CN110531091B - 一种促黄体生成素检测试纸、试纸卡及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物检测技术领域的一种促黄体生成素检测试纸、试纸卡及其制备方法和应用。该促黄体生成素检测试纸包括基片以及通过部分重叠搭接依次粘附于基片上的上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫；抗体承载膜上，靠近胶体金吸附垫的一端设置有检测线T2线，靠近吸水垫的一端设置有质控线，检测线T2线和质控线之间设置有检测线T1线；胶体金吸附垫上吸附有胶体金－抗β‑LH单克隆抗体结合物和胶体金－兔单克隆抗体结合物；检测线T1线包被有游离β‑LH单克隆抗体；检测线T2线包被有抗α‑LH单克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG多克隆抗体。通过检测线的显色情况判断促黄体生成素的分泌水平，提示排卵期和排卵峰值期，预测排卵时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种促黄体生成素检测试纸、试纸卡及其制备方法和应用。
背景技术
促黄体生成素(luteotropic hormone)，英文缩写为LH，是脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素，和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)一起被称为促性腺激素。LH的主要生理作用是对育龄妇女可促进成熟卵泡破裂、排卵，在月经中期即排卵前约24小时可观测到一个LH分泌高峰，其值比滤泡期高8～10倍，排卵后LH水平迅速下降。卵泡排卵后LH可促进黄体生成，并使黄体分泌雌激素和孕激素；对男性而言主要是促进睾丸的间质细胞增生，故又称为间质细胞刺激素(ICSH)，它能促使间质细胞合成并分泌雄激素(睾酮，T)，并协同FSH和T促进精子的成熟。
促黄体生成素的测定可用于预测排卵和排卵异常,但口服避孕药、超排卵药、潋素替代治疗、卵巢切除术等会影响促黄体生成素水平。血LH的浓度，在排卵前期为2～15mIU/ml，医学教育网收集整理排卵期为30～100mIU/ml，排卵后期为4～10mIU/ml。一般在非排卵期的正常值是5～25mIU/ml。低于5mIU/ml提示促性腺激素功能不足，见于席汉综合征；高FSH，如再加高LH，则说明卵巢功能已经衰竭。LH/FSH≥3则是诊断多囊卵巢综合征的依据之一。促黄体生成素检测异常的临床意义：1)LH水平增高见于：多囊卵巢综合征(持续无排卵及雄性激素过多等)、TUYN-ER综合征、原发性性腺功能低下、卵巢功能早衰、卵巢切除术后，以及更年期综合征或绝经期妇女；2)LH水平降低见于：下丘脑-垂体促性腺功能不足，如下丘脑性闭经；长期服用避孕药；使用激素替代治疗后，LH和FSH可下降。
正常女性体内保持微量的促黄体生成素(LH)，在月经中期LH的分泌量快速增加，形成一个LH峰，并在此后的28小时内，刺激成熟卵子的释放，即排卵。排卵预测试纸能准确地检测出LH的峰值水平，使女性能预知最佳的受孕或避孕时间。女性在检测前应首先确定自己的月经周期。算法是从这次来月经第一天到下次来月经的前一天为一个周期(初血当天为第一天)，多数妇女的排卵是在下次月经前14天左右，因此在排卵前2-3天及排卵后1-2天为易受孕期，亦即推算排卵日前后共4-5天内为易受孕期，故开始检测后应每天定时检测，当将要出现接近高峰值的颜色时应每隔12小时测试一次直至检测出LH峰值。
检测促黄体生成素的方法主要包括放射免疫法、宫颈粘液法、基础体温法、阴道B超法等。这几种方法各有一定的适应性。准确灵敏的放射免疫法由于同位素放射试剂的使用，而带来一系列的不便和限制；宫颈粘液法、基础体温法由于操作复杂及缺乏客观性限制了其使用；B超显像法是目前生殖学家们首推的监测排卵方法，被认为在指导人工授精时机上,特别对于单侧输卵管阻塞患者在行人工授精时具有特殊意义。当B超显示健侧输卵管所对应的卵巢排卵时行人工授精才具备较高的成功率,是其它监测排卵方法所不能代替的。但是,成熟的卵泡因个体差异超出其最大正常范围或卵巢位置异常以及肠气干扰，将给B超诊断带来困难。阴道B超在不孕妇女监测排卵中，能够清晰对卵泡的形态、数目、大小进行连续动态监测，被认为是最可靠的监测排卵方法，可避免肥胖、肠腔胀气的干扰，重复性好，安全无创，操作简单，但是由于每个人卵泡发育时间、大小相差悬殊，所以阴道B超不能根据卵泡直径准确预测排卵时间。以上方法均因操作复杂或需要大型仪器而不能在家进行自我测试使用。
