CN101963618A - 在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法及应用其检测目标抗原的抗体微阵列芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法,主要是在制作抗体微阵列芯片时,增加异嗜性抗体识别点。这个识别点的抗体是由各种指标的固相抗体的相似物组成。通过对具有统计学意义数量的样品进行检测后建立异嗜性抗体阳性干扰的判断标准,根据该标准判断以后的针对同种指标的临床样品是否存在异嗜性抗体阳性干扰。该方法是在不增加现有的工作量和试剂的情况下,对异嗜性抗体进行识别;不需要对每一份样品都添加阻断剂,节省了很多的阻断剂的用量,因此可以降低成本并减少未知的干扰;同时可以通过生物芯片阅读仪自动识别,客观判断,而不需要对病人的临床症状进行分析。
Description
技术领域
本发明涉及在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法及应用其检测目标抗原的抗体微阵列芯片。
背景技术
分析病人血清中的多种蛋白质从而指导诊断、治疗和预后,促进了蛋白质并行分析方法的发展(Expert Rev Mol Diag 2007;7:87-98.)。这种多种蛋白并行分析的方法称为蛋白质芯片,蛋白质微阵列芯片等。目前的多指标分析方法主要是基于传统的免疫学原理,将抗原或抗体以阵列的形式固定在固相表面,与血清中的相应的靶物质特异性的结合,并与标记的抗体相结合,标志物能够被蛋白质芯片阅读仪拍摄或扫描,计算机软件对扫描或拍摄的结果进行分析,得出各种蛋白质的分析结果。多指标分析的方法可以用于早期诊断、鉴别诊断、疾病分期以及预后(Clin chem.56:2,186,2010)。到目前为止主要应用的是抗体微阵列芯片技术。除了蛋白质芯片本身遇到的新的技术挑战,传统的免疫学方法所遭遇的很多技术问题,也必将在蛋白质芯片中体现,如异嗜性抗体的干扰。
异嗜性抗体存在于血清中,能够与动物来源的免疫球蛋白结合,从而干扰基于双抗体夹心法的免疫学检测(Clin chem.34/1,27-33,1988)。在血清中如果不存在被检测的特异性抗原,而存在这种能够结合动物(尤其是小鼠)免疫球蛋白的抗体,就会导致假阳性的结果(Lancet 1980;ii:1136,clin chem.1986;32:476,1986;32:1491,1987;33:414)。
目前临床实验室和诊断试剂生产厂商普遍采取了好多措施来警示这种异嗜性抗体的存在,并采用相应的封闭方法。这些方法包括1)采用其他的方法作对照,是否出现结果的差异(clin chem.2000;46:1037,clin chem.;1999;45:942,Ann clin bio 1999;36:704-21);2)对血清样品进行系列稀释,看信号是否呈现线 形(clin chem.;1999;45:942,Ann clin bio 1999;36:704-21);3)用特殊的试剂筛选血清中是否存在抗小鼠的抗体(clin chem.;1999;45:942,),或者用封闭试剂对样品进行预处理(clin chem.2001 47 1332,clin chem.1998 44 1942)。但是以上各种方法不能完全消除异嗜性抗体的影响。如果要对每一分血清进行筛选和封闭,存在工作量翻备,试剂成本提高的问题。并且由于异嗜性抗体干扰的多样化,以及各种产品所使用的抗体不同,目前尚未有一种方法可以有效的消除所有的异嗜性抗体的干扰。
在抗体微阵列系统中,一个产品中通常含有十几到二十几对单克隆抗体。被异嗜性抗体干扰的几率要比普通的免疫学检测产品要高的多。对每个抗体进行人源化改造是不可行的。对每一份血清在检测前进行预处理工作量会很大,如PEG处理。根据我们通常的经验是在每一份血清中添加阻断剂如HBR或mac33,大部分的样品中的干扰会被消除,但是剩余的一些顽固的样品中的干扰就很难判断是异嗜性抗体干扰还是指标的真阳性,对于一个肿瘤这种致死的疾病来说,肿瘤指标的假阳性所造成的负担应该尽可能的避免。因此需要建立一种对异嗜性抗体识别的有效机制,尽可能的减少假阳性的产生。
发明内容
本发明的一个目的在于克服上述现有的方法不能完全消除异嗜性抗体的影响或不能有效识别异嗜性抗体的缺陷,提供在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法。
在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法,包括以下步骤:
