CN110850097A - 钙卫蛋白检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种钙卫蛋白检测试剂盒及检测方法，主要由以下部分组成：包被有钙卫蛋白抗体的微孔板、钙卫蛋白校准品、辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体、抽提缓冲液、样本稀释液、底物A液(鲁米诺溶液)、底物B液(过氧化氢溶液)及浓缩洗液。本发明采用双抗体夹心免疫检测法，微孔板包含固定化的特异性抗体，样本及酶标抗体加入酶标板的反应孔，保温反应后形成包含特异性抗体‑抗原‑酶标抗体的固相免疫复合物，洗涤除去未结合的酶标抗体，适合大批量检测，操作简单、灵敏度高、特异性好、检测快速有效、成本低，具有推广使用价值。
Description
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种钙卫蛋白检测试剂盒。
背景技术：
炎症性肠病(IBD)是一组病因不十分明确的肠道慢性非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，其发病机制尚未完全明确，但已知肠道黏膜免疫系统异常所致的炎性反应在IBD的发病中起着重要作用。目前，IBD的诊断主要依靠病史、临床症状、结肠镜和病理组织活检等。病理组织活检虽是诊断的金标准，但因其痛苦大、费用高，且不便于反复检查，常延误诊断治疗。
钙卫蛋白是一种与钙、锌结合的蛋白，相对分子质量为36×103，来源于中性粒细胞和活化的巨噬细胞，具有免疫调节和抗微生物活性，其结构稳定不易水解。在IBD结肠病变部位的黏膜和黏膜下层有大量的中性粒细胞和单核细胞存在，明显高于非炎症部位和健康对照者的黏膜。而在感染和炎症性疾病时，钙卫蛋白能特异地在炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)中表达，因此测定血液、分泌物和特定组织中钙卫蛋白的浓度可以判断炎症的存在，并在一定程度上反映疾病的严重程度。
粪便钙卫蛋白的含量与组织钙卫蛋白显著相关，提示粪便钙卫蛋白直接反映了组织中钙卫蛋白的分布情况；而且粪便钙卫蛋白含量与组织学炎症程度亦显著相关，可以说粪便中的钙卫蛋白来自于病变的结肠黏膜而且与黏膜中钙卫蛋白的含量一致，因此测定粪便钙卫蛋白可以用作UC活动性的判断指标。体外研究证实，钙卫蛋白可以与钙离子结合，并具有鳌合锌离子的能力和抗热性，在钙离子存在的情况下具有抗蛋白酶活性，因此其在粪便中具有良好的稳定性，不被肠腔和粪便中的细菌及蛋白酶降解，不随温度变化而变化，具备良好的粪便标志物的条件。这正是钙卫蛋白作为粪便标志物优于其他指标的原因。钙卫蛋白可以反映组织的炎症程度在UC活动期，结肠黏膜中有不同程度的钙卫蛋白表达，表达量与急性炎症时组织学严重程度一致，且与粪便钙卫蛋白含量高度相关，由此推论，组织钙卫蛋白是粪便钙卫蛋白的来源，测量粪便钙卫蛋白可以反映组织的炎症程度。
随访粪便钙卫蛋白检查可以替代结肠镜和活组织检查，避免了反复进行有创性的肠镜和活检，患者容易接受。量化的化验指标可以客观而连续的反映肠道局部炎症的变化情况，有利于进行实时监控。
现有技术中公开了相关的钙卫蛋白检测试剂盒，例如专利号为CN110161254A的一种人血清钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法，又如专利号为CN110133275A公开的一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法，但是该类钙卫蛋白检测试剂盒的制作成本较高、灵敏度较低，测试结果的准确性低。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种操作简单、检测快速、成本低、准确性高的钙卫蛋白检测试剂盒。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种钙卫蛋白检测试剂盒，主要由以下部分组成：包被有钙卫蛋白抗体的微孔板、钙卫蛋白校准品、辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体、抽提缓冲液、样本稀释液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液及浓缩洗液。
其中，作为优选，所述钙卫蛋白校准品为重组蛋白，所述钙卫蛋白校准品选择浓度为0、10、30、90、270和540μg/g的钙卫蛋白校准品校准品、浓度范围28.0-52.0μg/g钙卫蛋白校准品质控品及浓度范围112.0-208.0μg/g钙卫蛋白校准品质控品；
所述钙卫蛋白校准品的制作工艺如下：
准确量取钙卫蛋白校准品，加蛋白稀释液适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀，2～8℃保存备用。