目前较为常用的是利用胶体金排卵检测试纸进行LH检测，但其仅能作定性判断，应用范围受到限制。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的LH检测试纸结果不够准确、仅能作定性判断的缺陷，从而提供一种促黄体生成素检测试纸、试纸卡及其制备方法和应用。
一种促黄体生成素检测试纸，包括基片以及依次粘附于所述基片上的上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫；所述上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫依次通过部分重叠搭接；
所述抗体承载膜上，靠近所述胶体金吸附垫的一端设置有检测线T2线，靠近所述吸水垫的一端设置有质控线，所述检测线T2线和所述质控线之间设置有检测线T1线；
所述胶体金吸附垫上吸附有胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物和胶体金－兔单克隆抗体结合物；所述检测线T1线包被有游离β-LH单克隆抗体；所述检测线T2线包被有抗α-LH单克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG多克隆抗体。
所述抗体承载膜位于所述上样垫和所述吸水垫的下方；所述胶体金吸附垫位于所述上样垫的下方和所述抗体承载膜的上方；
所述检测线T1线、检测线T2线和质控线相互平行且均与基片长度方向垂直。
所述抗体承载膜为孔径3-10μm的硝酸纤维素膜。
靠近吸水垫一端的抗体承载膜边缘到质控线的间距为0.6cm，质控线到检测线T1线的间距为0.4cm，检测线T1线到检测线T2线的间距为0.4cm，检测线T2线到靠近胶体金吸附垫一端的抗体承载膜边缘的间距为0.6cm。
所述上样垫和所述吸水垫上均设置有保护膜。
本发明进一步提供一种所述促黄体生成素检测试纸的制备方法，包括，
S1、将抗体承载膜分别包被游离β-LH单克隆抗体、抗α-LH单克隆抗体和抗兔IgG多克隆抗体，分别得到检测线T1线、检测线T2线和质控线，并在封闭处理液中进行封闭处理，干燥后备用；
S2、取胶体金，调节pH值后，加入抗β-LH单克隆抗体，加入稳定剂搅拌，离心，收集沉淀，用胶体金复溶液将沉淀复溶，得到胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液；
S3、取胶体金，调节pH值后，加入兔单克隆抗体，加入稳定剂搅拌，离心，收集沉淀，用胶体金复溶液将沉淀复溶，得到胶体金－兔单克隆抗体结合物复溶液；
S4、将所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和所述胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液混合，用胶体金复溶液对所述混合物复溶后浇制在所述胶体金吸附垫上，干燥，密封保存，备用；
S5、取上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜、吸水垫分别沿基片的长度方向上依次以部分重叠的方式粘贴，即得。
所述游离β-LH单克隆抗体的浓度为1-2mg/ml，包被量为1.2ul/cm；；
所述抗α-LH单克隆抗体的浓度为2-3mg/ml，包被量为1.2ul/cm；；
所述抗兔IgG多克隆抗体的浓度为1-2mg/ml，包被量为1.2ul/cm；
所述检测线T1线、检测线T2线和质控线的宽度为1mm左右。
所述抗β-LH单克隆抗体按照2μg/ml-5μg/ml标记胶体金；所述抗β-LH单克隆抗体的浇制量是50μl/cm2；
