CN103207279A - 大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法 - Google Patents

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罗娌
侯蓉
张志和
黄河
王成东
黄祥明
兰景超
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Abstract

本发明公开了一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法，在尿样检测结果没有差异的前提下，通过将样品由传统室温下孵育2小时改变为37℃孵育0.5小时，使得大熊猫孕酮浓度值的全部检测过程由原来的3小时缩短到1.5小时，检测时间缩短了50%，为适时自然交配和人工授精争取了宝贵的时间。

Description

大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于发情期雌性动物体内孕激素变化的检测方法，特别是涉及一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法。
背景技术
大熊猫作为我国特有的珍稀濒危野生动物，其独特的生理特点吸引了大量的科研人员对其进行研究。雌性大熊猫为周期性单发情动物，多为春季发情、秋季产仔，在一次发情期中只有1～3天接受自然交配。在圈养条件下，只有50%左右的大熊猫自然交配，有一半左右的大熊猫需要通过人工授精完成繁殖。在最短的时间内判断大熊猫是否排卵，并进行人工授精，是圈养条件下大熊猫繁殖成功的关键。
在早期的圈养大熊猫繁殖中，最主要的判断大熊猫是否发情排卵的依据来源于大熊猫的发情行为观察，包括精神、食欲、外阴颜色、乳头变化、是否有咩叫、是否出现待配姿势以及雄性大熊猫是否对雌性大熊猫出现交配欲望等。但由于以上方法无法完全量化，或者是某些行为在整个发情期均出现，所以无法非常准确地判断大熊猫是否排卵，从而是导致早期圈养大熊猫繁殖效率低下的重要原因。
在实际大熊猫配种过程中，我们至少需要采集到大熊猫雌二醇峰值后2个以上的样品、并根据检测出的尿样孕酮值才能基本确定雌二醇峰值出现的时间，每次从收到尿样到得到结果至少需要3～5小时，往往我们得到的雌二醇峰值的时间距我们收样的时间已经过去了近15小时，这使得我们进行适时自然交配或人工授精的时间非常紧促。
发明内容
本发明要解决的技术问题是一种缩短雌性大熊猫尿样检测时间、保障大熊猫有充裕自然交配时间或人工授精时间的大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法。
为解决上述技术问题，本发明一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法，包括以下步骤：
（1）对雌性大熊猫进行尿样收集，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存；
（2）用孕激素抗体CL425将96孔酶标板过夜包被6～48小时；所述的包被是将抗体吸附在酶标板，目的是为了获得最高的灵敏度、特异性、均一性和稳定性；
（3）将同一份尿样分成多小份；在96孔酶标板上选定好检测用孔；将浓度范围在0、0.78to200pg/孔，共10个等级的孕酮标准品做一系列等倍稀释；将一小份尿样按1：20、1：40、1：80、1：160、1：320……等等比例做一系列等倍稀释，越接近雌性大熊猫发情高峰时收集的尿样，其稀释倍数越高；然后分别将已稀释的孕酮标准品和尿样按顺序依次加入到已经包被好的96孔酶标板的检测用孔中；在96孔酶标板的每个检测用孔中加入Horseradish peroxidase溶液0.05mL，在37℃下孵育0.5小时后，用主要成分为NaCl、Tween20、H2O的洗液洗涤5次96孔酶标板；
（4）将0.04ml、浓度0.5M的H2O2和0.125ml、浓度为40mM的ABTS加入到12.5ml柠檬酸底液中，混合均匀成显色溶液；
（5）往洗涤后的96孔酶标板的每个检测用孔孔中加入已配制好的显色溶液0.1ml,室温下孵育30～60分钟后用酶标仪读取光吸收值，所得数值为该大熊猫孕酮值；
（6）将另一小份尿样按1：10～40稀释，将浓度为0.1mg/ml的肌酐标准品稀释成0、6.25、12.5、25、50、100ug/ml，然后在另一96孔酶标板上选定好检测用孔，将稀释的尿样和肌酐标准品稀稀分别按顺序依次加入到96孔酶标板上的检测用孔，再在每检测用孔中加入0.05mL、浓度为0.75N的NaOH和0.05mL、浓度为0.4N的苦味酸，在室温下孵育10～20分钟后，用酶标仪检测光密度值，所得数值为该大熊猫尿样肌酐值；当肌酐值低于0.1mg/mL时认为样品被过度稀释，须重新采用其它尿小份样进行检测，直到所检测尿样的肌酐值不低于0.1mg/mL时为止；
（7）用测到的该大熊猫孕酮值除以该大熊猫肌酐值，所得结果为该大熊猫孕酮浓度值，此浓度值为校正值。
所述的一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤：
（1）清洁并拖干兽舍地面；
（2）将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍；
（3）用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即放入冰箱冷冻或冷藏。
所述的一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法，其Horseradish peroxidase的中文名称为辣根过氧化物酶；其酶标仪的的滤波片参数分别为405nm、450nm、540nm、490nm和630nm；其ABTS的中文名称为联胺盐发色团；其Tween20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物；其计量单位中，mL为毫升、M为摩尔、mM为毫摩尔、mg为毫克、ug为微克、pg为皮克、nm为纳米、N为当量。
将12份雌性大熊猫尿样中的每1份均分为3小份，然后分别在三种不同条件下进行孕酮浓度值的检测和相关性检验，结果如表1和表2所示：
表1.三种检测方法得到的孕酮浓度值
室温孵育2小时 37℃孵育1小时 37℃孵育0.5小时
2.25 2.56 2.64
3.58 3.49 2.99
4.50 5.03 4.79
4.46 4.08 5.32
4.28 4.95 5.05
8.52 9.18 9.22
7.30 11.25 7.83
10.95 11.26 9.03
10.67 11.96 10.06
10.96 12.09 12.95
15.46 21.29 14.03
17.24 19.11 13.39
表2、三种不同检测方法得到的孕酮浓度值的差异性检验
Figure BDA00002949416300041
根据表1和2可以看出，37℃孵育0.5小时与传统室温下孵育2小时得出的结果没有差异。
本发明通过将样品由传统室温下孵育2小时改变为37℃孵育0.5小时，使得大熊猫孕酮浓度值的全部检测过程由原来的3小时缩短到1.5小时，检测时间缩短了50%，为适时自然交配和人工授精争取了宝贵的时间。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明检测孕酮值的96孔酶标板的主视图；
图2为本发明检测肌酐值的96孔酶标板孔的主视图。
图中标识：S1到S10代表放置不同稀释浓度的孕酮标准品的检测孔，T1到T26代表放置不同稀释浓度尿样的检测孔，s1到s6代表放置不同稀释浓度的肌酐标准品的检测孔，t1到t42代表放置不同稀释浓度尿样的检测孔。
具体实施方式
本发明在春季繁育期间，清洁并晾干兽舍地面后，将需收集尿样的雌性大熊猫放入兽舍；然后工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍，用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，立即放入冰箱冷冻室冷冻保存或冷藏室冷藏保存。
将同一份尿样分成多个小份，一般至少分成三个小份。
检测孕酮值时，先用孕激素抗体CL425将96孔酶标板过夜包被6～48小时；然后将浓度范围在0、0.78to200pg/孔，共10个等级的孕酮标准品做一系列等倍稀释，依次放置在图1所示的96孔酶标板上S1到S10的检测孔内；将一个小份尿样按1：20、1：40、1：80、1：160、1：320……等等比例做一系列等倍稀释，越接近雌性大熊猫发情高峰时收集的尿样，其稀释倍数越高，然后按图1所示将稀释的尿样放置96孔酶标板上T1到T26的部分或全部检测孔内，稀释尿样所占用96孔酶标板的检测孔数由系列稀释倍数决定，稀释倍数越高，占用检测孔数就越多；再后在图1所示的96孔酶标板每个检测孔内加入Horseradish peroxidase溶液0.05mL，在37℃下孵育0.5小时后，用主要成分为NaCl、Tween20、H2O的洗液洗涤5次96孔酶标板；将0.04ml、浓度0.5M的H2O2和0.125ml、浓度为40mM的ABTS加入到12.5ml柠檬酸底液中，混合均匀成显色溶液；按图1所示，往洗涤后的96孔酶标板每个检测孔内加入已配制好的显色溶液0.1ml,室温下孵育30～60分钟后用酶标仪读取光吸收值，所得数值为该大熊猫孕酮值。
检测肌酐值时，先将浓度为0.1mg/ml的肌酐标准品稀释成0、6.25、12.5、25、50、100ug/ml，将稀释的肌酐标准品放置在图2所示的另一96孔酶标板上s1到s6的检测孔内；然后将另一个小份尿样按1：10～40比例中的某一比例稀释，一般为1：20比例，按图2所示将稀释的尿样放置另一96孔酶标板上t1到t42的部分或全部检测孔内，一般只需要两个检测孔；再后在图2所示的96孔酶标板每个检测孔内加入0.05mL、浓度为0.75N的NaOH和0.05mL、浓度为0.4N的苦味酸，在室温下孵育15分钟后，用酶标仪检测光密度值，所得数值为该大熊猫尿样肌酐值；当肌酐值低于0.1mg/mL时认为样品被过度稀释，须重新采用其它小份尿样进行检测，直到所检测尿样的肌酐值不低于0.1mg/mL时为止。
最后，用测到的该大熊猫孕酮值除以该大熊猫肌酐值，所得结果为大熊猫孕酮浓度值，此浓度值为校正值。
本发明并不局限于以上实施例，本发明也可以应用于其它孕激素的检测；图1所示的的96孔酶标板上T1到T26检测孔和图2所示的的96孔酶标板上t1到t42检测孔，可以放置同一份尿样，也可以放置不同的尿样，甚至放置不同雌性大熊猫个体的尿样。