上述抽提缓冲液优选为PBS缓冲液，含有防腐剂，其制作工艺如下：
在容器中加入定量的工艺用水，准确称量定量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾及Proclin-300，缓慢加入水中，用玻璃棒搅拌直到完全混匀，定容至1000ml，保存备用。
上述样本稀释液优选为磷酸盐缓冲液，含有防腐剂，其制作工艺如下：
在容器中加入定量的工艺用水，准确称量定量干酪素、PVP-K30、PROCLIN-300、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾及磷酸二氢钾，缓慢加入水中，用玻璃棒搅拌直到完全混匀，定容至1000ml，保存备用。
上述浓缩洗液优选为浓缩磷酸盐洗涤液，含有吐温20和防腐剂，其制作工艺如下：
准确称量定量磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、吐温20、PROCLIN-300，加工艺用水适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀，微调pH至7.4，2～8℃保存备用。
具体地，所述包被有钙卫蛋白抗体的微孔板的制备方法如下：
(1)取定量钙卫蛋白包被液及空白微孔板，送入2-8℃冰箱中包被16-20小时，调整加液量为100ul/孔；
(2)将包被后的微孔板进行洗板，并取定量酶标板稳定剂，洗板后送入2-8℃冰箱中进行封闭加液18-20小时，调整加液量为120ul/孔；
(3)将封闭后的微孔板进行甩板脱水，脱水后置于干燥间干燥4小时，干燥后将微孔板及干燥剂装入铝箔袋中进行真空封装。
其中，步骤(1)中，钙卫蛋白包被液的制作工艺如下：
a包被缓冲液配置：准确称量碳酸钠和碳酸氢钠，加工艺用水适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml，混合均匀，微调pH至9.6，2～8℃保存备用；
b包被液配置：准确量取钙卫蛋白单克隆抗体，加包被缓冲液适量，搅拌使充分混匀后，加入包被缓冲液定容至1000ml，送入包被间，2～8℃保存备用。
本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体的制作工艺如下：
称取定量过氧化物酶溶解于蒸馏水中，向溶液中加入NaIO4溶液混匀，4℃静置30分钟，加入乙二醇水溶液混匀，静置30-60分钟；加入等量钙卫蛋白单克隆抗体溶液，混匀后装入透析袋，对pH9.6的碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜；透析过夜后加入NaBH4溶液，混匀后4℃静置2h；静置后边搅拌边滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，置于4℃，0.5-1小时；离心30min，弃上清，沉淀物以PBS缓冲液透析，4℃条件下透析过夜；透析结束后，离心30min，去除沉淀，上清液即为钙卫蛋白酶结合物，加入等体积甘油，混匀后冷冻保存，采用棋盘滴定法确定酶标记物的工作浓度范围1:5000-1:10000。
本发明还提供一种上述钙卫蛋白检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
一、样本处理：
(1)将空的试管按照样本信息进行编号称重；
(2)准确称量粪便样本50-100mg(净重)到试管内；
(3)向试管中加入49倍体积(样本净重)的抽提缓冲液，盖紧试管；
(4)使用漩涡混匀器充分混匀，使样本变成匀浆；
(5)将样本转移到2ml离心管中，并用离心机3000xg离心5分钟；
(6)吸取上清液到相应的干净试管中，可直接用于后续实验或保存于≤-20℃，至少可以保存4个月；
二、检测：
(1)检测实验前将试剂盒和样本在室温平衡30分钟以上；
(2)将浓缩洗液用水稀释20倍，用样本稀释液将粪便抽提物稀释20倍；
(3)向微孔条的微孔中分别加入钙卫蛋白抗原及样本，再加入辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体，用封板膜封板后，放于水平振荡器上，室温孵育45分钟；
(4)用稀释好的浓缩洗液洗板5次，在吸水纸上扣干；
(5)每孔加入鲁米诺溶液及过氧化氢溶液，震荡混匀，室温避光反应5分钟；
(6)反应结束后使用发光分析仪进行测定；
(7)绘制标准曲线。
本发明钙卫蛋白检测试剂盒及其检测方法的有益效果是：
本发明采用“双抗体夹心一步法”反应模式，相比传统两步法反应节省45-60min，提高检测效率；
本发明采用辣根过氧化物酶-鲁米诺发光体系，大大提高检测灵敏度，检测范围宽，稳定性好，适合大批量检测，操作简单；
