CN101598735A - 酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，属于生物技术领域。用相同大小的滤纸片采集尾乳，纸片应饱和浸润奶样，干燥纸片，将干燥后的奶样纸片称重剪碎置于提取管，加入二氯甲烷充分浸泡，震荡30min，将提取液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水，同时收集碎纸片干燥称重，向提取的标本中加入500μl含有0.1％BSA的浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液润洗制成ELISA工作液，按照ELISA程序进行检测。本发明方法孕酮检测灵敏度达到2.1pg/孔，回收率89％；雌二醇检测灵敏度达到1.7pg/孔，回收率92％，特异性强，稳定性好。

Description

酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法

(一)技术领域

本发明利用酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，属于生物技术领域。专用于纸片奶样生殖激素浓度的快速准确检测。

(二)背景技术

母畜性成熟后周期性发情的实质是卵泡期和黄体期的交替，在黄体期由于周期黄体分泌的孕激素抑制了母畜的发情，奶牛排卵后第14d孕酮含量达到高峰。在发情周期后期(第16d)，周期黄体被子宫内膜分泌的PG溶解，孕酮开始急剧下降，解除了对卵泡发育的抑制作用，使这期间发育的一波卵泡得以继续发育，最后形成第2次发情和排卵。在卵泡发育过程中，卵泡内膜细胞分泌雌激素，使母畜产生一系列的发情表现。排卵后又生成新黄体，奶中孕酮再次上升，这种周期变化反映了奶牛卵巢周而复始的变化。

从上述论述可知，母畜周期性发情的实质也是血液中孕激素与雌激素的周期性变化过程，但对奶牛来说，采血比较麻烦，应激强烈，采集奶样比较方便，奶中的孕酮和雌二醇变化与血液中的变化高度相关。为此生产中以测定奶牛乳中孕酮和雌二醇的变化来判定母牛的发情表现。定时排卵、输精技术的关键是注射LRH后有卵泡排卵并形成黄体，注射PG后有黄体溶解并出现发情表现，但由于生产中不同的定时排卵、输精技术程序，效果不一样，这些都可通过测定乳中孕酮和雌二醇的变化来验证。

目前国内用于激素水平测定的主要是放射免疫测定和酶联免疫吸附测定，放射免疫测定检测设备要求高，检测程序繁琐，放射性物质对操作人员有较强的危害。酶联免疫吸附测定设备要求简单，操作简便，但传统的酶免和放免操作中都需要定量采样，试管采样不方便保存和运输，不利于在奶牛场等生产单位推广，所以本发明创新地采用了滤纸片不定量(饱和浸润)采样，利用酶联免疫吸附测定法定量测定奶样中激素水平，采样及测定操作简便，检测设备要求低，有很广阔的商业推广前景。

(三)发明内容

技术问题

本发明的目的是解决放免测定设备要求高，有放射性物质危害，试管等定量采样及放免测定操作繁琐，不利于在生产实践中推广的问题，提供酶免法测定纸片奶样生殖激素水平的的方法，对奶样生殖激素水平快速准确测定。

技术方案

本发明利用酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，主要包括：

1)奶样采集：用相同大小的滤纸片采集尾乳，纸片应饱和浸润奶样，纸片烘干置于干燥器内；

2)滤纸片奶样制样：将干燥后的奶样纸片称重w₁，剪碎置于抽提管，加入二氯甲烷充分浸泡，震荡30min，将抽提液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水，同时收集碎纸片干燥称重w₂，向抽提液标本中加500μl含有质量体积比为0.1％BSA、浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液润洗，制成ELISA工作液；

3)包被抗体：用包被缓冲液将抗孕酮或抗雌二醇的抗体按照产品说明书稀释成包被工作液，在已编号的载体板各孔内，第1列第A、B、C排的3孔作为对照组除外，加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀释液100μl，加盖，4℃冰箱中静置24～48小时，包被缓冲液按200ml配制：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml；

4)洗涤：取出反应板，甩掉包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干，洗涤液按1000ml配制：500μl吐温20、H₂O1000ml；

5)加样：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔内依次加稀释后的待测样本100ul；B和C排重复A排加样，G和H排重复F排加样；D和E排按照浓度低至高的顺序依次加标准抗原，每个梯度重复3次；

