸附并包被在样品测定孔中。洗涤后在每个样品孔中加入含有2％BSA的PBS封闭缓冲液,常温封闭5h,洗涤，1:4000倍加入上面6种生物素标记的抗体，分别与6种包被抗体配对孵育，37℃下孵育30min，洗涤，再加入1:1000倍Streptoavidin-HRP(抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶)复合物，每孔加50ul，37℃下作用30min。以TMB为底物显色，终止液终止反应，酶标仪检测450nm波长下吸光值。结果为以3号兔的抗体(即A-3号抗体)作为包被抗体，5号兔的抗体(即B-5号)作为标记抗体，效果最佳。即表示：将第一种抗大熊猫促黄体素抗体作为包被抗体，第二种抗大熊猫促黄体素抗体作为标记抗体，效果佳。
实施例3
按照实施例1提供的制备方法得到的两种抗大熊猫促黄体素抗体，将其应用到在大熊猫促黄体素酶联检测试剂盒中。
(1)将特异的抗大熊猫LH的一种抗体(即上面所述的第一种抗大熊猫促黄体素抗体)作为“一抗”，包被在结合率高而背景低的酶标板上。采用标准的抗体包被浓度和制备方法(10ug/ml；详见HarlowandLane，Antibodies，aLaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY，p139,1988)。
(2)将特异的抗大熊猫LH的另一种抗体(即上面所述的第二种抗大熊猫促黄体素抗体)作为“二抗”。为进一步提高检测的灵敏度，将抗体经Protein亲和层析纯化和浓缩后标记上生物素。再采用商业化的多链Streptoavidin-HRP复合物(抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶)放大检测信号。
(3)将实施例1中设计的2条特异的多肽片段序列(RPLCRPINATLAAENEAC(即序列表中的SEQIDNo.1)和CGGPRAQPLACDRPPLPGLL(即序列表中的SEQIDNo.2))合成为1条多肽片段，即：RPLCRPINATLAAENEACCGGPRAQPLACDRPPLPGLL(即序列表中的SEQIDNo.3)共计38个氨基酸作为试剂盒的标准品。
使用本发明提供的两种抗大熊猫LH抗体，制备而成的检测试剂盒的具体组成为：抗大熊猫LH抗体(第一种抗大熊猫LH抗体)包被的96孔酶标板；生物素标记的抗LH抗体(第二种抗大熊猫LH抗体)；STREPTOAVIDIN-HRP复合物；LH多肽标准品(38个氨基酸)；样品缓冲液；洗涤缓冲液；色原底物溶液(TMB溶液)；色原终止液(1M的H2SO4溶液)。
本申请检测试剂盒的检定原理：该试剂盒是应用大熊猫LH特异性抗体包被在96孔酶标板上。尿液中的可溶性LH代谢残留蛋白和抗LH抗体结合；再采用生物素标记的另一种抗大熊猫LH抗体与包被抗LH抗体结合的、尿液中残留的LH蛋白进行夹心式结合。然后用Streptoavidin-HRP复合物结合抗生物素标记的抗LH抗体。辣根过氧化酶催化色原底物(TMB)显色，根据标准曲线确定检测样品中LH的浓度。
实施例4
大熊猫促黄体素酶联检测试剂盒的测定方法如下：
1)测定时，将大熊猫尿液加到抗LH抗体包被的酶标板，每孔0.05ml。同时加入样品稀释液配制成0到1.56ug/ml的LH多肽标准，共计8个标准点。37度孵育30分钟。
2)用洗涤液将酶标板洗涤5次。
3)加入用样品稀释液配制的1:4000的抗LH抗体-生物素复合物，每孔0.05ml。
4)37度孵育30分钟。
5)用洗涤液将酶标板洗涤5次。
6)加入用样品稀释液配制的1:1000的Strepoavidin-HRP复合物，每孔0.05ml，37度孵育30分钟。
7)用洗涤液将酶标板洗涤5次。
8)加入TMB工作液，每孔0.1ml。在室温下孵育10到15分钟。
9)用1M的H2SO4停止颜色反应，每孔0.1ml。
10)用酶标仪在450/630的波长读取样品盒标准的光密度，然后从标准曲线计算样品中LH的含量。
制备而得的标准曲线如图1所示。
将大熊猫尿液进行稀释，检测各稀释点的吸光值，得到尿液稀释曲线。将尿液稀释曲线与标准曲线进行对比，如图2所示(大熊猫LH检测试剂盒的平行试验结果)。从图2可看出：标准曲线和尿液稀释曲线平行，证明检测尿液中LH与蛋白试剂盒的标准一致。
实施例5
本发明应用大熊猫LH特异的抗体建立了大熊猫尿液中LH代谢产物的夹心式酶联免疫检测试剂盒，并对试剂盒的灵敏度，准确性和可重复性进行验证。
本发明提供的大熊猫促黄体素检测试剂盒，以10次重复试验0孔值的平均值加标准差的两倍来计算，可知本发明的检测试剂盒灵敏度高，可达10ng/ml。
为了验证本发明检测试剂盒的可重复性，经过试验，得到表三的结果：
表三大熊猫LH检测试剂盒可重复性结果
批间误差CV％均数+标准差 批内误差CV％均数+标准差
标准曲线(n＝10) 1±0.05 3±0.47
由表3可以看出，平均各标准点的批内和批间误差均小于10％。按酶联免疫检测法公知的标准，批内误差低于10％，批间误差低于15％，即可认定该试剂盒具有可靠的可重复性(详情请参见MicallefJ，AhsanR.Immunoassaydevelopment.In:GoslingJP，BassoLV，editors.Immunoassay:laboratoryanalysisandclinicalapplications.London:Butterworth-Heinemann；1994.p.51-680)。由此可以看出：本发明提供的大熊猫LH检测试剂盒具有很可靠的可重复性。
为了验证本发明检测试剂盒的准确性，进行回归试验。即：在同一样品尿样中加入不同剂量的LH多肽标准品，然后用大熊猫尿液LHELISA进行检测，得到实际测定值。因为已知未加LH多肽标准的样品中LH含量，对加入不同剂量的LH多肽标准品的同一尿样混合样就有理论测定值。实际测定值与理论测定值的比率既为该酶联免疫检测的回收率，也就是该检测方法的准确性。本发明中大熊猫LH检测试剂盒的回收试验结果见表四：
表四大熊猫尿液LHELISA检测法的准确性(回收试验)
从表四可以看出：本发明大熊猫LH检测试剂盒具有高度的准确性。
