CN102095879A - 黄体生成激素化学发光定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄体生成激素化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括黄体生成激素检测反应板，反应板包被有黄体生成激素抗体。黄体生成激素定量检测试剂盒，还包括：酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清黄体生成激素的含量，用于辅助诊断卵巢囊肿、原发性卵巢衰竭、垂体或下丘脑功能紊乱、先天性睾丸发育不全等疾病。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于黄体生成激素(LH)化学发光定量检测试剂盒及相关制备方法和使用方式。
背景技术
黄体生成激素(Luteinizing hormone，LH)是人体内由下丘脑释放的一种激素，在黄体生成素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone，LH-RH，亦称促性腺激素释放激素gonadotropin-releasing hormone，GnRH)调解下，由腺垂体合成，在男性体内亦称间质细胞刺激素(interstitial cell stimulating hormone，ICSH)。LH是一种分子量约30kD的糖蛋白，由两条不同的肽链构成——α和β亚基，以非共价键相连。LH的α亚基与促甲状腺激素(TSH)、促卵泡成熟激素(FSH)以及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的α亚基结构相似，这些激素间的差别取决于它们的β亚基，从而表现出免疫学上的不同特性。
在男性体内，腺垂体分泌的LH可促进间质细胞合成与分泌睾酮；在女性体内，通过下丘脑-垂体-性腺轴的作用，LH以动态的浓度参与成年女性排卵周期的调节。在排卵前，孕酮(Progesterone)和雌二醇(E2)的水平开始降低，导致垂体开始分泌GnRH，从而促进促性腺激素(FSH)的体内合成以及分泌。升高的FSH会促进卵泡开始发育，进入卵泡期。在卵泡开始发育的最初阶段，E2分泌缓慢，但通常在12～13天后，会呈现快速增长的态势。受其影响的垂体以及高水平的GnRF和FSH将促使LH释放。当LH浓度达到峰值的12～18小时后，卵子将被排出，随之进入黄体期。成形的黄体能够分泌孕酮和雌激素，从而对LH进行负反馈调节。在孕酮和雌二醇的负反馈调节下，下丘脑-垂体轴将会降低LH和FSH的分泌水平。怀孕后，发育的胚胎会产生hCG，从而导致黄体继续分泌孕酮和雌二醇。若未受孕，黄体将退化，从而引发孕酮、雌二醇含量下降以及月经的出现。受低水平激素的影响，下丘脑将再次引发新的月经周期。
患性腺功能减退症的病人体内会出现LH的升高。女性体内因原发性卵巢衰竭、卵巢囊肿或绝经等问题造成的类固醇激素分泌降低，会使LH的分泌失去调解能力。在男性体内，若出现睾丸发育不正常或无睾丸症，也会出现LH的失调情况，即先天性睾丸发育不全以及原发性睾丸衰竭均会导致LH的病理性升高。LH的升高还可见于肾衰竭、肝硬化以及甲亢等疾病。垂体前叶分泌功能的缺乏可导致LH水平的降低。在男性和女性体内，LH的降低可导致不孕不育。若下丘脑GnRH分泌降低，也可导致LH分泌水平的降低。此种情况下，LH的降低预示着垂体或下丘脑功能出现失调，但若要确定病因，还需要进一步的检查。在对垂体、下丘脑功能紊乱以及性腺生成障碍的诊断中，LH的检测往往与FSH的检测联用。此外，还可用于判断绝经期以及对内分泌腺治疗效果进行跟踪监控。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。
化学发光标记免疫分析是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物--acridinium ester(AE)，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。还有以三联吡啶钌(Ru(byp)3 2+)标记物为发光底物，用另一反应物三丙胺(TPA)来激发光反应，在电极表面反复进行氧化还原反应从而产生高效稳定连续发光的电化学发光免疫分析。这些免疫分析方法都需要高精度复杂的自动测量仪器，目前在国内还难以实现。
化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱，通过加入某些特殊的增强剂可增强发光的信号并可大大延长发光的持续时间。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度(检测限度可达10-15～10-18mol/L)，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂。试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。但是，国外的自动化学发光酶免疫分析仪及与之相匹配的试剂盒多采用封闭体系配合使用，价格昂贵，操作复杂，在国内不易推广。
发明内容
本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合，提供了一种能够定量检测LH的试剂盒。
本发明技术方案如下：
一种黄体生成激素化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有黄体生成激素抗体。
所述的校准品以黄体生成激素纯品配制，浓度优选为0、5、15、50、100、200mIU/ml。
所述的质控品以黄体生成激素纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为3-45mIU/ml，质控品II的浓度为55-195mIU/ml。
