CN106244559A - 一种分泌抗人il‑37单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人il‑37单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种分泌抗人il‑37单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人il‑37单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分泌抗人IL‑37单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人IL‑37单克隆抗体及其应用，其中抗人IL‑37单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：C20168的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的。本发明的抗人IL‑37单克隆抗体具有特异性高以及亲和力高的特点，能够识别人IL‑37的原核表达产物、人IL‑37的真核表达产物及天然表达的人IL‑37蛋白，利用该单克隆抗体可以通过IHC、WB、ELISA、FCM等免疫学方法简便、快速、准确地检测出人IL‑37蛋白的表达水平。

Description

一种分泌抗人IL-37单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人IL-37 单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分泌抗人IL-37单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人IL-37单克隆抗体及其应用。
背景技术
IL-37属于白细胞介素-1（inteleukin-1, IL-1）家族成员。IL-1家族共有11个成员，都具有β-三叶草结构， 可以与免疫球蛋白样受体结合, 家族中的大多数因子为促炎细胞因子，少部分属于受体拮抗剂，可以通过阻断受体与配体结合减轻炎性反应。2000年，Kumar等发现一种未成熟的前体肽IL-1H4，于2001年被Eleanor发现其为IL-1家族的第7个细胞因子，命名其为IL-1F7，至2010被正式更名为IL-37。
人类IL-37基因存在于2号染色体上，其分子量是17～24kD，结构与IL-1家族其它成员相似，由12条管状线组成，分为五个亚型IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d、IL-37e，其中IL-37b是占主导的亚型。IL-37b由218个氨基酸组成，在N端存在一个前导序列，并含有一个caspase-1切割位点，其前体分子被casepase-1酶切后产生成熟的IL-37b。IL-37b在人类的多种组织中都有表达，如淋巴结、肝脏、皮下脂肪、胸腺、骨髓、胎盘、肺、睾丸、子宫、结肠肿瘤。在一些细胞系中也发现了IL-37b的表达，如THP-1、U937、A431、IMTLHKG-1、HL60、HPBMC、HPT-4、NHDC等。IL-37b主要具有抗炎和免疫抑制作用，主要通过与细胞核内的Samd3结合形成复合体调节基因的转录来抑制炎症因子的释放，也能与IL-18受体结合抑制IFN-γ的合成，并对TLR后信号传导和DC细胞活性产生抑制作用，参与多种炎症性疾病的发生发展，如：肝炎、肿瘤、结核、系统性红斑狼疮、银屑病、结肠炎、肥胖症等。目前认为IL-37不但可以在胞内发挥其生物学功能，也可以分泌至细胞外作用于其他细胞或细胞因子而发挥作用。但是其对于免疫性疾病和感染性疾病的具体调节机制仍不十分清楚，因此，进一步阐明IL-37与炎症相关性疾病的发病机制，可以为疾病的治疗提供新思路和新靶点，高亲和力、高特异性的单抗无疑是研究IL-37功能的重要工具。
免疫分析作为一种特殊的检测技术已经广泛应用于人类和动物。在免疫分析测定中，抗体是一个核心试剂，决定了测定的特异性和敏感性。尽管近些年来一些小分子物质开始用于临床诊断及治疗，如单链可变区片段、核酸适配体、肽配体等，然而，单克隆抗体仍是最佳选择，且与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有特异性高、重现性好等优点。这也使其成为诊断试剂的最好选择。