(1)根据检测疾病的类型制备的抗体微阵列芯片的预定组成,对所有需要固相化的抗体进行免疫球蛋白的型和亚型的鉴定;
(2)根据步骤(1)的鉴定的所有抗体的型和亚型的种类,选择所有抗体的型和亚型的种类相同的多种与固相化抗体、被检测的抗原、酶标抗体不发生交叉反应的单克隆抗体进行组合得到混合物(mixture monoclonal antibodies,简称MMAB);
(3)在抗体微阵列芯片的制备过程中,在每一个检测阵列内均设置增加一个用于对照控制的识别异嗜性抗体干扰的识别点,所述识别点中的点样样品为 步骤(2)的混合物;
(4)取步骤(3)制作完成的抗体微阵列芯片检测系统(包括标准品和酶标二抗,以及相关各种试剂)检测若干份血清。将每一份血清分成两份,在其中的一份血清中添加所述步骤(2)的混合物,另一份血清中不添加所述步骤(2)的混合物,对所述血清采用生物芯片阅读仪进行检测,当有血清在添加所述步骤(2)的混合物后出现阳性指标转阴的结果则该样品判断为异嗜性抗体干扰阳性,去除异嗜性抗体阳性干扰的血清,对剩余血清的识别点进行读数,根据检测结果取单侧99%可信限的读数为判断血清是否存在异嗜性抗体干扰的标准临界值;
(5)采用步骤(4)的标准临界值判断检测临床样品,当临床样品的识别点读数高于所述标准临界值,则该血清被判断为异嗜性抗体干扰阳性。优选地,所述步骤(1)中的所使用的固相化抗体均为单克隆抗体。
优选地,所述步骤(2)中的不相关单克隆抗体的品种数量为1种以上,优选为10种以上。
优选地,所述步骤(3)中在识别点中各种单克隆抗体样品为等量混合。
优选地,所述步骤(4)中的在其中一份血清中添加所述步骤(2)的单克隆抗体混合物的量为按体积比5%(v/v)。
本发明的另一个目的在于提供一种采用上述方法检测目标抗原的抗体微阵列芯片,所述抗体微阵列中含有识别异嗜性抗体的识别点。
抗体微阵列系统的优势就是信息量大,指标之间能够互相参考。本发明提供了一种完全不同于传统免疫学检测方法里消除异嗜性抗体干扰的方法,可以有效、低成本、简单的对异嗜性抗体进行识别,然后进行阻断。本发明的异嗜性抗体识别点的抗体是由各种指标的固相抗体的相似物组成,类似于质量控制点。通过对具有统计学意义数量的样品进行检测后建立异嗜性抗体阳性干扰的判断标准,根据该标准判断以后的针对同种指标的临床样品是否存在异嗜性抗体阳性干扰。与现有技术相比,本发明所述在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法,是在不增加现有的工作量和试剂的情况下,对异嗜性抗体进行识别;不需要对每一份样品都添加异嗜性抗体阻断剂,与各种阻断剂相比,对已经识别的少量干扰阳性样品添加的所述多种不相关单克隆抗体的费用非常 低,因此可以降低成本并减少未知的干扰;同时可以通过生物芯片阅读仪自动识别,客观判断,而不需要对病人的临床症状进行分析。
附图说明
图1为实施例的抗体点样方阵示意图。
图2显示了各种异嗜性抗体干扰阳性样品的不同表现形式的检测图示。
图3显示了干扰阳性样品在加了MMAB阻断剂以后出现各个指标从假阳性恢复为阴性的对照图像。
图4为实施例的400份血清样品中每份样品的MMAB点的读数分布图。
图5显示了实施例的第657号健康体检血清在不添加阻断剂、添加1%(V/V)阻断剂、添加5%(V/V)阻断剂的检测结果。
图6显示了实施例的P24号血清样品在添加MMAB阻断剂前后的检测结果对照。
具体实施方式
基本原理
1、双抗体夹心法原理
将特异性抗体包被于固相载体上,形成固相抗体;加入含待测抗原的样品,使之与固相抗体结合;再加入酶标记的另一特异性抗体,使酶标抗体与固相免疫复合物中的抗原结合;最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
2、抗体微阵列检测原理
抗体微阵列技术基于抗原和抗体专一性结合的原理,将多种抗体结合在固相基质(如:特殊处理的玻片、有机膜片、硅微球等)上,检测生物样品中可与之专一性结合的对应抗原。抗体微阵列具备微型化,集成化,高通量化的优势。
3、MMAB抗体识别异嗜性抗体干扰的原理
病人血清/血浆中的内源性异嗜性抗体,可结合其他种属的免疫球蛋白,包括作为免疫分析试剂的抗体来源种属。这些抗体会干扰免疫分析系统,造成 比实际分析物浓度更高的检测值,因此有误判样本的可能。虽然异嗜性抗体可以影响各种检测,但主要作用于夹心法免疫分析系统。夹心法免疫检测至少使用两种针对不同表位抗原的抗体,捕获抗体在固相,标记抗体游离在溶液中。正常情况下,样本中的抗原与两抗体结合,标记抗体与固相结合的数量与样本中的抗原浓度成正比。异嗜性抗体在无抗原的情况下,也可以桥连这两种抗体,因而增加结合标记抗体的浓度(图2),造成假阳性结果。