6)加酶标物：加样后，将板置于4℃冰箱中，配制酶标物，取出载体板，在各孔内加酶标物100μl，置37℃培养箱中反应2小时；

7)洗涤：取出反应板，甩掉反应板的反应液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干；

8)加底物液：配制底物液，在各孔内加底物液200μl，室温避光反应30min，此时反应液呈蓝色；底物液按20.25ml配制：TMB250μl、过氧化脲2ml、H₂O18ml；

9)加终止液：各孔加终止液50μl，此时反应液呈黄色，终止液按6ml配制：浓硫酸∶水＝1∶9，浓硫酸600μl、水5.4ml；

10)读取OD值：用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值；

11)OD值到浓度的换算：

(1)以标准孕酮或雌二醇的浓度为横座标，结合率为纵座标，绘制标准曲线，待测样本的结合率在标准曲线横座标上所对应的值乘以样本稀释倍数，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

(2)或者将标准曲线直线化：设孕酮或雌二醇浓度为X，结合率为y。可得回归方程y＝A+Blogx，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

(3)或者直接使用curxpt软件建立标准曲线，进行结合率与浓度的换算；即得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

12)激素浓度定量计算：

(1)pg激素/片奶样：

(2)或者ng激素/ml奶样：根据抽提前后纸片重量差Δw＝w₁-w₂，牛奶干物质含量取12.5％，比重取1.02，换算得到生殖激素质量体积浓度：

有益效果

本发明与现有技术相比，其优点表现在：

(1)本发明相比较传统的放射免疫测定，具有设备要求简单，无放射物质危害等优点。

(2)本发明检测操作程序简便快速，从加样到出结果不到3小时，试剂药品价格低廉，工作成本低廉，便于在科研、临床诊断及畜牧生产中推广。

(3)本发明解决了传统测定方法中必须定量取样问题。采用滤纸片采样，操作简单，纸片干燥后可以通过邮寄方式送到检测机构，便于在养殖场等生产单位推广实施。

(4)本发明精确度高：孕酮检测灵敏度达到2.1pg/孔，回收率89％，板内和板间变异系数分别为5.3％(n＝8)和10.4％(n＝10)；雌二醇检测灵敏度达到1.7pg/孔，回收率92％，板内和板间变异系数分别为4.8％(n＝7)和9.6％(n＝10)，特异性强，稳定性好。

(5)本发明测定结果有两种定量生殖激素浓度的换算方法，以pg/片奶样定量时，操作更简便，以ng/ml奶样定量激素浓度时可以与不同的测定方法进行比较。二者都可以用于乳用动物如奶牛、奶山羊的早妊诊断、卵巢机能性疾病诊断、产后卵巢功能监测、生殖激素应用效果跟踪监测评价等方面。在早期妊娠诊断方面，传统的直肠检查法妊娠诊断只能在输精后60d以后进行，且受检查者经验影响较大，准确率较低；用B超进行妊娠诊断也要在输精后35d以上，且B超价格昂贵。使用本发明可以在输精后19-21d采集纸片奶样，干燥后寄送实验室进行早期妊娠诊断，准确率可达95％以上，对未妊娠母畜还能诊断卵巢功能，因此比直肠检查法和B超法能更早、更客观准确地诊断家畜是否妊娠，缩短空怀时间，提高经济效益。

