CN106990236A - 一种大米中黄曲霉毒素b1的胶体金免疫层析检测方法 - Google Patents

一种大米中黄曲霉毒素b1的胶体金免疫层析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大米中黄曲霉毒素B1(AFB1)的胶体金免疫层析检测方法，包含以下步骤：采用还原法还原HAuCl4水溶液制备胶体金，将胶体金与抗AFB1单克隆抗体混合均匀，得金标AFB1单克隆抗体作为分析探针；将检测线AFB1‑BSA偶联物和质控线羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上，建立AFB1的胶体金免疫层析检测体系(GICA)；将大米样品溶液缓慢滴加于分析探针上，观察检测线和质控线的颜色变化，当样品中AFB1浓度低于限值时，检测线和质控线均为红色；高于限值时，仅质控线为红色；本发明的胶体金免疫层析技术作为一种新型检测技术，无需借助仪器，具有操作简单、快速，检测结果及时、准确等优点，适用于对AFB1进行现场检测，在食品安全检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素(AFs)由二呋喃环和氧杂萘邻酮组成，是一种强致癌性物质；黄曲霉毒素B1(AFB1)是AFs的衍生物中毒性最强的，AFB1的摄入是导致肝癌的主要因素之一，饲料和粮食作物若水分含量高，存放温度不适宜，极易被AFB1污染，且AFB1能够耐高温，在后续的加工过程中很难被破坏，严重威胁人类和动物的生命安全。
为了降低AFB1人类和动物的危害，世界各国不断制定尽可能低的食品和饲料中AFB1限量标准，并通过检验检疫机构进行监测。国家标准GB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素测定，采用高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量，总量检出限为1μg/kg；国家标准GB/T5009.23-2006食品中黄曲霉毒素测定，采用高效液相色谱仪柱前衍生测定黄曲霉毒素的含量，AFB1和AFG1检出限为0.2μg/kg。
CN105651899A公开了一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，将现行黄曲霉毒素的柱前衍生技术与柱后衍生技术结合，柱前衍生反应在紫外光线照射下进行，使衍生反应进行的完全且产生的荧光强，衍生产物荧光稳定性好，同时又提高了检测灵敏度；CN105911157A公开了一种快速检测食品中黄曲霉毒素的新方法，结合高效液相色谱-在线柱后光化学衍生-荧光检测器检测食品中黄曲霉毒素，采用分散磁固相微萃取与分散液液微萃取技术结合，进行样品中黄曲霉毒素的分离、净化及富集。上述现有技术AFB1的检测方法需要专门的仪器设备并且操作繁琐，已无法满足现场快速检测的要求；因此，建立一种方便、简易、快速的AFB1检测方法具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便、简易、快速的大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法。
一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，包含以下步骤：
(1)抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化：将稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB/c小鼠腹腔，通过体内诱生制备抗AFB1的腹水抗体，然后将腹水抗体采用亲和层析纯化得高纯度的抗AFB1单克隆抗体；
(2)胶体金免疫层析检测体系(GICA)的制备：采用还原剂还原HAuCl4水溶液制备胶体金，将胶体金与步骤(1)中抗AFB1单克隆抗体混合均匀得金标AFB1单克隆抗体，作为分析探针；将检测线AFB1-BSA偶联物和质控线羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上，建立AFB1的胶体金免疫层析检测体系(GICA)；
(3)大米样品溶液AFB1的检测：制备大米样品溶液，缓慢滴加于步骤(2)中分析探针上，依据检测条件，观察检测线和质控线的颜色变化，当样品中AFB1浓度低于限值时，检测线和质控线均为红色；高于限值时，仅质控线为红色。
所述的胶体金制备方法包括:取0.01wt％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸30min，迅速加入1wt％还原剂枸橼酸三钠水溶液0.75ml-4ml，继续煮沸约5min，出现橙红色；所述胶体金颗粒粒径为15nm-50nm。
优选的，所述胶体金颗粒粒径为20nm-25nm。
所述的金标AFB1单克隆抗体中抗AFB1单克隆抗体和胶体金的标记量为15μg：1mL。
所述的大米样品溶液的制备方法包括：称取粉碎均质后的大米样品2.0g，置50ml离心管中，加入洗脱剂3-6ml，旋涡混合4min，在4000r/min下离心4min，精密量取上清液1ml，过0.2um滤膜即得。
所述的洗脱剂包含甲醇、乙酸乙酯、乙腈中的一种。
所述的检测条件包括：标记pH值为7.5，AFB1-BSA偶联物浓度为10μg/mL，羊抗鼠IgG为原液时，肉眼判定AFB1检测限值为10ng/mL，检测时间为10-15min；当样品中不含有AFB1或AFB1含量低于10ng/mL，所述检测线和质控线呈现红色条带，测试样品为阴性；当样品中AFB1含量超过10ng/mL，所述质控线呈现红色条带，测试样品为阳性。
本发明的检测原理：样品中的AFB1首先与胶体金颗粒表面的抗AFB1单克隆抗体反应，如果样品中AFB1含量超过限值，胶体金的抗体位点将不再有剩余，当胶体金颗粒经过检测线时，胶体金颗粒将不再停留在该线的所在位置，继续上行时与质控线上的羊抗鼠IgG反应，呈现出胶体金的红色条带；如果样品中不含有AFB1或AFB1含量低于限值，胶体金表面的抗体将于检测线上的化合物反应呈现出红色条带，质控线也呈现红色条带。