本发明试剂盒可以清楚地区分器质性疾病如炎症性疾病IBD和功能性疾病如IBS，从而避免避免昂贵的费用和结肠镜侵入性检查，具有推广使用价值。
附图说明
图1为本发明的实施例的标准曲线图；
图2为本发明的相关性曲线图。
具体实施方式：
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例：
本发明的钙卫蛋白检测试剂盒，其组成如下表所示：
本试剂盒采用双抗体夹心免疫检测法，微孔板包含固定化的特异性抗体，样本及酶标抗体加入酶标板的反应孔，保温反应后形成包含特异性抗体-抗原-酶标抗体的固相免疫复合物，洗涤除去未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的含量直接相关，加入发光底物后，测定发光强度(RLU)，样本的RLU值随浓度增加而上升，通过标准曲线即可算出样本含量。
本发明中，各种溶液液体的配置如下：
包被缓冲液的配制：
标准配方：
按照1000ml量计。
碳酸钠 1.590g
碳酸氢钠 2.930g
工艺用水 定容至1000ml
配制方法：
按照标准配方内容，准确称量碳酸钠和碳酸氢钠，加工艺用水适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml，混合均匀。测定初始PH值，微调pH至9.60±0.05。检验合格后，2～8℃保存备用，包被16-20h。
包被液的配制：
标准配方：
按照1000ml量计。
包被缓冲液 适量
钙卫蛋白包被抗体 3mg
包被缓冲液定容至 1000ml
配制方法：
按照标准配方内容，准确量取钙卫蛋白包被抗体，加包被缓冲液适量，搅拌使充分混匀后，加入包被缓冲液定容至1000ml，送入包被间，2～8℃保存备用，有效期7天。
酶结合物溶液的配制：
标准配方：
按照500ml量计。
钙卫蛋白酶标记抗体配方(10X)
钙卫蛋白标记抗体 0.5mg
辣根过氧化物酶 5mg
HRP偶联物稳定剂定容至 0.5ml
配制方法：
称取5.0mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中，向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO4溶液混匀，4℃静置30分钟，加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml混匀，静置30-60分钟；加入等量钙卫蛋白单克隆抗体溶液1ml，混匀后装入透析袋，对PH9.6的碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜；透析过夜后加入200ul的5mg/mlNaBH4溶液(现配现用)，混匀后4℃静置2h；静置后边搅拌边滴加如等体积的饱和硫酸铵溶液，置于4℃0.5-1小时；3000r/min离心30min，弃上清，沉淀物以4ml的0.02M pH7.4PBS缓冲液透析，4℃条件下透析过夜；透析结束后，10000r/min离心30min，去除沉淀，上清液即为钙卫蛋白酶结合物，加入等体积甘油，混匀后冷冻保存，采用棋盘滴定法确定酶标记物的工作浓度范围1:5000-1:10000。
抽提缓冲液的配制：
标准配方：
HCL或NaOH调pH至7.4，纯化水定容至1000ml
配制方法：
按照标准配方内容，在容器中加入600ml(约实际生产量的60％)的工艺用水，准确称量各组分，缓慢加入水中，用玻璃棒搅拌直到完全混匀，定容至1000ml。检验合格后，保存备用，有效期24个月。
浓缩洗液的配制：
标准配方：
按照1000ml量计。
配制方法：
按照标准配方内容，准确称量磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、吐温20、Proclin-300，加工艺用水适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀。微调pH至7.4，检验合格后，2～8℃保存备用，有效期24个月。
样本稀释液的配制：
配制方法：
按照标准配方内容，在容器中加入600ml(约实际生产量的60％)的工艺用水，准确称量各组分，缓慢加入水中，用玻璃棒搅拌直到完全混匀，定容至1000ml。检验合格后，保存备用，有效期24个月。
校准品溶液的配制：
标准配方：
按照1000ml量计。
配制方法：
按照标准配方内容，准确量取钙卫蛋白校准品，加蛋白稀释液适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀。检验合格后，2～8℃保存备用，有效期12个月。
质控品溶液的配制：
质控品1
标准配方：
按照1000ml量计。
钙卫蛋白校准品 40ug
蛋白稀释液 适量
蛋白稀释液定容至 1000ml
质控品2
钙卫蛋白校准品 160ug
蛋白稀释液 适量
蛋白稀释液定容至 1000ml
配制方法：