ELISA法作为免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作，检测成本较低等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且一天之内可以检查几百甚至上千份标本。因此，也适合于血清流行病学调查。
目前市面上有两家公司出售IL-37单克隆抗体，LSBio与Abcam各有一株，主要应用于免疫组织化学（immunohistochemical, IHC）、Western Blot（WB）、酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）、和免疫荧光流式细胞术（Flowcytometer Analysis, FCM）等，如在肝癌患者中，通过IHC检测到肝癌组织IL-37表达显著的升高，且表达水平与肿瘤大小呈负相关。同样的，可以通过WB来评估IL-37在细胞以及组织中表达的变化。ELISA主要用于检测血清、体液中的可溶性IL-37表达水平，这对于疾病筛查排除诊断是十分重要的。迄今商品IL-37单抗较少应用到FCM检测，因为没有流式标记抗体，需要先孵育IL-37单抗，再孵育相应二抗才能进行检测。可见，目前IL-37的单克隆抗体种类较少，应用范围有限，不足以满足实验研究的需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种特异性高、亲和力高的抗人IL-37单克隆抗体、能分泌产生该抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体在免疫检测领域和临床药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
提供一种分泌抗人IL-37单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCNO：C201683。
本发明还提供一种抗人IL-37单克隆抗体，其所述抗人IL-37单克隆抗体是由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的。
本发明还提供一种人IL-37的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：
a）重组人IL-37蛋白标准品；
b）鼠抗人IL-37单克隆抗体；
c）兔抗人IL-37多克隆抗体；
d）HRP标记的羊抗兔IgG；
e）酶标板；
所述鼠抗人IL-37单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：C201683的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的。
优选的，所述的一种人IL-37的双抗体夹心ELISA 检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以下试剂：
f）TMB显色液；
g）终止液；
h）包被缓冲液；
i）洗涤液；
j）封闭液；
k）稀释液。
优选的，所述包被缓冲液为pH9.6、浓度为0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液。
优选的，所述洗涤液为PBST洗涤液，所述封闭液为含有体积百分比为5%的脱脂奶粉的PBST溶液，所述稀释液为含有体积百分比为3%的脱脂奶粉的PBST溶液.
本发明的抗人IL-37单克隆抗体在制备用于治疗由人IL-37介导的自身免疫系统疾病的药物中的应用。
所述自身免疫系统疾病选自胰腺炎、炎性肌病、显微镜下多血管炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肝炎、韦格纳氏综合征、肠憩室病、强直性脊柱炎、硬皮病、系统性硬化症、银屑病关节炎、骨关节炎、异位性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、皮肤T 细胞淋巴瘤、肾小球性肾炎、IgA 肾病、高敏移植患者、抗磷脂综合征、葡萄膜炎和哮喘、I 型糖尿病炎性肠病、类风湿型关节炎、系统性红斑狼疮或银屑病。
本发明的抗人IL-37单克隆抗体在制备用于治疗炎症性疾病的药物中的应用。
所述炎症性疾病为登革热病、结核病或炎症性肠病。
本发明的有益效果是：