所述兔单克隆抗体按照15μg/ml-20μg/ml标记胶体金；所述兔单克隆抗体的浇制量是50μl/cm2。
S2步骤中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物的体积百分含量是3％-5％；
S3步骤中，所述胶体金－兔单克隆抗体结合物复溶液中，所述胶体金－兔单克隆抗体结合物的体积百分含量是3％-5％；
S4步骤中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物的复溶液中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物的体积百分含量是40％-60％。
S4步骤中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物用胶体金复溶液复溶后，浇制在胶体金吸附垫上的量为50μl/cm2。
所述封闭处理液包括，0.08-0.12Mol缓冲液、质量百分含量为0.3-0.7％的糖份、质量百分含量为0.8-1.2％的封闭蛋白、质量百分含量为0.03-0.07％的防腐剂；
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述糖份为蔗糖或海藻糖，所述防腐剂为NaN3或硫柳汞，所述封闭蛋白为络蛋白或牛血清蛋白。
S2和S3步骤中，所述pH值调节为6.5-7.0。
本发明还提供一种促黄体生成素检测试纸卡，包括所述的促黄体生成素检测试纸或所述制备方法制备的促黄体生成素检测试纸。
所述的促黄体生成素检测试纸卡，还包括卡壳，所述卡壳由卡壳上盖和卡壳下盖构成；所述卡壳内部设置有安装所述促黄体生成素检测试纸的定位槽；
所述卡壳上盖设置有加样孔和视窗；
所述加样孔对应于所述促黄体生成素检测试纸的上样垫；
所述视窗对应于所述促黄体生成素检测试纸的抗体承载膜。
本发明进一步提供一种所述的促黄体生成素检测试纸、或任一项所述制备方法制备的促黄体生成素检测试纸、或所述的促黄体生成素检测试纸卡，在检测促黄体生成素、排卵期和排卵峰值期中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的促黄体生成素检测试纸包括基片以及依次粘附于基片上的上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫；上样垫、胶体金吸附垫、抗体承载膜和吸水垫依次通过部分重叠搭接；抗体承载膜上，靠近胶体金吸附垫的一端设置有检测线T2线，靠近吸水垫的一端设置有质控线，检测线T2线和所述质控线之间设置有检测线T1线。所述胶体金吸附垫上吸附有胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物和胶体金－兔单克隆抗体结合物，检测线T1线包被有游离β-LH单克隆抗体，检测线T2线包被有抗α-LH单克隆抗体，质控线包被有抗兔IgG多克隆抗体。本发明通过检测线T1线和T2线是否显色来判断促黄体生成素规则分子和游离β片段的分泌水平，提示排卵期和排卵峰值期，预测排卵时间，使女性能预知最佳的受孕或避孕时间。
2、本发明通过抗β-LH单克隆抗体2μg/ml-5μg/ml标记胶体金，兔单克隆抗体15μg/ml-20μg/ml标记胶体金，游离β-LH单克隆抗体1-2mg/ml，抗α-LH单克隆抗体2-3mg/ml、抗兔IgG多克隆抗体1-2mg/ml，制备的促黄体生成素检测试纸在检测时，5mIU/ml的β-LH样品液：T1线的结果为阴性；10mIU/ml的β-LH样品液：T1线的结果为阳性；25mIU/ml的β-LH样品液：T1线的结果为阳性；10mIU/ml的LH样品液：T2线的结果为阴性；25mIU/ml的LH样品液：T2线的结果为阳性；50mIU/ml的LH样品液：T2线的结果为阳性。因此，能够准确地判断促黄体生成素规则分子和游离β片段的分泌水平，提示排卵期和排卵峰值期，预测排卵时间，使女性能预知最佳的受孕或避孕时间。
