CN1673748A - 一种黄曲霉毒素b1金标检测试纸盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种黄曲霉毒素B₁金标检测试纸盒及其制备方法，属于生物工程产品技术领域。本发明试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在试纸条一端注样区粘贴吸附胶体金－抗AFB₁单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜；在中间测试区粘贴硝酸纤维素膜，在膜上喷涂完全抗原AFB₁－O－OVA作检测线，喷涂羊抗鼠IgG作质控线，再用1％BSA封闭硝酸纤维素膜；在另一端吸水区粘贴吸水纸。试纸条被包装在对应设有注样孔和观察孔的盒壳体内。将被测试样滴入注样孔后，根据检测线的变色情况，检测试样中黄曲霉毒素B₁含量达标与否。本发明优点是不需要大型检测仪器，试纸盒制作方便，检测快速、准确、明显、灵敏度高等。

Description

一种黄曲霉毒素B1x金标检测试纸盒及其制备方法

技术领域

一种黄曲霉毒素B₁金标检测试纸盒及其制备方法，属于生物工程产品技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见霉菌——黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。黄曲霉在自然界的存在较寄生曲霉普遍，很容易污染食品，又能在受侵染的粮食和油料作物(尤其是玉米和花生)上生长繁殖产生毒素。1960年，英国曾发生了约十万只火鸡幼仔短短几个月内相继死亡的严重事故，后来查明是由于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料引起的，并从霉变的花生饼中分离出黄曲霉产毒菌株。1961年已证实喂饲了含有黄曲霉毒素的花生饼可使大鼠发生原发性肝癌。大多数产毒黄典霉菌产生黄曲霉毒素B₁的量比其它黄曲霉毒素多，而且黄曲霉毒素B₁的毒性又最大。黄曲霉毒素B₁除主要可引发肝癌外，由于毒素侵入试验动物的途径不同，也可引起其它部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿。根据一些流行病学的调查和研究结果表明，世界上许多肝癌高发区，食品的黄曲霉毒素污染率较高。江苏省启东市是全国肝癌发病率最高的地区，据一些专家研究显示这与当地人们对粮食储存方法不当，再加上气候温暖潮湿，粮食受黄曲霉菌污染所致。

黄曲霉毒素是一类结构相似的化合物的总称。其基本结构都有一个二呋南环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。最初根据其在紫外光下发生荧光的颜色及薄层层折时Rf值的不同分别命名为黄曲霉毒素B₁、B₂和G₁、G₂。在365nm波长下B₁、B₂呈蓝紫色荧光；G₁、G₂呈黄绿色荧光。以后又发现这类毒素在动物体内的代谢产物，种类有黄曲霉毒素P₁、M₁、M₂、CM₁等等，黄曲霉毒素可溶于多种溶剂中，如氯仿、甲醇等，但不溶于己烷、石油醚与乙醚中，在紫外光照射下毒素可产生很强的荧光，此种毒素用有机溶剂提取净化后，可在硅胶板上作薄层层析。结构如下所示。

动物摄取黄曲霉毒素B₁后，在体内形成代谢物M₁。M₁是B₁的羟基化衍生物，最初在羊奶中发现，故命名。牛、羊等动物食入含有黄曲霉毒素B₁的饲料后，其奶中即有M₁排出。猴摄入B₁后尿中排出代谢物为P₁。P₁是B₁的去甲基衍生物，因而代以一个酚基命名。动物摄入B₁后，在奶、尿液、血液中都有B₁或其它代谢物检出。组织器官中以肝脏最为重要，各种动物肝脏均有B₁或其它代谢物出现，肾、脾、肾上腺中亦可含有B₁，但在肝脏中的蓄积作用显著较其它组织高。

黄曲霉毒素与人类的健康有着密切关系，全世界都在关心食品安全问题。世界卫生组织(WHO)建议自1975年4月1日起将1970年所规定的果实及其产品中的黄曲霉毒素的“可行性标准”(“actionable level”)由20ppb降至15ppb以下，在将来随着检验水平的提高，限量标准将进一步下降。国内外检测黄曲霉毒素B₁的方法有很多，其中薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫化学法是目前研究较多、且受人们关注的几个代表性方法。(一)TLC：该法是常规方法，一般实验室均可完成，但测定黄曲霉毒素B₁的专一性差，且有其它荧光物质干扰，分析时间较长。(二)HPLC：HPLC法是一个灵敏快速的方法，分辨率高，往往一次可同时测定多种黄曲霉毒素，可定性、定量，但仪器较昂贵，技术水平要求高，不宜推广使用。(三)免疫分析法：包括放射免疫法、酶联免疫法和亲和层析法。免疫分析法有特异性强，灵敏度高等特点，但需要检验人员有较高的专业知识或配有检测仪器。以上三种方法的不足之处在于或检测灵敏度不高、或一次不能检测大量样品、或需昂贵的设备、或安全性较差等缺点。

