CN1796998A

CN1796998A - 用于奶牛早期妊娠诊断的试纸及其检测方法

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Publication number: CN1796998A
Application number: CNA2005101091653A
Authority: CN
Inventors: 万积成
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-10-20
Publication date: 2006-07-05

Abstract

本发明涉及一种通过测定配种后牛的乳汁孕酮含量进行奶牛早期妊娠诊断的试纸及其检测方法，属于胶体金免疫检测领域。试纸是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、孕酮单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成；利用双抗夹心和竞争两种不同的方法制成试纸，检测授精后25－30天的奶牛乳汁，根据显色区的不同颜色变化来判断所测奶牛是否怀孕。奶牛早期妊娠诊断试纸特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。

Description

用于奶牛早期妊娠诊断的试纸及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种通过测定配种后奶牛的乳汁孕酮含量进行奶牛早期妊娠诊断的试纸及其检测方法，属于胶体金免疫诊断技术领域。

背景技术

提高牛奶产量，尽量缩短空怀期是奶牛饲养管理的目标之一。因此奶牛早期妊娠诊断是促进奶牛业发展的重要措施。简便而有效的奶牛早期妊娠诊断方法，是养牛生产者及畜牧兽医工作者长期以来亟待解决的问题。因为奶牛早期妊娠诊断是改善奶牛饲养管理，提高繁殖率的一项重要措施。如果奶牛配种后不能及时诊断是否妊娠，就可导致产犊间隔延长、繁殖率降低、奶产量减少，饲养管理成本增高，大大影响经济效益。据报道，如延误1个情期(一般是21天)，每头牛将减少奶产量168-315kg；另据专家估计，每头多喂1天将在饲料、人工、能源等方面多耗20-32元，多喂一个发情周期将增加成本420-672元。若利用此方法能及时对奶牛妊娠进行诊断，则其经济效益十分显著。目前我国奶牛的第一情期受孕率仅40-60％，多数奶牛需配种(授精)2-3次才能受孕，以延误1-2个发情周期计算，减奶168-630kg。

可见，奶牛早期妊娠诊断技术的研究，对缩短空怀期和产犊间隔，提高繁殖率，进一步促进奶牛业的发展具有重要的经济意义。

乳汁孕酮(MP4)浓度的变化是标示母牛卵巢活动的一项特异指征。应用放射免疫测定法(RIA)测定MP4，证明了MP4的变化所反映的发情周期阶段与直检卵巢的评估结果相一致。因此，可以通过MP4的浓度来监测母牛的生殖活动。MP4浓度随着母牛所处的生殖生理阶段不同具有特征性变化，根据文献报道：曾宪垠等。应用双抗EIA检测奶牛发情周期中奶孕酮含量。四川农业大学学报，1996，14(3)：453-456.其变化规律为：配种后1-5天，乳汁中孕酮含量低，小于3ng/ml。随着配种后天数的增加，孕酮含量也逐渐增加。配种后11天，孕酮含量迅速升高。配种后11-19天，孕酮含量维持在较高水平，均大于8ng/ml。配种后1-19天，孕与非孕牛奶中孕酮含量无明显差异。20天以后，非孕牛奶中孕酮含量开始下降，配种后21天陡降到低水平(小于1ng/ml)，而孕牛奶中孕酮含量则继续维持在较高水平。经统计学T检验，配种后21-24天，孕牛乳汁孕酮含量显著高于非孕牛(p＜0.01)。孕与非孕牛配种后0-29天乳汁孕酮含量变化图式不相同，非孕牛配种后25天起，乳中孕酮含量又逐渐上升。因此采集配种后25-30天乳样并测定其MP4含量，对早孕诊断是切实可行的。

目前在奶牛早期妊娠诊断中常用的几种方法有直肠诊断法，超声波诊断法，孕酮的放射免疫法和孕酮的酶标免疫法。其中直肠诊断法要求操作者必须具有一定的临床经验，较为费时费力，有时还会引起疾病传染或流产，而且两个半月才能检测出怀孕的征象，做出诊断。超声波诊断法由于仪器昂贵和专业技术人员操作而使其广泛应用受限；孕酮的放射免疫法又具有放射性污染，需要特殊防护设备、价格昂贵的仪器和训练有素的人员，而且操作费时等弊端，样品的测试仅限于专门的实验室；孕酮酶标免疫法是近年来使用较多的方法，但仍需要专业人员或经培训的人员操作，并且检测时间长，步骤多，试剂盒也需冷藏。