3、本发明提供的促黄体生成素检测试纸，靠近吸水垫一端的抗体承载膜边缘到质控线的间距为0.6cm，质控线到检测线T1线的间距为0.4cm，检测线T1线到检测线T2线的间距为0.4cm，检测线T2线到靠近胶体金吸附垫一端的抗体承载膜边缘的间距为0.6cm。通过T1线β亚单位垂体促黄体生成素的显色和T2线促黄体生成素总分子的显色对比，提示促黄体生成素(LH)排卵期和峰值期，使女性能预知最佳的受孕或避孕时间。
4、本发明上样垫和吸水垫上均设置有保护膜，起到保护作用，防止外界物质对其干扰，从而保证检测结果的准确性。
5、本发明提供的促黄体生成素检测试纸卡，在检测促黄体生成素时，只需在加样孔内加入3滴尿样，10分钟观察检测线和质控线是否显色，即可实现促黄体生成素规则分子和游离β片段的分泌水平的检测，提示排卵期和排卵峰值期，预测排卵时间，使女性能预知最佳的受孕或避孕时间。该试纸卡使用方便卫生，适用于现场、即时、快速检测。
6、本发明提供的促黄体生成素检测试纸和检测试纸卡的检测特异性、检测重复性和检测稳定性好，检测批间差小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1促黄体生成素检测试纸的结构示意图；
图2是本发明实施例2促黄体生成素检测试纸卡的结构示意图；
图3是本发明实施例3促黄体生成素检测试纸卡的检测结果示意图；
图4是本发明实验例液体移行速度的测试示意图；
附图标记：
1-基片；2-上样垫；3-吸水垫；4-保护膜；5-抗体承载膜；6-胶体金吸附垫；T1-检测线T1；T2-检测线T2；C-质控线；7-加样孔；8-视窗；9-卡壳上盖；10-卡壳下盖。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中涉及到的抗β-LH单克隆抗体、兔单克隆抗体、游离β-LH单克隆抗体、抗α-LH单克隆抗体、抗兔IgG多克隆抗体抗体购自杭州隆基生物技术有限公司。
实施例1
本实施例提供的促黄体生成素检测试纸，其结构如图1所示，包括，基片1以及依次粘附于基片1上的上样垫2、胶体金吸附垫6、抗体承载膜5和吸水垫3；上样垫2、胶体金吸附垫6、抗体承载膜5和吸水垫3依次通过部分重叠搭接。具体地，抗体承载膜5位于上样垫2和吸水垫3的下方；胶体金吸附垫6位于上样垫2的下方和抗体承载膜5的上方，搭接部分长度为1mm。上样垫2和吸水垫3上均设置有保护膜4。
抗体承载膜5为孔径3-10μm的硝酸纤维素膜。抗体承载膜5上，靠近胶体金吸附垫6的一端设置有检测线T2线T2，靠近吸水垫3的一端设置有质控线C，检测线T2线T2和质控线C之间设置有检测线T1线T1；所述检测线T1线T1、检测线T2线T2和质控线C相互平行且均与基片长度方向垂直。检测线T1线T1和检测线T2线T2的间距、检测线T1线T1和质控线C的间距均为0.4cm。
胶体金吸附垫6上吸附有胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物和胶体金－兔单克隆抗体结合物。检测线T1线T1包被有游离β-LH单克隆抗体；检测线T2线T2包被有抗α-LH单克隆抗体；质控线C包被有抗兔IgG多克隆抗体。
本实施例提供以上促黄体生成素检测试纸的制备方法，包括：
1、抗体承载膜的制备
(1)选择3μm～10μm孔径的硝酸纤维素膜，根据需要将膜分切成宽度为2.0cm，长度为30.5cm的规格，备用。
(2)用质量百分含量0.85％的氯化钠缓冲液配制供检测线T1包被使用的游离β-LH单克隆抗体，抗体浓度为1.5mg/ml；用质量百分含量0.85％的氯化钠缓冲液配制供检测线T2包被使用的抗α-LH单克隆抗体，抗体浓度为2.0mg/ml。用质量百分含量0.85％的氯化钠缓冲液配制供质控线包被使用的抗兔IgG多克隆抗体，使抗体浓度为1.0mg/ml。
(3)选择硝酸纤维素膜的抗体包被面并作标记，将需包被的检测线T1、T2和质控线的抗体溶液平行均匀的包被在膜片上，且检测线T1与检测线T2的间距、检测线T1与质控线的间距均控制为0.4cm，硝酸纤维素膜在2℃～30℃的恒温条件下干燥备用。
(4)配制封闭处理浸泡液，向配液罐加入实际生产量的纯化水；分别称量缓冲液、糖份、封闭蛋白和防腐剂，将以上组分直接加入到配液罐中搅拌，直至完全溶解，加纯化水定容至所需体积，充分搅拌均匀，搅拌时间不少于10分钟，备用。