实施例6
本发明提供的大熊猫促黄体素检测试剂盒，通过对尿液促黄体素的检测，可实现对大熊猫发情和排卵的监测，为大熊猫的人工授精或自然交配提供时间指导，解决大熊猫受孕难的问题。
图3为大熊猫发情期LH与雌激素变化趋势图(雌激素与LH浓度均用尿液中肌酐的浓度校正)，从图3可以看出：大熊猫尿液中LH在发情期波动频繁，在雌激素峰后出现一个峰值。利用本发明建立的大熊猫尿液LH酶联免疫检测方法，我们收集了2012和2013两个年度大熊猫发情配种季节的尿液进行检测分析发现：第一次配种时间和尿液LH峰值出现的时间间隔小于10小时，经过配种并产仔的大熊猫共有6只，经过配种未产仔的大熊猫有1只，产仔成功率85.71％；第一次配种的时间和尿液LH峰值出现的时间间隔大于10小时，经过配种并产仔的大熊猫共有8只，经过配种未产仔的大熊猫有16只，产仔成功率33.33％；第一次配种的时间发生在尿液LH峰值出现之前，经过配种并产仔的大熊猫共有1只，经过配种未产仔的大熊猫有4只，产仔成功率20％，经过统计分析表明产仔的成功率存在显著差异(P＝0.027)(结果见表5)由此看出：利用本发明研制的大熊猫尿液促黄体素酶联免疫方法，通过对大熊猫尿液中LH的变化规律进行监控，为适时人工授精与适时自然交配提供时间参考，对提高大熊猫的繁殖性能是切实可行的。
表5卡方检验结果
<110>成都大熊猫繁育研究基地<120>大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用<160>3
<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>1
ArgProLeuCysArgProIleAsnAlaThrLeuAlaAlaGluAsn
151015
GluAlaCys
18
<210>2<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>2
CysGlyGlyProArgAlaGlnProLeuAlaCysAspArgProPro
151015
LeuProGlyLeuLeu
20
<210>3<211>38<212>PRT<213>人工序列<400>3
ArgProLeuCysArgProIleAsnAlaThrLeuAlaAlaGluAsn
151015
GluAlaCysCysGlyGlyProArgAlaGlnProLeuAlaCysAsp
202530
ArgProProLeuProGlyLeuLeu
3538

Claims (7)

1.一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的抗大熊猫促黄体素抗体的制备方法，其特征在于，包括以下内容：
（1）特异多肽片段的设计与合成：分别设计并合成大熊猫LHβ亚基的两条特异多肽片段，记为LHβ-1和LHβ-2；所述LHβ-1的编码序列是序列表中的SEQIDNo.1，所述
LHβ-2的编码序列是序列表中的SEQIDNo.2；将所述的LHβ-1和LHβ-2两条多肽片段分别与匙孔血蓝蛋白偶联，得到两种偶联免疫原，分别记为LHβ-KLH-1和LHβ-KLH-2；
（2）抗大熊猫促黄体素抗体的制备：将步骤（1）中所述的偶联免疫原LHβ-KLH-1免疫兔，对免疫后的兔进行心脏采血，并分离血得到血清，将得到的血清通过亲和层析，分步收集高浓度的纯化产物，然后通过超滤离心管进行浓缩，即得浓缩后第一种抗大熊猫促黄体素抗体；同时，将步骤（1）中所述的偶联免疫原LHβ-KLH-2免疫兔，并进行上述相同的操作后，得到浓缩后第二种抗大熊猫促黄体素抗体。
2.根据权利要求1所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中将偶联免疫原免疫兔包括以下内容：首次免疫时，是将500μg偶联免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；两周后进行第一次加强免疫，将250μg偶联免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；一周后进行第二次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同；待兔耳缘静脉血清效价达1:10000倍后，进行第三次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同。
3.根据权利要求1所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的心脏采血是在第三次加强免疫3天后进行。
4.根据权利要求1所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的亲和层析的填料为蛋白G琼脂糖。
5.一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的大熊猫促黄体素检测试剂盒，其特征在于，包括以下内容：权利要求1-4任一项所述的第一种抗大熊猫促黄体素抗体包被的96孔酶标板、生物素标记的权利要求1-4任一项所述的第二种抗大熊猫促黄体素抗体、抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶复合物、标准品、样品缓冲液、洗涤缓冲液、色原底物溶液和色原终止液；
所述的标准品为一条共计38个氨基酸的多肽片段，此多肽片段的编码序列为序列表中SEQIDNo.3。
6.根据权利要求5所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，所述的色原底物溶液为TMB显色液；所述的色原终止液为浓度1M的硫酸溶液。
7.一种权利要求1-6任一项所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，在大熊猫尿液促黄体素检测中的应用。
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