CN103941009B - 用于牛羊早期妊娠诊断的isg15胶体金试纸条及其制作方法 - Google Patents

用于牛羊早期妊娠诊断的isg15胶体金试纸条及其制作方法 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条，由含有金标ISG15抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜样品垫和吸水垫组成，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜样品垫和吸水垫粘贴在PVC底板上，玻璃纤维膜样品垫和含有金标ISG15抗体的金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接，硝酸纤维素膜与吸水垫尾首相接；在硝酸纤维素膜上有ISG15抗体检测线和羊抗鼠二抗对照线，ISG15抗体检测线靠近含有金标ISG15抗体的金标垫一侧。本发明具有操作简单、检测时间短、结果清晰、可通过肉眼判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、无污染且携带方便等优点。

Description

用于牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条及其制作方法
技术领域
本发明涉及一种用于牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条及其制作方法。
背景技术
提高牛羊的繁殖率，尽量缩短空怀期是牛羊饲养管理的目标之一。因此牛羊早期妊娠诊断是促进牛羊发展的重要措施。简便而有效的牛羊早期妊娠诊断方法，是牛羊生产者及畜牧工作者长期以来急待解决的问题。因为牛羊早期妊娠诊断是改善牛羊饲养管理，提高繁殖率的一项重要措施。如果牛羊配种后不能及时诊断是否妊娠，就可导致产犊（羔）间隔延长、繁殖率降低，饲养管理成本增高，大大影响经济效益。目前我国牛羊的第一情期受孕率仅40-60%，多数牛羊需配种（或人工授精）2-3次才能受孕，以延误1-2个发情周期计算，就相当于每头/只繁殖牛羊多饲养20-40多天，增加了饲养成本。可见，牛羊早期妊娠诊断技术的研究，对缩短空怀期，提高繁殖率，进一步促进牛羊业的发展具有重要的经济意义。
目前在牛羊早期妊娠诊断中常用的几种方法有：直肠诊断法（牛），超声波诊断法（牛羊），孕酮的放射免疫法（牛羊）、孕酮的酶标免疫法（牛羊）和外部观察法（牛羊）。其中直肠诊断法要求操作者必须具有一定的临床经验，较为费时费力，有时还会引起疾病传染或流产，而且40多天以后才能检测出怀孕的征象，做出正确的诊断。超声波诊断法由于仪器昂贵和需专业技术人员操作，使其广泛应用受限，而且需要胎儿较大时，才能检测出来，不适合早期妊娠诊断。牛羊的外部观察法进行妊娠早期诊断极不准确，资料报道，羊在妊娠后，有30%会出现发情表现。孕酮的放射免疫法（牛羊）和孕酮的酶标免疫法（牛羊），可以直接检测牛羊血液或奶中的孕酮含量，但是需要在牛羊发情周期的发情期进行检测，由于牛羊发情周期不同（朱士恩，家畜繁殖学，2009），黄牛和奶牛平均21天（18-24），绵羊平均16-17天（14-19），山羊平均20天（18-22）。并且不同牛羊个体之间发情周期还存在差异。另外，由于持久黄体和黄体囊肿也会持续分泌孕酮。这样检测孕酮含量并不能非常准确确定牛羊妊娠与否。
因此，研究一种使用简便的用于牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条及其制作方法，是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供一种用于牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条及该用于牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制作方法。
本发明解决其技术问题的技术方案是：
用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条，由含有金标ISG15抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜样品垫和吸水垫组成，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜样品垫和吸水垫粘贴在PVC底板上，玻璃纤维膜样品垫和含有金标ISG15抗体的金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接，硝酸纤维素膜与吸水垫尾首相接；在硝酸纤维素膜上有ISG15抗体检测线和羊抗鼠二抗对照线，ISG15抗体检测线靠近含有金标ISG15抗体的金标垫一侧。
作为本发明的一种优选方案，羊抗鼠二抗对照线距吸水垫近端0.3-0.6cm，ISG15抗体检测线与吸水垫近端相距0.8-1.3cm。
作为本发明的一种优选方案，羊抗鼠二抗对照线的羊抗鼠二抗的喷涂浓度为0.2-2mg/mL，ISG15抗体检测线的ISG15抗体的喷涂浓度为5-10μg/mL。