配制的封闭处理浸泡液中含有0.1Mol缓冲液、质量百分含量为0.5％的糖份、质量百分含量为1％的封闭蛋白、质量百分含量为0.05％的防腐剂。其中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，糖份为蔗糖，防腐剂为硫柳汞，封闭蛋白为牛血清蛋白。
(5)将包被了检测线和质控线的膜放于处理槽中，加入配好的上述(4)的封闭处理浸泡液，确保每条膜完全浸没在上述(4)的封闭处理浸泡液中30分钟，并保证膜不移动、不重叠，30分钟后将膜从处理槽中取出，将上述(4)的封闭处理浸泡液倒掉；用镊子将膜放在纱布上晾稍干，得到抗体承载膜。
(6)贴板干燥：撕去胶板双面胶上切割线中间的白纸，用镊子将封闭处理后的抗体承载膜正好放在胶板中央空白位置，且胶板右边与膜右边平齐，避免在生产过程中的误差，确保显色位置相对准确，贴板时全部顶质控线一头贴，膜贴在胶板上后，隔着双面胶纸抹平膜面，避免有气泡，控制室内的温度18～28℃、相对湿度≤40％，并保证干燥间空气能循环流通且除湿机风不会直接吹到膜面上。干燥时间≥4小时，备用。
2、胶体金吸附垫的制备
(1)胶体金复溶液的配制：向配液罐加入实际生产量的纯化水；用电子分析天平称量海藻糖、牛血清白蛋白、柠檬酸三钠、聚乙二醇和NaN3，直接加入到配液罐中搅拌，搅拌直至完全溶解，加纯化水定容至所需体积，充分搅拌均匀，搅拌时间大于30分钟，备用。
胶体金复溶液中含有，质量百分含量5％的海藻糖、质量百分含量2％的牛血清白蛋白、质量百分含量0.5％的柠檬酸三钠、质量百分含量0.05％的聚乙二醇、质量百分含量0.05％的NaN3。
(2)用量筒量取需要标记量的胶体金，按pH6.5-7.0进行调节，即按体积百分含量为0.53％加入0.2mol/L的碳酸钾溶液，于磁力搅拌器上搅拌15分钟后，取抗β-LH单克隆抗体，用双蒸水将抗β-LH单克隆抗体进行稀释，并按3ug/ml标记胶体金，将抗β-LH单克隆抗体加入胶体金中，于磁力搅拌器上搅拌30分钟，加入体积百分含量0.5‰的稳定剂聚乙二醇，搅拌30分钟后离心，收集沉淀，用胶体金复溶液按体积百分含量3％复溶，于磁力搅拌器上搅拌至混合均匀，得到体积百分含量3％的胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液，备用。
(3)用量筒量取需要标记量的胶体金，按pH6.5-7.0进行调节，即按体积百分含量为0.6％加入0.2mol/L的碳酸钾溶液，于磁力搅拌器上搅拌15分钟后，取兔单抗，用双蒸水将抗β-LH单克隆抗体进行稀释，并按15ug/ml标记胶体金，将兔单抗加入胶体金中，于磁力搅拌器上搅拌30分钟，加入体积百分含量0.5‰的稳定剂聚乙二醇，搅拌30分钟后离心，收集沉淀，用胶体金复溶液按体积百分含量10％复溶，于磁力搅拌器上搅拌至混合均匀，得到体积百分含量10％的胶体金－兔单单克隆抗体结合物复溶液，备用。
(4)取上述(2)中体积百分含量3％的胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和上述(3)中体积百分含量10％的胶体金－兔单抗隆抗体结合物复溶液混合，用胶体金复溶液对该混合物按体积百分含量50％进行复溶，于磁力搅拌器上混合均匀，按照50μl/cm2浇制在准备好的胶体金吸附垫上，置于干燥室晾干≥4个小时，干燥室控制温度18-28℃，相对湿度≤40％，保证空气畅通且气流不能直接吹于胶体金吸附垫上，将干燥好的胶体金吸附垫放入到装有干燥剂的铝箔袋中，密封保存，做好标记为试纸条胶体金吸附垫，备用。
注：胶体金为浇制，是因为浇制的胶体金可以自由的裁切宽度，从而方便调节产品的深浅显色。
3、组装及裁切
(1)取已粘贴抗体承载膜5的透明基片1半成品，将胶体金吸附垫6按0.5cm宽度裁切成0.5cm×30cm的条状后粘贴在靠近检测线一侧的透明基片1上，并保持与抗体承载膜5呈搭接约1mm，将吸水垫3复合在靠近质控线C一侧的透明基片1上并与抗体承载膜5搭接约1mm，将上样垫2复合在胶体金吸附垫6远离抗体承载膜5的一端并与其搭接约1mm，做好标记，备用。