按照标准配方内容，准确量取钙卫蛋白校准品，加蛋白稀释液适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀。检验合格后，2～8℃保存备用，有效期12个月。
化学发光底物液A、化学发光底物液B配制：
化学发光底物液A配方：
分别称取鲁米诺(10mM)1.7716g、4-羟基联苯(3mM)0.050g、4-碘苯硼酸(0.1mM)0.006g、硼酸11.4g、硼砂4.9g，蒸馏水溶解后定容至1000ml，调整PH至8.0-10.0。
化学发光底物液B配方：
分别称取过氧化脲(3.5mM)0.329g、Tween-200.25ml、5.8gNa2HPO4·12H2O、0.59gNaH2PO4·2H2O，蒸馏水溶解后定容至1000ml，调整PH至8.0-10.0。
使用时A液与B液1:1混合。
微孔板制备：
微孔板包被
标准配方：
钙卫蛋白包被液 1000ml
空白微孔板 100块
包被方法：
仪器准备：检查仪器外观是否清洁；各部件是否完好；微孔板托板往复位置是否有阻挡。
仪器加液量确认：接通电源，打开仪器电源开关及软件控制面板开关，调整加液量为100ul±2ul/孔。
微孔板包被：按顺序进行加液，操作人员不定时检查微孔板加液量及枪头挂液情况，保证微孔板加液量准确，无气泡。
将包被完成的微孔板按次序码放整齐，贴封板膜，标示：产品名称、数量、操作人员及操作时间，放于2-8℃冰箱中包被16-20小时。
微孔板封闭
洗板：
(1)检查洗板机工作状况，用纯化水清洗管道。
(2)将浓缩洗液配成一倍工作洗液倒入洗板机洗液杯中。
(3)将包被微孔板按次序进行洗板：按洗板机SOP进行操作，每块板清洗1次，拍干后进行封闭。洗板过程中不定时检查微孔板清洗情况。(液体残留量≤5ul，无泡沫)
封闭：
标准配方：
钙卫蛋白包被板 100块
封闭液 1200ml
封闭液的配制：
将5.8gNa2HPO4·12H2O、0.59gNaH2PO4·2H2O、1-5％BSA、40g海藻糖、3mlProclin300溶液加入容器，溶解后使用双蒸水定容至1000ml。
封闭方法：
仪器准备：检查仪器外观是否清洁；各部件是否完好；微孔板托板往复位置是否有阻挡。
仪器加液量确认：接通电源，打开仪器电源开关及软件控制面板开关，调整加液量为120ul±5ul/孔。
微孔板封闭：包被板洗板后应立即按顺序进行封闭加液操作，操作人员不定时检查微孔板加液量及枪头挂液情况，保证微孔板加液量准确，无气泡。
将封闭完成的微孔板按次序码放整齐，贴封板膜，标示：产品名称、数量、操作人员及操作时间，放于2-8℃冰箱中封闭16-20小时。
微孔板脱水干燥
标准配方：
钙卫蛋白封闭板 100块
干燥剂 200个
自封袋 100个
干燥方法：
(1)打开酶标板脱水机开关，设置参数：脱水时间20s，将微孔板从冰箱中依次取出，进行甩板脱水。
(2)将脱水后的微孔板置于干燥间干燥4小时。确认干燥条件：干燥间温度34±3℃，湿度≤40％。
(3)干燥结束后，分别按照1块干燥板、2个干燥剂装入铝箔袋中，铝箔袋距开口2cm处微折。注意微孔板正向朝外，干燥剂置于微孔板背面底部。
微孔板真空封装
标准配方：
钙卫蛋白干燥板 100块
干燥剂 200个
自封袋 100个
操作方法：
打开真空封装机开关，设置参数：封口温度150℃，抽真空时间15秒，空载封口2-3次，进行预热。
将铝箔袋(装有微孔板)有折痕的一边进行封口，封口后检查封口是否均匀，有无漏气现象。
本发明在保证其他工艺条件不变的条件下，将微孔板包被为96孔透明聚苯乙烯微孔板，将发光底物液更换为单组分TMB显色液后，制作成钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)，能够降低成本，满足基层客户需求。
本发明的检验方法如下：
一、样本处理
1、将空的试管按照样本信息进行编号称重。
2、准确称量粪便样本50-100mg(净重)到试管内。
3、向试管中加入49倍体积(样本净重)的抽提缓冲液，盖紧试管。
4、使用漩涡混匀器充分混匀，使样本变成匀浆。
5、将样本转移到2ml离心管中，并用离心机3000xg离心5分钟。
6、吸取上清液到相应的干净试管中，可直接用于后续实验或保存于≤-20℃，至少可以保存4个月。
二、检测步骤
1、实验前将试剂盒和样本室温(20-25℃)平衡30分钟以上，加样前充分混匀试剂和样本。
2、将浓缩洗液用水稀释20倍(即50ml浓缩洗液+950ml去离子水或蒸馏水)。
3、用样本稀释液将粪便抽提物稀释20倍(例：30ul抽提物+570ul稀释液)，充分混匀。
4、准备相应校准品、质控品和样本数量的微孔条，多余的微孔条立刻连同干燥剂装于自封袋中，冷藏保存。
5、向微孔中分别加入50μl的校准品0-5、质控品和样本，再加入酶结合物50μl/孔，封板膜封板后，放于水平振荡器上(400-600转/分钟)，室温(20-25℃)孵育45分钟。