(6)本发明操作简单，设备试剂要求低，无毒，生产应用价值高，具有良好的商业化推广前景。

附图说明

图1.程序一实施方案

图2.程序二实施方案

图3.孕酮标准曲线

图4.雌二醇标准曲线

图5.定时排卵程序一中母牛乳中孕酮含量(pg/片纸样)变化曲线图

图6.定时排卵程序二中母牛乳中孕酮含量(pg/片奶样)变化曲线图

图7.定时排卵程序二中母牛乳中雌二醇含量(pg/片奶样)变化曲线图

具体实施方式

母畜的乳或血液中的雌二醇、孕酮的含量变化是卵巢上卵泡、黄体发育的结果，是母畜卵巢功能的体现。母畜周期性发情的实质是卵巢上卵泡与黄体的交替发育，反映到乳中是雌二醇与孕酮含量的周期性变化，在发情期，由于卵巢上黄体退化、卵泡发育，乳中孕酮含量很低，而雌二醇含量较高；如果母畜发情输精后受精、妊娠，则发情后形成的周期黄体不再被子宫内膜分泌的前列腺素所溶解、退化，周期性发情终止，形成妊娠黄体，在下个发情期到来的时间内，乳中的孕酮含量维持在较高水平；如果卵巢功能异常，则乳中的雌二醇与孕酮含量变化出现不规则的变化，因此通过测定乳中的雌二醇与孕酮含量可以用来判定母畜的发情表现、早期妊娠诊断、卵巢功能诊断等。

同样生殖激素对母畜生殖生理的调控也是通过对卵巢功能的调控实现的，监测应用生殖激素后乳中的孕酮与雌二醇的变化能够更好地了解生殖激素对母畜生殖生理的调控机理，为此我们对奶牛定时排卵、输精程序比较试验中应用了纸片乳中孕酮酶免疫测定技术。

1试验药物

生源(GnRH，100μg/支)或LRH-A₃(25μg/支)宁波三生药业有限公司生产，氯前列烯醇(PG)上海计划生育研究所生产。

2试验方法

2.1定时排卵程序

根据定时排卵技术的原理，我们拟定两种定时排卵程序进行对比试验，见图1、图2。其中程序一的诱情素即氯前列烯醇，生源即GnRH。

程序一(简称三次PG法，以宁波三生药业有限公司提供给奶牛养殖单位的参考程序为依据，在用药间隔时间方面进行了调整)：于2008年11月28日-2009年1月6日在绍兴一景奶牛场的15头奶牛中进行。即每头试验牛11月28日第一次注射氯前列烯醇3支，12月12日第二次注射氯前列烯醇3支，12月26日注射生源1支，1月3日16时第三次注射氯前列烯醇3支，1月5日16时注射生源1支，1月6日8时输精。

程序二(简称一次PG法，宁波三生药业有限公司提供给奶牛养殖单位的参考程序)：于2009年3月22-4月1日在金华婺城区琅峰奶牛场的30头奶牛中进行。即每头试验牛3月22日注射生源1支，3月28日16时注射氯前列烯醇2支，3月31日16时注射生源1支，4月1日8时输精。

2.2乳中孕酮及雌二醇含量测定方法

在实施定时排卵程序时，分别对3头试验奶牛定时采集奶样，用酶免疫法测定其乳中的孕酮及雌二醇含量，了解定时排卵程序中及激素使用后乳中孕酮及雌二醇含量变化规律。

2.2.1试验仪器

酶标仪为美国Bio-TEK产品，型号为ELX800；振荡器、精密电子天平、加样器、烘箱、96孔酶标板(购于Greiner公司)等常规仪器。

2.2.2试剂

抗体购于Sigma公司、吐温20、二氯甲烷、30％H₂O₂均购于国药集团；TMB和过氧化脲均为基天公司产品；孕酮-11α-半琥珀酸酯(购自Fitgerald公司)；牛血清白蛋白(BSA)、透析袋均为华美公司产品。其他常规化学试剂均为分析纯，购于国药集团。

2.2.3溶液配制

包被缓冲液(200ml)：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml。

稀释缓冲液(500ml)：Na₂HPO₄·12H₂O10.925g、NaH₂PO₄·2H₂O3.04g、NaCl4.35g、BSA0.5g、H₂O500ml。

洗涤液(1000ml)：500μl吐温20、H₂O1000ml。

底物液(20.25ml)：TMB250μl、过氧化脲2ml、H₂O18ml(针对96孔板，现配现用，TMB和过氧化脲提前配好避光保存)。

终止液(6ml)：浓硫酸∶水＝1∶9。

2.2.4操作流程

1)奶样采集：具体采集时间见表1，表2。

2)滤纸片奶样制样：将干燥后的奶样纸片称重w₁，奶片大小为2.5cm×4.7cm，剪碎置于提取管，加入二氯甲烷2mL，震荡30min，将提取液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水，同时收集碎纸片干燥称重w₂，计算Δw，向提取的标本中加500μl含有0.1％BSA的磷酸盐缓冲液(0.01M、pH7.0)润洗制成ELISA工作液。