发明内容

本发明的目的：是提供一种黄曲霉毒素B₁金标检测试纸盒及其制备方法，黄曲霉毒素B₁金标检测试纸条属于生物工程产品，主要用于检测粮食、食品、饮料、酒类、饲料等中的黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的含量。

本发明的技术方案：检测原理是样品中的黄曲霉毒素B₁(AFB₁)首先与胶体金颗粒表面的抗AFB₁单克隆抗体反应，如果样品中AFB₁的含量超过限值，胶体金的抗体位点将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不会停留在该线的所在位置，继续上行时与控制线上喷涂的羊抗鼠IgG反应，呈现出胶体金的红色。如果样品中不含AFB₁或AFB₁含量低于限值，胶体金表面的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色，质控线也呈现红色。

黄曲霉毒素B₁金标检测试纸盒的结构是由盒壳体和试纸条所组成，试纸条被封装在盒壳体内，试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在试纸条一端的注样区粘贴吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜；在试纸条中间的测试区粘贴硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜连接处有一小段重叠区，玻璃纤维膜的一小段重叠在硝酸纤维素膜上，在试纸条另一端吸水区粘贴吸水纸；在硝酸纤维素膜上从注样区到吸水区的方向，依次喷涂黄曲霉毒素B₁-卵清白蛋白作检测线，喷涂羊抗鼠IgG作质控线，然后再用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；盒壳体上面开有注样孔，观测孔，注样孔的位置对应于试纸条注样区的玻璃纤维膜，观测孔的位置对应于试纸条的测试区，使能观察到检测线和质控线的变色。

吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜的制备：将胶体金-抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体结合物稀释至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纤维膜，浸泡10-20分钟，37℃烘干，4-8℃保存，粘贴在背衬一端的注样区；在背衬中间检测区粘贴硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为100-500μg/mL黄曲霉毒素B₁-卵清白蛋白作检测线，喷涂浓度为50-200μg/mL羊抗鼠IgG作质控线，再用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸；所得黄曲霉毒素B₁金标检测试纸条包封在上面开有注样孔和观测孔的盒壳体内。硝酸纤维素膜厚度为120μm，蛋白质负载量为5-20μg/cm²，聚氯乙烯或聚乙烯背衬厚度为100μm。试纸条的尺寸约为(55-65)mm×(3-5)mm，检测线和质控线的宽度为0.5-1mm。

本发明的有益效果：本发明采用金标检测法，用于检测粮食、食品、饮料、酒类、饲料等中的黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的含量。检测时只需将检测样品滴入注样孔中，稍许，即可在观测区中观察检测线和质控线的变色情况，确定样品中黄曲霉毒素B₁含量是否超标。如果检测线和质控线均呈红色，则样品中黄曲霉毒素B₁含量达标，如果检测线不变色，仅质控线变色，则样品中黄曲霉毒素B₁含量超标。与现有测试方法相比，不需要大型检测仪器，检测快速、准确、明显、灵敏度高。

附图说明

图1黄曲霉毒素B₁金标检测试纸盒检测示意图。

图2黄曲霉毒素B₁金标检测试纸条结构图。

1.盒壳体，2.试纸条，3.玻璃纤维膜，4.硝酸纤维素膜，5.检测线，6.质控线，7.吸水纸，8.注样孔，9.观测孔。

具体实施方法

1.完全抗原AFB₁-O-BSA的合成

取AFB₁的活化物5mg于5mL无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，置4℃冰箱中冷却。取50mg碳二亚胺盐(EDPC)溶于1.0mL蒸馏水中，取44mg牛血清白蛋白(BSA)溶于4.0mL0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)中，冰箱中冷却待用。在磁力搅拌的同时，将0.5mLEDPC溶液逐滴加入AFB₁溶液中，4℃搅拌，避光反应1小时。在反应液中缓慢滴加BSA溶液，继续搅拌1小时后，再加入0.5mLEDPC溶液，4℃下反应16小时。将产物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小时，每12小时换一次透析液。最后将透析好的溶液分装，-20℃保存。

2.黄曲霉毒素B₁(AFB₁)单克隆抗体的制备

1)动物免疫：用完全抗原AFB₁-O-BSA免疫8周龄BALB/c小鼠，每鼠抗原量为200μg。第一次免疫，抗原与福氏完全佐剂1∶1乳化后，腹腔及皮下注射；第二次免疫于三周后进行，采用抗原与福氏不完全佐剂1∶1乳化后，腹腔及皮下注射；间隔三周后，进行第三次免疫，方法与第二次相同；2周后，加强免疫，直接用抗原通过尾静脉免疫，抗原量为100μg。在免疫的过程中，监测抗体的产生情况。加强免疫72小时后，杀死小鼠，取脾脏制备脾细胞悬液。