(2)将已组装备用的基片1，切割成条状试纸，备用。
实施例2
本实施例提供促黄体生成素检测试纸卡，结构如图2所示。其包括实施例1中的促黄体生成素检测试纸，还包括由卡壳上盖9和卡壳下盖10构成的卡壳；卡壳内部设置有安装促黄体生成素检测试纸的定位槽；卡壳上盖9设置有加样孔7和视窗8；加样孔7对应于促黄体生成素检测试纸的上样垫2；视窗8对应于促黄体生成素检测试纸的抗体承载膜5。
实施例3
本实施例提供实施例中促黄体生成素检测试纸卡的使用方法，包括，将样本、试纸卡均在室温下平衡；除去试剂盒外包装，用吸管吸取尿样后，在加样孔内加入3滴尿样；10分钟内观察试纸条的检测线和质控线是否显色。检测结果如图3所示，包括如下几种情况：
(1)处于非排卵期(阴性)：在质控线C仅出现一条紫红色线，表示不在排卵期(图3-图一)；
(2)非LH高峰(阴性)：若检测线T2线不出现或略有紫红色线，检测线T1线和对照质控线C各出现一条紫红色线，但检测线T1线、检测线T2线显色明显比质控线C显色浅，表明尿液中LH含量不在高峰水平(见图3-图二)；
(3)处于排卵期(阴性)：若检测线T1线与质控线C显色基本相似或比质控线C显色深，而检测线T2线显色比检测线T1线显色浅，提示处于排卵期(见图3-图三)；处于此阶段时，若下个时间段再次检测，检测线T1线或检测线T2线显色有所加深，则表明在LH高峰前，还未达到峰值；若下个时间段再次检测，检测线T1线或检测线T2线显色明显减弱，则表明LH高峰可能已过；
(4)LH高峰(阳性)：若检测线T1线、检测线T2线和质控线C各出现一条紫红色线，而且检测线(T1、T2)与质控线显色基本相似或检测线(T1、T2)比对照线深，表示接近或处于LH高峰期，预计将于24-48小时内排卵(见图3-图四)；
(5)无效：若质控线C不出现紫红色线，表明试验失败或试纸失效(见图3-图五)。
实施例4
本实施例提供实施例1中促黄体生成素检测试纸卡在检测妇女尿中促黄体生成素规则分子和游离β片段的分泌水平，提示排卵期和峰值期，预测排卵时间的用途。
促黄体生成素是一种糖蛋白类激素,由二个非共价键联接的α和β亚单位组成。其α亚单位的氨基酸序列与人促卵泡成熟激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、人绒毛膜性腺激素(HCG)等激素的α亚单位都一致,但其β亚单位有生化和免疫学特性。正常女性体内保持微量的促黄体生成素，当女性进入排卵期时，促黄体生成素游离β片段基础水平逐渐升高，在排卵期中期LH规则分子的分泌量快速增加，形成一个LH峰，并在此后的24-48小时内，刺激成熟卵子的释放，即排卵。
采用实施例3中促黄体生成素检测试纸卡的使用方法，对尿液样品进行检测，根据检测线和质控线的显色情况，检测促黄体生成素分泌的基础水平、排卵期和排卵峰值期，使女性预知最佳的受孕或避孕时间。
若经过一段时间的测试，检测线(T1、T2)始终没有显色，可能是无排卵型患者；若检测线(T1、T2)始终明显浅于对照线，可能是多囊卵巢综合症患者或卵泡黄素化患者，出现上述情况建议去医院就诊。
实验例
1、所需试剂如下:
(1)空白对照液
含蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.2～7.4。
(2)测定样品液
a)含有β-LH标准品的样品液：用含蛋白的磷酸盐缓冲液配制5mIU/ml、10mIU/ml和25mIU/ml的β-LH样品液；
b)含有LH标准品的样品液：用含蛋白的磷酸盐缓冲液配制10mIU/ml、25mIU/ml和50mIU/ml的LH样品液；
c)含有200mIU/ml FSH标准品的样品液：用含蛋白的磷酸盐缓冲液配制FSH浓度为200mIU/ml；
d)含有250μIU/ml TSH标准品的样品液：用含蛋白的磷酸盐缓冲液配制TSH浓度为250μIU/ml。
2、物理性状检验
外观：随机取1人份试纸，自然光下目视观察，应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染，材料附着牢固。
膜条宽度：随机取1人份试纸，用游标卡尺(精密度0.02mm)测量其宽度，测量1次，试纸的宽度结果应不小于2.5mm。
