CN102707047A - 快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡及其制备方法，试纸条封装于检测卡壳体中，检测卡壳体上开有加样孔和观测孔；所述试纸条包括底板，底板上依次设置有吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜及样品垫；玻璃纤维膜浸渍有胶体金标记的麦角生物碱抗体，所述硝酸纤维膜上喷涂有包被抗原麦角酸-OVA和羊抗兔抗体两条线。本发明检测卡，携带方便，操作简便，能够现场半定量检测原粮及其制品中麦角生物碱的含量，且检测准确率高、特异性强，使麦角生物碱的检测不再局限于专业机构的专业人员，各个禽畜养殖场、粮食收购站、各级检验检疫部门及消费者均可即时进行检验。

Description

快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡的制备方法。

背景技术

麦角是麦角菌在寄生植物的子房中形成的紫黑色、具有真菌结构的长角形菌核，形状像动物的角，故称麦角（ergot）。其宿主多为禾本科植物。世界范围内种植的小麦、玉米、大麦、水稻、谷子、燕麦、高粱、黑麦等均可被麦角菌侵染。麦角中毒是由于受麦角菌侵染谷物中的一系列有活性的生物碱引起的。麦角菌毒素的有毒成分主要是以麦角酸为基本结构的一系列生物碱衍生物，如麦角毒碱（ergotoxin）、麦角胺（ergotamine）、麦角新碱（ergonovine）、麦角生碱（ergosine）、麦角克碱（ergocristine）等。麦角碱是一类物质的总称，医学上常用来收缩子宫、促进产程、治疗偏头痛及高血压等。另一方面麦角也是谷类作物的重要病害，不但能引起谷物减产，而且当人们食用了混杂有较大量的麦角谷物或面粉所做的食品后，就可能发生麦角菌中毒。因此，对麦角的检测显得尤为重要。

目前，有关麦角的检测大都采用感官检验以及化学定性分析。但对于已经研磨或某种处理使得菌核难于或不能辨认的谷物，就必须进行麦角生物碱含量的测定。一般情况下，通过HPLC定量测定生物碱含量，该方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐、耗时长，不用适于对大批量样品的检测，且需要昂贵的仪器设备，检测成本高，而且要求操作人员具有一定的专业知识才能进行操作，因此应用范围受限；胶体金免疫层析检测技术是一种快速免疫诊断技术，利用胶体金作为标记物，短时间（10 min之内）便可得到直观的结果，它不须进行未反应结合物与已反应结合物的分离，省去了繁琐的加样、洗涤步骤，操作过程简便快速，特异性和灵敏度也较高，检测成本也较其他方法低，可以实现真正的一步法快速检测，非专业人士也能进行操作，符合现代分析检测技术发展的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够满足现场检测的需要，检测快速，携带方便，操作简单的快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡及其制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡，其特征是：包括试纸条，所述试纸条封装于检测卡壳体中，所述检测卡壳体上开有加样孔和观测孔；所述试纸条包括底板，底板上依次设置有吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜及样品垫；玻璃纤维膜浸渍有胶体金标记的麦角生物碱抗体，所述硝酸纤维膜上喷涂有包被抗原麦角酸-OVA和羊抗兔抗体两条线。

在硝酸纤维素膜的两端结合处，分别有吸水纸和玻璃纤维膜的一小段重叠压在硝酸纤维素膜上。

所述吸水纸的长度为30mm，所述硝酸纤维膜的长度为25mm，所述玻璃纤维膜的长度为0.5mm，所述样品垫的长度为15mm。

一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）以几种麦角生物碱的共有结构——麦角酸偶联钥孔嘁血蓝蛋白及麦角酸偶联卵清蛋白，分别制备人工免疫抗原和包被抗原；

（2）用上述免疫抗原免疫新西兰大白兔，制备抗麦角生物碱多克隆抗体；

（3）制备胶体金标记抗麦角生物碱特异性抗体探针；

（4）麦角生物碱胶体金检测卡的制备：将包被抗原及羊抗兔抗体分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，从而形成检测线和质控线；将玻璃纤维膜浸泡于胶体金标记的麦角生物碱抗体中，取出，干燥；组装麦角生物碱胶体金免疫试纸，该试纸条自下至上依次包括：样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸四部分，最后将试纸条封装于检测卡壳体中，检测卡壳体上开有加样孔和观测孔。