Claims (2)

1.一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法，包括以下步骤：
（1）对雌性大熊猫进行尿样收集，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存；
（2）用孕激素抗体CL425将96孔酶标板包被6～48小时；
（3）将孕酮标准品和尿样稀释后，分别按顺序依次加入到已经包被好的96孔酶标板孔中；在96孔酶标板孔中加入Horseradish peroxidase溶液，在37℃下孵育0.5小时后，用洗液洗涤96孔酶标板；
（4）将H2O2和ABTS加入到柠檬酸底液中，混合均匀成显色溶液；
（5）往洗涤后的96孔酶标板孔中加入已配制好的显色溶液,室温下孵育30～60分钟后用酶标仪读取光吸收值，所得数值为该大熊猫孕酮值；
（6）将尿样和肌酐标准品稀稀释后分别按顺序依次加入到96孔酶标板中，再在96孔酶标板孔中加入NaOH和苦味酸，在室温下孵育10～20分钟后，用酶标仪检测光密度值，所得数值为该大熊猫尿样肌酐值；
（7）用测到的该大熊猫孕酮值除以该大熊猫肌酐值，所得结果为该大熊猫孕酮浓度值。
2.根据权利要求2所述的一种大熊猫孕酮浓度值的快速检测方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤：
（1）清洁并拖干兽舍地面；
（2）将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍；
（3）用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即放入冰箱冷冻或冷藏。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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