3)包被抗体：用包被缓冲液稀释将抗孕酮或抗雌二醇IgG稀释成包被工作液，在已编号的载体板各孔内(第1列第A、B、C排的3孔除外)加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀释液100μl，加盖，4℃冰箱中静置24～48小时。

4)洗涤：取出反应板，甩掉包被液，用洗涤液洗涤3次，用吸水纸吸干。

5)加样：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔内依次加稀释后的待测样本100μl。B和C排重复A排加样，G和H排重复F排加样。D和E排按照浓度低至高的顺序依次加标准抗原，每个梯度重复3次。

6)加酶标物：加样后，将板置于4℃冰箱中，同时配制酶标物。取出载体板，在各孔内加酶标物100μl，置37℃培养箱中反应2小时。

7)洗涤：取出反应板，甩掉反应液，用洗涤液洗涤3次，用吸水纸吸干。

8)加底物液：配制底物液，在各孔内加底物液200μl，室温避光反应30分钟，此时反应液呈蓝色。

9)加终止液：各孔加终止液50μl，此时反应液呈黄色。

10)读取OD值：用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值。

11)OD值到浓度的换算：

(1)以标准孕酮或雌二醇的浓度为横座标，结合率为纵座标，绘制标准曲线，待测样本的结合率在标准曲线横座标上所对应的值乘以样本稀释倍数，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

(2)或者将标准曲线直线化：设孕酮或雌二醇浓度为X，结合率为y。可得回归方程y＝A+Blogx，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

(3)或者直接使用curxpt软件建立标准曲线，进行结合率与浓度的换算；即得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

12)激素浓度定量计算：

(1)pg激素/片奶样：

(2)或者ng激素/ml奶样：根据抽提前后纸片重量差Δw＝w₁-w₂，牛奶干物质含量取12.5％，比重取1.02，换算得到生殖激素质量体积浓度：

2.2.5奶样纸片酶免法测定雌二醇与孕酮方法的建立和鉴定

将一定量的孕酮与雌二醇标准进行梯度稀释，建立的典型标准曲线如图3和4。

在一般操作情况下，结合率(E/E₀)与孕酮浓度的自然对数lnP之间的典型直线回归方程式为：E/E₀＝87.30-9.06lnP(r＝-0.9951)，标准曲线的可测范围为：10～200pg，OD450nm范围为0.2～0.4(E₀，0pg孕酮)到0.09～0.12(1000pg孕酮)；结合率(E/E₀)与雌二醇浓度的自然对数lnE之间的典型直线回归方程式为：E/E₀＝86.83-8.06lnE(r＝-0.9921)，雌二醇标准曲线的可测范围为：10～500pg，OD450nm范围为0.5～0.7(E₀，0pg孕酮)到0.19～0.22(1000pg孕酮)。

对建立的方法进行方法学鉴定，灵敏度与回收率：孕酮ELISA试剂盒灵敏度为2.1pg/孔，回收率为89％；雌二醇ELISA试剂盒灵敏度为1.7pg/孔，回收率为92％。

重复性：重复测定高中低三水平样本中的孕酮含量，板内和板间变异系数分别为5.3％(n＝8)和10.4％(n＝10)；重复测定高中低三水平样本中的雌二醇含量，板内和板间变异系数分别为4.8％(n＝7)和9.6％(n＝10)。

3测定结果

3.1程序一乳中孕酮含量酶免疫测定结果

我们在浙江省绍兴市一景奶牛场按照程序一实施定时排卵，为了解程序实施过程中乳中孕酮变化规律，特别是激素注射后对乳中孕酮含量的影响，对按照程序一实施定时排卵的15头奶牛，随机选择3头跟踪采集奶样，在注射激素的当天与后一天，随后每隔3d分别采集纸片奶样一次，用竞争性ELISA法测定乳中孕酮含量，结果见表1和图5。

