CN101923094A

CN101923094A - 奶牛乳汁孕酮检测试剂盒

Info

Publication number: CN101923094A
Application number: CN2009102174327A
Authority: CN
Inventors: 张洪友; 夏成; 高维明; 曾文渊; 刘骞; 黄海波
Original assignee: 张洪友
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2010-12-22

Abstract

本发明公开了一种奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，涉及生物技术，尤其是一种可用于酶标记免疫检测技术，建立了直接竞争ELISA法的定量酶免疫吸附试验，用于检测奶牛乳汁中孕酮水平。应用ELISA方法，通过抗原-抗体的特异性结合，将抗孕酮单克隆抗体、孕酮或酶标孕酮复合物间接地固定于固相酶标板上，建立了直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁中孕酮。用抗孕酮单克隆抗体包被酶标板，辣根过氧化物酶标记孕酮抗原。具有简便、快速、灵敏度高等优点，用于检测奶牛乳汁孕酮有良好的开发使用价值。

Description

奶牛乳汁孕酮检测试剂盒

技术领域

本发明涉及的是一种奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，用于检测奶牛乳汁孕酮水平。

技术背景

目前我国奶牛的饲养规模不断的扩大，现在已经成为畜牧业的支柱产业，为了缩短奶牛的产犊间隔提高奶牛的利用率，能使奶牛多产奶和多繁殖犊牛，要经常对产犊后空怀泌乳母牛进行卵巢孕酮检查，目前在养殖现场进行卵巢孕酮检查常用的有直肠检查与采血检查这两种方法，直肠检查法对牛的直肠粘膜卵巢等易造成机械性刺激易引起粘膜损伤和造成出血对奶牛卵巢造成损伤，需要检查人员直检水平较高，但检查结果也不很准确；采血检查法须将奶牛保定易造成应激有碍奶牛健康，奶牛乳汁孕酮的变化与血浆孕酮的含量同步。所以，根据乳汁中孕酮含量可以描述出母牛生殖过程所发生的生理变化，包括黄体的形成及其分泌活动的连续或结束等生理状态。因此，根据乳汁中孕酮含量的变化可检查母牛的发情、妊娠诊断、产后卵巢机能活动、以及一些繁殖疾病的诊断及其治疗效果的监测等。乳汁中孕酮含量的测定，取样方便，不损害家畜健康，不影响生产，比血浆孕酮的测定更具有实用性。因此，采取奶牛乳汁孕酮检查法是奶牛机体孕酮含量测定的有效途径，寻求一种奶牛乳汁孕酮试剂盒成为广大奶牛养殖场、户和兽医的祈盼。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是针对上述现有的技术不足，提供一种取样方便，不损害家畜健康，不影响生产，比血浆孕酮的测定更具有实用性的乳汁孕酮检测试剂盒。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在于：提供一种试剂盒，系板式直接竞争ELISA法。

本发明的目的可通过下述技术方案实现的：本发明是通过抗原-抗体特异性反应，将抗体、抗原或酶标抗原固定于固相酶标板上。以酶免疫技术为基础，建立直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮，可供奶牛早期妊娠诊断、发情鉴定以及相关疾病的诊断的确诊使用，可以通过连续动态监测孕酮判断奶牛机体的生殖状态。

在上述技术方案基础上，采用抗孕酮单克隆抗体固相于酶标板，辣根过氧化物酶标记孕酮抗原，建立直接竞争ELISA法。

本发明中，抗孕酮单克隆抗体直接固相于酶标板，单克隆抗体经0.01mmol/LPBS稀释后，置于4℃过夜包被酶标板，后用1％酪蛋白封闭，再经过30℃干燥箱处理2h，置于4℃保存。应用该方法制备的酶标板具有稳定性好、操作及处理简便等优点。同时抗孕酮单克隆抗体的特异性强，降低阴性成本底，提高了试剂盒的灵敏度，应用于孕酮的检测，能够达到检测乳汁中孕酮含量的要求。

