CN112730854A - 一种排卵检测试纸条及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种排卵检测试纸条，包括PVC底板、样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，硝酸纤维素膜上设有检测线T1、检测线T2及质控线，检测线T1上包被有鼠抗人β‑LH单克隆抗体1A4，检测线T2上包被有可替宁抗原，质控线上包被有羊抗鸡IgY多克隆抗体，金标垫上固化有胶体金‑鼠抗人β‑LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金‑鸡IgY抗体结合物及胶体金‑可替宁单克隆抗体结合物。本发明检测灵敏度高，特异性好，可避免因LH与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）交叉造成的异常判读结果，检测结果更加准确，且结合了尿液中吸烟代谢产物可替宁的监测。本发明还公开了一种排卵检测方法，步骤简单，测试结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种排卵检测试纸，尤其是涉及一种排卵检测试纸条及检测方法。
背景技术
促黄体生成素（LH）是由腺垂体嗜碱粒细胞分泌的物质。在女性（LH）协同促卵泡激素（FSH）共同作用维持卵巢的月经周期，导致排卵与黄体形成。LH的产生受下丘脑促性腺释放激素的控制，同时受卵巢的正、负反馈调控。在月经周期LH的释放高峰与卵巢排卵有着密切关系，LH高峰一经出现，预示24-36小时卵巢排卵，因此可以在月经周期中监测血清LH峰值，以确定最佳受孕时间。该检测结果以毫国际单位/毫升（mIu/ml）表示。
LH为糖蛋白，分子量约3万，其蛋白部分由204个氨基酸构成α和β两个亚基，α亚基与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）和人绒毛膜促性腺激素相同，只有β亚基具有特异的结构，两者通过非共价键连接。
目前检测促黄体生成素（LH）的方法有时间分辨免疫荧光法（专利申请号：200810043552.5），该方法采用长效荧光标记物如稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）标记，通过时间分辨非特异性荧光，但是该方法需要利用稀土金属，成本高，标记难度大。
专利申请号201210571305.9的专利是采用标记荧光素的方法来检测促黄体生成素，该试剂盒有效期短，稳定性差。
中国发明专利CN201310237681.9公开了一种促黄体生成素纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，该试剂盒使用方法复杂，需要用到化学发光仪，不适用于家庭监测。
胶体金法检测排卵试纸条成为家庭自检的主流，操作判读简单，无需样本稀释和仪器设备，但由于LH的a亚基与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）的α亚基结构相同，易造成交叉导致结果异常判读。
发明内容
本发明是为了解决现有技术的排卵检测试纸所存在的上述问题，提供了一种可监测吸烟代谢产物可替宁，其灵敏度与特异性均不受影响，灵敏度高，特异性好的排卵检测试纸条。
本发明还提供了一种排卵检测方法，步骤简单，测试结果准确。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种排卵检测试纸条，包括PVC底板、样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述硝酸纤维素膜、样本垫、金标垫及吸水垫均固定于PVC底板表面，硝酸纤维素膜的两端分别搭接吸水垫、金标垫，所述金标垫的外端搭接样本垫，硝酸纤维素膜上设有检测线T1、检测线T2及质控线，检测线T1上包被有鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4，检测线T2上包被有可替宁抗原，质控线上包被有羊抗鸡IgY多克隆抗体，金标垫上固化有胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物及胶体金-可替宁单克隆抗体结合物。本发明在现有胶体金法检测排卵试纸条基础上，使用了针对β-LH抗原两个特异性表位的单克隆抗体，避免了与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）交叉造成的异常判读结果，通过肉眼可见的检测线、质控线显色强度对比，随时在家监测排卵期；本发明在现有的排卵检测试纸条基础上，在检测线T1和质控线之间还设置包被有吸烟代谢物可替宁抗原的检测线T2，并在金标垫上喷涂了胶体金标记的可替宁抗原的抗体。利用双抗夹心法检测人体尿液中的LH抗原。采用竞争抑制法，当尿液中没有吸烟代谢物可替宁时，标记的可替宁抗体和检测线T2包被的可替宁抗原结合反应，在检测线T2显色。本发明在预测排卵的同时，可以检测是否有吸烟代谢物可替宁残留，从而实现指导广大女性尤其主动吸烟和被动吸烟女性健康备孕，优生优育的目的；检测线T1与检测线T2、检测线T2与质控线间的间距控制在0.3cm。
作为优选，所述样本垫和吸水垫上设有保护膜。
作为优选，所述金标垫通过以下方法制得：
（a）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至7.5，取鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8，按5ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物，备用。
（b）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取鸡IgY抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鸡IgY抗体结合物，备用。
（c）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取可替宁单克隆抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min，10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-可替宁单克隆抗体结合物，备用。
（d） 将上述胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物和胶体金-可替宁单克隆抗体结合物按体积比5:1:2比例混合，用金标稀释液对该混合物按体积百分含量50%进行稀释，涡旋混匀后以喷量6ul/cm均匀喷涂在金标垫上，烘干。37℃烘干。