液体移行速度：随机取1人份试纸，按实施例3中的使用方法进行操作，如图4所示，从试纸浸入样品液开始用秒表(精度为0.01s)计时，直至液体达到图4所示的E区与F区之间的交界线时停止计时，所用的时间记为(t)，用游标卡尺(精密度0.02mm)测量(A区+B区+E区)的长度，记为(L)，计算L/t即为移行速度，结果符合液体移行速度不低于10mm/min。
3、检测临界值
(1)随机取同一批号试纸3人份，用空白对照液检测，3条试纸T1线和T2线均为阴性，合格。
(2)随机取同一批号试纸9人份，用5mIU/ml、10mIU/ml和25mIU/ml的β-LH样品液检测，每个浓度重复检测3次，结果判定如下：
a)5mIU/ml的β-LH样品液：3条试纸T1线的结果均为阴性，合格；
b)10mIU/ml的β-LH样品液：3条试纸T1线的结果均为阳性，合格；
c)25mIU/ml的β-LH样品液：3条试纸T1线的结果均为阳性，合格。
(3)随机取同一批号试纸9人份，用10mIU/ml、25mIU/ml和50mIU/ml的LH样品液检测，每个浓度重复检测3次，结果判定如下：
d)10mIU/ml的LH样品液：3条试纸T2线的结果均为阴性，合格；
e)25mIU/ml的LH样品液：3条试纸T2线的结果均为阳性，合格；
f)50mIU/ml的LH样品液：3条试纸T2线的结果均为阳性，合格。
4、检测特异性
(1)与FSH的交叉反应
随机取同一批号试纸3人份，用200mIU/ml的FSH样品液检测，重复检测3次，3次结果T1线和T2线均为阴性。
(2)与TSH的交叉反应
随机取同一批号试纸3人份，用250μIU/ml的TSH样品液检测，重复检测3次，3次结果T1线和T2线均为阴性。
5、检测重复性
(1)随机取同一批号试纸30人份，用5mIU/ml、10mIU/ml和25mIU/ml的β-LH样品液检测，每个浓度重复检测10次，T1线反应结果一致，显色均一。
(2)随机取同一批号试纸30人份，用10mIU/ml、25mIU/ml和50mIU/ml的LH样品液检测，每个浓度重复检测10次，T2线反应结果一致，显色均一。
6、检测稳定性
取有效期后一个月的同批产品，按2-5各项检测，结果均符合要求。
7、检测批间差
(1)取3个批号的试纸，每个批号10人份，共30人份。每个批号的试纸均用10mIU/ml的β-LH样品液重复检测10次，3个批号的T1线反应结果一致，显色均一。
(2)取3个批号的试纸，每个批号10人份，共30人份。每个批号的试纸均用25mIU/ml的LH样品液重复检测10次，3个批号的T2线反应结果一致，显色均一。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种促黄体生成素检测试纸的制备方法，其特征在于，包括，
S1、将抗体承载膜(5)分别包被游离β-LH单克隆抗体、抗α-LH单克隆抗体和抗兔IgG多克隆抗体，分别得到检测线T1线(T1)、检测线T2线(T2)和质控线(C)，并在封闭处理液中进行封闭处理，干燥后备用；
S2、取胶体金，调节pH值后，加入抗β-LH单克隆抗体，加入稳定剂搅拌，离心，收集沉淀，用胶体金复溶液将沉淀复溶，得到胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液；
S3、取胶体金，调节pH值后，加入兔单克隆抗体，加入稳定剂搅拌，离心，收集沉淀，用胶体金复溶液将沉淀复溶，得到胶体金－兔单克隆抗体结合物复溶液；
S4、将所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和所述胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液混合，用胶体金复溶液对所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和所述胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物复溶后浇制在所述胶体金吸附垫(6)上，干燥，密封保存，备用；
