CN1673748A - 一种黄曲霉毒素b1金标检测试纸盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种黄曲霉毒素B1金标检测试纸盒及其制备方法,属于生物工程产品技术领域。本发明试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬,在试纸条一端注样区粘贴吸附胶体金-抗AFB1单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜;在中间测试区粘贴硝酸纤维素膜,在膜上喷涂完全抗原AFB1-O-OVA作检测线,喷涂羊抗鼠IgG作质控线,再用1%BSA封闭硝酸纤维素膜;在另一端吸水区粘贴吸水纸。试纸条被包装在对应设有注样孔和观察孔的盒壳体内。将被测试样滴入注样孔后,根据检测线的变色情况,检测试样中黄曲霉毒素B1含量达标与否。本发明优点是不需要大型检测仪器,试纸盒制作方便,检测快速、准确、明显、灵敏度高等。
Description
技术领域
一种黄曲霉毒素B1金标检测试纸盒及其制备方法,属于生物工程产品技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见霉菌——黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。黄曲霉在自然界的存在较寄生曲霉普遍,很容易污染食品,又能在受侵染的粮食和油料作物(尤其是玉米和花生)上生长繁殖产生毒素。1960年,英国曾发生了约十万只火鸡幼仔短短几个月内相继死亡的严重事故,后来查明是由于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料引起的,并从霉变的花生饼中分离出黄曲霉产毒菌株。1961年已证实喂饲了含有黄曲霉毒素的花生饼可使大鼠发生原发性肝癌。大多数产毒黄典霉菌产生黄曲霉毒素B1的量比其它黄曲霉毒素多,而且黄曲霉毒素B1的毒性又最大。黄曲霉毒素B1除主要可引发肝癌外,由于毒素侵入试验动物的途径不同,也可引起其它部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿。根据一些流行病学的调查和研究结果表明,世界上许多肝癌高发区,食品的黄曲霉毒素污染率较高。江苏省启东市是全国肝癌发病率最高的地区,据一些专家研究显示这与当地人们对粮食储存方法不当,再加上气候温暖潮湿,粮食受黄曲霉菌污染所致。
黄曲霉毒素是一类结构相似的化合物的总称。其基本结构都有一个二呋南环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。最初根据其在紫外光下发生荧光的颜色及薄层层折时Rf值的不同分别命名为黄曲霉毒素B1、B2和G1、G2。在365nm波长下B1、B2呈蓝紫色荧光;G1、G2呈黄绿色荧光。以后又发现这类毒素在动物体内的代谢产物,种类有黄曲霉毒素P1、M1、M2、CM1等等,黄曲霉毒素可溶于多种溶剂中,如氯仿、甲醇等,但不溶于己烷、石油醚与乙醚中,在紫外光照射下毒素可产生很强的荧光,此种毒素用有机溶剂提取净化后,可在硅胶板上作薄层层析。结构如下所示。
动物摄取黄曲霉毒素B1后,在体内形成代谢物M1。M1是B1的羟基化衍生物,最初在羊奶中发现,故命名。牛、羊等动物食入含有黄曲霉毒素B1的饲料后,其奶中即有M1排出。猴摄入B1后尿中排出代谢物为P1。P1是B1的去甲基衍生物,因而代以一个酚基命名。动物摄入B1后,在奶、尿液、血液中都有B1或其它代谢物检出。组织器官中以肝脏最为重要,各种动物肝脏均有B1或其它代谢物出现,肾、脾、肾上腺中亦可含有B1,但在肝脏中的蓄积作用显著较其它组织高。
黄曲霉毒素与人类的健康有着密切关系,全世界都在关心食品安全问题。世界卫生组织(WHO)建议自1975年4月1日起将1970年所规定的果实及其产品中的黄曲霉毒素的“可行性标准”(“actionable level”)由20ppb降至15ppb以下,在将来随着检验水平的提高,限量标准将进一步下降。国内外检测黄曲霉毒素B1的方法有很多,其中薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫化学法是目前研究较多、且受人们关注的几个代表性方法。(一)TLC:该法是常规方法,一般实验室均可完成,但测定黄曲霉毒素B1的专一性差,且有其它荧光物质干扰,分析时间较长。(二)HPLC:HPLC法是一个灵敏快速的方法,分辨率高,往往一次可同时测定多种黄曲霉毒素,可定性、定量,但仪器较昂贵,技术水平要求高,不宜推广使用。(三)免疫分析法:包括放射免疫法、酶联免疫法和亲和层析法。免疫分析法有特异性强,灵敏度高等特点,但需要检验人员有较高的专业知识或配有检测仪器。以上三种方法的不足之处在于或检测灵敏度不高、或一次不能检测大量样品、或需昂贵的设备、或安全性较差等缺点。
发明内容
本发明的目的:是提供一种黄曲霉毒素B1金标检测试纸盒及其制备方法,黄曲霉毒素B1金标检测试纸条属于生物工程产品,主要用于检测粮食、食品、饮料、酒类、饲料等中的黄曲霉毒素B1(AFB1)的含量。
本发明的技术方案:检测原理是样品中的黄曲霉毒素B1(AFB1)首先与胶体金颗粒表面的抗AFB1单克隆抗体反应,如果样品中AFB1的含量超过限值,胶体金的抗体位点将不再有剩余,当胶体金颗粒层析经过检测线时,胶体金颗粒将不会停留在该线的所在位置,继续上行时与控制线上喷涂的羊抗鼠IgG反应,呈现出胶体金的红色。如果样品中不含AFB1或AFB1含量低于限值,胶体金表面的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色,质控线也呈现红色。