表1定时排卵程序一中母牛乳中孕酮含量

从表1和图5的乳样中孕酮含量变化曲线可看出，定时排卵程序一中三次注射PG，每次注射后的10-13d的每片乳样中孕酮含量分别是320.3，317.8和423.6pg，差异不显著，说明连续三次注射PG对动物黄体发育没有明显影响，与吕雪峰等的结果相似。在本定时排卵程序实施中，采用三次注射PG法，可使发情周期的黄体溶解，缩短黄体期，使牛群同期进入下一个发情期。根据这三头奶牛的乳中孕酮含量测定结果，其乳中孕酮含量变化基本符合卵巢发育规律，如在注射PG后一天(12.13与1.3日)乳中孕酮含量分别从注射前的4.4和4.5ng/ml降为0.9和1.8ng/ml，注射后2-3d时进一步降为0.2和0.1ng/ml，符合前列腺素注射后母畜发情的规律。本试验在第三次注射PG后，乳中孕酮浓度从423.6pg/片奶样下降到1.5日输精时的6.6pg/片奶样，说明PG处理后黄体溶解，配合使用生源，卵泡发育，从孕酮浓度变化趋势可以推断输精时间选择合理。

由程序一实施的定时排卵程序的结果，15头牛经直肠检查确定卵泡发育数12，受胎率达到67％。本试验进行过程中，通过激素水平变化趋势对个体奶牛进行发情鉴定，准确率达到93％，说明本方法科学可行，可以在临床应用大力推广。

3.2程序二乳中孕酮、雌二醇含量酶免疫测定结果

在浙江省金华市婺城区琅峰奶牛场实施定时排卵程序二过程中，对实施定时排卵程序二的30头奶牛，随机选择3头跟踪采集奶样(饱和浸润)，用竞争性ELISA法测定乳中孕酮、雌二醇含量，结果见表2和图6、图7。

表2定时排卵程序二中母牛乳中孕酮及雌二醇含量

表2和图6、图7的乳样中孕酮、雌二醇含量变化曲线显示，在3月21日注射LRH-A₃后到3月28日注射PG期间，乳中雌二醇含量每片奶样维持在53-55pg水平，乳中孕酮含量从每片奶样617.6pg下降到361.1pg，说明3头采样牛注射LRH-A₃后有的没有出现排卵并形成新黄体。因注射LRH-A₃后有没有卵泡排卵与注射LRH-A₃的时机有关，当没有优势卵泡时，注射LRH-A₃就不会有卵泡排卵并形成黄体。在3月28日注射PG后，黄体溶解卵泡发育导致乳中孕酮含量迅速下降、雌二醇分泌增加，3.31日输精时乳中雌二醇浓度达到153.7pg/片奶样，而孕酮浓度减至31.8pg/片奶样，此时输精较合理。输精后21d，孕酮浓度回升到719.2pg/片奶样，雌二醇浓度降至15.9pg/片奶样，初步判定妊娠建立，与临床结果相符。

实施程序二奶牛的直肠检查结果：21头青年牛卵泡明显发育数17，受胎率达到71％；9头经产牛卵泡明显发育数7，注射生源后其中2头出血，但是受胎率还达到了56％，程序二的总受胎率达到67％，说明程序二外源激素处理及输精时间选择合理，与激素水平测定所得结果一致，说明本方法科学可靠，对生产应用有较强的指导意义。在本试验中，通过奶样激素水平变化对个体奶牛进行发情鉴定和妊娠诊断，准确率分别达到92％和95％，说明本发明有较好的应用价值，具有很强的商业推广前景。

4结论

本方法对不同定时排卵程序的母牛进行乳中孕酮、雌二醇的ELISA测定结果初步表明，定时排卵程序实施中母牛乳中孕酮、雌二醇变化规律与理论分析相符合。与试管采集乳样进行乳中孕酮、雌二醇测定的方法相比，纸片采样法具有采样方便、操作简单，无需使用微量取液器等优点，更有利于在奶牛场、养牛专业户、个体户中推广和应用。虽然批内变异稍高于试管定量取乳的方法，但各项指标仍符合质量控制的要求。另外本发明利用ELISA进行测定操作，相比较放射免疫测定，具有设备要求简单，操作简便，无放射物质危害等优点。故使用该方法测定乳中孕酮、雌二醇含量，可进行奶牛发情鉴定、早孕诊断、卵巢功能性疾病(不孕症)诊断、检测生殖激素应用效果评价，探讨合理应用生殖激素等方面有较高的实用价值，本发明的商业推广前景较好。