发明内容

本发明克服了现有技术中存在的一些缺点，提供了一种通过胶体金免疫法来检测配种后奶牛乳汁中的孕酮含量，现场诊断奶牛早孕的检测试纸及其检测方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

在奶牛早期妊娠诊断试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水层和孕酮单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在1-2毫米范围)，在孕酮单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。关于底板、硝酸纤维素膜、吸水纸、胶体金标垫的组合方法已是公知技术。万华普曼生物工程有限公司于1995年已获双抗夹心法检测人绒毛膜促性腺激素诊断试纸的国药批准文号：国药准字S10950049号；1998年获得竞争法检测吗啡试纸的国药字批准文号：国药准字S19990038号，并将产品投放市场。

方案1双抗夹心法：由于孕酮分子有不同的结合位点，用不同的方法来合成不同结合位点的免疫原，将免疫原进行免疫，筛选出两种不同孕酮单克隆抗体，两种不同抗体能够识别同一抗原并以夹心的方式结合于同一孕酮分子的不同位点，利用双抗夹心法原理制成的试纸一种抗体称为I用于包被试验线，另一种抗体称为II用于胶体金标记。

把奶牛早期妊娠诊断试纸的样品吸液层端放入待测的奶牛乳汁中(液面不得超过MAX线图中8)，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至孕酮单克隆抗体II金标垫时，样品中的孕酮与孕酮单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有孕酮单克隆抗体I试验线时，样品中的孕酮另一位点又与试验线中的孕酮单克隆抗体相结合，因此其胶体金滞留于试验线上，试验线处显示红色，为阳性；相反如果样品中没有孕酮，抗孕酮单克隆抗体金标探针就不会与试验线上的孕酮单克隆抗体I发生特异结合，没有胶体金滞留，即仅有一条红色控制线为阴性，这就是双抗夹心法原理。根据此原理，两条线为阳性，一条线为阴性得出诊断。

方案2竞争法：试验线是由孕酮-BSA包被。把奶牛早期妊娠诊断试纸的样品吸液层端放入奶牛乳汁中，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至孕酮单克隆抗体金标垫时，样品中的孕酮与孕酮单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有孕酮-BSA联结物试验线时，由于孕酮单克隆抗体金标垫中的抗体与样品中孕酮优先结合成复合物而失去其与孕酮-BSA结合，因此其胶体金不能滞留于试验线上，试验线处没有红色线显示，即只有一条红色控制线为阳性；相反如果样品中没有孕酮，孕酮单克隆抗体金标垫中的抗体移动到试验线上，孕酮单克隆抗体就会与孕酮-BSA联结物发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条红色线为阴性，这就是免疫竞争法原理。试验线的颜色深浅与样品中孕酮含量高低成反比。从阳性过渡到阴性，由于所测孕酮含量不同，试验线的颜色也不同，形成一个红色颜色梯度差，以这种原理检测出OD值，从而推断出试验线所反应的实际孕酮ng水平，从而得出诊断。

方案1或方案2中，当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无孕酮，标记的金标探针都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。

由于采用上述技术方案，本发明所提供的奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法具有这样的有益效果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。

附图说明

图1为本发明奶牛早期妊娠诊断试纸的主视结构图。

图2为发明图1的侧视结构图。

图3为本发明方案1双抗夹心法的应用于检测时显示为阴性结果图；

发明方案2竞争法的应用于检测时显示的阳性结果图。

图4为本发明方案1双抗夹心法应用于检测时显示为阳性结果图；

发明方案2竞争法的应用于检测时显示的阴性结果图。

图5为本发明方案2竞争法所制试纸比色用的检测色标。

图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单克隆抗体金标垫，6、样品吸液层，7、底板，8、MAX线。

具体实施例

1.孕酮免疫原合成

(1)抗原I的合成

半抗原I的合成：将10.45g(0.033mol)孕烯醇酮与10.45g(0.082mol)(0-羰基甲基)羟胺盐酸盐，溶于517ml含有46.5ml 2N KOH乙醇溶液中，将此溶液回流3小时，旋转蒸除溶剂，向体系中添加150ml水，用2N KOH溶液调pH值在10～10.5范围，用乙酸乙酯萃取2次，再用浓HCl酸化水相到pH值至2左右，于冰箱中放置24h，过滤后用水洗涤沉淀，产物A约为13g，再用乙酸乙酯重结晶，得到产物12g。