作为本发明的一种优选方案，试纸条大小为6-8cm×0.3-0.6cm，吸水垫长1.8-2.2cm、样品垫长1.8-2.2cm、含有金标ISG15抗体复合物的金标垫长0.6-1.0cm、硝酸纤维素膜长2-3cm；硝酸纤维素膜贴在底板上，硝酸纤维素膜与底板吸水端边缘相距1.3-1.8cm；吸水垫与硝酸纤维素膜（3）交叠贴于底板吸水端，样品垫、含有金标ISG15抗体复合物的金标垫与硝酸纤维素膜由上而下依次交叠，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫位于样品垫和硝酸纤维素膜之间，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫与硝酸纤维素膜的交叠长度为0.8-1.0mm。
用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法，具体制备步骤如下：
第一步，制备胶体金：将0.01%HAuCl4水溶液100mL加热至沸腾，加入1%枸橼酸三钠水溶液1mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小40nm；
第二步，制备纯化ISG15单克隆抗体：重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠；骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合；采用阳性杂交瘤细胞制备腹水；ISG15单克隆抗体的提纯；
第二步的具体操作为：
1.动物免疫：重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠，采用四次免疫的方法，第一次采用弗氏完全佐剂（FCA）0.2mL+0.2mg重组牛ISG15，第二次采用弗氏不完全佐剂(FIA)0.2mL+0.2mg重组牛ISG15，第三次采用FIA0.2mL+0.2mg重组牛ISG15，第四次单独采用重组牛ISG15，剂量加倍腹腔注射。
2.骨髓瘤细胞SP2/0的准备和细胞融合：细胞融合前一周复苏冻存于液氮中的SP2/0，在含20%胎牛血清和1%HT的DMEM培养基中培养。准备好的骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合。
3.阳性杂交瘤细胞的筛选与腹水单克隆抗体的制备：采用间接ELISA方法对生长的杂交瘤细胞进行筛选，用6μg/mL的重组牛ISG15进行包被。对检测为阳性的细胞采用有限稀释法进行2次亚克隆，取形态良好、生长旺盛的单克隆细胞进行扩大培养，用于制备腹水。
4.单克隆抗体的鉴定：用重组牛ISG15对制备的腹水单克隆抗体（1﹕10000稀释）进行免疫印迹分析，进行DAB显色和化学发光显色。同时进行ISG15在绵羊组织中的免疫印迹分析和免疫组织化学检测，进一步对单克隆抗体进行鉴定。
第三步，制备金标抗体：将抗体溶液去盐，胶体金pH值在9-9.5之间时与抗体吸附，采用离心法纯化；
第三步的具体操作为：
1.取0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1mL，同时不断搅拌，待金黄色的HAuCl4水溶液在2min内变为红色，中速搅拌，煮沸5min，直至颜色稳定不变，冷却后用超纯水恢复到原体积，加入0.02％的Na2N3，经0.22μm滤膜过滤除菌，装入洁净的经硅化的棕色瓶中4℃保存。
2.取所需量抗体在磁力搅拌下与胶体金溶液混合，缓慢逐滴加ISG15单克隆抗体，lmg的抗体大约5min加完，标记30min；缓慢滴加5%BSA至终浓度为1%，作为稳定剂，制备金标抗体。抗体的最终浓度为1-10μg/mL。把抗体标记的胶体金液，吸附在纤维材料上，干燥后备用。
第四步，胶体金试纸条的制备：将金标抗体灌注在已处理好的硝酸纤维素膜上，干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将ISG15抗体和羊抗鼠二抗喷成2条线，分别为检测线和对照线，再真空干燥；将样品垫、金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上，吸水垫贴在硝酸纤维素膜的另一侧，组装制成检测ISG15胶体金试纸条。
第四步中的硝酸纤维素膜制备，使用制膜机制膜：采用硝酸纤维素膜制作免疫层析试纸，检测线应用ISG15抗体制作，硝酸纤维素膜对照线由羊抗鼠二抗制成。
样品垫由三层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、第三层为一定规格无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后备用。
作为用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法的优选方案，制备胶体金时，用微波炉加热0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，一次性加入1%的枸橼酸三钠水溶液1mL。
作为用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法的优选方案，制备ISG15单克隆抗体时，采用重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠，骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合方法获得ISG15单克隆抗体，纯化后抗体浓度为1-3mg/mL。
本发明的原理：
干扰素-tau是反刍动物胚胎向母体发出的最初妊娠信号，它是在胚胎附植前，由囊胚滋养层产生的一种Ⅰ型干扰素，牛干扰素-tau的mRNA表达高峰出现在妊娠后第17天，在胚胎滋养层表达消失的时间是第25天（Roberts等，2008）。在绵羊上，干扰素-taumRNA的表达高峰出现在妊娠后第16天（Godkin等，1982），表达消失的时间是第20天。在妊娠早期，来源于孕体的干扰素-tau，可诱导牛羊子宫内膜表达ISG15。近期研究发现，在牛羊妊娠早期，其它组织也表达ISG15。Oliveira等（2008）报道，在妊娠早期，来源于孕体的干扰素-tau，可诱导绵羊外周血液细胞和黄体表达ISG15。我们前期的研究也表明（Yang等，2010），在牛妊娠早期，黄体的ISG15蛋白也上调表达，这是由于牛外周血液细胞表达ISG15引起的。
妊娠早期牛羊外周血液细胞表达ISG15也是一个非常重要的妊娠指标。由于牛羊在受到来自早期胎儿分泌的干扰素-tau的刺激后，外周血液细胞会表达ISG15。因此，检测外周血液细胞ISG15表达与否，可以十分准确地获悉妊娠与否。采集20-25天的牛羊外周血液，检测血细胞ISG15的表达情况，对牛羊早孕诊断是切实可行的。
本发明的使用方法：牛羊孕情检测。取母牛或母羊外周血液5mL作为待测样本，经过离心处理，获得外周血液单个核细胞，采用细胞裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白样品，使用样品垫直接蘸取或加样至样品垫，5min后，观察结果。
结果判断：利用双抗夹心法制成的检测试纸的检测线和对照线显示为彩带，即显色区为两条线时为阳性，即妊娠；只有一条对照线显色时为阴性，即未妊娠。如果对照线也不显色，即检测试纸失效。
与现有技术相比，使用本发明检测牛羊早期妊娠，具有操作简单、检测时间短、结果清晰、可通过肉眼判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、无污染且携带方便等优点。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
具体实施方式
用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条，由含有金标ISG15抗体复合物的金标垫6、硝酸纤维素膜3、玻璃纤维膜样品垫8和吸水垫4组成，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫6、硝酸纤维素膜3、玻璃纤维膜样品垫8和吸水垫4粘贴在PVC底板1上，玻璃纤维膜样品垫8和含有金标ISG15抗体的金标垫6与硝酸纤维素膜3首尾相接，硝酸纤维素膜3与吸水垫4尾首相接；在硝酸纤维素膜3上有ISG15抗体检测线2和羊抗鼠二抗对照线5，ISG15抗体检测线2靠近含有金标ISG15抗体的金标垫一侧。
羊抗鼠二抗对照线5距吸水垫近端0.3-0.6cm，ISG15抗体检测线2与吸水垫近端相距0.8-1.3cm。
3.按照权利要求1或2所述的用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条，其特征是，羊抗鼠二抗对照线5的羊抗鼠二抗的喷涂浓度为0.2-2mg/mL，ISG15抗体检测线2的ISG15抗体的喷涂浓度为5-10μg/mL。
试纸条大小为6-8cm×0.3-0.6cm，吸水垫4长1.8-2.2cm、样品垫8长1.8-2.2cm、含有金标ISG15抗体复合物的金标垫6长0.6-1.0cm、硝酸纤维素膜长2-3cm；硝酸纤维素膜3贴在底板上，硝酸纤维素膜3与底板吸水端边缘相距1.3-1.8cm；吸水垫4与硝酸纤维素膜3交叠贴于底板吸水端，样品垫8、含有金标ISG15抗体复合物的金标垫6与硝酸纤维素膜3由上而下依次交叠，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫6位于样品垫8和硝酸纤维素膜3之间，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫6与硝酸纤维素膜3的交叠长度为0.8-1.0mm。
用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法，具体制备步骤如下：
第一步，制备胶体金：将0.01%HAuCl4水溶液100mL加热至沸腾，加入1%枸橼酸三钠水溶液1mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小40nm；
第二步，制备纯化ISG15单克隆抗体：重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠；骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合；采用阳性杂交瘤细胞制备腹水；ISG15单克隆抗体的提纯；
第三步，制备金标抗体：将抗体溶液去盐，胶体金pH值在9-9.5之间时与抗体吸附，采用离心法纯化；
第四步，胶体金试纸条的制备：将金标抗体灌注在已处理好的硝酸纤维素膜上，干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将ISG15抗体和羊抗鼠二抗喷成2条线，分别为检测线和对照线，再真空干燥；将样品垫、金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上，吸水垫贴在硝酸纤维素膜的另一侧，组装制成检测ISG15胶体金试纸条。
制备胶体金时，用微波炉加热0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，一次性加入1%的枸橼酸三钠水溶液1mL。
制备ISG15单克隆抗体时，采用重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠，骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合方法获得ISG15单克隆抗体，纯化后抗体浓度为1-3mg/mL。

Claims (4)

1.用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条，由含有金标ISG15抗体复合物的金标垫（6）、硝酸纤维素膜（3）、玻璃纤维膜样品垫（8）和吸水垫（4）组成，其特征是，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫（6）、硝酸纤维素膜（3）、玻璃纤维膜样品垫（8）和吸水垫（4）粘贴在PVC底板（1）上，玻璃纤维膜样品垫（8）和含有金标ISG15抗体的金标垫（6）与硝酸纤维素膜（3）首尾相接，硝酸纤维素膜（3）与吸水垫（4）尾首相接；在硝酸纤维素膜（3）上有ISG15抗体检测线（2）和羊抗鼠二抗对照线（5），ISG15抗体检测线（2）靠近含有金标ISG15抗体的金标垫一侧；羊抗鼠二抗对照线（5）距吸水垫近端0.3-0.6cm，ISG15抗体检测线（2）与吸水垫近端相距0.8-1.3cm；羊抗鼠二抗对照线（5）的羊抗鼠二抗的喷涂浓度为0.2-2mg/mL，ISG15抗体检测线（2）的ISG15抗体的喷涂浓度为5-10μg/mL；试纸条大小为6-8cm×0.3-0.6cm，吸水垫（4）长1.8-2.2cm、样品垫（8）长1.8-2.2cm、含有金标ISG15抗体复合物的金标垫（6）长0.6-1.0cm、硝酸纤维素膜长（3）2-3cm；硝酸纤维素膜（3）贴在底板上，硝酸纤维素膜（3）与底板吸水端边缘相距1.3-1.8cm；吸水垫（4）与硝酸纤维素膜（3）交叠贴于底板吸水端，样品垫（8）、含有金标ISG15抗体复合物的金标垫（6）与硝酸纤维素膜（3）由上而下依次交叠，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫（6）位于样品垫（8）和硝酸纤维素膜（3）之间，含有金标ISG15抗体复合物的金标垫（6）与硝酸纤维素膜（3）的交叠长度为0.8-1.0mm。
2.用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法，其具体制备步骤如下：
第一步，制备胶体金：将0.01%HAuCl4水溶液100mL加热至沸腾，加入1%枸橼酸三钠水溶液1mL，加热至透明红色，制得胶体金颗粒大小40nm；
第二步，制备纯化ISG15单克隆抗体：重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠；骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合；采用阳性杂交瘤细胞制备腹水；ISG15单克隆抗体的提纯；
第三步，制备金标抗体：将抗体溶液去盐，胶体金pH值在9-9.5之间时与抗体吸附，采用离心法纯化；
第四步，胶体金试纸条的制备：将金标抗体灌注在已处理好的硝酸纤维素膜上，干燥；在硝酸纤维膜上用点膜机将ISG15抗体和羊抗鼠二抗喷成2条线，分别为检测线和对照线，再真空干燥；将样品垫、金标垫与硝酸纤维素膜首尾相接粘贴在底板上，吸水垫贴在硝酸纤维素膜的另一侧，组装制成检测ISG15胶体金试纸条。
3.按照权利要求2所述的用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法，其特征是：制备胶体金时，用微波炉加热0.01％的HAuCl4溶液100mL，加热至沸腾，一次性加入1%的枸橼酸三钠水溶液1mL。
4.按照权利要求2所述的用于检测牛羊早期妊娠诊断的ISG15胶体金试纸条的制备方法，其特征是：制备ISG15单克隆抗体时，采用重组牛ISG15免疫Balb/c小鼠，骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞进行融合方法获得ISG15单克隆抗体，纯化后抗体浓度为1-3mg/mL。
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