（1）本发明的杂交瘤细胞株能够分泌产生一种特异性高、亲和力高的抗人IL-37单克隆抗体，该抗体能够识别人IL-37的原核表达产物，人IL-37的真核表达产物，及天然表达的人IL-37蛋白。因此，利用该单克隆抗体可以通过IHC、WB、ELISA、FCM等免疫学方法简便、快速、准确地检测出人IL-37蛋白的表达水平；
（2）本发明的杂交瘤细胞株具有良好的传代能力并能大量扩增培养，能稳定在体外分泌抗体，并且分泌抗体的能力随着培养代次增加没有下降，诱生腹水的能力也不随传代次数的增加而改变；
（3）本发明的抗人IL-37单克隆抗体与市面出售的抗体具有不同的结合位点，增加了抗体的种类；
（4）本发明的抗人IL-37单克隆抗体可用于制备双抗体夹心ELISA 检测试剂盒，并通过双抗夹心ELISA检测方法，能够简单、快速、准确地检测出人血清中IL-37蛋白的表达水平，因此可用于临床样本检测，为疾病辅助诊断提供依据；
（5）本发明的抗人IL-37单克隆抗体在临床上可用于制备治疗由人IL-37介导的自身免疫系统疾病和炎症性疾病的药物。
附图说明
图1是鼠抗人IL-37多抗的血清效价检测结果。
图2是重链（H2），轻链（L2）PCR产物测序结果以及重链、轻链超变区结构分析。
图3 是鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于WB的检测结果。
图4 是鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于FCM间接法的检测结果。
图5 是鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于FCM直接法的检测结果。
图6 是鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于IHC的检测乳腺癌组织中IL-37表达的检测结果。
图7是间接ELISA测定兔抗人IL-37多抗的血清效价检测结果。
图8是WB检测鼠抗人IL-37多抗特异性的检测结果。
图9 是鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于ELISA法检测IL-37工作曲线图。
图10 是鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于ELISA法检测血浆标本IL-37含量检测图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：抗体的制备、鉴定及纯化
1．免疫原的制备与动物免疫
使用实验室保存的含有IL-37基因片段的质粒，转入大肠杆菌中，IPTG诱导大肠杆菌大量表达目的蛋白，超声破碎大肠杆菌后，使用镍柱纯化，得到可溶性IL-37b蛋白。准备2只6周雌性BALB/c小鼠，用人IL-37b蛋白按照表1的方案免疫接种小鼠，总的来说，使用弗氏完全佐剂乳化的150μg纯化重组IL-37b进行腹腔注射来初次免疫接种小鼠，14天后进行第二次免疫，初次免疫接种后，每只小鼠以周为间隔经腹腔途径再接受三次含弗氏不完全佐剂乳化的150μg纯化重组IL-37b。第四次免疫接种后7天，经尾静脉对所述小鼠采血并从血中分离血清以分析其与IL-37结合的能力（见图1）。
表1 动物免疫方案
天数 操作 剂量 佐剂 接种部位
1 初次免疫 200 μg CFA 腹腔注射
14 第一次加强免疫 200 μg IFA 腹腔及皮下多点注射
21 第二次加强免疫 200 μg IFA 腹腔及皮下多点注射
28 第三次加强免疫 200 μg IFA 腹腔及皮下多点注射
35 冲击免疫 200 μg 无 腹腔注射
2．细胞融合及阳性克隆细胞筛选
从两只小鼠中选择效价较高的BALB/c小鼠采集并采集脾细胞，进行细胞融合，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合比例为4：1。融合生长7天后，用重组IL-37b蛋白作为特异性抗体标靶，通过间接ELISA识别产生特异性抗体的杂交瘤细胞上清（结果见表2）。
表2 间接ELISA法筛选阳性细胞
克隆号 OD值 克隆号 OD值
2A3 OVER 1C4 3.4931
2A11 3.7121 1C6 OVER
2B4 OVER 1C9 OVER
2B10 OVER 1C10 OVER
2D1 OVER 1D4 OVER