将0.68g A加入到50ml乙酸乙酯中，加入10ml乙醚和重氮甲烷的混合溶液，有气泡放出，反应体系常温搅拌过夜，过量的重氮甲烷用少量的冰醋酸除去，旋转蒸除反应体系中的溶剂，得到0.6g晶体B。

取2.57g(6.4mmol)B加入95ml无水丙酮和25ml无水苯，加热回流，加入异丙醇铝溶液(4.73g异丙醇铝溶于100ml无水苯中)，反应液回流8h后，转移到分液漏斗中，并添加25ml苯。用40ml 50％罗氏盐溶液洗涤混合液，滤出固体并分出苯层，用水洗涤三次，用无水硫酸钠干燥，过滤出干燥剂后，旋转蒸除溶剂，得到1.62g粘稠状固体，将该固体用少量苯稀释，通过硅胶柱纯化，重结晶后得到中间体C。

取2.18gC溶于78.5ml甲醇中，加入8.7ml(0.1N)NaOH，室温下搅拌反应，每隔1h取出少量反应液，用水稀释后进行TLC检测，3h后基本反应完全。浓缩反应物，用蒸馏水稀释，用50ml乙醚洗涤两次。水层用1NHCl调pH值至2左右，冷藏过夜后过滤，用水洗涤滤饼，在真空干燥箱中(90～95℃)干燥2小时，得到粗品。用水和甲醇重结晶2次，得到产物D。

取2.33gD溶于350ml丙酮中，并冷却到10℃，通N₂，滴加琼斯铬酸氧化剂并将反应温度保持在15℃左右，直至出现橄榄绿色沉淀，加入2L含20ml甲醇的水溶液，使沉淀完全。过滤、水洗、风干，得到2.28g产物E，将其溶于150ml甲醇中，加5滴10％KOH溶液，冷藏过夜，用HCl调pH值至2左右，添加足够的水使沉淀完全，用乙酸乙酯萃取，用水洗涤酯层，无水Na₂SO₄干燥，旋转蒸除溶剂。用丙酮-石油醚重结晶得1.9g孕酮半抗原I(P₄I)。P₄免疫抗原I和检测抗原I的合成：1.2g的孕酮半抗原I(P₄I)和0.75ml三正丁胺溶于30ml二氧六环中，冷却至8℃，加入0.4ml氯甲酸异丁酯。这个反应在8℃下进行35min，而后混合溶液被添加到BSA溶液中(4.2g BSA、110ml H₂O、80ml二氧六环、4.8ml 1N NaOH)，此时pH值为9，冷却、搅拌。溶液开始时混浊，20min后变清，测pH值降到6.8左右。用1N NaOH溶液将反应液pH值调到7.5左右，搅拌30min，加入0.5ml此浓度NaOH溶液。反应进行4.5h后，用蒸馏水透析过夜，用1N HCl调pH值至4.5，过滤，沉淀冷冻24小时，将连接物(沉淀)加到200ml水中，用1N NaOH调pH值至7左右，再加300ml丙酮用1N HCl调pH值至5左右，连接物又变成沉淀。冷藏3小时后离心连接物，得到两个相似沉淀。

用蒸馏水透析5天，每天更换透析液2次，冷冻干燥后得到P4免疫抗原I(P₄I-BSA)。

同法合成P₄检测抗原I(P₄I-OVA)。

(2)抗原II的合成

半抗原II的合成：称取1.0g 11α-羟基孕酮溶解于40ml无水吡啶中，加入3g琥珀酸酐，在120℃下回流24h，用簿层色谱(TLC)法检测，反应完全。冷却，向反应体系中添加200ml蒸馏水。先用乙醚萃取反应液(100mL×2)，用水洗一次乙醚相(1/20vol)，再用饱和碳酸钠溶液洗涤一次。分离水相，用10％的盐酸酸化水相pH值至4左右，再用乙酸乙酯萃取3遍，无水Na₂SO₄干燥有机相。旋转蒸除溶剂，得到的黄色油状物用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到11α-羟基孕酮半琥珀酸，即半抗原II(P₄II)。

P₄免疫抗原II和检测抗原II的合成：称取11α-羟基孕酮半抗原(P4II)215mg溶于2ml无水二氧六环中，二环己基碳二亚胺(DCC)113mg溶于1ml无水二氧六环中，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)57.5mg溶于1ml无水二氧六环中。三种溶液混合，室温搅拌2h。