我们选择的作为识别点的非相关抗体与固化抗体型和亚型相同,除了抗原结合位点的氨基酸序列不同以外,绝大部分的分子结构相似或相同。异嗜性抗体在于固化抗体结合的同时,也能够与这些不相关抗体结合,造成这些同时出现阳性。这样,在检测样品时,如果样品中存在特异性的抗原,只会与特异性的抗体结合,不会出现异嗜性抗体干扰识别点的强信号,那么其阳性是真实的,如果样品中存在异嗜性抗体的干扰,不但出现特异性的信号增强,也会出现异嗜性抗体干扰识别点的强信号,那么该指标的阳性结果应该引起怀疑。
单克隆抗体制备过程
1、抗原免疫小鼠。
2、取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。
3、筛选所需要的融合单克隆细胞,建立细胞库。
4、提取单克隆细胞分泌的抗体,获得所需的单克隆抗体。
更详细的步骤参照甑永苏、邵荣光编著的《抗体工程药物》(化学工业出版社,2002)
单克隆抗体型和亚型检测方法
将待测样本同时加在9个测试孔中筛选和确定单克隆抗体/小鼠抗体的亚型。检测步骤如下:
1.包被抗体。50μl/孔,在4℃冰箱内过夜或者在室温下温育2hr。然后37℃下封闭液封闭2hr,125μl/孔。最后洗板,125μl/次,每次洗4遍。
2.上待测抗体样品(50μl/孔),同时加9个孔,最后第10个孔加阳性质控(单克隆鼠抗IgG1),在37℃下温育1hr。洗板,125μl/次,每次洗4遍。
3.在前面9各孔分别依次加入各种亚型抗体:正常兔血清(阴性质控)、鼠抗IgG1、鼠抗IgG2a、鼠抗IgG2b、鼠抗IgG3、鼠抗IgA、鼠抗IgM、鼠抗Kappa Light Chain、鼠抗Lambda Light Chain一共九种检测亚型抗体,最后再加入鼠抗IgG1到阳性质控孔中。同样在37℃下温育1hr。洗板,125μl/次,每次洗4遍。
4.将配置好的酶标二抗羊抗兔抗体IgG均分别加入到10个孔中,50μl/孔,37℃下温育1hr。然后洗板,125μl/次,每次洗4遍。
5.加入发光液,等待30min反应后通过酶标仪在405处读数,读数时要保证阳性对照的值处在0.8~1.2之间。
标记抗体制作过程
抗体标记的方式根据产品设计的需要,可以是酶标记、荧光标记、金标标记等。其标记方法也根据不同的标记原理进行。
抗体微阵列制作过程
采用全自动的微量高密度点样系统,将第一抗体按照一定的秩序排列在固相基质上,抗体与基质的结合方式根据基质以及表面特征的不同,可以是静电吸附也可以是化学偶联。在点样后经过装配、封闭、干燥等处理,包装成成品。为了保证反应的通量,以及被检测样品与标准的抗原在同一反应条件下进行,要求有一种反应的模块,能同时装有几十张已经点制有相同的蛋白质阵列的基质。而且这几十个抗体阵列在整个反应过程中都形成一个独立的反应体系,不相互影响,不相互渗漏。
混合校准品制作过程
抗体微阵列检测系统所使用的校准品是将多种被检测物质的抗原稀释于冻干缓冲体系中,根据每个指标抗原原料的浓度和校准品中该指标所需要的浓度,计算得出抗原原料的加入量,最后进行冻干。采用冻干标准品的工艺是为了标准品的稳定保存和运输方便。冻干后的校准品会按照严格的溯源过程为其各指标的浓度赋值。
交叉反应试验方法
为了避免用于判断样品是否被异嗜性抗体干扰的MMAB点与抗体微阵列中其他指标之间存在交叉反应,我们在从自有杂交瘤细胞库随机选择单抗进行混合前即对每一个被选择的单抗进行交叉反应的验证,只有不发生交叉反应的单抗才被选择用于混合。
验证是否存在交叉反应的实验我们是这样进行的,首先按照抗体微阵列的制备方案将待选择的单抗点于基质上,然后分别加入各种酶标抗体以及按照抗体微阵列系统检测生物样品的过程加入校准品和酶标抗体,只有在这两种情况下都不发生交叉反应的时候,该抗体才会被挑选用于混合MMAB。
抗体微阵列检测系统组成
整个抗体微阵列检测系统由如下部分组成:抗体微阵列模块、系列浓度校准品、复溶剂、反应液(示踪剂标记的抗体混合液)、浓缩洗液等。其他的实际根据检测系统的原理实际的需要。
抗体微阵列系统检测生物样品的过程
样品检测过程分成5个环节:
1、第一抗体(抗体微阵列)与生物样品主要是血清进行反应,特异性的捕获样品中的抗原。
2、已经结合第一抗体的抗原与示踪抗体进行特异性的结合。
3、以上两个步骤之间都需要通过洗涤方法,将没有结合的其他成分清洗掉。
4、采用特殊的阅读仪采集生物信号,可以是拍摄成像、或者是扫描成像。
5、数据处理。首先制作各种指标的标准曲线,再阅读被检样品的读数,根据标准曲线获得样品各种指标的浓度。
异嗜性抗体干扰判断方法的建立