所述的质控品I的浓度优选为4.9mIU/ml，质控品II的浓度优选为57.9mIU/ml。
所述的酶结合物为HRP标记的黄体生成激素抗体，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。
本发明提供的试剂盒具有开放性系统，可以应用于多种不同公司的化学发光检测仪器，无需昂贵的专用配套仪器，并具有简便，快速，稳定的检测能力，易于在国内市场推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：LH定量检测试剂盒的制备
(1)抗LH的抗体包被板制备
a.包被：取1mol/L Na2HPO4 77.4ml和1mol/L NaH2PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量LH单抗(购买自Meridianlifescience)混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃ 16小时；
b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃ 2小时；
c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8℃保存。
(2)酶标记物的制备
用含有2.5％BSA、1.5％的脱脂奶粉和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制缓冲系统。
LH抗体(购买自Meridian lifescience)用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联。
(3)LH校准品的制备
用含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制缓冲系统。用LH纯品配制校准品工作液(LH纯品购买自Meridian lifescience)，分别为0、5、15、50、100、200mIU/ml共6个浓度。
(4)LH质控品的制备
(5)小牛血清与去离子水6∶4混合，并添加0.05％防腐剂(ProclinTM 300)，配制成质控品缓冲液。
用LH纯品制备质控品工作液(LH纯品购买自Meridian lifescience)分装4.9、57.9mIU/ml。
(6)化学发光底物液的制备
使用PIERCE公司的
ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶。
(7)20×浓缩洗涤液制备
取NaCl 170g吐温-2010ml加水定容至1L即成，临用前稀释20倍。
(8)半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需抽检，合格后才能出厂。
实施例2：LH定量检测试剂盒的使用方法
1.试剂和样本准备
(1)试剂准备
a.将试剂盒置室温(18~26℃)平衡20分钟。
b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用新鲜的纯化水1∶20稀释后加入洗板机的洗液瓶中。
(2)样本准备
使用前将待测的合格血清或血浆置室温(18~26℃)平衡20分钟。
2.操作步骤
a.取出所需的LH抗体包被微孔板置于微孔架上
b.加入校准品1~6、质控品1~2和待测样本，每孔50μl。
c.加入酶标记物100μl/孔。
d.轻柔震荡混匀。
e.室温孵育45分钟。
f.弃去孔内废液。
手工洗涤：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5次后拍干；
洗板机洗涤：每孔350μl，重复4次，洗涤后拍干。
g.加发光底物A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。
3.实验结果的计算
可以采用作图法或计算法进行结果计算
作图法：以标准品抗原含量的lg值为横坐标(X)，以其对应的信号值为纵坐标(Y)绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量lg值，再计算出抗原含量。
计算法：以标准品抗原含量的lg值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量(Y)，求出回归方程，将待测标本的信号值带入回归方程，求得相应的抗原含量。
Claims (5)
1.一种黄体生成激素化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有黄体生成激素抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以黄体生成激素纯品配制，浓度为0、5、15、50、100、200mIU/ml。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品以黄体生成激素纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为3-45mIU/ml，质控品II的浓度为55-195mIU/ml。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品I的浓度为4.9mIU/ml，质控品II的浓度为57.9mIU/ml。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的黄体生成激素抗体，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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