2E3 2.9471 1D6 3.9523
2E9 3.9597 1D10 OVER
2F1 1.7416 1E7 1.3864
2F5 OVER 1E11 2.6078
2F12 3.8275 1F9 3.9892
2H10 3.7136 1F10 2.5389
2H12 OVER 1G1 2.5638
1A5 OVER 1G2 OVER
1B8 3.9891 1G7 OVER
1C1 1.7519 1G9 OVER
3．抗体的特异性及亚型鉴定
（1） pcDNA3.1-il37-GFP转染293T细胞
转染前一天，胰酶消化293-T细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用 50μl 无血清DMEM 培养基稀释 0.8μg-1.0μg DNA。50μl DMEM 培养基稀释1μl~3μl LIPO2000试剂。LIPO2000稀释后，在5 min内同稀释的DNA混合。混合稀释的 DNA和稀释的LIPO 2000。在室温保温 20 分钟。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在 37℃，5％的 CO2中保温4~5h后更换生长培养基。24h后在荧光显微镜下观察转染情况，转染后的细胞表达真核IL-37b蛋白，转染成功的细胞在荧光显微镜下观察可见绿色荧光，得到的真核表达IL-37-GFP融合蛋白用于以下WB与FCM对抗体的特异性鉴定。
（2） WB鉴定抗体特异性
收获转染了48h的293-T细胞，离心，去上清，加入2×的上样缓冲液，煮沸后上样。电泳于4℃进行。浓缩胶90v 15min，分离胶120v 1h。制备足够的转移缓冲液，取下凝胶，浸入转移缓冲液中15-30min，滤纸在转移缓冲液中浸泡30s。膜在甲醇中润湿15s，在转移缓冲液中平衡5min。转膜装置至于冰水中，220v 1h。转好的膜使用8％的脱脂奶粉，室温封闭2h。去除封闭液，使用PBST洗涤3次，每次10min。使用封闭液分别稀释制备得到的IL-37b抗体，4℃孵育过夜。去除一抗，使用PBST洗涤3次，每次10min。加入使用封闭液稀释的二抗，室温孵育1h后。暗室压片曝光。
（3） 使用FCM鉴定抗体特异性
收取转染24h的293T细胞,细胞放入流式管中，加入3ml PBS洗液，离心500g 5min，去上清。（PBS洗液成分：需加入2％FBS或者2％BSA，0.01％的叠氮化钠。）加入破膜剂，每管250μl，混匀，4℃孵育 20min。加入3ml PBS 离心500g 5min，去上清。每管加入100μl洗液，分别加入制备的IL-37b单克隆抗体，混匀后，4℃孵育 30min。使用3ml PBS洗涤两次，加入带有APC标记二抗，混匀，4℃孵育30min。PBS洗涤两次。加入200ml 1％的甲醛溶液，固定，放入4℃待检测。
（4） 抗体亚型鉴定
使用抗体亚型鉴定试剂盒，按照厂商说明书鉴定抗体的亚型。经鉴定，单克隆抗体1C6的亚型为IgG1，轻链为κ链。
4．抗体超变区基因扩增和序列分析
（1） 抗体超变区基因扩增
① 1C6单克隆细胞株复苏：使用含 20%FBS的DMEM培养基培养细胞，待细胞长至1×106细胞/ml时准备提取RNA，使用前一天细胞进行半换液，以维持细胞良好的生长状态。
② 1C6单克隆细胞株RNA的提取： 细胞用PBS洗涤，1ml胰酶消化，4mlDMEM培养基中和胰酶的消化，1200r/min，离心5min，弃上清，加入4ml TRIZOL重悬，混匀后分别放入EP管中（1ml/支），反复吹打来裂解细胞至均一透亮的液态后，将匀浆样品在室温条件下孵育5min，以使核蛋白体完全分解。每支EP管加入200μl氯仿(1/5倍TRIZOL量)，震荡15s，室温放置5min，4度，12000g（离心机需提前降温）离心15min。吸取上清液置新的无酶EP管中，加入与TRIZOL等量的异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min，弃上清，加入与TRIZOL等量的75%无水乙醇进行洗涤，上下颠倒混匀，7500g，离心5min，弃上清,倒扣在滤纸上,室温静置待乙醇挥发。用20ul的DEPC水溶解RNA沉淀，用核酸定量检测仪检测RNA含量为480ng/ul。
③ 逆转录：冰上操作，在无菌EP管内加入逆转录酶2μl，mRNA 1μl（480ng），无酶水补足10μl，涡旋混匀，42℃反应1小时，95℃加热5分钟，然后置于冰上。