本发明中快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡，携带方便，操作简便，能够现场半定量检测原粮及其制品中麦角生物碱的含量，且检测准确率高、特异性强，使麦角生物碱的检测不再局限于专业机构的专业人员，各个禽畜养殖场、粮食收购站、各级检验检疫部门及消费者均可即时进行检验。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是本发明检测卡检测结果示意图；

图2为试纸条的结构示意图；

图3为图2的侧视图。

具体实施方式

见图1、图2，一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡，其包括检测卡壳体1和试纸条2，试纸条2封装于检测卡壳体1中，检测卡壳体1上开有加样孔3和观测孔4，试纸条2包括底板5，试纸条2的底板5上依次粘贴有吸水纸6、硝酸纤维素膜7、玻璃纤维膜8、样品垫9，吸水纸6和玻璃纤维膜8分别粘贴在硝酸纤维素膜7两侧，在硝酸纤维素膜7的两端结合处，吸水纸6和玻璃纤维膜8的一小段重叠压在硝酸纤维素膜7上，样品垫9粘贴在玻璃纤维膜8的另一侧，样品垫9的一小段重叠在玻璃纤维膜8上；玻璃纤维膜8上喷涂有金标抗麦角生物碱多克隆抗体；硝酸纤维素膜7上依次喷涂有材质为麦角酸-OVA的检测线10、材质为羊抗兔抗体的质控线11。

实施例1：完全抗原的制备

麦角酸-钥孔嘁血蓝蛋白（麦角酸- KLH）及麦角酸-卵清蛋白（麦角酸- OVA）的制备：①75~85 mg麦角酸溶于10 mL 热的二氧六环，然后加入到100~120 mg碳二亚胺（EDC）水溶液 （5 mL）中。②20~40mg钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）或卵清蛋白（OVA）溶于10 mL PBS，逐滴加入上一步制成的混合液中。③室温搅拌10小时后，4℃过夜保存。再用PBS透析2天，分别得到麦角酸-钥孔嘁血蓝蛋白（麦角酸- KLH）及麦角酸-卵清蛋白（麦角酸- OVA），冷冻干燥后-20℃保存备用。

实施例2：抗麦角生物碱多克隆抗体的制备及纯化

用实施例1中所获得的免疫抗原（麦角酸- KLH）免疫三只健康雄性新西兰大白兔。免疫前一周从兔耳缘静脉采血作为阴性对照。称取1mg麦角酸-KLH，用2mL 0.1mol/L的PBS（经高压灭菌）溶解，然后取1mL溶解的抗原与1mL完全弗氏佐剂充分混合，乳化完全后在新西兰大白兔背部进行多点皮下注射。1个月后进行第1次加强免疫，采用四肢内部肌肉注射，剂量与首次免疫相同，与等量不完全弗氏佐剂混合充分乳化。共免疫5次，每次间隔2周。每次加强免疫前从兔耳缘静脉采血，采用间接ELISA法测定抗血清效价。效价合格后，采用兔颈动脉放血，分离抗血清，并采用Protein A亲和纯化多克隆抗体，冷冻干燥后于-20℃保存备用。

实施例3：胶体金溶液的制备

用新制双蒸水配制100 mL 0.01%氯金酸溶液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸（110℃左右），在100 r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在37℃保温的1%柠檬酸三钠溶液4.5 mL，保持温度和转速不变，继续搅拌加热15 min左右，直至溶液呈现清亮的酒红色；室温冷却，4℃冰箱保存备用。

实施例4：胶体金标记抗麦角生物碱多克隆抗体探针的制备

取30 mL胶体金溶液加于50 mL离心管中，用0.1 M K₂CO₃或0.1 M HCl调节pH至7.5左右，用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入3 mL含250μg抗体蛋白的蛋白溶液，继续振荡20 min左右；逐滴加入1.5 mL 1%BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于4℃，9000 rpm，离心45 min；离心后取出离心管，将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉淀小心吸至1.5 mL离心管中，4℃保存备用。