采用上述抗体微阵列芯片的检测步骤和方法检测400份血清样品,每一份分成两份,其中一份加入5%(V/V)作为识别点的点样样品MMAB,另一份不 添加MMAB,添加的和未添加的同时检测读数。我们对异嗜性抗体干扰阳性进行了定义。如果一份血清样品在添加MMAB前后出现某个指标或某一群指标的检测结果的显著差异,就表示这份血清存在异嗜性抗体的干扰。其中结果差异定义为指标检测结果跟参考值相比,存在阳性和阴性的差异。如果没有出现这种情况,我们就认为该份血清中没有异嗜性抗体干扰,或干扰极弱,不至于影响检测结果。对剩余血清的识别点进行读数,根据检测结果取单侧99%可信限的读数为判断血清是否存在异嗜性抗体干扰的标准临界值。
实施例
检测11种肿瘤标志物的抗体微阵列检测系统
1、主要原材料:
11种肿瘤标志物的抗体和抗原的来源如表1所示:
表1 11种肿瘤标志物的抗体和抗原的来源
肿瘤标志物指标 | 产品代号 | 厂商 |
CA19-9第一抗体 | M8073022 | Meridian.,US |
CA153第一抗体 | M37901M | Meridian.,US |
CA242第一抗体 | 101-01 | Fujirebio Diagnostics |
CA125第一抗体 | M86306M | Meridian.,US |
SCC第一抗体 | SCC113 | Fujirebio Diagnostics |
CK19第一抗体 | 120-01 | Fujirebio Diagnostics |
NSE第一抗体 | 405-01 | Fujirebio Diagnostics |
CEA第一抗体 | M0911042 | Fitzgerald CO.,US |
AFP第一抗体 | M19301 | Fitzgerald CO.,US |
B-HCG第一抗体 | M15294 | Fitzgerald CO.,US |
PSA第一抗体 | M86506M | Meridian.,US |
CA19-9第二抗体 | 210-508 | Fujirebio Diagnostics |
CA153第二抗体 | M37552M | Meridian.,US |
CA125第二抗体 | M86294M | Meridian.,US |
SCC第二抗体 | SCC107 | Fujirebio Diagnostics |
CK19第二抗体 | KS19.1 | Mpbio.,US |
NSE第二抗体 | 5E2 | Fitzgerald CO.,US |
CEA第二抗体 | M0911041 | Fitzgerald CO.,US |
AFP第二抗体 | M94115 | Fitzgerald CO.,US |
B-HCG第二抗体 | M141 | Calbioreagents |
PSA第二抗体 | M86209M | Meridian.,US |
CA19-9抗原 | 116-05 | Fujirebio Diagnostics |
CA153抗原 | 211-06 | Fujirebio Diagnostics |
CA242抗原 | 117-05 | Fujirebio Diagnostics |
CA125抗原 | 210-05 | Fujirebio Diagnostics |
SCC抗原 | 803-25 | Fujirebio Diagnostics |
CK19抗原 | 30R-AC040 | Fitzgerald CO.,US |
NSE抗原 | 30R-AN004 | Fitzgerald CO.,US |
CEA抗原 | 30C-CP1001 | Fitzgerald CO.,US |
AFP抗原 | 30R-AA030 | Fitzgerald CO.,US |
B-HCG抗原 | 30R-AC065 | Fitzgerald CO.,US |
PSA抗原 | 30C-CP1099 | Fitzgerald CO.,US |
辣根过氧化物酶和化学发光底物(Supersignal Femto),单克隆抗体分型试剂盒( Monoclonal Antibody Isotyping Kit I)(HRP/ABTS)购自美国Pierce公司。单克隆抗体的酶标记方法采用过碘酸钠法。硝酸纤维素膜购自美国GE公司。其他涉及到的化学试剂均为分析纯。
样品标本:血清样品标本从当地医院收集,为医院送检血清检测以后的废弃血清,在医院伦理委员会的要求下,所有血清均隐去病人信息。血清在收集后进行分装,并保存在-20℃,临用时融化,不能反复冻融。
2、测定肿瘤标志物相关固相抗体型和亚型
表2 11种肿瘤标志物的各种固相抗体的型和亚型