6、用稀释好的洗涤液洗板5次(每孔用300μl左右的洗涤液冲洗)，最后在吸水纸上扣干。
7、每孔加入底物A液、B液各50ul(底物A液和B液可以按需求等量混合，然后每孔加入100ul底物混合液，必须在加样之前现用现混)，轻轻震荡混匀，室温避光反应5分钟。
8、反应结束后立即使用发光分析仪进行测定。
9、标准曲线绘制：以校准品的浓度值为横坐标，RLU为纵坐标。质控品的浓度由软件根据校准曲线自动计算得出，所得浓度应在说明书规定的范围内。如质控值超过规定范围，本次检测结果无效，必须重新检测样本。
临界参考值：＜50ug/g，由于地区、性别及年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考值和质控血清。
粪便钙卫蛋白水平低于临界值的样本为正常；高于临界值的样本视为阳性，患者需要进行结肠镜或者其他检测来进一步确诊。
通过其它方法得到的钙卫蛋白浓度值与本试剂盒的测定结果不具有直接的可比性。
本试剂检测结果仅供参考，需结合临床表现、病史及其他检查结果综合考虑，不能作为临床诊断的唯一依据。
本试剂用来检测人粪便提取的钙卫蛋白，不能用于其他体液样本的检测。
当样本浓度超过检测上限时，应使用样本稀释液将高浓度样本抽提物进行60倍稀释，计算浓度乘以稀释倍数得到样本原始浓度。
本发明的产品性能指标如下：
1.线性：在10.0μg/g-540.0μg/g的线性范围内，试剂盒的相关系数r应不低于0.9900。
2.批间差：试剂盒之间的批间变异系数(CV)应不大于15％。
3.检测限：试剂盒的检测限应不高于10.0μg/g。
4.准确度：测量结果的相对偏差应在±10％范围内。
5.重复性：测量结果的变异系数(CV)应不大于10％。
下面举例说明。
根据《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》，分别选择正常对照组(128例)，炎症性肠病组(132例)，溃疡性结肠炎组(98例)，克罗恩病组(34例)，肠易激综合征组(38例)共430例样本进行测试。
表1为临床数据：
表1
结果表明：IBS组与正常对照患者粪便钙卫蛋白浓度无明显差异。炎症性肠病组(IBD)患者钙卫蛋白浓度明显偏高，差异具有统计学意义。
与瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)进行样本检测相关性比较。采用本发明钙卫蛋白试剂盒(化学发光法)与瑞士BuhlmannLaboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)同时进行50例样本，以瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)检测结果为横坐标，以本发明申请的方法测定的结果为纵坐标，绘制相关性曲线，相关系数r＝0.9995，表明两者相关性很好。检测结果见图1，相关性比较见图2。
样本对比检测结果如表2所示：
表2
由上表可以看出，本发明的检测结果与瑞士Buhlmann Laboratories AG公司的数据基本一致，能够满足临床实际需要。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，主要由以下部分组成：包被有钙卫蛋白抗体的微孔板、钙卫蛋白校准品、辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体、抽提缓冲液、样本稀释液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液及浓缩洗液。
2.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述钙卫蛋白校准品包括浓度为0、10、30、90、270和540μg/g的钙卫蛋白抗原溶液、浓度范围28.0-52.0μg/g钙卫蛋白质控品及浓度范围112.0-208.0μg/g钙卫蛋白质控品；
所述钙卫蛋白校准品的制作工艺如下：
准确量取钙卫蛋白校准品，加蛋白稀释液适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀，2～8℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述抽提缓冲液为PBS缓冲液，其制作工艺如下：
在容器中加入定量的工艺用水，准确称量定量氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾及Proclin-300，缓慢加入水中，用玻璃棒搅拌直到完全混匀，定容至1000ml，保存备用。
4.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液，其制作工艺如下：
