CN117233406A - 一种检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括：在母羊配种前72小时、48小时、24小时或当日，采集羊血、分离出血清；将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入血清中，试纸质控线C未显色、检测线T1或T2显色，检测无效；质控线C显色，检测线T1、T2未显色，要隔日检测；质控线C及检测线T1、T2都显色，表明母羊有卵泡，可适时配种，有效避免母羊空怀期，同时优选出高繁殖力的母羊群体，提升母羊产羔效率，显著提升后代多胎基因母羊群体数量，为增加养殖效益提供可靠的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，属于动物繁育技术领域。
背景技术
对非季节性发情母绵羊而言，虽一个情期有四次卵泡波峰，每次卵泡波峰的出现都有成熟卵母细胞排出，具有很强的繁殖性能。但受现有繁殖方法如：自然排卵交配、药物诱发排卵交配、同期发情定时输精、胚胎移植等限制，普遍存在空怀羊多、母羊群体产羔间隔长、繁殖率低下、成本高等问题，致使绵羊养殖场亏损严重。因此有必要对现有技术加以改进。
发明内容
本发明旨在提供一种检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，以便及时输精配种，避免母羊空怀，缩短母羊的产羔间隔，提高母羊的繁殖率，降低养殖成本，同时排除激素类药物对母羊发情行为的干扰，优选高繁殖力的母羊群体，高质量提升母羊的产羔效率，增加养殖效益。
本发明通过下列技术方案完成：一种检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）在母羊配种前72小时、48小时、24小时或当日，采集1--10 ml母羊血，于阴凉处静置1-2小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C未显色、检测线T1或T2显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C显色，检测线T1与T2未显色，表明母羊的LH及FSH水平低下，需要隔日进行检测；
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1与T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
31）当LH≥5-15mIU/ml、FSH≥30-65mIU/ml，表明母羊卵泡为3-4毫米，于48小时后配种；
32）当LH≥15-30 mIU/ml、FSH≥30-65mIU/ml，表明母羊卵泡为4-5毫米，于24小时后配种；
33）当LH≥30-100mIU/ml、FSH≥65-100mIU/ml，表明母羊卵泡≥5毫米以上，卵泡成熟，于当日配种；
34）当LH≤5mIU/ml、 FSH<5mIU/ml，表明母羊卵泡为1—2毫米，于72小时后，重复步骤1）-3），并按步骤31）或32）或33）进行处理。
所述步骤2）羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为2%的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
LH包被液：将100-200mg羊的黄体生成素单克隆α亚级抗体LHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得LH包被液；
FSH包被液：将100-200mg羊的FSH单克隆α亚级抗体FSHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得FSH包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01MPBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将LH包被液均匀地划在NC膜的中部作为检测线T1，且质控线C与检测线T1相距3mm±1mm；将FSH包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T2，且检测线T1与检测线T2相距3mm±1mm；质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T2距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下，干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2、1.5-2mgFSHmb4，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀，形成LHmb2及FSHmb4复合胶体金结合物稀释溶液；
23B）将40ml LHmb2及FSHmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可方便、简单、快速、准确地检测出母羊的卵泡大小，进而根据不同大小的卵泡进行适时配种，有效避免母羊空怀期，缩短母羊的产羔间隔，提高母羊的繁殖率，降低养殖成本，同时排除激素类药物对母羊发情行为的干扰，优选高繁殖力的母羊群体，高质量提升母羊产羔效率，显著提升后代多胎基因母羊群体数量，从而为增加养殖效益提供可靠的技术支持。
附图说明
图1为羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸条的结构示意图；
图2为FSH比色卡图。
图3为LH比色卡图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1 羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为2%的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
LH包被液：将100-200mg羊的黄体生成素单克隆α亚级抗体LHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得LH包被液；
FSH包被液：将100-200mg羊的FSH单克隆α亚级抗体FSHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得FSH包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01MPBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将LH包被液均匀地划在NC膜的中部作为检测线T1，且质控线C与检测线T1相距3mm±1mm；将FSH包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T2，且检测线T1与检测线T2相距3mm±1mm；质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T2距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下，干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2、1.5-2mgFSHmb4，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀，形成LHmb2及FSHmb4复合胶体金结合物稀释溶液；
23B）将40ml LHmb2及FSHmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸，如图1。
实施例2 检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种前72小时，采集2 ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中5秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C未显色、检测线T1或T2显色，表明检测结果无效，需要重新检测。
实施例3 检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种前48小时，采集10 ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C显色，检测线T1和T2未显色，表明母羊的LH及FSH水平低下，需要隔日进行检测。