肿瘤标志物指标 | 固化抗体的型和亚型 |
CA19-9 | IgG1/Kappa |
CA153 | IgG1/Kappa |
CA242 | IgG1/Kappa |
CA125 | IgG1/Kappa |
SCC | IgG1/Kappa |
CK19 | IgG2a/kappa |
NSE | IgG1/Kappa |
CEA | IgG1/Kappa |
AFP | IgG1/Kappa |
β-HCG | IgG1/Kappa |
PSA | IgG1/Kappa |
从表2可以看出11种肿瘤标志物的各种固相抗体的型和亚型有两种,其中大部分的抗体的型和亚型为IgG1/kappa,除了CK19的抗体为IgG2a/kappa。根据以上固相化抗体的型和亚型,理论上只要选择2种单克隆抗体。但是由于异嗜性抗体的多样性,品种太少会识别不出一部分异嗜性抗体的干扰,我们从自有杂交瘤细胞库随机选择相应的单抗,原则是:(1)在IgG1和IgG2a的单抗中随机选择多种单抗,尽量的多样化,在本实施例中为10种,其中两种为IgG2a,其余为IgG1;(2)这些单抗与被检测的抗原和抗体不发生交叉反应。
对异嗜性抗体干扰示踪抗体做出以上的选择,主要是基于以下的原因:
(1)、异嗜性抗体干扰免疫学检测的方式多种多样,所以选择识别抗体的品种越多越好。没有选择多克隆抗体或者小鼠的IgG直接作为识别抗体,是因为,无法控制各种型和亚型的抗体的比例。一些罕见型和亚型的抗体由于在总IgG中含量过低,无法识别相应的异嗜性抗体干扰。而选择成株的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体,可以根据需要,按一定的比例加入不同型(亚型)的IgG,而且每一批的混合物中不同单克隆抗体的比例可以有效的稳定控制。
(2)、在本系统中,11种指标的抗体只有两种型和亚型,理论上只要选择2种单克隆抗体。但是由于异嗜性抗体的多样性,品种太少会识别不出一部分异嗜性抗体的干扰。我们实验室自备丰富的杂交瘤细胞库,因此选择尽量多的单克隆抗体品种进行混和。本实施中为10种。
被选择的10种单克隆抗体,其中8株为IgG1/kappa,2株为IgG2a/kappa,分别为201abNC04(IgG1/kappa),204abND09(IgG1/kappa),403abNC01(IgG1/kappa),413abND05(IgG2a/kappa),807abND05((IgG1/kappa),813abNC01(IgG1/kappa),813abNC02(IgG2a/kappa),814abNC02(IgG1/kappa),814abNC05(IgG1/kappa),818abNC02(IgG1/kappa),等量混合,简称为MMAB,使用0.1mol/L的PBS溶液稀释至1-5mg/ml。经过交叉反应实验,不与任何一种肿瘤标志物的第一抗体、第二抗体、抗原发生交叉反应。在不同的实施例中,选择的单克隆抗体可以不同。
3、制备抗体微阵列芯片
抗体微阵列芯片的制作方法参考Sun等的报道(Anticancer Research 2004;24:1159-1166.)。每种抗体在硝酸纤维素膜上的点样顺序如图1所示。每种抗体点样平均浓度为0.6mg/ml,点样量为20nl,MMAB的点样浓度为1mg/ml。每种样品点样采用双点。点样的设备是上海铭源数康公司的HD-2003A点样仪。点样完成后,硝酸纤维素膜用膜具装配后,再用含有5%BSA的PBS进行封闭。每个膜具内含有48个抗体微阵列,在检测时同时反应,通常5个微阵列用来制作标准曲线,一个或两个阵列用来进行质量控制,其余的阵列均用作血清样品检测。
为了保证反应的通量,以及被检测样品与标准的抗原在同一反应条件下进行,要求有一种反应的模块,能同时装有几十张已经点制有相同的蛋白质阵列的硝酸纤维素膜。而且这几十张硝酸纤维素膜在整个反应过程中都形成一个独立的反应体系,不相互影响,不相互渗漏。本发明采用本申请人的中国专利号为01253423.4的蛋白芯片反应模块。这种蛋白芯片反应模块包括盒盖1和盒体5两部分。其中盒盖是多孔的塑料板1,孔是方形的,数量是48个,每个孔的分隔板突出于该塑料板的上方和下方,并紧贴于膜片2上,有利于滴加样品时防止样品之间的交叉污染。盒体5包括粘贴于垫片上方具有48个标志性蛋白点阵的硝酸纤维素膜2、双面粘性的48孔橡胶片3和粘贴于垫片下放的48空塑料板4。其中塑料板4具有突出平面,平面的面积略小于该塑料板4,以便同盒盖1相吻合。突出的平面上粘附有双面粘性的48孔橡胶片3,橡胶片3上粘附膜片2,牢固固定膜片并防止渗漏,并便于操作。盒盖,膜,橡胶片的右下角呈钝 形,作为蛋白芯片的位置标志,并且在盒盖和盒体板上均有数字标记,便于装配和使用。