作为优选，所述金标保存液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa2HPO4.12H2O，1g BSA，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml即为金标保存液。
作为优选，所述金标稀释液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa2HPO4.12H2O，1g BSA，1g Tween-20，20g 蔗糖，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
作为优选，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将将硝酸纤维素膜平整贴在PVC底板中央位置，用包被缓冲液分别将鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4稀释至浓度为1.0mg/ml，可替宁抗原稀释至浓度为0.3mg/ml，羊抗鸡IgY多克隆抗体稀释至浓度为0.5mg/ml，将稀释好的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T1上，将稀释好的可替宁抗原溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T2上，将稀释好的羊抗鸡IgY多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的质控线上，烘干。37℃烘干。
作为优选，所述包被缓冲液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa2HPO4.12H2O，0.9g Nacl，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
作为优选，所述样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维裁成所需规格后，用样本垫处理液喷涂均匀，烘干；所述样本垫处理液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入3.58gNa2HPO4.12H2O，0.5g BSA，1g S9，1g PVP，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。37℃烘干。
作为优选，所述鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8通过以下方法制得：
（一）制备β-LH重组抗原
（1）以人β-LH糖蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAstar分析其抗原序列，选取β-LH中特有的两个表位序列A和B，与FSH、TSH糖蛋白序列比较结果表明无同源性，为β-LH所特有，将A和B表位通过柔性片段（GlyGlyGlyGlySer）连接，得到如SEQ ID No：1所示的β-LH重组蛋白氨基酸序列。
（2）β-LH重组蛋白氨基酸序列不变前提下，根据CHO细胞偏爱密码子将β-LH重组蛋白氨基酸序列转化为对应的β-LH重组蛋白核苷酸序列，得到的β-LH重组蛋白核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，在β-LH重组蛋白核苷酸序列上下游分别添加酶切位点EcoRI和BamHI对应的核苷酸序列后合成目的基因，将目的基因克隆于pMD19-T载体。
（3）用限制性内切酶EcoRI和BamHI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pTT5载体12h，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pTT5载体；使用T4连接酶将回收的目的基因和pTT5载体按7:1的比例于4℃连接12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，于37℃恒温培养12h后，于平板上挑取单克隆菌株至含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
（4）将构建好的重组表达载体转染CHO-K1细胞。根据转染体系每毫升中加入2.4μg重组表达载体和3.6μg转染试剂PEI，37℃，6% CO2摇床转速120rpm培养6h，加入1% 200mMVPA以及1% 20g/L L-盐酸半胱氨酸，37℃，6% CO2摇床转速120rpm培养7天后离心收集上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，20mM咪唑溶液去除杂蛋白，300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收液后转至截留分子量为3kD-5kD的透析袋中，于10mmol/L、pH7.4的PBS溶液中过夜透析；透析后取出于-20℃保存备用，即得β-LH重组抗原，其中20mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑0.136g，加10mmol/L、pH7.4 的PBS溶液溶解定容至100mL；所述300mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑2.04g，加10mmol/L、pH7.4的PBS溶液溶解定容至100mL。（二）制备鼠抗人β-LH单克隆抗体
（Ⅰ）取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100ug β-LH重组抗原，共400ul/只；25天后进行第二次加强免疫，具体方法为：取80ugBSA偶联蛋白用福氏不完全佐剂乳化，共400ul/只，皮下多点注射；20天后第三次加强免疫，第三次加强免疫方法同第二次加强免疫；20天后，处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，通过聚乙二醇使融合；再加入等体积饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养；5天后半保留换液，10天后采用酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清；检测阳性的杂交瘤细胞，使用有限稀释法进行三次亚克隆，最终用β-LH重组蛋白经酶联免疫吸附法筛选得到2株单克隆细胞株1A4和6B8。