目前母牛发情鉴定多通过直肠检查触摸卵泡发育情况，但这需要一定的经验，也比较费时，劳动强度较大，而且准确度不高，生产中经常出现假发情牛诊断失误，进而用药或输精造成流产的情况；对发情不明显的牛，通过直肠检查法诊断其造成的原因非常困难，经常出现所谓的非典型持久黄体与卵巢静止病例，造成治疗延误。而通过酶免疫测定技术测定乳中孕酮、雌二醇水平，就能非常准确地反映出卵巢的功能状态，从而能够正确地诊断真假发情与发情不明显的原因，准确率在90％以上，从而很好地避免诊断失误的发生，因此该法也可用于卵巢功能性疾病(不孕症)诊断。

同样，当前的母牛妊娠诊断多采用直肠检查法进行，需要一定的经验，也容易发生诊断失误；直肠检查时稍不注意还容易造成流产；同时不能做到早期诊断，一般要在输精后50-60天以上才能进行直肠检查法妊娠诊断。目前虽有使用兽用B型超声波诊断的，一般也需在输精后35天以上才能进行。而使用酶免疫激素测定技术就可在输精后一个情期(19-23天)进行准确的妊娠诊断，准确率在95％以上，而且能同时发现不妊娠的原因，及时配种从而缩短母牛犊产间隔。

Claims (1)

1、酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，包括：

1)奶样采集：用相同大小的滤纸片采集尾乳，纸片应饱和浸润奶样，纸片烘干置于干燥器内；

2)滤纸片奶样制样：将干燥后的奶样纸片称重w₁，剪碎置于抽提管，加入二氯甲烷充分浸泡，震荡30min，将抽提液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水，同时收集碎纸片干燥称重w₂，向抽提液标本中加500μl含有质量体积比为0.1％BSA、浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液润洗，制成ELISA工作液；

3)包被抗体：用包被缓冲液将抗孕酮或抗雌二醇的抗体按照产品说明书稀释成包被工作液，在已编号的载体板各孔内，第1列第A、B、C排的3孔作为对照组除外，加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀释液100μl，加盖，4℃冰箱中静置24～48小时，包被缓冲液按200ml配制：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml；

4)洗涤：取出反应板，甩掉包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干，洗涤液按1000ml配制：500μl吐温20、H₂O1000ml；

5)加样：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔内依次加稀释后的待测样本100μl；B和C排重复A排加样，G和H排重复F排加样；D和E排按照浓度低至高的顺序依次加标准抗原，每个梯度重复3次；

6)加酶标物：加样后，将板置于4℃冰箱中，配制酶标物，取出载体板，在各孔内加酶标物100μl，置37℃培养箱中反应2小时；

7)洗涤：取出反应板，甩掉反应板的反应液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干；

8)加底物液：配制底物液，在各孔内加底物液200μl，室温避光反应30min，此时反应液呈蓝色；底物液按20.25ml配制：TMB250μl、过氧化脲2ml、H₂O18ml；

9)加终止液：各孔加终止液50μl，此时反应液呈黄色，终止液按6ml配制：浓硫酸∶水＝1∶9，浓硫酸600μl、水5.4ml；

10)读取OD值：用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值；

11)OD值到浓度的换算：

(1)以标准孕酮或雌二醇的浓度为横座标，结合率为纵座标，绘制标准曲线，待测样本的结合率在标准曲线横座标上所对应的值乘以样本稀释倍数，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

(2)或者将标准曲线直线化：设孕酮或雌二醇浓度为X，结合率为y，可得回归方程y＝A+Blogx，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

(3)或者直接使用curxpt软件建立标准曲线，进行结合率与浓度的换算；即得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；

12)激素浓度定量计算：

(1)pg激素/片奶样：

(2)或者ng激素/ml奶样：根据抽提前后纸片重量差Δw＝w₁-w₂，牛奶干物质含量取12.5％，比重取1.02，换算得到生殖激素质量体积浓度：

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