4、混合校准品的制备和定值
抗体微阵列检测系统所使用的校准品是将11种肿瘤标志物的抗原稀释于冻干缓冲体系中,根据每个指标抗原原料的浓度和校准品中该指标所需要的浓度,计算得出抗原原料的加入量,最后进行冻干。采用冻干标准品的工艺是为了标准品的稳定保存和运输方便。冻干后的校准品会按照严格的溯源过程为其各指标的浓度赋值。定值结果如下表3所示:
表3校准品的定值结果
标志物 | 浓度单位 | SD0 | SD1 | SD2 | SD3 | SD4 |
CA19-9 | U/ml | <0.6 | 35.54 | 71.09 | 142.17 | 284.3 |
NSE | ng/ml | <0.05 | 12.16 | 24.33 | 48.66 | 97.3 |
CEA | ng/ml | <0.2 | 5.37 | 10.74 | 21.49 | 43.0 |
CA242 | U/ml | <1.0 | 17.54 | 35.08 | 70.15 | 140.3 |
CK19 | ng/ml | <0.1 | 4.26 | 8.52 | 17.03 | 34.1 |
β-HCG | mIU/ml | <0.1 | 2.82 | 5.65 | 11.29 | 22.6 |
AFP | ng/ml | <0.61 | 13.58 | 27.15 | 54.30 | 108.6 |
SCC | ng/ml | <0.02 | 4.59 | 9.19 | 18.38 | 36.8 |
c-PSA | ng/ml | <0.03 | 4.09 | 8.18 | 16.36 | 32.7 |
CA125 | U/ml | <0.6 | 32.89 | 65.78 | 131.55 | 263.1 |
CA15-3 | U/ml | <1.0 | 15.39 | 30.78 | 61.55 | 123.1 |
5、混合酶标二抗的制备
将各种第二抗体进行辣根过氧化物酶标记,标记过程如下:
(1)配制10mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.06M过碘酸钠溶液,两种溶液按照需要等体积混合,在4℃冰箱中静置避光30分钟,至颜色由棕色变为墨绿色。
(2)配制1%乙二醇溶液,再以之前混合溶液体积的一半逐滴加入混合液,即三种溶液各占三分之一体积。4℃冰箱中静置避光45分钟,至颜色由墨绿色 变回棕色。
(3)在酶处理液中加入等质量的抗体;扎透析袋,用缓冲液试漏,将酶与抗体的混合物加入透析袋中,放入CBS缓冲液中,4℃冰箱透析过夜。
(4)第二天配制5mg/ml的硼氢化钠溶液,精确吸取透析袋内液体,置于EP管中,逐滴加入对应比例的硼氢化钠溶液(按质量比5(抗体)∶1(溶液)),并充分混匀,静置4℃冰箱避光2.5-3小时。
(5)在上述液体中逐滴加入等体积饱和硫酸铵,摇晃混匀,静置4℃冰箱避光3小时;然后用离心机4℃,4000转/分钟下离心30分钟。
(6)扎透析袋,用缓冲液试漏,将液体加入透析袋中,4℃冰箱透析过夜。
(7)精确吸取透析袋内液体;在紫外分光光度计以280nm和403nm测O.D值。用稳定剂将酶标二抗稀释至浓度为0.2mg/ml。
然后将各种酶标记二抗按照各自的工作浓度混合于稳定剂中。各种抗体的工作浓度如下表4:
表4各种抗体的工作浓度
标志物 | 二抗浓度 |
CA19-9 | 0.15μg/ml |
NSE | 0.1μg/ml |
CEA | 1.2μg/ml |
CA242 | 0.15μg/ml |
CK19 | 2μg/ml |
β-HCG | 0.15μg/ml |
AFP | 0.1μg/ml |
SCC | 1.3μg/ml |
c-PSA | 2.7μg/ml |
CA125 | 1μg/ml |
CA15-3 | 1.5μg/ml |
6、抗体微阵列芯片的检测步骤和方法
A、试验前准备
校准品稀释:
1)、将校准品4用240μl复溶剂复溶;
2)、将校准品0用600μl复溶剂复溶;
3)、吸取120μl复溶后的校准品4,加120μl复溶后的校准品0稀释,得到校准品3;
4)、吸取120μl校准品3,加120μl复溶后的校准品0稀释,得到校准品2;
5)、吸取120μl校准品2,加120μl复溶后的校准品0稀释,得到校准品1;
6)、将定量质控品用120μl复溶剂复溶。
浓缩洗涤液用纯化水稀释15倍。
B、加待测样本、校准品复溶液、定量质控品复溶液,各吸取100μl,加入不同的芯片表面。
C、温育,振荡,37℃、100rpm温育振荡30分钟。然后弃去芯片表面的液体。