（Ⅱ）取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，每只400μL，3天后腹腔注射单克隆细胞，注射标准为1×106个/只，6-8天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水；用磁珠法抗体纯化试剂盒，通过样品处理，磁珠预处理，抗体吸附，磁珠洗涤，抗体洗脱，抗体中和，得到的纯化后的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8。
一种使用排卵检测试纸条的排卵检测方法，包括以下步骤：将试纸条浸入端的样本垫插入尿液标本容器中，尿液依次流经金标垫、检测线T1、检测线T2、质控线而显色，10min内观察显示结果。若检测线T1显色强度大于等于质控线，且检测线T2显色，则提示未来24-48h内排卵且体内无吸烟代谢物可替宁残留，可备孕；当检测线T1不显色或弱于质控线，且检测线T2显色，提示无排卵且体内无吸烟代谢物可替宁残留，可继续监测；检测线T1显色强度大于等于质控线，且检测线T2不显色，则提示未来24-48h内排卵且体内有吸烟代谢物可替宁残留，建议继续监测；当检测线T1不显色或弱于质控线，且检测线T2不显色，提示无排卵且体内有吸烟代谢物可替宁残留，建议继续监测；质控线线不显色表明试纸条无效或试验失败。
因此，本发明具有如下有益效果：
（1）检测灵敏度高，特异性好，可避免因LH与促卵泡激素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）交叉造成的异常判读结果，检测结果更加准确。
（2）结合了尿液中吸烟代谢产物可替宁的监测，在预测排卵的同时，可以监测是否有吸烟代谢产物可替宁残留，实现指导广大女性尤其主动吸烟和被动吸烟女性健康备孕，优生优育的目的。
（3）采用鸡IgY抗体标记和羊抗鸡IgY单克隆抗体包被做独立质控线，使检测线T1检测结果判读不受检测线T2结果影响，保证了结果的准确性。
附图说明
图1是本发明的一种结构示意图。
图中：PVC底板1，样本垫2，金标垫3，硝酸纤维素膜4，吸水垫5，检测线T1 6，检测线T2 7，质控线8，保护膜9。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
一种排卵检测试纸条，包括PVC底板1、样本垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4及吸水垫5，硝酸纤维素膜、样本垫、金标垫及吸水垫均固定于PVC底板表面，硝酸纤维素膜的两端分别搭接吸水垫、金标垫，金标垫的外端搭接样本垫，硝酸纤维素膜上设有检测线T1 6、检测线T2 7及质控线8，检测线T1与检测线T2、检测线T2与质控线间的间距控制在0.3cm，检测线T1上包被有鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4，检测线T2上包被有可替宁抗原，质控线上包被有羊抗鸡IgY多克隆抗体，金标垫上固化有胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物及胶体金-可替宁单克隆抗体结合物，样本垫和吸水垫上覆有保护膜9。
本实施例排卵检测试纸条中的金标垫通过以下方法制得：
（a）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至7.5，取鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8，按5ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物，备用；
（b）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取鸡IgY抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鸡IgY抗体结合物，备用；
（c）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取可替宁单克隆抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min，10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-可替宁单克隆抗体结合物，备用；金标保存液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na2HPO4.12H2O，1g BSA，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml即为金标保存液；金标稀释液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na2HPO4.12H2O，1g BSA，1g Tween-20，20g 蔗糖，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml；
（d） 将上述胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物和胶体金-可替宁单克隆抗体结合物按体积比5:1:2比例混合，用金标稀释液对该混合物按体积百分含量50%进行稀释，涡旋混匀后，用三维点膜喷金仪以喷量6ul/cm均匀喷涂在宽6mm、长30cm的喷涂在金标垫上，37℃烘干。
本实施例排卵检测试纸条中的硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将将硝酸纤维素膜平整贴在PVC底板中央位置，用包被缓冲液分别将鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4稀释至浓度为1.0mg/ml，可替宁抗原稀释至浓度为0.3mg/ml，羊抗鸡IgY多克隆抗体稀释至浓度为0.5mg/ml，将稀释好的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T1上，将稀释好的可替宁抗原溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T2上，将稀释好的羊抗鸡IgY多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的质控线上，37℃烘干；包被缓冲液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa2HPO4.12H2O，0.9g Nacl，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