过滤(除尿素)，用无水二氧六环洗涤(总体积8ml)。取6.4ml滤液逐滴滴加到BSA溶液(500mg BSA溶于10ml 0.2mol/L磷酸缓冲液)中，添加水和二氧六环防止产成沉淀，室温下搅拌过夜。

过滤反应液，用蒸馏水于4℃下透析5天，每天换液2次，冷冻干燥后得到P4免疫抗原II(P₄II-BSA)。

同法合成P₄检测抗原II(P₄II-OVA)。

2.孕酮单克隆抗体的制备。

(1)将制备的两种不同结合位点的孕酮-BSA分别免疫BALB/c小鼠。用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。

(2)提取小鼠腹水纯化筛选，获得与孕酮分子不同位点结合的两种孕酮单克隆抗体I、II，II可用于双抗夹心法的胶体金标记和竞争法的胶体金标记。

3.胶体金的制备及与孕酮单克隆抗体的结合。

(1)取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90～95℃，加入适量枸橼酸三纳继续加热搅拌至沸腾5分钟，冷却后避光保存备用。

(2)把孕酮单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。

4.制膜机制膜：利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。

5.试纸条组合：按公知技术组合。

使用方法：授精后25-30天为早孕最佳检测时间。把奶牛早期妊娠诊断试纸的样品吸液层端放入新采的牛奶中(液面不得超过MAX线图中8)，1分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，双抗夹心为5分钟时观察结果，竞争法为15分钟时观察结果。

结果判断

方案1：利用双抗夹心法制成试纸的反应线颜色为红色，即显色区为两条红色线时为阳性；只有一条红色控制线时为阴性；如果显色区有两条线，其中试验线未变红色时则判断为可疑。

方案2：利用竞争法制成试纸其检测色标所标定的深红色代表的阴性值为孕酮浓度4ng/ml以下，浅红色代表阳性值为孕酮浓度8ng/ml以上，颜色在两者之间为可疑。光电仪器的标准值，其中阳性值代表孕酮浓度在8ng/ml以上，阴性值代表孕酮浓度在4ng/ml以下，在两值之间的值判定为可疑。

Claims

1.一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，试纸是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、孕酮单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)组成；底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和孕酮单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在孕酮单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层，其特征在于利用免疫胶体金法来进行奶牛的早期妊娠诊断，进而确定所测奶牛是否怀孕。

2.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于此试纸可用两种不同的方法制成，一种是由双抗夹心原理制成，另一种是由竞争法原理制成。

3.根据权利要求1所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，当样品通过胶体金标记的孕酮单克隆抗体移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，控制线便显示红色。

4.根据权利要求1或2所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于由于孕酮分子有不同的结合位点，用不同的方法来合成不同结合位点的免疫原，将免疫原进行免疫，筛选出两种不同孕酮单克隆抗体，两种不同抗体能够识别同一抗原并以夹心的方式结合于同一孕酮分子的不同位点，利用双抗夹心法原理制成的试纸一种抗体称为I用于包被试验线，另一种抗体称为II用于胶体金标记。

5.根据权利要求1或2所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于利用竞争法原理所制成的试纸由孕酮-BSA包被试验线，筛选一种特异性强、灵敏度高的单克隆抗体作为胶体金标记。

6.根据权利要求1或4所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于利用双抗夹心法制成试纸的试验线颜色深浅与检测样品中孕酮含量高低成正比。

7.根据权利要求1或5所述的一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于利用竞争法制成试纸的试验线颜色深浅与检测样品中孕酮含量高低成反比。

8.根据权利要求4所述一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于利用双抗夹心法制成试纸的反应线颜色为红色，即显色区为两条线时为阳性；只有一控制线为红色时为阴性；如果显色区有两条线，其中试验线未变红色时则判断为可疑。

9.根据权利要求5所述一种用于奶牛早期妊娠诊断试纸及其检测方法，其特征在于利用竞争法制成试纸其检测色标所标定的深红色代表阴性值为孕酮浓度4ng/ml以下，浅红色色标代表阳性值为孕酮浓度8ng/ml以上，颜色在深浅色标之间为可疑；光电仪器的标准值，其中阳性值代表孕酮浓度在8ng/ml以上，阴性值代表孕酮浓度在4ng/ml以下，在两值之间的值判定为可疑。