辣根过氧化物酶标记孕酮抗原的制备，采用常用的碳化二亚胺法。标记结合物分别加30-40％的甘油，-20℃可保存数年。

(三)有益效果

本发明优越性在于：板式直接竞争ELISA定量检测奶牛乳汁孕酮的方法具有简便、快速、低阴性本底和低成本。方法学考核表明本发明方法的最低检测限可达0.14ng/mL，批内平均差异4.11％，批间平均差异6.26％。用本发明方法对配种奶牛19-23天乳汁孕酮检测，确定妊娠与未妊娠的诊断准确率为93.3％和95.8％。说明本方法对检测奶牛乳汁孕酮来改善奶牛繁殖具有重要的商业开发价值。

附图说明

图1是发明创建的板式直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮的操作流程图。

图2是本发明板式直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮的定量标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图，进一步详细说明本发明所述奶牛乳汁孕酮检测试剂盒的具体实施方式，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例一

通过抗原-抗体反应，将抗体、抗原或酶标抗原固定于固相酶标板上，建立板式直接竞争ELISA法。其中所述的固相直接竞争ELISA法是用抗孕酮单克隆抗体包被酶标板，辣根过氧化物酶标记孕酮抗原。

抗孕酮单克隆抗体固相酶标板的制备：抗孕酮单克隆抗体经 0.01mmol/LPBSpH7.2稀释后，100ul/孔加入酶标板，置于4℃过夜，后用1％酪蛋白(用0.01mmol/LPBSpH7.2稀释)封闭，再经过30℃干燥箱处理2h，避光、真空包装置于4℃保存，备用。

酶标记孕酮抗原的制备：采用碳化二亚胺法，具体步骤如下：(1)称取11α-羟孕酮半琥珀酸酯(11α-OH-P₄-HS)2.6mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.9mg和二环己基羰二亚胺(DCC)1.3mg置5mL三角烧杯中，滴加0.15mL二甲基甲酰胺(DMF)，混匀后于4℃过夜；(2)次日可发现有尿素衍生物结晶析出，说明已有孕酮衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯形成；(3)取辣根过氧化物酶(HRP)2mg，用2mL0.1MNaHCO₃液溶解，室温搅拌下加活化酯2uL，以后每10秒2uL，共加10uL。室温下继续搅拌8h，然后应用0.04MpH7.2的PBS1000mL搅拌透析24h，期间换液三次。初步透析的偶联物上SephadexG-25柱(GE)，用PBS洗脱，流速为1滴/6s。加入30-40％甘油-20℃保存。

实施例二

直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮方法。

如图1是本发明创建的板式直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮的操作流程图所示，抗孕酮单克隆抗体预包被酶标板的每孔加入100ul样本、标准品与酶标抗原工作液等比例混合的试剂，37℃反应50min，洗涤。加四甲基联苯胺(TMB)底物液，室温避光15min，加2mol/L硫酸终止反应。酶标仪上测450nm处的吸光值(OD值)。B₀为零孕酮浓度(0ng/mL)抑制时的OD值，B为不同孕酮浓度 (40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL)抑制时的OD值，代入公式Logit(B/B₀)＝Ln[(B/B₀)/(1-B/B₀)]，以Lg[P]为横坐标，Logit(B/B₀)为纵坐标绘制标准曲线，利用Microsoft Excel拟合曲线方程。将所得B/B₀值代入曲线方程求出乳汁样品中的孕酮含量。

最低检测量：选用8个不同浓度的孕酮乳样标准品，且每个做4个水平重复，以孕酮浓度的对数为横坐标，以各个浓度的B/B₀值为纵坐标绘制标准曲线，建立曲线方程的同时，计算无孕酮抑制的B₀值均数和标准差(SD)。以B₀-3SD的值再回归曲线上所对应的孕酮浓度为试剂盒的最小检出量。计算平均吸光值为1.241，标准差为0.0212。所以最低检测限是0.14ng/mL。

精密度：应用同一批次组装的孕酮乳汁检测试剂盒，连续8天，每天检测一个标准品，并做三个水平重复，测出OD450nm值，计算批内变异系数；8个批次的孕酮乳汁试剂盒，在同一时间检测三个水平的孕酮标准品，并做三个水平重复，测定OD_450nm值，计算批间变异系数。结果平均批内变异系数为4.11％，平均批间变异系数为6.26％。