实施例4 检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种前24小时，采集5 ml母羊血，于阴凉处静置1.5小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中8秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1与T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
31）LH为6mIU/ml、FSH为35mIU/ml，表明母羊卵泡为3-4毫米，于48小时后配种，之后该母羊怀孕。
实施例5 检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种前当日，采集7 ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中7秒，取出，于17分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1和T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
LH为30 mIU/ml、FSH为60mIU/ml，表明母羊卵泡为4-5毫米，于24小时后配种，之后该母羊怀孕。
实施例6 检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种前72小时，采集5 ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中6秒，取出，于156分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1和T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
LH为90mIU/ml、FSH为80mIU/ml，表明母羊卵泡≥5毫米以上，卵泡成熟，于当日配种，之后该母羊怀孕。
实施例7 检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，包括下列步骤：
1）在母羊配种前48小时，采集9 ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸插入步骤1）的血清中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1与T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
LH为3mIU/ml、 FSH为4mIU/ml，表明母羊卵泡为1—2毫米，于72小时后，重复步骤1）-3）后，羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1与T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
LH为30 mIU/ml、FSH为60mIU/ml，表明母羊卵泡为4-5毫米，于24小时后配种，之后该母羊怀孕。
下面通过对比实验证明本发明的效果：
采用本发明实施例的方法分别对50只母羊进行检测，检测结果如下：
有40只母羊按时配种后，均怀孕；有5只母羊重复检测后，按时配种并怀孕；有3只母羊没有结果，是因为激素水平低于配种水平，经超声探测结果为卵巢静止，垂体分泌的激素水平低于试纸检测的灵敏度，分栏后仍没有检测结果，另行处理；有2只按时配种后，没有怀孕，经内窥镜检查是因为生殖道梗阻，另行处理。
Claims (2)
1.一种检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，其特征在于包括下列步骤：
1）在母羊配种前72小时、48小时、24小时或当日，采集1--10 ml母羊血，于阴凉处静置1-2小时，分离出血清；
2）将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸，插入步骤1）的血清中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T1、T2是否显色：
3）试纸显色结果如下：
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C未显色、检测线T1或T2显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C显色，检测线T1与T2未显色，表明母羊的LH及FSH水平低下，需要隔日进行检测；
羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸质控线C及检测线T1与T2都显色，用该显色与LH及FSH比色卡进行下列对比；
31）当LH≥5-15mIU/ml、FSH≥30-65mIU/ml，表明母羊卵泡为3-4毫米，于48小时后配种；
32）当LH≥15-30 mIU/ml、FSH≥30-65mIU/ml，表明母羊卵泡为4-5毫米，于24小时后配种；
33）当LH≥30-100mIU/ml、FSH≥65-100mIU/ml，表明母羊卵泡≥5毫米以上，卵泡成熟，于当日配种；
34）当LH≤5mIU/ml、 FSH<5mIU/ml，表明母羊卵泡为1—2毫米，于72小时后，重复步骤1）-3），并按步骤31）或32）或33）进行处理。
2.根据权利要求1所述的检测非季节性发情母绵羊自然周期成熟卵泡的方法，其特征在于所述步骤2）羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸经过下列方法制备：
21）按下列制备各组分：
金溶液：将质量浓度为2%的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
LH包被液：将100-200mg羊的黄体生成素单克隆α亚级抗体LHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得LH包被液；
FSH包被液：将100-200mg羊的FSH单克隆α亚级抗体FSHmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得FSH包被液；
IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；
22）在底板上划膜
22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；
22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将LH包被液均匀地划在NC膜的中部作为检测线T1，且质控线C与检测线T1相距3mm±1mm；将FSH包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T2，且检测线T1与检测线T2相距3mm±1mm；质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T2距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下，干燥18h±2h，得划膜板；
23）金垫制备
23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mg LHmb2、1.5-2mgFSHmb4，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀，形成LHmb2及FSHmb4复合胶体金结合物稀释溶液；
23B）将40ml LHmb2及FSHmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜RB65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；
24）样本垫制备
24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；
25）贴板
25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；
25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；
25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；
26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸。
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