本发明具有如下优点：
1、本发明的胶体金免疫层析技术作为一种新型检测技术,无需借助仪器，具有操作简单快速，检测结果及时、准确等优点，适用于对AFB1进行现场检测；2、本发明检测手段易于制备、成本低，具有高度特异性和高敏感性，检测结果直接用颜色显示，肉眼判断直观可靠，在食品安全检测领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法
一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，包含以下步骤：
(1)抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化：将稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB/c小鼠腹腔，100个/只，接种5只，通过体内诱生获得20ml抗AFB1的腹水抗体，然后将腹水抗体通过5ml亲和层析柱纯化得10mg高纯度的抗AFB1单克隆抗体；
(2)胶体金免疫层析检测体系(GICA)的制备：取0.01wt％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸30min，迅速加入1wt％枸橼酸三钠水溶液2.5ml，继续煮沸约5min，出现橙红色；所得胶体金颗粒粒径为20nm；将20nm胶体金1ml与步骤(1)中15ug抗AFB1单克隆抗体混合均匀，得金标AFB1单克隆抗体作为分析探针；将作为检测线的10μg/mL AFB1-BSA偶联物和作为质控线的羊抗鼠IgG原液分别包被在硝酸纤维素膜上，建立AFB1的胶体金免疫层析检测体系(GICA)；
(3)大米样品溶液AFB1的检测：将大米样品溶液缓慢滴加于步骤(2)中分析探针上，观察检测线和质控线的颜色变化，当样品中AFB1浓度低于10ng/mL时，检测线和质控线均为红色；高于10ng/mL时，仅质控线为红色。
实施例2按照实施例1所述的检测方法检测30例不同批次的大米AFB1的阳性率
称取粉碎均质后的大米样品2.0g，置50ml离心管中，加入乙酸乙酯3ml，旋涡混合4min，在4000r/min下离心4min，精密量取上清液1ml，过0.2um滤膜即得大米样品溶液。
按照上述方法分别制备30例不同批次的大米样品溶液，分析探针中胶体金粒径为20nm，缓慢滴加于分析探针上，标记pH值为7.5，AFB1-BSA偶联物浓度为10μg/mL，羊抗鼠IgG为原液时，肉眼判定AFB1检测限值为10ng/mL，检测时间为10min；当样品中不含有AFB1或AFB1含量低于10ng/mL，所述检测线和质控线呈现红色条带，测试样品为阴性；当样品中AFB1含量超过10ng/mL，所述质控线呈现红色条带，测试样品为阳性；通过本发明的胶体金免疫层析检测方法检测这30例不同批次的大米AFB1含量，阳性率为2.9％，说明大米中AFB1合格率达97.1％。
实施例3一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法
一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，包含以下步骤：
(1)抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化：将稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB/c小鼠腹腔，110个/只，接种4只，通过体内诱生获得25ml抗AFB1的腹水抗体，然后将腹水抗体通过5ml亲和层析柱纯化得12.5mg高纯度的抗AFB1单克隆抗体；
(2)胶体金免疫层析检测体系(GICA)的制备：取0.01wt％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸30min，迅速加入1wt％枸橼酸三钠水溶液0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色；所得胶体金颗粒粒径为50nm；将50nm胶体金1ml与步骤(1)中15ug抗AFB1单克隆抗体混合均匀，得金标AFB1单克隆抗体作为分析探针；将作为检测线的10μg/mL AFB1-BSA偶联物和作为质控线的羊抗鼠IgG原液分别包被在硝酸纤维素膜上，建立AFB1的胶体金免疫层析检测体系(GICA)；
(3)大米样品溶液AFB1的检测：将大米样品溶液缓慢滴加于步骤(2)中分析探针上，观察检测线和质控线的颜色变化，当样品中AFB1浓度低于10ng/mL时，检测线和质控线均为红色；高于10ng/mL时，仅质控线为红色。
实施例4按照实施例3所述的检测方法检测检测50例不同批次的大米AFB1的阳性率
称取粉碎均质后的大米样品2.0g，置50ml离心管中，加入甲醇6ml，旋涡混合4min，在4000r/min下离心4min，精密量取上清液1ml，过0.2um滤膜即得大米样品溶液。
按照上述方法分别制备50例不同批次的大米样品溶液，分析探针中胶体金粒径为50nm，缓慢滴加于分析探针上，标记pH值为7.5，AFB1-BSA偶联物浓度为10μg/mL，羊抗鼠IgG为原液时，肉眼判定AFB1检测限值为10ng/mL，检测时间为15min；当样品中不含有AFB1或AFB1含量低于10ng/mL，所述检测线和质控线呈现红色条带，测试样品为阴性；当样品中AFB1含量超过10ng/mL，所述质控线呈现红色条带，测试样品为阳性；通过本发明的胶体金免疫层析检测方法检测这50例不同批次的大米AFB1含量，阳性率为3.2％，说明大米中AFB1合格率达96.8％。
实施例5一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法
