CN102565426A

CN102565426A - 用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法

Info

Publication number: CN102565426A
Application number: CN2011104337294A
Authority: CN
Inventors: 霍五奎; 岳晓燕; 马雪明; 刘寅; 王晶; 罗云萍; 张有青
Original assignee: JOYSBIO (TIANJIN) BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: JOYSBIO (TIANJIN) BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法。促黄体生成素是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素。促黄体生成激素(LH)是随女性月经周期而含量呈周期性变化的激素，其作用是刺激卵巢内成熟卵子的释放。动态的监测掌握LH变化特点，确定LH的峰值及时间，从而可以更准确的预测与监测排卵情况，为临床提供更准确的结果，指导育龄妇女选择最佳受孕时机或指导安全期避孕。免疫胶体金技术近年来发展迅速，得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明采用胶体金免疫层析法，建立快速检测LH的方法。并且能够半定量检测25～50mIU/ml这一LH灰区范围。

Description

用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法。

背景技术

优生优育是计划生育具体内涵的延伸，是新的历史条件下对计划生育的具体化体现。我国是人口大国，巨大的人口压力会制约着社会的发展，所以做好优生优育既是提高人口素质的重要手段，也是制约人口发展的重要手段，对未来社会整个民资的发展有重要的作用。所以大家应该要坚持做好优生优育，为子孙后代的良性发展创造有利条件。

那么，在计划生育时为了优生优育应该怎样做呢？可以从优恋、优婚、优孕三个方面考虑。优恋指的是谈婚论嫁之前，要注意了解对方及其家庭成员身体健康方面的信息。优婚是指在完全知情的情况下结婚，这一点就要依赖于婚前的体检。优孕，就是在适宜的孕育年龄、最佳的受孕时机怀孕生子，这样可以最大可能的避开对胎儿发育不良的不利因素。据调查，半数以上的青年夫妇结婚以后不采取避孕措施，往往在不知不觉中怀孕。由于事先毫无计划和准备，结果有的发生了自然流产，有的感染了流感、风疹等病毒性疾病，有的使用了孕期应当禁用的药物……可见，婚后注意避孕、实行有计划的自主怀孕很有必要。

促黄体生成素是由垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素。在女性体内则主要是促进排卵的发生。促黄体生成激素(LH)是随女性月经周期而含量呈周期性变化的激素，其作用是刺激卵巢内成熟卵子的释放。通常在排卵前36～48小时左右突然大幅度上升，LH达到最高峰值后的12到18小时开始排卵，如未受孕LH迅速下降，重复下一周期。LH峰值后1-3天时间内妇女最易受孕。因此对女体内LH的检测常被用来判断女性的排卵状况。

动态的监测掌握LH变化特点，确定LH的峰值及时间，从而可以更准确的预测与监测排卵情况，为临床提供更准确的结果，指导育龄妇女选择最佳受孕时机或指导安全期避孕。开发简单、快速的促黄体生成素诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。

利用胶体金的检测方法测定尿液中LH作为排卵的考察检测，已被开发，其检测下限为25mIU/ml。但是对于临床上单独使用25mIU/ml这一标准不能直接、快速区分排卵的强弱程度，所以开发能够检测LH 25～50mIU/ml这一LH诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。

发明内容

本发明的目的：开发简单、快速的测排卵方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测LH的方法。并且能够半定量检测25mIU/ml～50mIU/ml这一LH灰区范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记β-LH抗体并均匀涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的α-LH抗体固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。本发明方法包括如下步骤：