④ PCR扩增抗体重链超变区基因、轻链超变区基因：根据PUBMED上已有的IgG1kappa链超变区mRNA序列设计引物如下：
重链上游（SEQ ID NO：1）：5'-GTCCAGAGTGAAGTGAAGCTTGAGG -3'；
重链下游（SEQ ID NO：2）：5'-CTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3'；
轻链上游（SEQ ID NO：3）：5'-ACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTC-3'；
轻链下游（SEQ ID NO：4）：5'-GCAGCTGTGATACCCAAAGTAAGAC -3'。
进行PCR扩增，采用50μl反应体系，共扩增4管，总量200μl。即加入2× Taq酶0.25μl，10×Buffer 5μl，dNTP 4μl，上下游引物各2 μl， 模板2μl，无菌水补足50μl。反应条件如下，①94℃，1min；②94℃，30S；③65℃，30s；④72℃，30s；②-④，30个循环；⑤72℃，10min；⑥ 4℃,+∞ 。
⑤ 2%琼脂糖凝胶电泳：Marker上样2.5μl加1μl的核酸Ⅱ型染料，PCR产物共4管分别吸取5μl上样，加1μl的上样缓冲液和1μl的核酸Ⅱ型染料，110v，40min，进行电泳。
⑥ 凝胶回收DNA：扩大PCR产物上样量,每孔50μl，共上样200μl，进行凝胶电泳，使用TaKaRa胶回收试剂盒，在紫外灯下切下含有目的DNA部分的凝胶，具体步骤参照试剂说明书。回收后测得的重链DNA含量为60ng/μl，轻链DNA含量为40 ng/μl。
（2） 质粒构建
① 将胶回收产物与T载体连接，连接体系为T4连接酶1μl，T载体0.5μl，目的片断2μl，10×T4缓冲液1μl，ddH2O补足10μl，16℃连接过夜。
② 质粒转化DH5α：转化平板制备，向铺好的含有AMP的固体培养基表面加入16μl的IPTG（50mg/ml），40μl的x-gal（20mg/ml），均匀涂开后置于37℃避光1h。取10μl连接产物加入到100μl 的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴90sec，立即置于冰浴中2-3Min，其间不要摇动离心管。向离心管中加入500μl 37℃预热的LB培养基，150rpm，37℃震荡培养45min后混匀菌液吸取250μl加入到上述平板中，均匀涂开后置于37℃，培养12-16h。观察菌落情况。
③ 菌落鉴定：分别挑选重链和轻链4个白色菌落加入到5ml含AMP的LB液体培养基中进行增菌培养，16h后吸取2ml菌液提取质粒，具体步骤参照质粒小提取试剂盒说明书，测定提取的质粒浓度后进行PCR扩增，反应体系，条件同上，进行2%琼脂糖凝胶电泳验证条带。轻链仅有一个菌落重组成功。
（3）菌液测序（见图2结果）
抗体重链和轻链测序结果以及抗体重链和轻链超变区序列分析，其中图中方框内所示的序列，分别表示的是重链和轻链的三个超变区。
5．抗体的纯化
（1） 腹水的制备
选取杂交瘤细胞株1C6（进行融合细胞培养时共用了4块96孔板，这里指的是第1块板的C行6列孔中的细胞），取8~10周两只BALB/c雌鼠，注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5ml/只。三天后，注射使用0.5ml PBS悬浮的1C6融合细胞，1×106/只，一周后，每天观察小鼠状态和腹水产生情况。小鼠中度腹胀时第一次收获腹水，实施穿刺抽取术，用18号针头，倾斜呈45°角刺入下腹部腹中线的右侧引流，避开上腹部的脏器和中线附近的血管。每次收集腹水合并在一起。1500g离心腹水10min以沉淀并移除腹水中的细胞。将腹水上清液转移至50ml离心管中并冻存在-20℃。
（2）抗体的纯化
纯化前，解冻腹水，用高速离心机离心使其澄清，纯化前去除脂质。使用蛋白G层析介质纯化，检测腹水前后的效价并验证纯化后的抗体纯度。
实施例2：杂交瘤细胞的鉴定及保存
本发明的杂交瘤细胞株的保藏信息为：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学；保藏日期：2016年5月；命名：杂交瘤细胞株1C6；保藏号为CCTCCNO：C201683。
1．杂交瘤细胞克隆不同代次的抗体分泌能力的稳定性分析
