CN106443022A - 促黄体生成素半定量排卵检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板和依次固连在所述背板上的吸水垫、含有抗体工作液的硝酸纤维膜、含有胶体金工作液的胶体金垫和含有缓冲液的样品垫。本发明的有益效果是:应用单克隆抗体技术和新型金标显色技术,连续使用本试纸,能动态地测定妇女尿促黄体生成素(LH)的变化情况,可帮助医生了解卵泡发育情况、确定有无排卵,可提前12‑24小时预测排卵时间,可用于辅助诊断LH相关的内分泌综合症,对促排卵治疗、人工授精、更年期妇女LH的监测具有一定的临床应用意义。
Description
技术领域
本发明属于不孕检测技术领域,具体涉及一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸及其制备方法。
背景技术
不孕检测试纸是检测女性尿液中促黄体生产素的含量(单位为mIU/ml),适用范围为女性预测排卵以及辅助不孕症诊断。
现有的不孕检测试纸仅能提供两种结果(阴性和阳性),无法读出尿LH数值,也就定性检测试纸使得很难对LH激素水平进行动态监测,也就无法准确预测排卵时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,该试纸能有效测定促黄体生成素含量的变化情况。
本发明的另一目的是提供上述试纸的制备方法。
本发明所采取的技术方案是促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板和依次固连在所述背板上的吸水垫、含有抗体工作液的硝酸纤维膜、含有胶体金工作液的胶体金垫和含有缓冲液的样品垫。
优选的,所述抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:将检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。
优选的,所述步骤b中融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为2:1以上的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
优选的,所述步骤c中筛选采用HAT培养基来进行。
优选的,所述步骤d中检测采用酶联免疫吸附法来进行;所述冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
优选的,所述步骤e中所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1M pH值为3-4的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析24-48h。采用纯化工艺,能使最终抗体的总蛋白浓度达到5mg/ml以上,纯度>99%,ELISA检测其效价能稳定在10-6,从而能高度特异性结合尿LH,保证试纸的灵敏性和准确性。
优选的,所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7-8的3M的PBS溶液。
优选的,所述胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
优选的,所述缓冲液为0.1M Tris缓冲液。
优选的,所述Tris缓冲液加入0.5%-1%的BSA溶液。
本发明申请中,若无特殊说明,百分比均指的质量百分比。
本发明的有益效果在于:
应用单克隆抗体技术和新型金标显色技术,连续使用本试纸,能动态地测定妇女尿促黄体生成素(LH)的变化情况,可帮助医生了解卵泡发育情况、确定有无排卵,可提前12-24小时预测排卵时间,可用于辅助诊断LH相关的内分泌综合症,对促排卵治疗、人工授精、更年期妇女LH的监测具有一定的临床应用意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的其中一个实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试纸的结构示意图。
图中:1-吸水垫,2-硝酸纤维膜,3-胶体金垫,4-样品垫,5-背板。
图2为使用本发明试纸后与色卡比色的示意图。
具体实施方式
为使本领域技术人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果,下面以具体的生产实例来进一步介绍本发明的应用和技术效果。
实施例1
如图1所示,一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板5和依次固连在所述背板5上的吸水垫1、含有抗体工作液的硝酸纤维膜2、含有胶体金工作液的胶体金垫3和含有0.1M Tris缓冲液的样品垫4。
其中,抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为2:1的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,采用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:采用酶联免疫吸附法检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1MpH值为3.5的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析36h。所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7.5的3M的PBS溶液。
其中,胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
实施例2
如图1所示,一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板5和依次固连在所述背板5上的吸水垫1、含有抗体工作液的硝酸纤维膜2、含有胶体金工作液的胶体金垫3和含有加入0.7%的BSA溶液的0.1M Tris缓冲液的样品垫4。
其中,抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为2:1的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,采用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:采用酶联免疫吸附法检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1MpH值为3.5的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析36h。所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7.2的3M的PBS溶液。
其中,胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
实施例3
如图1所示,一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板5和依次固连在所述背板5上的吸水垫1、含有抗体工作液的硝酸纤维膜2、含有胶体金工作液的胶体金垫3和含有0.1M Tris缓冲液的样品垫4。