本实施例排卵检测试纸条中的样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维裁成宽16mm、长30cm后置于网架上，每条玻璃纤维用3.5ml样本垫处理液喷涂均匀，37℃烘干；样本垫处理液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入3.58g Na2HPO4.12H2O，0.5g BSA，1g S9，1gPVP，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
本实施例排卵检测试纸条中的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8通过以下方法制得：
（一）制备β-LH重组抗原
（1）以人β-LH糖蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAstar分析其抗原序列，选取β-LH中特有的两个表位序列A和B，与FSH、TSH糖蛋白序列比较结果表明无同源性，为β-LH所特有，将A和B表位通过柔性片段（GlyGlyGlyGlySer）连接，得到如SEQ ID No：1所示的β-LH重组蛋白氨基酸序列；
（2）β-LH重组蛋白氨基酸序列不变前提下，根据CHO细胞偏爱密码子将β-LH重组蛋白氨基酸序列转化为对应核的β-LH重组蛋白核苷酸序列，并在β-LH重组蛋白核苷酸序列上下游分别添加酶切位点EcoRI和BamHI对应的核苷酸序列后合成目的基因，将目的基因克隆于pMD19-T载体；
（3）用限制性内切酶EcoRI和BamHI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pTT5载体12h，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pTT5载体；使用T4连接酶将回收的目的基因和pTT5载体按7:1的比例于4℃连接12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，于37℃恒温培养12h后，于平板上挑取单克隆菌株至含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体；
（4）将构建好的重组表达载体转染CHO-K1细胞；根据转染体系每毫升中加入2.4μg重组表达载体和3.6μg转染试剂PEI，37℃，6% CO2摇床转速120rpm培养6h，加入1% 200mMVPA以及1% 20g/L L-盐酸半胱氨酸，37℃，6% CO2摇床转速120rpm培养7天后离心收集上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，20mM咪唑溶液去除杂蛋白，300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收液后转至截留分子量为3kD-5kD的透析袋中，于10mmol/L、pH7.4的PBS溶液中过夜透析；透析后取出于-20℃保存备用，即得β-LH重组抗原，其中20mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑0.136g，加10mmol/L、pH7.4 的PBS溶液溶解定容至100mL；所述300mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑2.04g，加10mmol/L、pH7.4的PBS溶液溶解定容至100mL；
（二）制备鼠抗人β-LH单克隆抗体
（Ⅰ）取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100ug β-LH重组抗原，共400ul/只；25天后进行第二次加强免疫，具体方法为：取80ugBSA偶联蛋白用福氏不完全佐剂乳化，共400ul/只，皮下多点注射；20天后第三次加强免疫，第三次加强免疫方法同第二次加强免疫；20天后，处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，通过聚乙二醇使融合；再加入等体积饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养；5天后半保留换液，10天后采用酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清；检测阳性的杂交瘤细胞，使用有限稀释法进行三次亚克隆，最终用β-LH重组蛋白经酶联免疫吸附法筛选得到2株单克隆细胞株1A4和6B8；
（Ⅱ）取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，每只400μL，3天后腹腔注射单克隆细胞，注射标准为1×106个/只，6-8天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水；用磁珠法抗体纯化试剂盒，通过样品处理，磁珠预处理，抗体吸附，磁珠洗涤，抗体洗脱，抗体中和，得到的纯化后的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8。
灵敏度试验
用含BSA、pH7.4的PBS将LH标准品分别稀释至10mIu/ml，25mIu/ml，50mIu/ml，做好标识，随机取同一批次的试纸条9人份，每个浓度测试3次重复，10mIu/ml的3个测试检测线T1显色均弱于质控线，为阴性；25mIu/ml的3个检测线T1显色均大于等于质控线，为阳性；50mIu/ml的3个检测线T1线显色均强于质控线，为阳性。临床诊断灵敏度为25mIu/ml。
特异性试验
用含BSA、pH7.4的PBS溶液分别将FSH标准品稀释至200mIU/ml，TSH标准品稀释至250μIU/ml，做好标识，随机取同一批次的试纸6人份，FSH和TSH分别测试3次，检测线T1显色均弱于质控线为阴性，特异性高。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州新脉生物科技有限公司
<120> 一种排卵检测试纸条及检测方法
<130> 20201212
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β-LH重组蛋白氨基酸序列
<400> 1
Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly
35 40 45
Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Cys
65 70 75 80
Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Trp
85 90 95
Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Cys Pro
100 105 110
Val Cys Ile Thr Val Asn Thr His His His His His His
115 120 125
<210> 2
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-LH重组蛋白核苷酸序列
<400> 2
ggtacttggg cctcaaaaga acctttgaga ggaggtggtg gatccgaggg ttgtcctgta 60
tgcatcacag taaatacagg cgggggaggt tcagggactt gggctagtaa agaaccactt 120
cgcgggggag gaggatccga aggatgtcct gtatgcatca ctgtgaacac tggaggtggt 180
ggttcaggaa cctgggcttc caaagagcct cttaggggtg gaggagggag tgaaggctgc 240
ccagtatgca ttactgtcaa cactggaggt ggggggagcg gtacatgggc atctaaggag 300
cctctgcggg gtggaggcgg atctgaaggt tgccctgtgt gtatcacagt caatacacat 360
catcaccatc atcat 375
Claims (10)
1.一种排卵检测试纸条，其特征在于，包括PVC底板（1）、样本垫（2）、金标垫（3）、硝酸纤维素膜（4）及吸水垫（5），所述硝酸纤维素膜、样本垫、金标垫及吸水垫均固定于PVC底板表面，硝酸纤维素膜的两端分别搭接吸水垫、金标垫，所述金标垫的外端搭接样本垫，硝酸纤维素膜上设有检测线T1（6）、检测线T2（7）及质控线（8），检测线T1上包被有鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4，检测线T2上包被有可替宁抗原，质控线上包被有羊抗鸡IgY多克隆抗体，金标垫上固化有胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物及胶体金-可替宁单克隆抗体结合物。
2.根据权利要求1所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述样本垫和吸水垫上设有保护膜（9）。
3.根据权利要求1所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述金标垫通过以下方法制得：
（a）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至7.5，取鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8，按5ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物，备用；
（b）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取鸡IgY抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min、10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-鸡IgY抗体结合物，备用；
（c）用量筒量取需要标记量的粒径40-50nm胶体金溶液，按体积百分含量为1%加入0.1M、pH7.6的Na2HPO4.12H2O溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调PH值至8.0，取可替宁单克隆抗体，按10ug/ml比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续搅拌30min后，按体积百分含量为1%加入浓度为100g/L的稳定剂BSA，搅拌20min后10000r/min，10℃离心30min，小心去除上清，用金标保存液重悬至原体积的1/100，涡旋混匀，即得胶体金-可替宁单克隆抗体结合物，备用；
（d） 将上述胶体金-鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8结合物、胶体金-鸡IgY抗体结合物和胶体金-可替宁单克隆抗体结合物按体积比5:1:2比例混合，用金标稀释液对该混合物按体积百分含量50%进行稀释，涡旋混匀后以喷量6ul/cm均匀喷涂在金标垫上，烘干。
4. 根据权利要求3所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述金标保存液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na2HPO4.12H2O，1g BSA，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml即为金标保存液。
5. 根据权利要求3所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述金标稀释液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na2HPO4.12H2O，1g BSA，1g Tween-20，20g 蔗糖，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
6.根据权利要求1所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将将硝酸纤维素膜平整贴在PVC底板中央位置，用包被缓冲液分别将鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4稀释至浓度为1.0mg/ml，可替宁抗原稀释至浓度为0.3mg/ml，羊抗鸡IgY多克隆抗体稀释至浓度为0.5mg/ml，将稀释好的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T1上，将稀释好的可替宁抗原溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线T2上，将稀释好的羊抗鸡IgY多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的质控线上，烘干。