2)细胞融合：免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期限的骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10∶1混合，用含20％胎牛血清RPMI-1640培养液清洗细胞，4000KD聚乙二醇(PEG)为融合剂融合。离心，移去上清液。融合细胞悬浮于含20％胎牛血清的黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养液中，稀释至适当浓度(2×10⁶脾细胞/mL)，加入预先制备的96孔细胞培养板(BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，2×10⁴个/孔)，放入CO₂孵育箱中37℃培养，当镜检杂交瘤克隆生长达1/2视野时，取上清液用间接竞争ELISA法进行筛选得到适合的杂交瘤细胞。

3)克隆化：采用准确计数稀释法，得到杂交瘤细胞株，冻存。

4)单克隆抗体的制备：将培养的杂交瘤细胞离心，弃去上清液，用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮，并将细胞数调至2×10⁶个/mL，每只BALB/c小鼠腹腔注射1mL，对侧腹腔注射1mL降植烷和不完全福氏佐剂，12天后收集腹水。将腹水离心(3000rpm，20min)，收集上清液。用33％饱和硫酸铵和50％饱和硫酸铵分级沉淀，得到抗AFB₁单克隆抗体。

3、抗体与胶体金结合原液的制备

1)胶体金的制备：取0.01％的氯金酸100mL，加热煮沸，然后快速加入1％的柠檬酸钠1.0mL，继续煮沸5分钟。用0.1mol/L K₂CO₃和0.1mol/L HCl调整PH至8.0-8.6。

2)抗体准备：抗AFB₁单克隆抗体用葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25脱盐。

3)抗体与胶体金结合原液的制备：用纯化好的抗AFB₁单克隆抗体加入胶体金液中，体积比为1∶20，终浓度为50-70μg/mL，室温搅拌均匀。加入10％牛血清白蛋白(BSA)，终浓度为0.4％，再加入10％PEG(MW20000)，终浓度为0.2％，室温搅拌均匀。加入与胶体金-抗体结合物液同体积的10％NaCl，静置1小时。12000rpm离心60分钟，沉淀溶解于适量0.01M PBS溶液中，用0.45μm的滤膜过滤，终浓度为40-50μg/mL。用0.01M PBS溶液稀释到所需浓度0.5-2μg/mL，用于浸泡玻璃纤维膜使之吸附。

4)抗原AFB₁-O-OVA的合成：取AFB₁的活化物1mg于1mL无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解，置4℃冰箱中冷却。取20mg碳二亚胺盐(EDPC)溶于1.0mL蒸馏水中，取20mg卵清白蛋白(OVA)溶于2.0mL0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)中，冰箱中冷却待用。在磁力搅拌的同时，将0.5mL EDPC溶液逐滴加入AFB₁溶液中，4℃搅拌，避光反应1小时。在反应液中缓慢滴加OVA溶液，继续搅拌1小时后，再加入0.5mL EDPC溶液，4℃下反应16小时。将产物溶液用0.01M PBS溶液在4℃下透析72小时，每12小时换一次透析液。最后将透析好的溶液分装，-20℃保存。用0.01M PBS溶液稀释到所需浓度100-500μg/mL，用于喷涂检测线。

5)羊抗鼠IgG：购买于上海华美试剂公司。羊抗鼠IgG用0.01MPBS溶液稀释到所需浓度50-200μg/mL，用于喷涂质控线。

Claims (4)

1、一种黄曲霉毒素B₁金标检测试纸盒，其特征是由盒壳体(1)和试纸条(2)所组成，试纸条被封装在盒壳体内，试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在试纸条一端的注样区粘贴吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜(3)；在试纸条中间的测试区粘贴硝酸纤维素膜(4)，硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜连接处有一小段重叠区，玻璃纤维膜的一小段重叠在硝酸纤维素膜上，在试纸条另一端吸水区粘贴吸水纸(7)；在硝酸纤维素膜上从注样区到吸水区的方向，依次喷涂黄曲霉毒素B₁-卵清白蛋白作检测线(5)，喷涂羊抗鼠IgG作质控线(6)，然后再用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；盒壳体上面开有注样孔(8)，观测孔(9)，注样孔的位置对应于试纸条注样区的玻璃纤维膜，观测孔的位置对应于试纸条的测试区，使能观察到检测线和质控线的变色。

2、如权利要求1所述的检测试纸盒的制备方法，其特征是所述吸附胶体金-抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜的制备：将胶体金-抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体结合物稀释至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纤维膜，浸泡10-20分钟，37℃烘干，4-8℃保存，粘贴在背衬一端的注样区；在背衬中间检测区粘贴硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为100-500μg/mL黄曲霉毒素B₁-卵清白蛋白作检测线，喷涂浓度为50-200μg/mL羊抗鼠IgG作质控线，再用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸；所得黄曲霉毒素B₁金标检测试纸条包封在上面开有注样孔和观测孔的盒壳体内。

3、根据权利要求2所述的检测试纸盒的制备方法，其特征是硝酸纤维素膜厚度为120μm，蛋白质负载量为5-20μg/cm²。

4、根据权利要求2所述的检测试纸盒的制备方法，其特征是聚氯乙烯或聚乙烯背衬厚度为100μm。

Images