一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，包含以下步骤：
(1)抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化：将稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB/c小鼠腹腔，100个/只，接种6只，通过体内诱生获得30ml抗AFB1的腹水抗体，然后将腹水抗体通过5ml亲和层析柱纯化得15mg高纯度的抗AFB1单克隆抗体；
(2)胶体金免疫层析检测体系(GICA)的制备：取0.01wt％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸30min，迅速加入1wt％枸橼酸三钠水溶液4ml，继续煮沸约5min，出现橙红色；所得胶体金颗粒粒径为15nm；将15nm胶体金1ml与步骤(1)中15ug抗AFB1单克隆抗体混合均匀，得金标AFB1单克隆抗体作为分析探针；将作为检测线的10μg/mL AFB1-BSA偶联物和作为质控线的羊抗鼠IgG原液分别包被在硝酸纤维素膜上，建立AFB1的胶体金免疫层析检测体系(GICA)；
(3)大米样品溶液AFB1的检测：将大米样品溶液缓慢滴加于步骤(2)中分析探针上，观察检测线和质控线的颜色变化，当样品中AFB1浓度低于10ng/mL时，检测线和质控线均为红色；高于10ng/mL时，仅质控线为红色。
实施例6按照实施例5所述的检测方法检测检测80例不同批次的大米AFB1的阳性率
称取粉碎均质后的大米样品2.0g，置50ml离心管中，加入乙腈5ml，旋涡混合4min，在4000r/min下离心4min，精密量取上清液1ml，过0.2um滤膜即得大米样品溶液。
按照上述方法分别制备80例不同批次的大米样品溶液，分析探针中胶体金粒径为15nm，缓慢滴加于分析探针上，标记pH值为7.5，AFB1-BSA偶联物浓度为10μg/mL，羊抗鼠IgG为原液时，肉眼判定AFB1检测限值为10ng/mL，检测时间为15min；当样品中不含有AFB1或AFB1含量低于10ng/mL，所述检测线和质控线呈现红色条带，测试样品为阴性；当样品中AFB1含量超过10ng/mL，所述质控线呈现红色条带，测试样品为阳性；通过本发明的胶体金免疫层析检测方法检测这80例不同批次的大米AFB1含量，阳性率为3.5％，说明大米中AFB1合格率达96.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(1)抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化：将稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB/c小鼠腹腔，通过体内诱生制备抗AFB1的腹水抗体，然后将所述腹水抗体采用亲和层析纯化得高纯度的抗AFB1单克隆抗体；
(2)胶体金免疫层析检测体系的制备：采用还原剂还原HAuCl4水溶液制备胶体金，将所述胶体金与所述步骤(1)中抗AFB1单克隆抗体混合均匀得金标AFB1单克隆抗体，作为分析探针；将作为检测线的AFB1-BSA偶联物和作为质控线的羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上，建立AFB1的胶体金免疫层析检测体系；
(3)大米样品溶液AFB1的检测：制备大米样品溶液，缓慢滴加于所述步骤(2)中分析探针上，依据检测条件，观察检测线和质控线的颜色变化，当样品中AFB1浓度低于限值时，检测线和质控线均为红色；高于限值时，仅质控线为红色。
2.根据权利要求1所述的一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述胶体金制备方法包括:取0.01wt％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸30min，迅速加入1wt％还原剂枸橼酸三钠水溶液0.75ml-4ml，继续煮沸约5min，出现橙红色；所述胶体金颗粒粒径为15nm-50nm。
3.根据权利要求1所述的一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述胶体金颗粒粒径为20nm-25nm。
4.根据权利要求1所述的一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述的金标AFB1单克隆抗体中所述抗AFB1单克隆抗体和所述胶体金的标记量为15μg：1mL。
5.根据权利要求1所述的一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述大米样品溶液的制备方法包括：称取粉碎均质后的大米样品2.0g，置50ml离心管中，加入洗脱剂3-6ml，旋涡混合4min，在4000r/min下离心4min，精密量取上清液1ml，过0.2um滤膜即得。
6.根据权利要求1所述的一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述洗脱剂包含甲醇、乙酸乙酯、乙腈中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种大米中黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析检测方法，其特征在于，所述检测条件包括：标记pH值为7.5，所述AFB1-BSA偶联物浓度为10μg/mL，所述羊抗鼠IgG为原液时，肉眼判定AFB1检测限值为10ng/mL，检测时间为10-15min；当样品中不含有AFB1或AFB1含量低于10ng/mL，所述检测线和质控线呈现红色条带，测试样品为阴性；当样品中AFB1含量超过10ng/mL，所述质控线呈现红色条带，测试样品为阳性。
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