其中,抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为5:1的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,采用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:采用酶联免疫吸附法检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1MpH值为4的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析24h。所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7的3M的PBS溶液。
其中,胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
实施例4
如图1所示,一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板5和依次固连在所述背板5上的吸水垫1、含有抗体工作液的硝酸纤维膜2、含有胶体金工作液的胶体金垫3和含有0.1M Tris缓冲液的样品垫4。
其中,抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为10:1的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,采用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:采用酶联免疫吸附法检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1MpH值为4的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析48h。所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7.8的3M的PBS溶液。
其中,胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
实施例5
如图1所示,一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板5和依次固连在所述背板5上的吸水垫1、含有抗体工作液的硝酸纤维膜2、含有胶体金工作液的胶体金垫3和含有加入1%的BSA溶液的0.1M Tris缓冲液的样品垫4。
其中,抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为3:1的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,采用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:采用酶联免疫吸附法检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1MpH值为4的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析48h。所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为8的3M的PBS溶液。
其中,胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
实施例6
如图1所示,一种促黄体生成素半定量排卵检测试纸,包括背板5和依次固连在所述背板5上的吸水垫1、含有抗体工作液的硝酸纤维膜2、含有胶体金工作液的胶体金垫3和含有加入0.5%的BSA溶液的0.1M Tris缓冲液的样品垫4。
其中,抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为7:1的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,采用HAT培养基筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:采用酶联免疫吸附法检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1MpH值为3的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析24h。所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7的3M的PBS溶液。
其中,胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
为验证本发明试纸的技术效果,特以实施例1所述方法制备三批产品,试纸批号为:0320150801,0320150901,0320151001。
物理性状检测
三个批号的不孕试纸其物理性状经测试评估其外观均整洁完整,其膜条宽度三批产品经测试其均值分别为3.03mm、3.07mm、3.07mm,其液体移行速度其测试其均值分别47.7mm/min、48mm/min、47.7mm/min。
最低检测限
检测限(limit of detection)是指检测方法可检测出的最低被测量浓度,也称检测低限(lower limit of detection)或最小检出浓度(minimum detectableconcentration),有时也称为分析灵敏度(analytical sensitivity)。
不孕检测试纸产品标准中将最低检测限设定为LH标准品10mIU/ml,检测该浓度时检测带要求有色带显现,其色带显色均一,与色卡对应色标10mIU/ml颜色一致。
特异性
空白对照液:含蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)0.02mol/L,pH7.4;
测定样品液
1.含有LH标准品的样品液:
用含蛋白的磷酸盐缓冲液PBS配制5、10、25、45、65mIU/ml的LH样品液;
2.含有FSH标准品的样品液:
用含蛋白的磷酸盐缓冲液PBS配制200mIU/ml的FSH样品液;
3.含有TSH标准品的样品液:
用含蛋白的磷酸盐缓冲液PBS配制250μIU/ml的TSH样品液。
三个批号的不孕试纸经测定浓度为200mIU/ml的FSH和浓度为250μIU/ml的TSH,其试纸检测带均无色带显现。
不孕检测试纸(胶体金免疫层析法)连续三批产品经系列相关实验,结果表明,能够满足临床实际需要。
半定量分析semiquantitative analy-sis泛指那些对测定组成含量准确性要求比定量分析稍差的分析方法,其特点是简便、快速、费用低。对于尿LH的检测来说只要求分析速度快,不太追求成分的准确含量,同样;尿LH半定量检测目的也仅用于粗略的知道尿LH水平,用以预测排卵是足够的。
不孕检测试纸可以相对精确的测定出尿LH数值,这是符合半定量检测方法的要求的;因此,从产品性能分析来看,不孕检测试纸属于半定量检测试纸。
在使用本发明上述实施例所得试纸时,先确定您上次月经周期的天数(以月经来潮的当天为第一天,到下次月经来潮日的上一天为止,之间的天数为月经周期天数)。再按表1推算本次开始测试的时间:
表1