D、洗涤,将芯片放入洗盒中加入洗涤液,37℃、250rpm温育振荡8分钟,弃去洗涤液。共洗涤四次。
E、加反应液,每个芯片表面各加入100μl反应液。
F、温育,振荡,同步骤3。
G、洗涤,剥离蛋白芯片集成块的上部,后同步骤4。
H、检测,在每个芯片的膜表面加入20μl已混合15分钟的检测液A和B混合液,静置1.5分钟。
I、阅读,分析,将蛋白芯片集成块放入Lu-07生物芯片阅读仪,软件自动读取图象(时间60s)、作校准曲线、分析各被测样本的测试结果并打印数据报表。
蛋白芯片的制备和使用方法更详细的步骤参照本申请人的中国专利《蛋白芯片及其制备方法和使用方法》,专利号为01253423.4。
检测的典型图片如图2、3所示。图2显示了各种异嗜性抗体干扰阳性样品的不同表现形式的检测图示。其中A为没有干扰的健康人血清对照样品,各种指标均为阴性,D是干扰阴性的肿瘤血清对照,其中的阳性制表为真阳性。其中MMAB点的读数都很低。图2的B、C、D、E、F为各种干扰的图谱,干扰 可以影响2个或全部指标的检测结果,MMAB均呈现强信号。图3显示了干扰阳性样品在加了阻断剂以后出现各个指标从假阳性恢复为阴性的对照图像。A1、B1、C1是没有加阻断剂之前的检测结果,A2、B2、C2是加了阻断剂以后的检测结果,MMAB点的信号也恢复到了背景值。
7、根据上述抗体微阵列芯片的检测步骤和方法建立判断异嗜性抗体干扰阳性的标准值
采用上述抗体微阵列芯片的检测步骤和方法检测400份血清样品,每一份分成两份,其中一份加入5%(V/V)作为识别点的点样样品MMAB,另一份不添加MMAB,添加的和未添加的同时检测读数(参见图4)。图4显示了每份样品MMAB点的读数分布图。我们对异嗜性抗体干扰阳性进行了定义。如果一份血清样品在添加MMAB前后出现某个指标或某一群指标的检测结果的显著差异,就表示这份血清存在异嗜性抗体的干扰。其中结果差异定义为指标检测结果跟参考值相比,存在阳性和阴性的差异。如果没有出现这种情况,我们就认为该份血清中没有异嗜性抗体干扰,或干扰极弱,不至于影响检测结果。检测结果是有9份样品在添加MMAB以后至少有2个肿瘤标志物指标从阳性转为阴性,具体检测结果参见表5。所有400份样品中没有一份样品在添加了MMAB后,有肿瘤指标从阴性转为阳性。
″+″表示检测结果高于该指标的正常参考值
″-″表示检测结果低于该指标的正常参考值
将被判断为异嗜性抗体干扰阳性的样品排除以后,我们对剩余的391份干扰阴性的样品的MMAB识别点进行读数,读数的频数分布表如表6所示。
取单侧99%可信限,对剩余样品的MMAB识别点的读数进行排序,从低到高将99百分位数的读数作为判断异嗜性抗体阳性的临界值。
99百分位数的计算公式如下,
其中P99指的是99百分位点,L指的是包含P99的数段的最低值,这里是80,W是指包含P99数段的宽度,这里是10,f是指这一数段的频数,n是指总的频数,这里是391,C是指到前一数段为止的累积频数,这里是386。计算结果99百分位数是82。我们设定该系统中判断干扰阴阳性的标准是MMAB的读数82。将这一标准设置在软件中。在以后的针对该11种肿瘤标志物的抗体微阵列芯片检测样品时,如果样品中MMAB识别点的读数高于该标准,软件自动提供警示,表示该样品异嗜性抗体干扰阳性,建议在添加MMAB以后重新检测。
8、血清样品测试
采用本发明的方法测试了1000例健康体检样品和100例肿瘤血清,以验证本发明的上述方法。肿瘤血清使用检测,其中11种肿瘤标志物指标中至少有1种指标超过正常参考值。用MMAB的信号判断得到,MMAB点读数超过临界值的血清样品共有26例,其中23例为健康体检血清和3例为肿瘤血清,将该26例判断为异嗜性抗体干扰阳性。
将这些判断为异嗜性抗体干扰阳性的血清样品分成三份,分别为不添加MMAB阻断剂、添加1%(V/V)MMAB阻断剂和添加5%(V/V)MMAB阻断剂,分别进行检测。在23例MMAB信号值超过我们设定的临界值健康体检血清中21例健康体检血清样品在添加1%(v/v)的MMAB阻断剂以后,MMAB信号转为阴性,而另外2例样品在添加5%(v/v)的阻断剂以后才转为阴性。3例肿瘤血清中添加阻断剂以后仍然为阳性,我们采用ROCHE 2010全自动电化学发光免疫分析仪进行检测验证,结果显示阳性。以下例举几例比较典型的样品的检测结果。
N657号正常血清的结果用图5和表7显示。在图5中,A为未添加阻断剂的检测结果,B为添加1%(v/v)阻断剂的检测结果,C为添加5%(v/v)阻断剂的检测结果。其中的异嗜性抗体干扰比较顽固,在添加了1%(v/v)阻断剂后干扰部分消除,但还是能够看到显著地干扰,在添加5%(v/v)的阻断剂之后,才显示干扰消除。在添加1%(v/v)阻断剂时,MMAB能警示干扰继续存在。