7. 根据权利要求6所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述包被缓冲液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na2HPO4.12H2O，0.9g Nacl，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
8. 根据权利要求1所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维裁成所需规格后，用样本垫处理液喷涂均匀，烘干；所述样本垫处理液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入3.58g Na2HPO4.12H2O，0.5g BSA，1g S9，1g PVP，0.05g 防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M 盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。
9. 根据权利要求1或3所述的一种排卵检测试纸条，其特征在于，所述鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8通过以下方法制得：
（一）制备β-LH重组抗原
（1）以人β-LH糖蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAstar分析其抗原序列，选取β-LH中特有的两个表位序列A和B，与FSH、TSH糖蛋白序列比较结果表明无同源性，为β-LH所特有，将A和B表位通过柔性片段（GlyGlyGlyGlySer）连接，得到如SEQ ID No：1所示的β-LH重组蛋白氨基酸序列；
（2）β-LH重组蛋白氨基酸序列不变前提下，根据CHO细胞偏爱密码子将β-LH重组蛋白氨基酸序列转化为对应的β-LH重组蛋白核苷酸序列，得到的β-LH重组蛋白核苷酸序列如SEQID No：2所示，在β-LH重组蛋白核苷酸序列上下游分别添加酶切位点EcoRI和BamHI对应的核苷酸序列后合成目的基因，将目的基因克隆于pMD19-T载体；
（3）用限制性内切酶EcoRI和BamHI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pTT5载体12h，酶切产物分别行1%琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pTT5载体；使用T4连接酶将回收的目的基因和pTT5载体按7:1比例于4℃连接12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，于37℃恒温培养12h后，于平板上挑取单克隆菌株至含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经EcoRI和BamHI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体；
（4）将构建好的重组表达载体转染CHO-K1细胞；根据转染体系每毫升中加入2.4μg重组表达载体和3.6μg转染试剂PEI，37℃，6% CO2摇床转速120rpm培养6h，加入1% 200mM VPA以及1% 20g/L L-盐酸半胱氨酸，37℃，6% CO2摇床转速120rpm培养7天后离心收集上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，20mM咪唑溶液去除杂蛋白，300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，收液后转至截留分子量为3kD-5kD的透析袋中，于10mmol/L、pH7.4的PBS溶液中过夜透析；透析后取出于-20℃保存备用，即得β-LH重组抗原，其中20mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑0.136g，加10mmol/L、pH7.4 的PBS溶液溶解定容至100mL；所述300mM咪唑溶液通过以下方法制得：咪唑2.04g，加10mmol/L、pH7.4的PBS溶液溶解定容至100mL；
（二）制备鼠抗人β-LH单克隆抗体
（Ⅰ）取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100ug β-LH重组抗原，共400ul/只；25天后进行第二次加强免疫，具体方法为：取80ug BSA偶联蛋白用福氏不完全佐剂乳化，共400ul/只，皮下多点注射；20天后第三次加强免疫，第三次加强免疫方法同第二次加强免疫；20天后，处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0，通过聚乙二醇使融合；再加入等体积饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养；5天后半保留换液，10天后采用酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清；检测阳性的杂交瘤细胞，使用有限稀释法进行三次亚克隆，最终用β-LH重组蛋白经酶联免疫吸附法筛选得到2株单克隆细胞株1A4和6B8；
（Ⅱ）取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，每只400μL，3天后腹腔注射单克隆细胞，注射标准为1×106个/只，6-8天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水；用磁珠法抗体纯化试剂盒，通过样品处理，磁珠预处理，抗体吸附，磁珠洗涤，抗体洗脱，抗体中和，得到的纯化后的鼠抗人β-LH单克隆抗体1A4和鼠抗人β-LH单克隆抗体6B8。
10.一种使用如权利要求1所述的排卵检测试纸条的排卵检测方法。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114236119A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-25 | 润和生物医药科技(汕头)有限公司 | 新冠总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸及其制备方法 |
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