在容器中加入定量的工艺用水，准确称量定量干酪素、PVP-K30、PROCLIN-300、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾，缓慢加入水中，用玻璃棒搅拌直到完全混匀，定容至1000ml，保存备用。
5.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗液为浓缩磷酸盐洗涤液，其制作工艺如下：
准确称量定量磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、吐温20、PROCLIN-300，加工艺用水适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml混合均匀，微调pH至7.4，2～8℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述包被有钙卫蛋白抗体的微孔板的制备方法如下：
(1)取定量钙卫蛋白包被液及空白微孔板，送入2-8℃冰箱中包被16-20小时，调整加液量为100ul/孔；
(2)将包被后的微孔板进行洗板，并取定量酶标板稳定剂，洗板后送入2-8℃冰箱中进行封闭加液18-20小时，调整加液量为120ul/孔；
(3)将封闭后的微孔板进行甩板脱水，脱水后置于干燥间干燥4小时，干燥后将微孔板及干燥剂装入铝箔袋中进行真空封装。
7.根据权利要求6所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，钙卫蛋白包被液的制作工艺如下：
a包被缓冲液配置：准确称量碳酸钠和碳酸氢钠，加工艺用水适量，搅拌使充分溶解后，定容至1000ml，混合均匀，微调pH至9.6，2～8℃保存备用；
b包被液配置：准确量取钙卫蛋白单克隆抗体，加包被缓冲液适量，搅拌使充分混匀后，加入包被缓冲液定容至1000ml，送入包被间，2～8℃保存备用。
8.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体的制作工艺如下：
称取定量过氧化物酶溶解于蒸馏水中，向溶液中加入NaIO4溶液混匀，4℃静置30分钟，加入乙二醇水溶液混匀，静置30-60分钟；加入等量钙卫蛋白单克隆抗体溶液，混匀后装入透析袋，对PH9.6的碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜；透析过夜后加入NaBH4溶液，混匀后4℃静置2h；静置后边搅拌边滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，置于4℃，0.5-1小时；离心30min，弃上清，沉淀物以PBS缓冲液透析，4℃条件下透析过夜；透析结束后，离心30min，去除沉淀，上清液即为钙卫蛋白酶结合物，加入等体积甘油，混匀后冷冻保存，采用棋盘滴定法确定酶标记物的工作浓度范围1:5000-1:10000。
9.根据权利要求1所述的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述鲁米诺溶液的制作工艺如下：分别称取定量鲁米诺、4-羟基联苯、4-碘苯硼酸、硼酸、硼砂，蒸馏水溶解后定容至1000ml，调整PH至8.0-10.0；
所述过氧化氢溶液的制作工艺如下：分别称取定量过氧化脲、Tween-20、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O，蒸馏水溶解后定容至1000ml，调整PH至8.0-10.0。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的钙卫蛋白检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、样本处理：
(1)将空的试管按照样本信息进行编号称重；
(2)准确称量粪便样本到试管内；
(3)向试管中加入定量抽提缓冲液，盖紧试管；
(4)使用漩涡混匀器充分混匀，使样本变成匀浆；
(5)将样本转移到离心管中，并用离心机离心5分钟；
(6)吸取上清液到相应的干净试管中，可直接用于后续实验或保存于≤-20℃，至少可以保存4个月；
二、检测：
(1)检测实验前将试剂盒和样本在室温平衡30分钟以上；
(2)将浓缩洗液用水稀释20倍，用样本稀释液将粪便抽提物稀释20倍；
(3)向微孔条的微孔中分别加入钙卫蛋白校准品及样本，再加入辣根过氧化物酶标记的钙卫蛋白抗体，用封板膜封板后，放于水平振荡器上，室温孵育45分钟；
(4)用稀释好的浓缩洗液洗板，在吸水纸上扣干；
(5)每孔加入鲁米诺溶液及过氧化氢溶液，震荡混匀，室温避光反应5分钟；
(6)反应结束后使用发光分析仪进行测定；
(7)绘制标准曲线。
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