S5、取上样垫(2)、胶体金吸附垫(6)、抗体承载膜(5)、吸水垫(3)分别沿基片(1)的长度方向上依次以部分重叠的方式粘贴，即得；
所述游离β-LH单克隆抗体的浓度为1-2mg/ml，包被量为1.2ul/cm；
所述抗α-LH单克隆抗体的浓度为2-3mg/ml，包被量为1.2ul/cm；
所述抗兔IgG多克隆抗体的浓度为1-2mg/ml，包被量为1.2ul/cm；
所述检测试纸包括，基片(1)以及依次粘附于所述基片(1)上的上样垫(2)、胶体金吸附垫(6)、抗体承载膜(5)和吸水垫(3)；所述上样垫(2)、胶体金吸附垫(6)、抗体承载膜(5)和吸水垫(3)依次通过部分重叠搭接；
所述抗体承载膜(5)上，靠近所述胶体金吸附垫(6)的一端设置有检测线T2线(T2)，靠近所述吸水垫(3)的一端设置有质控线(C)，所述检测线T2线(T2)和所述质控线(C)之间设置有检测线T1线(T1)；
所述胶体金吸附垫(6)上吸附有胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物和胶体金－兔单克隆抗体结合物；所述检测线T1线(T1)包被有游离β-LH单克隆抗体；所述检测线T2线(T2)包被有抗α-LH单克隆抗体；所述质控线(C)包被有抗兔IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗体承载膜位于所述上样垫(2)和所述吸水垫(3)的下方；所述胶体金吸附垫(6)位于所述上样垫(2)的下方和所述抗体承载膜(5)的上方；
所述检测线T1线(T1)、检测线T2线(T2)和质控线(C)相互平行且均与基片长度方向垂直。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，靠近吸水垫(3)一端的抗体承载膜(5)边缘到质控线(C)的间距为0.6cm，质控线(C)到检测线T1线(T1)的间距为0.4cm，检测线T1线(T1)到检测线T2线(T2)的间距为0.4cm，检测线T2线(T2)到靠近胶体金吸附垫(6)一端的抗体承载膜(5)边缘的间距为0.6cm。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述上样垫(2)和所述吸水垫(3)上均设置有保护膜(4)。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述抗β-LH单克隆抗体按照2μg/ml-5μg/ml标记胶体金；所述抗β-LH单克隆抗体的浇制量是50μl/cm2；
所述兔单克隆抗体按照15μg/ml-20μg/ml标记胶体金；所述兔单克隆抗体的浇制量是50μl/cm2。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，S2步骤中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物的体积百分含量是3％-5％；
S3步骤中，所述胶体金－兔单克隆抗体结合物复溶液中，所述胶体金－兔单克隆抗体结合物的体积百分含量是3％-5％；
S4步骤中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物的复溶液中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物的体积百分含量是40％-60％。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，S4步骤中，所述胶体金－抗β-LH单克隆抗体结合物复溶液和胶体金-兔单克隆抗体结合物复溶液的混合物用胶体金复溶液复溶后，浇制在胶体金吸附垫(6)上的量为50μl/cm2。
8.一种权利要求1-7任一项所述制备方法制备的促黄体生成素检测试纸在检测促黄体生成素、排卵期和排卵峰值期中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。
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