初步临床应用试验：通过对发情和妊娠奶牛乳样各5份的测定：发情奶牛乳汁的孕酮浓度均小于0.5ng/mL；妊娠母牛平均为4.48ng/mL。

奶牛妊娠乳汁孕酮临界值的确定

牛场采取奶牛配种后19～23天奶牛乳样54份，按试剂盒操作检测待测样本，并以2.5ng/mL和0.625ng/mL做为半定量区分妊娠与否。

经测定乳汁中孕酮含量判定30头妊娠，24头为未孕。经配种后为期60天观察，并经直肠检查核对，未孕的诊断准确率为95.8％(23/24)，妊娠准确率为93.3％(28/30)。

以上为本发明的最佳实施方式，依据本发明公开的内容，本领域的普通技术人员能够显而易见地想到的一些雷同、代替方案，均应落入本发明保护的范围。

Claims

1.奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：通过抗原-抗体反应，将抗体、抗原或酶标抗原固定于固相酶标板上，建立板式直接竞争ELISA法。

2.根据权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：所述的板式抗孕酮单克隆抗体包被酶标板，辣根过氧化物酶标记孕酮抗原。

3.根据权利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：用板式直接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮。

4.根据权利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：制备方法是板式之际竞争ELISA法的制备方法，第一，抗孕酮单克隆抗体固相酶标板制备：抗孕酮单克隆抗体腹水采用辛酸-硫酸铵法和HiTrap Protein G HP层析柱纯化，用0.01mmol/LPBS1∶8000稀释抗体包被酶标板4℃过夜，并用1％酪蛋白封闭，后置于30℃干燥箱处理，处理后置于4℃待用。第二，酶标记孕酮抗原的制备：(1)称取11α-羟孕酮半琥珀酸酯2.6mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.9mg和二环己基羰二亚胺(DCC)1.3mg置5mL三角烧杯中，滴加0.15mL二甲基甲酰胺(DMF)，混匀后于4℃过夜；(2)次日可发现有尿素衍生物结晶析出，说明已有孕酮衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯形成；(3)取辣根过氧化物酶(HRP)2mg，用2mL0.1MNaHCO₃液溶解，室温搅拌下加活化酯2uL，以后每10秒2uL，共加10uL。室温下继续搅拌8h，然后应用0.04MpH7.2的PBS1000mL搅拌透析24h，期间换液三次。初步透析的偶联物上SephadexG-25柱(GE)，用PBS洗脱，流速为1滴/6s。加稳定剂在-20℃保存。第三，标准品的制备：以5.0g活性炭和0.5g葡聚糖(G25)溶于250mL不含BSA的测定缓冲液，磁力搅拌器搅拌30min，成为用葡聚糖包被的活性炭(DCC)，弃上清取沉淀，加入50mL奶牛乳样，磁力搅拌器搅拌30min，置冰箱中过夜，2000rpm离心1h，取上清液同法再离心一次，收集上清即为去激素率98％的脱激素乳。

5.根据权利要求3所述的奶牛乳汁孕酮检测试剂盒，其特征在于：试剂盒的使用方法：(1)将试剂盒取出，将各种试剂恢复到室温；(2)洗涤：用洗涤液洗涤酶标板，3min/次，洗2次；(3)标准品配制：用标准品稀释液稀释标准品成8个浓度(40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0ng/mL)；(4)加样：将稀释后的标准品和待测乳样各100uL，分别加入100uL酶标孕酮工作液混匀后加入各孔，100uL/孔，并做重复孔。置于37℃反应50min；(5)洗涤：同2，洗3次；(6)显色：加入显色剂(由显色B液对显色A液100倍稀释)100，室温避光15min；(7)终止：加入终止液50uL/孔；(8)酶标仪测定OD_450nm值。其中B0是无孕酮抑制时0ng/mL的OD值，B为各个孕酮浓度抑制时的40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL OD值，代入公式Logit(B/B₀)＝Ln[(B/B₀)/(1-B/B₀)]，以Lg[P]为横坐标，Logit(B/B₀)为纵坐标绘制标准曲线，利用Microsoft Excel拟合曲线方程。将所得B/B₀值代入曲线方程求出乳汁样品中的孕酮含量。试剂盒的最低检测限为0.14ng/mL。