首先对1C6杂交瘤细胞进行传代，分别取第一代，第二代，第五代，第七代，第十代杂交瘤（初始细胞密度为细胞在培养瓶底部铺满）培养时间满两天后的上清样本，对细胞分泌上清进行ELISA鉴定，分别取每代细胞的上清样本作为一抗，以获得的IL-37原核纯化蛋白包板，进行ELISA，每组别均做8个重复孔，其余步骤如上操作，分析结果显示OD450平均值分别为3.576854，3.902718，3.8062735，3.518442，3.602658从统计学分析五个代次的分泌抗体能力无统计学上的差异；说明本发明获得一株能稳定体外分泌抗体的杂交瘤细胞（命名为1C6），同时说明随着培养代次增加而分泌抗体的能力不下降。
2．抗人IL-37单克隆抗体建株与冻存
通过有限稀释将在间接ELISA方法中产生阳性结果的杂交瘤细胞亚克隆至少两到三次，直至到使用间接ELISA进行筛选，整个96孔板的细胞上清都为阳性为止。筛选过程中的阳性孔都要在10％生长培养基中扩大培养杂交瘤细胞克隆，并在37℃和5~6％CO2的条件下维持在1×105和5×105细胞/ml之间。细胞数足够时。将细胞冷冻在70％血清、20％DMEM、10％DMSO中并存放在液氮中。
实施例3：抗人IL-37单克隆抗体的应用
一、鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于WB
（一）试剂及配制
1、电极缓冲液（1×电极缓冲液配制）：
Tris 碱3.03g，甘氨酸 18.8g，SDS1.0g，双蒸水调至体积为1L，pH8.3；
2、转移缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 碱5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml，pH8.3；
3、TBST（Tris-Hcl，Nacl）缓冲液：6g Tris 碱，9g Nacl，双蒸水500ml，Hcl pH7.5，定容1L，加1ml Tween-20；
4、封闭液：8％脱脂奶粉；
5、30％丙烯酰胺储存液：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加双蒸水至100ml；
6、浓缩胶缓冲液：1mol/L Tris 碱，pH6.8；
7、分离胶缓冲液：1mol/L Tris 碱，pH8.8；
以上试剂均用双蒸水配制；
8、预染蛋白Marker；
9、PVDF蛋白印迹转移膜；
10、HRP标记的羊抗鼠IgG；
11、发光液；
12、通用显影粉；
13、酸性定影粉；
（二）实验步骤：
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）配胶：12%胶分离胶10 ml ；蒸馏水2.0 ml，30%Acr-Bis(29:1) 4.0 ml，1M Tris,pH8.8 3.8 ml，10%SDS 0.1 ml，10%过硫酸铵0.1 ml，TEMED 0.004 ml；
5%浓缩胶3ml：蒸馏水2.1 ml，30%Acr-Bis(29:1) 0.5 ml ，1M Tris pH6.8 0.38 ml，10%SDS 0.03 ml，10%过硫酸铵 0.03 ml，TEMED 0.003 ml。
（2）灌胶：将配制好的分离胶溶液缓慢加入到装配好的板中，加至距离短板顶端约3cm处时停止，在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层，大约30min聚合完毕。30min后，将浓缩胶加入板中至顶部，插入梳子，凝胶聚合1h左右。
（3）样品制备：48小时后，收集转染的细胞，把细胞及培养基一起收集到15ml离心管中，1500rpm离心3min，弃上清，1ml PBS重悬，移入1.5ml EP管，用PBS洗涤两次，2500rpm，4℃离心5min，尽量去除所有残留上清，每孔细胞加70μl 2×上样缓冲液，混匀后煮沸5min。
（4）电泳：电泳于4℃进行，旁置冰块降温。浓缩胶90v 15min，当蛋白全部压成一条线时，换成电压120v跑分离胶1h，尽量将蛋白跑开。
2.转印蛋白质到PVDF膜上
（1）制备足够的转移缓冲液以充满转移槽，另外准备200ml用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。
（2）从玻璃板上取下凝胶，去除多余凝胶，保留目的蛋白条带。