黄曲霉毒素B1金标检测试纸盒的结构是由盒壳体和试纸条所组成,试纸条被封装在盒壳体内,试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬,在试纸条一端的注样区粘贴吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜;在试纸条中间的测试区粘贴硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜连接处有一小段重叠区,玻璃纤维膜的一小段重叠在硝酸纤维素膜上,在试纸条另一端吸水区粘贴吸水纸;在硝酸纤维素膜上从注样区到吸水区的方向,依次喷涂黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白作检测线,喷涂羊抗鼠IgG作质控线,然后再用1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜;盒壳体上面开有注样孔,观测孔,注样孔的位置对应于试纸条注样区的玻璃纤维膜,观测孔的位置对应于试纸条的测试区,使能观察到检测线和质控线的变色。
吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜的制备:将胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物稀释至0.5-2μg/mL,放入10mm×300mm玻璃纤维膜,浸泡10-20分钟,37℃烘干,4-8℃保存,粘贴在背衬一端的注样区;在背衬中间检测区粘贴硝酸纤维素膜,在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为100-500μg/mL黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白作检测线,喷涂浓度为50-200μg/mL羊抗鼠IgG作质控线,再用1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜;在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸;所得黄曲霉毒素B1金标检测试纸条包封在上面开有注样孔和观测孔的盒壳体内。硝酸纤维素膜厚度为120μm,蛋白质负载量为5-20μg/cm2,聚氯乙烯或聚乙烯背衬厚度为100μm。试纸条的尺寸约为(55-65)mm×(3-5)mm,检测线和质控线的宽度为0.5-1mm。
本发明的有益效果:本发明采用金标检测法,用于检测粮食、食品、饮料、酒类、饲料等中的黄曲霉毒素B1(AFB1)的含量。检测时只需将检测样品滴入注样孔中,稍许,即可在观测区中观察检测线和质控线的变色情况,确定样品中黄曲霉毒素B1含量是否超标。如果检测线和质控线均呈红色,则样品中黄曲霉毒素B1含量达标,如果检测线不变色,仅质控线变色,则样品中黄曲霉毒素B1含量超标。与现有测试方法相比,不需要大型检测仪器,检测快速、准确、明显、灵敏度高。
附图说明
图1黄曲霉毒素B1金标检测试纸盒检测示意图。
图2黄曲霉毒素B1金标检测试纸条结构图。
1.盒壳体,2.试纸条,3.玻璃纤维膜,4.硝酸纤维素膜,5.检测线,6.质控线,7.吸水纸,8.注样孔,9.观测孔。
具体实施方法
1.完全抗原AFB1-O-BSA的合成
取AFB1的活化物5mg于5mL无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解,置4℃冰箱中冷却。取50mg碳二亚胺盐(EDPC)溶于1.0mL蒸馏水中,取44mg牛血清白蛋白(BSA)溶于4.0mL0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.4)中,冰箱中冷却待用。在磁力搅拌的同时,将0.5mLEDPC溶液逐滴加入AFB1溶液中,4℃搅拌,避光反应1小时。在反应液中缓慢滴加BSA溶液,继续搅拌1小时后,再加入0.5mLEDPC溶液,4℃下反应16小时。将产物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小时,每12小时换一次透析液。最后将透析好的溶液分装,-20℃保存。
2.黄曲霉毒素B1(AFB1)单克隆抗体的制备
1)动物免疫:用完全抗原AFB1-O-BSA免疫8周龄BALB/c小鼠,每鼠抗原量为200μg。第一次免疫,抗原与福氏完全佐剂1∶1乳化后,腹腔及皮下注射;第二次免疫于三周后进行,采用抗原与福氏不完全佐剂1∶1乳化后,腹腔及皮下注射;间隔三周后,进行第三次免疫,方法与第二次相同;2周后,加强免疫,直接用抗原通过尾静脉免疫,抗原量为100μg。在免疫的过程中,监测抗体的产生情况。加强免疫72小时后,杀死小鼠,取脾脏制备脾细胞悬液。
2)细胞融合:免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期限的骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10∶1混合,用含20%胎牛血清RPMI-1640培养液清洗细胞,4000KD聚乙二醇(PEG)为融合剂融合。离心,移去上清液。融合细胞悬浮于含20%胎牛血清的黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养液中,稀释至适当浓度(2×106脾细胞/mL),加入预先制备的96孔细胞培养板(BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞,2×104个/孔),放入CO2孵育箱中37℃培养,当镜检杂交瘤克隆生长达1/2视野时,取上清液用间接竞争ELISA法进行筛选得到适合的杂交瘤细胞。