例如:如果测试者上次月经周期的天数为26天(以月经来潮的当天为第一天到下次月经来潮日的前一天之间的天数),则先在表中上栏找到自己上次月经周期的天数26,对应下栏可找到数字9。以月经开始来潮的当天作为第一天,就在本次月经开始来潮的第9天开始测定。如果月经周期为28天,则就在本次月经开始来潮的第11天开始测定,依此类推。
从开始测试之日起,每天在相对固定的时间进行测定。建议测定两次,推荐时间:中午(11:00-13:00)、晚上(20:00—23:00)各测定一次,每次一条。操作步骤如下:1.用干燥、洁净容器取尿液少许(之前4小时内尽量不要排尿,也不要大量饮水)。2.撕开一包铝箔袋,取出试纸条(请勿触摸到试纸中段白色部分)。3.手持无箭头的一端,把试纸箭头所指的一端浸入尿液中,注意不要使尿液液面超过箭头所指的横线。液体移行到试纸条中间时取出平放,18分钟时观察试纸中段是否显示一条红色色带(超过20分钟结果仅供参考)。4.如未显示色带,则在色卡背面记录表中记录当次结果为0。5.如出现色带,请将色带与所配色卡上色标比对颜色深浅,并在色卡背面记录表中记录该比色数值。
比色说明(参见图2):与所附色卡比色时,将纸条平放于色卡上,纸条垂直于色标色带,让纸条的色带与色标色带重合。比较色带颜色与色标颜色的差异,找出与色带颜色最接近的色标,确定出数值,将测试时间与结果记录在色卡背面的表中。注意:比色时,如果检测带颜色深浅处于某两个相连色标颜色之间,可取两色标数值中间值或根据其颜色接近色标的程度,取估计值。(比如:颜色处于25与45之间,可取中间值35,如果颜色更接近于45,可取估计值40等)。
同时,色卡背面印有座标图,横轴为测定顺序(第几次测定),纵轴为测定数值。可将每次的测定结果描点在座标图中。如本次测定为第5次测定,数值为35,则先在横轴上找到第5次,再在纵轴上找到35,两者垂直相交的点即为本次的数值点。再将每次测定的数值点连接起来为一条曲线。
本发明所得试纸使用后仅会出现一条检测带,将检测带与色卡进行对比,就可以获得相应数值。测得尿LH≤10mIU/ml时,建议一天测试1条;测得尿LH>10mIU/ml时,一天测试2条,时间间隔8小时;当测得尿LH≥25mIU/ml时,一天测试3-4条,时间间隔为4小时,继续监测,若测得LH数值小于上次所测数值,说明已经越过峰值,12-24小时内将会排卵,此时可以停止检测,安排同房。在健康成年男性及具有正常月经周期而正处于卵泡期或黄体期的成年妇女人群中,检测结果其LH浓度值均低于20mIU/ml。
本发明所得试纸取消了质控线(C线)的设计,在经典的侧向层析方法中,质控线的存在意义是看胶体金是否从胶体金结合垫中释放出来并通过NC膜,并以此保证实验过程是完成的;其基本原理是:胶体金上结合一个抗LH抗体,也可称为金标抗体,C线所用的也是一种抗体(多抗),这个多抗的抗原既是金标抗体,也称为羊抗鼠IgM,称为二抗,由于这对抗原-抗体反应是已经处理在试纸上了(C线所检测的抗原就是金标抗体),所以这对抗原-抗体反应对于产品检测没有任何帮助,反而严重阻碍使用者判断结果。C线的存在只是符合定性检测方法的(定性试纸输出的结果是阳性和阴性结果,该结果的输出依赖于C线和T线的对比),而对于半定量和定量检测来说,C线的存在是一种干扰。
最后应说明的是,以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,本领域技术人员应当理解,依然可以对本发明进行修改或者等同替换,而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (10)
1.促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:包括背板(5)和依次固连在所述背板(5)上的吸水垫(1)、含有抗体工作液的硝酸纤维膜(2)、含有胶体金工作液的胶体金垫(3)和含有缓冲液的样品垫(4)。
2.根据权利要求1所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述抗体工作液的制备方法包括以下步骤:
a、动物免疫:采用纯种BALB/C小鼠作为免疫对象,注射人体促黄体生成素作为抗原溶液进行免疫;
b、细胞融合:将免疫后的小鼠处死,取出脾脏,将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合;
c、选择杂交瘤细胞:所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后,筛选出杂交瘤细胞;
d、杂瘤细胞克隆:将检测抗体呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆,冷冻;
e、抗体的制备和纯化:将所述呈阳性的杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔中,小鼠感染产生腹水,抽取所述腹水经过滤、纯化,得到抗体。
3.根据权利要求2所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述步骤b中融合是将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按体积比为2:1以上的量混匀后,离心,去除上清液,在室温条件下加入50%的PEG溶液,静置,再加入不含血清的培养液或盐水缓冲液,再静置。
4.根据权利要求2所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述步骤c中筛选采用HAT培养基来进行。
5.根据权利要求2所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述步骤d中检测采用酶联免疫吸附法来进行;所述冷冻的方法:先在4℃放置1小时,再在-20℃放置30分钟,然后-80℃放置12小时,再转入液氮中冻存。
6.根据权利要求2所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述步骤e中所述过滤是向腹水中加入结合缓冲液,离心,用0.45um滤膜滤过;所述纯化是将所得过滤液上样于Protein A亲和层析柱,再用0.1M pH值为3-4的柠檬酸缓冲液进行洗脱,收集洗脱液,加入0.5M的Tris缓冲液进行中和,最后于4℃透析24-48h。
7.根据权利要求6所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述腹水与结合缓冲液按体积比为1:1的量进行混合;所述结合缓冲液为pH值为7-8的3M的PBS溶液。
8.根据权利要求1所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述胶体金工作液的制备方法包括以下步骤:
a、将0.01%的氯金酸溶液加热煮沸,加入1%的柠檬酸溶液,继续煮沸,至溶液呈红色;然后离心,去除上清液,得浓缩后的胶体金溶液;
b、将所述抗体工作液和所述浓缩后的胶体金溶液混合,经偶联反应形成金标抗体,再经冷冻,离心浓缩,得到胶体金工作液。
9.根据权利要求1所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述缓冲液为0.1M Tris缓冲液。
10.根据权利要求9所述的促黄体生成素半定量排卵检测试纸,其特征在于:所述Tris缓冲液加入0.5%-1%的BSA溶液。
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