CN102095866A - 孕酮化学发光定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孕酮化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括孕酮检测反应板，反应板包被有孕酮抗体。孕酮定量检测试剂盒，还包括：酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清孕酮的含量，用于辅助诊断葡萄胎、卵巢颗粒层膜细胞瘤、卵巢脂肪样瘤、先天性肾上腺增生等疾病。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于孕酮(Progesterone)化学发光定量检测试剂盒及相关制备方法和使用方式。
背景技术
孕酮(Progesterone)是一种具有多种生理学效应的21碳甾体雌性激素。排卵前，颗粒细胞和卵泡膜即可分泌少量孕酮，排卵后黄体细胞在分泌雌激素的同时，还大量分泌孕酮，并在排卵后5-10天达到高峰，以后分泌量逐渐降低。妊娠两个月左右，胎盘开始合成大量孕酮。孕酮主要在肝内降解，然后随尿、粪排出体外。
孕酮能够调节腺垂体激素的分泌，可协同雌激素诱发LH分泌出现高峰，而排卵后对腺垂体促性腺激素的分泌起负反馈抑制作用。孕酮还可使处于增生期的子宫内膜进一步增厚，并进入分泌期，从而为受精卵的生存和着床提供适宜的环境。此外，孕酮还具有降低子宫肌细胞膜的兴奋性、抑制母体对胎儿的排斥反应，以及降低子宫肌对缩宫素的敏感性等作用，有利于安宫保胎。在雌激素作用的基础上，孕酮可促进乳腺腺泡的发育和成熟，并与缩宫素等激素一起，为分娩后泌乳作准备。此外，孕酮还具有能够升高女性基础体温等生理学效应。
正常妇女月经周期中，血中孕酮含量以黄体期最高，卵泡期最低。利用动态检测，有助于判定排卵期，了解黄体功能以及研究各种类固醇避孕药及抗早孕药的作用机理。正常妊娠自第11周开始，血中孕酮含量升高，至35周达高峰，可达80～320μg/L。先兆流产时，孕酮仍为高值；若有下降趋势，则有流产之可能。多胎妊娠时，孕酮增高。孕酮的病理性增高见于糖尿病孕妇、葡萄胎、卵巢颗粒层膜细胞瘤、卵巢脂肪样瘤、先天性肾上腺增生、先天性17α-羟化酶缺乏症、原发性高血压等疾病。孕酮的病理性降低主要见于黄体生成障碍和功能不良，多囊卵巢综合征，无排卵型功能失调子宫出血、严重妊娠高血压综合征、妊娠性胎盘功能不良、胎儿发育迟缓及死胎。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。
化学发光标记免疫分析是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物--acridinium ester(AE)，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。还有以三联吡啶钌(Ru(byp)3 2+)标记物为发光底物，用另一反应物三丙胺(TPA)来激发光反应，在电极表面反复进行氧化还原反应从而产生高效稳定连续发光的电化学发光免疫分析。这些免疫分析方法都需要高精度复杂的自动测量仪器，目前在国内还难以实现。
化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱，通过加入某些特殊的增强剂可增强发光的信号并可大大延长发光的持续时间。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度(检测限度可达10-15～10-18mol/L)，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂。试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。但是，国外的自动化学发光酶免疫分析仪及与之相匹配的试剂盒多采用封闭体系配合使用，价格昂贵，操作复杂，在国内不易推广。
发明内容
本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合，提供了一种能够定量检测孕酮的试剂盒。
本发明技术方案如下：
一种孕酮化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有孕酮抗体。
所述的校准品以孕酮纯品配制，浓度优选为0、0.5、5、20、60、100ng/ml。
所述的质控品以孕酮纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为0.3-19.5ng/ml，质控品II的浓度为20.5-95ng/ml。
所述的质控品I的浓度优选为1.52ng/ml，质控品II的浓度优选为47.07ng/ml。
所述的酶结合物为HRP标记的孕酮，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。
本发明提供的试剂盒具有开放性系统，可以应用于多种不同公司的化学发光检测仪器，无需昂贵的专用配套仪器，并具有简便，快速，稳定的检测能力，易于在国内市场推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：孕酮化学发光定量检测试剂盒的制备
(1)抗Progesterone的抗体包被板制备
a.包被：取1mol/L Na2HPO4 77.4ml和1mol/L NaH2PO4 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量Progesterone单抗(购买自Meridian lifescience)混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃16小时；
b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃2小时；
c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8℃保存。
(2)酶标记物的制备
用含有2.5％BSA、1.5％的脱脂奶粉和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制缓冲系统。
孕酮(购买自Meridian lifescience)用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联。
(3)Progesterone校准品的制备
用含有3％BSA和0.05％防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制缓冲系统。
用Progesterone纯品配制校准品工作液(Progesterone纯品购买自Meridianlifescience)，分别为0、0.5、5、20、60、100ng/ml共6个浓度。
(4)Progesterone质控品的制备
小牛血清与去离子水6∶4混合，并添加0.05％防腐剂(ProclinTM 300)，配制成质控品缓冲液。
用Progesterone纯品制备质控品工作液(Progesterone纯品购买自Meridianlifescience)分装1.52、47.07ng/ml。
(5)化学发光底物液的制备
使用PIERCE公司的ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶。
(6)20×浓缩洗涤液制备
取NaCl 170g吐温-20 10ml加水定容至1L即成，临用前稀释20倍。
(7)半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需抽检，合格后才能出厂。
实施例2：孕酮化学发光定量检测试剂盒的使用方法
1.试剂和样本准备
(1)试剂准备
a.将试剂盒置室温(18-26℃)平衡20分钟。
b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用新鲜的纯化水1∶20稀释后加入洗板机的洗液瓶中。
(2)样本准备
使用前将待测的合格血清或血浆置室温(18-26℃)平衡20分钟。
2.操作步骤
a.取出所需的孕酮抗体包被微孔板置于微孔架上
b.加入校准品1-6、质控品1-2和待测样本，每孔25μl。
c.加入酶标记物100μl/孔。
d.轻柔震荡混匀。
e.室温孵育20分钟。
f.弃去孔内废液。
手工洗涤：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5次后拍干；
洗板机洗涤：每孔350μl，重复4次，洗涤后拍干。
g.加发光底物A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。
3.实验结果的计算
可以采用作图法或计算法进行结果计算
作图法：以标准品抗原含量的lg值为横坐标(X)，以其对应的信号值为纵坐标(Y)绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量lg值，再计算出抗原含量。
计算法：以标准品抗原含量的lg值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量(Y)，求出回归方程，将待测标本的信号值带入回归方程，求得相应的抗原含量。
Claims (5)
1.一种孕酮化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有孕酮抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以孕酮纯品配制，浓度为0、0.5、5、20、60、100ng/ml。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品以孕酮纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为0.3-19.5ng/ml，质控品II的浓度为20.5-95ng/ml。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品I的浓度为1.52ng/ml，质控品II的浓度为47.07ng/ml。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的孕酮，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110615 |