3)克隆化:采用准确计数稀释法,得到杂交瘤细胞株,冻存。
4)单克隆抗体的制备:将培养的杂交瘤细胞离心,弃去上清液,用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮,并将细胞数调至2×106个/mL,每只BALB/c小鼠腹腔注射1mL,对侧腹腔注射1mL降植烷和不完全福氏佐剂,12天后收集腹水。将腹水离心(3000rpm,20min),收集上清液。用33%饱和硫酸铵和50%饱和硫酸铵分级沉淀,得到抗AFB1单克隆抗体。
3、抗体与胶体金结合原液的制备
1)胶体金的制备:取0.01%的氯金酸100mL,加热煮沸,然后快速加入1%的柠檬酸钠1.0mL,继续煮沸5分钟。用0.1mol/L K2CO3和0.1mol/L HCl调整PH至8.0-8.6。
2)抗体准备:抗AFB1单克隆抗体用葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25脱盐。
3)抗体与胶体金结合原液的制备:用纯化好的抗AFB1单克隆抗体加入胶体金液中,体积比为1∶20,终浓度为50-70μg/mL,室温搅拌均匀。加入10%牛血清白蛋白(BSA),终浓度为0.4%,再加入10%PEG(MW20000),终浓度为0.2%,室温搅拌均匀。加入与胶体金-抗体结合物液同体积的10%NaCl,静置1小时。12000rpm离心60分钟,沉淀溶解于适量0.01M PBS溶液中,用0.45μm的滤膜过滤,终浓度为40-50μg/mL。用0.01M PBS溶液稀释到所需浓度0.5-2μg/mL,用于浸泡玻璃纤维膜使之吸附。
4)抗原AFB1-O-OVA的合成:取AFB1的活化物1mg于1mL无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解,置4℃冰箱中冷却。取20mg碳二亚胺盐(EDPC)溶于1.0mL蒸馏水中,取20mg卵清白蛋白(OVA)溶于2.0mL0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.4)中,冰箱中冷却待用。在磁力搅拌的同时,将0.5mL EDPC溶液逐滴加入AFB1溶液中,4℃搅拌,避光反应1小时。在反应液中缓慢滴加OVA溶液,继续搅拌1小时后,再加入0.5mL EDPC溶液,4℃下反应16小时。将产物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小时,每12小时换一次透析液。最后将透析好的溶液分装,-20℃保存。用0.01M PBS溶液稀释到所需浓度100-500μg/mL,用于喷涂检测线。
5)羊抗鼠IgG:购买于上海华美试剂公司。羊抗鼠IgG用0.01MPBS溶液稀释到所需浓度50-200μg/mL,用于喷涂质控线。
Claims (4)
1、一种黄曲霉毒素B1金标检测试纸盒,其特征是由盒壳体(1)和试纸条(2)所组成,试纸条被封装在盒壳体内,试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬,在试纸条一端的注样区粘贴吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜(3);在试纸条中间的测试区粘贴硝酸纤维素膜(4),硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜连接处有一小段重叠区,玻璃纤维膜的一小段重叠在硝酸纤维素膜上,在试纸条另一端吸水区粘贴吸水纸(7);在硝酸纤维素膜上从注样区到吸水区的方向,依次喷涂黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白作检测线(5),喷涂羊抗鼠IgG作质控线(6),然后再用1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜;盒壳体上面开有注样孔(8),观测孔(9),注样孔的位置对应于试纸条注样区的玻璃纤维膜,观测孔的位置对应于试纸条的测试区,使能观察到检测线和质控线的变色。
2、如权利要求1所述的检测试纸盒的制备方法,其特征是所述吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜的制备:将胶体金-抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合物稀释至0.5-2μg/mL,放入10mm×300mm玻璃纤维膜,浸泡10-20分钟,37℃烘干,4-8℃保存,粘贴在背衬一端的注样区;在背衬中间检测区粘贴硝酸纤维素膜,在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为100-500μg/mL黄曲霉毒素B1-卵清白蛋白作检测线,喷涂浓度为50-200μg/mL羊抗鼠IgG作质控线,再用1%牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜;在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸;所得黄曲霉毒素B1金标检测试纸条包封在上面开有注样孔和观测孔的盒壳体内。
3、根据权利要求2所述的检测试纸盒的制备方法,其特征是硝酸纤维素膜厚度为120μm,蛋白质负载量为5-20μg/cm2。
4、根据权利要求2所述的检测试纸盒的制备方法,其特征是聚氯乙烯或聚乙烯背衬厚度为100μm。
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |