CN111596075B - 一种检测牛早期妊娠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测牛早期妊娠的方法，包括：在母牛配种后的第7‑‑14天，收集母牛的晨尿或者上一次小便后1‑2小时再小便的尿液；将牛的HCG检测试纸插入尿液中5‑10秒，试纸质控线C未显色、检测线T显色，检测结果无效；质控线C显色，检测线T未显色，母牛的HCG水平低下；质控线C及检测线T都显色，与HCG比色卡进行对比；HCG＜10mIU/ml,母牛未怀孕；HCG≧10mIU/ml,母牛可能怀孕，需要连续测试两次；两次检测的HCG上升，且后一次是前一次的1‑2倍，母牛怀孕，且为活胎；两次检测的HCG维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊娠。

Description

一种检测牛早期妊娠的方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种检测牛早期妊娠的方法，属于动物检测方法技术领域。

背景技术

目前，牛的妊娠检测主要有外部观察法和试情法，以及超声波检测法，免疫学检测法、红细胞凝集实验、血清酸滴定法等。外部观察法和试情法通常是以母牛配种后17-21天，观察母牛是否返情来检测是否妊娠，但牛胚胎停止发育，母牛在短时间内也不会返情，会处在假妊娠状态。超声波诊断法是利用超声波的物理特性，把超声波的物理特性和动物组织结构的声学特点密切结合的一种物理学检测，该方法需要在母牛配种40天后才能测出牛是否妊娠，60天后准确率才能达到100%。免疫学诊断法即利用妊娠前后母牛血清孕酮激素物质进行检测，根据其含量来判断母牛是否妊娠。但由于这些激素在妊娠和未妊娠母牛血清中，因品种、个体差异等因素的影响，目前还很难在生产中推广。红细胞凝集实验即将妊娠早期母牛体内特异性抗原与红细胞相结合，用其制备抗血清，与妊娠10---15天的母牛红细胞混合时会发生红细胞凝集现象，如未妊娠，则不发生红细胞凝集现象，此法对母牛妊娠28---60天的准确率为90%，但母牛胚胎停止发育后也会发生红细胞凝集现象，易导致母牛长期处于假妊娠状态。血清酸滴定法即母牛在胚胎快速生长过程中，机体生产出一种特有的免疫球蛋白，在酸性环境中与其它蛋白质形成低溶性复合物（絮状物）的特性，准确率可达90.81%，但母羊胚胎停止发育后也会发生与其它蛋白质形成低溶性复合物（絮状物）的特性，也易导致母牛长期处于假妊娠状态，操作过程繁琐，并且需要在18--25度的室温环境下才能进行，不利于现场检测。

发明内容

鉴于上述牛的生理特征，本发明提供一种检测牛早期妊娠的方法，以确定母牛是否妊娠以及胚胎是否存活，减少母牛空怀孕所造成的经济损失，缩短母牛的非繁殖天数，同时及时对妊娠母牛进行合理的饲养和管理，提高繁殖效率，促进母牛的集约化管理，提高牛的生产效益。

本发明通过下列技术方案完成：一种检测牛早期妊娠的方法，其特征在于包括下列步骤：

1）在母牛配种后的第7---14天，收集母牛的晨尿或者上一次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；

2）将牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；

试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，需要隔日进行检测；

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡进行下列对比；

31）当促绒毛膜性腺激素HCG＜10mIU/ml, 表明母牛未怀孕；

32）当当促绒毛膜性腺激素HCG≧10mIU/ml, 表明母牛可能怀孕，需要连续测试两次，每隔一天测试一次；

33）当步骤32）的两次检测试结果的促绒毛膜性腺激素HCG上升，且后一次的促绒毛膜性腺激素HCG是前一次的1-2倍，表明母牛怀孕，且为活胎；

34）当步骤32）的两次检测结果的HCG维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊娠。

所述步骤2）牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸经过下列方法制备：

21）按下列制备各组分：

金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；

封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；

样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；

胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；

HCG包被液：将100-200mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCGmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG包被液；

IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01MPBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；

22）在底板上划膜

22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；

22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将HCG包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；

23）金垫制备

23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；

23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm²玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；

24）样本垫制备

24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；

25）贴板

25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；

25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；

25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；

26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸。

本发明具有下列优点及效果：采用上述方案，可在母牛配种后的第7---14天，取尿样，对牛的早期妊娠进行简单、方便、快速、准确的检测，比现有技术更早地知道牛是否妊娠以及胚胎是否存活，弥补了现有技术仅能判断牛是否妊娠，却不能反应牛胚胎是否存活，进而带来假妊娠、空怀胎所造成的经济损失，以便尽快消除假妊娠、空怀胎，让母牛尽早恢复正常，缩短母牛的非繁殖天数，同时对正常的妊娠母牛进行对应的饲养和管理，一方面提高牛的繁殖效率，另一方面减少种牛哺乳之后的死亡率，促进牛的集约化管理，提高羊的养殖效益。

附图说明

图1为HCG检测试纸条的结构示意图；

图2为HCG比色卡图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸经过下列方法制备：

1）按下列制备各组分：

11）金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；

12）封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；

13）样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；

14）胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；

15）HCG包被液：将200mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCGmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG包被液；

16）IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；

上述各组分的量是用于5块6cm×30cm的PVC板，每块PVC板切为100条6cm× 3mm的试纸条；

2）在底板上划膜

2A）将NC膜贴分别贴在5块PVC板上表面的中部，得底板；

2B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将步骤16）的IgG包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将步骤15）的HCG包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；

3）金垫制备

3A）在100ml步骤11）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul步骤12）的封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 步骤14）的胶体金结合物稀释液混匀，得45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液；

3B）将步骤3A）的45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液均匀铺在5块玻璃纤维素膜RB65上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为6mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；

4）样本垫制备

4A）按30ml/张的量，将步骤13）的样本垫处理液均匀铺在5块玻璃纤维素膜SB06上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为20mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；

25）每一块贴板的制备

25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；

25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；

25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；

26）将步骤5C）的每一块贴板切割成100条6cm×3mm的试纸条，装盒，共得500条促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸，每一条促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸的结构如图1。

实施例2

检测牛早期妊娠的方法，包括下列步骤：

1）在母牛配种后的第8天，收集母牛的晨尿5ml；

2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中6秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效；

第二天重复步骤1）、2），观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色，显色结果如下：

试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，该母牛没有怀孕，等待下一个发情期再配种。

实施例3

检测牛早期妊娠的方法，包括下列步骤：

1）在母羊配种后的第7天，收集母上一次小便后2小时再小便的尿液10ml；

2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中9秒，取出，于17分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，于第三日重复步骤1）、2）进行检测，结果显示：试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

促绒毛膜性腺激素HCG＜10mIU/ml,表明母牛没有怀孕，等待下一个发情期再配种。

实施例4

检测羊早期妊娠的方法，包括下列步骤：

1）在母牛配种后的第12天，收集母牛的晨尿5ml；

2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的血清中10秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）促绒毛膜性腺激素HCG=10mIU/ml, 表明母牛可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；

32）步骤31）的两次检测结果的HCG在上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的1-2倍，表明母牛怀孕，且为活胎，即按常规对母牛进行妊娠饲养，直至产小牛。

实施例5

检测牛早期妊娠的方法，包括下列步骤：

1）在母羊配种后的第14天，收集母牛在上次小便后2小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）促绒毛膜性腺激素HCG大于10mIU/ml, 表明母牛可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；

32）步骤31）的两次检测结果的HCG不变，表明母牛怀孕，但胚胎停育，按常规采取保胎措施，之后恢复妊娠，并按常规对母牛进行妊娠饲养，直至产小牛。

实施例6

检测牛早期妊娠的方法，包括下列步骤：

1）在母牛配种后的第10天，收集母羊在上次小便后1小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中8秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）促绒毛膜性腺激素HCG大于10mIU/ml, 表明母牛可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；

32）步骤31）的两次检测结果的HCG下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，按常规采取措施终止妊娠。

实施例7

检测牛早期妊娠的方法，包括下列步骤：

1）在母牛配种后的第9天，收集母羊在上次小便后1.5小时再小便的尿液3ml；

2）将一条实施例1的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）促绒毛膜性腺激素HCG大于10mIU/ml, 表明母牛可能怀孕，需要连续检测两次，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测；

32）步骤31）的两次检测结果的HCG上升，且后一次的HCG是前一次的HCG的2倍，表明母牛怀孕，且为活胎，按常规对母牛进行妊娠饲养，直至产小牛。

上述HCG比色卡为常规产品。

下面通过对比实验证明本发明的效果：

采用实施例4-7的方法，分别对120头母牛进行检测，其中将120头牛分为四组，每组30头，分别用与实施例4-7相同的方法进行检测，检测结果如下：

第一组有26头怀孕，且为活胎，4头没有怀孕；第二组有22头怀孕，有18头活胎受孕，4头胚胎停育，8头没有怀孕；第三组有25头怀孕，有20头活胎，5头胚胎停育，5头没有怀孕；第四组有27头怀孕，有25头活胎，2头胚胎停育，3头没有怀孕。准确率为100%。

Claims (1)

1.一种检测牛早期妊娠的方法，其特征在于包括下列步骤：

1）在母牛配种后的第7-14天，收集母牛的晨尿或者上一次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；

2）将牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸插入步骤1）的尿液中5-10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；

试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母牛的促绒毛膜性腺激素HCG水平低下，需要隔日进行检测；

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡进行下列对比；

31）当促绒毛膜性腺激素HCG＜10mIU/ml, 表明母牛未怀孕；

32）当促绒毛膜性腺激素HCG≧10mIU/ml, 表明母牛可能怀孕，需要连续测试两次，每隔一天测试一次；

33）当步骤32）的两次检测试结果的促绒毛膜性腺激素HCG上升，且后一次的促绒毛膜性腺激素HCG是前一次的1-2倍，表明母牛怀孕，且为活胎；

34）当步骤32）的两次检测结果的HCG维持不变或下降，表明母牛怀孕，但胚胎停育，及时采取保胎措施或停止妊娠；

所述步骤2）牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸经过下列方法制备：

21）按下列制备各组分：

金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；

封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；

样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；

胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；

HCG包被液：将100-200mg牛的促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCGmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG包被液；

IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；

22）在底板上划膜

22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；

22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将HCG包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；

23）金垫制备

23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；

23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm²玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；

24）样本垫制备

24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；

25）贴板

25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；

25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；

25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；

26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得牛的促绒毛膜性腺激素HCG检测试纸。

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