一、胶体金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％柠檬酸三钠溶液；

3.将0.02％的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2％的柠檬酸三钠2mL；

4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸10min；

停止加热，继续搅拌至室温。

二、胶体金标记物的制备

1.取两个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金溶液；

2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8.0；

3.加入20μg/mLβ-LH抗体，使其达到最小蛋白浓度，混匀，振荡30min；

4.加入20μL的10％BSA，混匀，振荡30min；

5.12000rpm离心5min，轻轻吸除上清；

6.用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；

7.重复5.步操作；

8.重复6.步操作；

9.重复5.步操作；

10.用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5～1.0的胶体金免疫复合物；

11.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。

三、在硝酸纤维素膜上划线

1.T1线用浓度为0.75mg/mL的a-LH抗体划线，用于检出25mIU/ml的LH；

2.T2线用浓度为0.4mg/mL的α-LH抗体划线，用于检出50mIU/ml的LH；

3.C线用0.75mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；

4.将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

四、胶体金试纸条的组装

1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1)；

2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。

五、检测

试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。样本中的LH含量和T线的颜色呈正相关，当LH含量达到25mIU/ml(＜50mIU/ml)时，T1线颜色与质控线相当或强于质控线，而T2线颜色弱于质控线(见附图2)；当LH含量达到50mIU/ml及以上时，T2线颜色与质控线相当或强于质控线，而T1线颜色强于质控线(见附图3)；若样本中没有LH或LH含量较低＜25mIU/ml时，则两条T线不显色或颜色均弱于C线，为阴性(见附图4)；T线和C线均不显色则试纸条无效。

本发明检测对象单一且针对性强，准确率高。检测速度快，所需时间短，只需5min，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足医院、门诊、个人等快速、准确地检测排卵状况的要求，并且便于基层推广和运用。

附图说明

图1为本发明实施例试纸条的图示

图2为本发明实施例试纸条的阳性结果(50mIU/ml＜LH水平≥25mIU/ml)

图3为本发明实施例试纸条的阳性结果(LH水平≥50mIU/ml)

图4为本发明实施例试纸条的阴性结果(LH水平＜25mIU/ml)

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实例先用2％的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水，并标记β-LH抗体喷金标垫，α-LH抗体、羊抗鼠多克隆抗体分别包被至检测线(T线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37℃烘箱烘干并裁成4mm/条，室温干燥保存备用。

实施例

1.准备α-LH抗体、β-LH抗体。并清洗实验所需的玻璃器皿。

2.胶体金的制备

先将0.02％氯金酸溶液溶液加热煮沸，迅速加入2％的柠檬酸三钠2mL；

溶液颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加热出现酒红色，继续煮沸10min；出现透明的酒红色，停止加热，继续搅拌至室温。这样就制备了20nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均匀，颗粒直径在20nm左右，否则重新制作。

3.胶体金标记物的制备

取两个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8.0；加入20μg/mL β-LH抗体，使其达到最小蛋白浓度，混匀，于振荡仪上快速振荡30min；加入20μL的10％BSA，混匀，振荡30min；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5～1.0的胶体金免疫复合物；在玻璃纤维素膜上点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。

4.胶体金试纸条的组装

分别将0.75mg/mL和0.4mg/mL的α-LH抗体划在硝酸纤维素膜的检测线(T线)上，将0.75mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线(C线)上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中40℃干燥3天。然后将各个部分按附图1组装成试纸条。

5.胶体金试纸条的使用及结果判读

检测前，先提取被检者的尿液样本。

然后把试纸条试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。样本中的LH含量和T线的颜色呈正相关，当LH含量达到25mIU/ml(＜50mIU/ml)时，T1线颜色与质控线相当或强于质控线，而T2线颜色弱于质控线(见附图2)；当LH含量达到50mIU/ml及以上时，T2线颜色与质控线相当或强于质控线，而T1线颜色强于质控线(见附图3)；若样本中没有LH或LH含量较低＜25mIU/ml时，则两条T线不显色或颜色均弱于C线，为阴性(见附图4)；T线和C线均不显色则试纸条无效。

实施例可直接检测样品中的LH，使用方法不需要专业培训，操作方便、快速，5min即可获得结果，可达到快速、简便、及时地检测LH的目的。

Claims

1.一种用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法，其特征在于，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记β-LH抗体并均匀涂布于胶体金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的α-LH抗体固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

2.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法，其特征在于，抗体划线浓度为：

T1线用浓度为0.75mg/mL的α-LH抗体划线，用于检出25mIU/ml的LH；

T2线用浓度为0.40mg/mL的α-LH抗体划线，用于检出50mIU/ml的LH；

C线用0.75mg/mL羊抗鼠多克隆载体划线；

将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

3.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断促黄体生成素的方法，其特征在于，运用不同浓度的抗体溶液在相同的基质上划线，以胶体金方法检测多个不同浓度水平物质的方法。