实施例5：硝酸纤维素膜的处理

用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上，麦角酸-OVA作为检测线，羊抗兔抗体作为质控线，置37℃真空干燥后备用。

实施例6：玻璃纤维膜的处理

将玻璃纤维膜浸泡于胶体金标记抗麦角生物碱多克隆抗体中，取出，置37℃真空干燥后备用。

实施例7：胶体金测试卡的组装

取制作试纸条专用的底板，先将干燥好的硝酸纤维素膜粘贴在相应位置，再将吸水纸和干燥好的玻璃纤维膜粘贴在相应位置并稍微压住硝酸纤维素膜，最后将样品垫粘好并压住玻璃纤维膜，用切条机切割成3 mm宽的试纸条装入检测卡中，此时，样品垫的位置正对检测卡的加样孔、硝酸纤维素膜位置正对检测卡的观测孔，与干燥剂一起装入铝箔袋中，密封包装。

实施例7：麦角生物碱胶体金测试卡的使用

对样品进行检测时，将检测卡平放，取100 μL样夜滴入加样孔3，在15 min内观察结果。羊抗兔抗体和麦角酸-OVA分别喷涂在硝酸纤维素膜的质控线11（C）和检测线10（T），含麦角生物碱的待侧样品经样品垫9根据层析原理向另一端移动，并先后经过质控线11和检测线10，固化在玻璃纤维膜8上的胶体金标记抗麦角生物碱多克隆抗体与样品中的麦角生物碱起特异性反应，并竞争抑制其与检测线10上的包被抗原结合，因此，当样品中不含麦角生物碱或其含量低于某一限值时，玻璃纤维膜8上的胶体金标记抗麦角生物碱多克隆抗体与检测线10上的麦角酸-OVA反应呈现红色条带，质控线也呈现红色条带。反之，当样品中的麦角生物碱含量超过某一限值时，则玻璃纤维膜8上的胶体金标记麦角碱多克隆抗体位点结合完全，当胶体金颗粒层析经过检测线10（含麦角酸-OVA）时，将不会停留，继续层析上行，与质控线11上喷涂的羊抗兔抗体反应，呈现出胶体金的红色条带。如试纸条上仅检测线10上出现一条红色条带则判定为阳性；如检测线10和质控线11均出现两条红色条带则为阴性；若质控线11不出现红色条带，无论检测线10是否出现，测试结果均无效。

Claims (4)

1.一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡，其特征是：包括试纸条，所述试纸条封装于检测卡壳体中，所述检测卡壳体上开有加样孔和观测孔；所述试纸条包括底板，底板上依次设置有吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜及样品垫；玻璃纤维膜浸渍有胶体金标记的麦角生物碱抗体，所述硝酸纤维膜上喷涂有包被抗原麦角酸-OVA和羊抗兔抗体两条线。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡，其特征是：在硝酸纤维素膜的两端结合处，分别有吸水纸和玻璃纤维膜的一小段重叠压在硝酸纤维素膜上。

3. 根据权利要求1或2所述的一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡，其特征是：所述吸水纸的长度为30mm，所述硝酸纤维膜的长度为25mm，所述玻璃纤维膜的长度为0.5mm，所述样品垫的长度为15mm。

4. 一种快速检测麦角生物碱的胶体金检测卡的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）以几种麦角生物碱的共有结构——麦角酸偶联钥孔嘁血蓝蛋白及麦角酸偶联卵清蛋白，分别制备人工免疫抗原和包被抗原；

（2）用上述免疫抗原免疫新西兰大白兔，制备抗麦角生物碱多克隆抗体；

（3）制备胶体金标记抗麦角生物碱特异性抗体探针；

（4）麦角生物碱胶体金检测卡的制备：将包被抗原及羊抗兔抗体分别均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，从而形成检测线和质控线；将玻璃纤维膜浸泡于胶体金标记的麦角生物碱抗体中，取出，干燥；组装麦角生物碱胶体金免疫试纸，该试纸条自下至上依次包括：样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸四部分，最后将试纸条封装于检测卡壳体中，检测卡壳体上开有加样孔和观测孔。

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