P24号肿瘤血清的结果如图6和表8所示,在图6中A为未添加阻断剂的检测结果,B为添加1%(v/v)阻断剂的检测结果,其中信号较高的指标为CA153。在添加了1%(v/v)阻断剂以后,各项指标MMAB读数除了CA153也都转变为阴性,我们采用ROChe 2010检测CA153,结果显示为阳性。我们可以把CA153的真阳性从一组假阳性的结果中识别出来。
由于MMAB识别点的监控功能,节省了很多的阻断剂的用量,没有必要对每一分样品添加阻断剂,也可以避免阻断剂本身造成的不可预知的影响。在建立了有效地干扰识别机制以后,厂家可以根据需要选择不同的阻断方法。最简单的就是,出现了干扰阳性的样品,再添加阻断剂重新检测。如果考虑到重新检测的工作量大,可以对每一分样品添加低浓度的阻断剂,一些干扰顽固的血清被识别以后再添加大剂量的阻断剂重新检测。我们检测的1100份血清中,只有两分血清是需要加大阻断剂量的,这样重复检测的工作量大大的减轻,也没有必要在每一份血清中添加大剂量的阻断剂。
本发明提供的在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法,完全不同于传统免疫学检测方法里的消除干扰的方法,可以有效、低成本、简单的对异嗜性抗体进行识别,然后进行阻断。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。当然,本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,本发明所采用的具体的实验方法和操作例如点样方阵的阵列形式不局限于本发明所表示的形式,可以根据芯片而任意组合,所采用的抗体微阵列芯片是根据所采用的生物芯片阅读仪进行选择,但不局限于本发明所采用的仪器。上述实施例和说明书 中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (7)
1.在抗体微阵列系统中识别异嗜性抗体干扰的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)根据需检测疾病的类型制备的抗体微阵列芯片的预定组成,对所有需要固相化的抗体进行免疫球蛋白的型和亚型的鉴定;
(2)根据步骤(1)的鉴定的所有抗体的型和亚型的种类,选择与所有抗体的型和亚型的种类相同的多种与固相化抗体、被检测抗原、酶标抗体不交叉反应的单克隆抗体进行组合,得到混合物;
(3)在抗体微阵列芯片的制备过程中,在每一个检测阵列内均设置增加一个用于对照控制的识别异嗜性抗体干扰的识别点,所述识别点中的点样样品为步骤(2)的混合物;
(4)取步骤(3)制作完成的抗体微阵列芯片检测系统检测若干份血清,将每一份血清分成两份,在其中的一份血清中添加所述步骤(2)的混合物,另一份血清中不添加所述步骤(2)的混合物,对所述血清进行免疫学检测,当有血清在添加所述步骤(2)的混合物后出现阳性指标转阴的结果则该样品判断为异嗜性抗体干扰阳性,去除异嗜性抗体阳性干扰的血清,对剩余血清的识别点进行读数,根据检测结果取单侧99%可信限的读数为判断血清是否存在异嗜性抗体干扰的标准临界值;
(5)采用步骤(4)的标准临界值判断检测临床样品,当临床样品的识别点读数高于所述标准临界值,则该血清被判断为异嗜性抗体干扰阳性。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中的所使用的固相化抗体均为单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的用作异嗜性抗体干扰指示剂的单克隆抗体的品种数量为1种以上。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的用作异嗜性抗体干扰指示剂的单克隆抗体的品种数量为10种以上。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中在识别点中各种单克隆抗体样品为等量混合。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中的在其中一份血清中添加所述步骤(2)的单克隆抗体混合物的量为按体积比5%(v/v)。
7.采用权利要求1所述方法检测目标抗原的抗体微阵列芯片,其特征在于,所述抗体微阵列中含有识别异嗜性抗体的识别点。
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