（3）将凝胶浸入转移缓冲液中15-30min。滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30s。
（4）准备膜：在甲醇中润湿膜15s，保证膜由不透明变成半透明，小心将膜放入双蒸水中浸泡2min，小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5min。
（5）按照黑板、海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵、白板的顺序组装转移夹层。
（6）将转移夹放入转移槽中，确保正负极正确，加入足够的转移缓冲液，保证液面完全高于滤纸高度。
（7）转膜装置至于冰水中，200v 1h。
3.封闭
（1）转好的膜小心放入PBST中漂洗，3次，每次5min。
（2）加入8％的脱脂奶粉，室温封闭2h。
4. 抗体杂交
（1）去除封闭液，使用PBST洗涤3次，每次10min。使用封闭液稀释IL-37单克隆抗体，根据Abcam商品化IL-37单克隆抗体说明书，WB的建议浓度为1µg ~5µg/ml，本次试验一抗的抗体浓度分别选择0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml。加入抗体，4℃孵育过夜。
（2）去除一抗，使用PBST洗涤3次，每次10min。加入使用封闭液稀释的二抗，室温孵育1h后，使用PBST洗涤3次，每次10min。洗涤结束后吸干液体，准备显色。
5. 加底物显色
剪切好胶片，在暗室中将显色液均匀平铺在膜上，每张膜约使用200μl显色液，静置显色，在暗室中进行胶片曝光。
6. 结果
实验结果如图3所示（图中M: Protein Marker；1：一抗1C6使用浓度为0.5μg/ml；2：一抗1C6使用浓度为1μg/ml；3：一抗1C6使用浓度为2μg/ml；4：一抗1C6使用浓度为5μg/ml），纯化后的抗体有良好的特异性，目的条带分子量在42KD左右，可以与真核表达的IL-37特异性结合，抗体浓度改变时并不影响实验结果，且当抗体浓度为0.5μg/ml时，仍然可用。
二．鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于FCM间接法
（一）试剂及配制
1、PBS洗液：PBS中加入2％BSA, 0.01％的叠氮化钠；
2、破膜剂；
3、一抗：鼠抗人IL-37单克隆抗体；
4、二抗：APC标记的羊抗鼠IgG；
5、固定液：1%的甲醛溶液；
（二）实验步骤
1、收取细胞：收集转染pcDNA3.1-IL-37-GFP的293-T细胞与培养基一起放入流式管中，1×106个细胞/管，加入3ml PBS洗液500g离心5min，弃上清，加入3ml PBS洗液一次，弃上清，扣干；
2、破膜：按照每管250μl的量加入破膜剂，充分混匀，4℃孵育20min。加入3ml PBS洗液震荡混匀，500g离心5min，弃上清，扣干；
3、孵育一抗：每管加100μl洗液，根据Abcam商品化IL-37单克隆抗体说明书，FCM的建议浓度为1µg/106个细胞，本次试验中，纯化抗体的使用浓度分别选择0.125μg、0. 25μg、0. 5μg、0. 75μg、1μg/106个细胞。分别加入相应浓度的IL-37单克隆抗体，震荡混匀，4℃孵育30min。加3ml PBS洗液重复洗涤两次，500g离心5min，弃上清，留取最后一滴液体；
4、孵育二抗：加入APC标记的羊抗鼠IgG二抗，震荡混匀，4℃ 孵育20min。加3ml PBS洗液重复洗涤两次，扣干。每管加入200ml 1%的甲醛溶液，固定，放入4℃待测。
5、结果：如图4所示，其中图A：转染空白质粒的293-T细胞；图B：转染pCDNA3.1-il37-GFP的293-T细胞；图C：一抗浓度为0.125μg/106个细胞，抗体与胞内抗原的结合率为76.3%；图D：一抗浓度为0. 25μg/106个细胞，抗体与胞内抗原的结合率为88.3%；图E：一抗浓度为0. 5μg/106个细胞，抗体与胞内抗原的结合率为96.6%；图F：一抗浓度为0.75μg/106个细胞，抗体与胞内抗原的结合率为97.7%；图G：一抗浓度为1μg/106个细胞，抗体与胞内抗原的结合率为98.2%。
其中，图C中，图C1：转染后的293-T细胞孵育抗体后，胞内抗原与抗体的结合比例；图C2示：转染后的293-T细胞未孵育抗体与孵育相应浓度抗体后的对比结果；图C2中的1表示未加入抗体的阴性对照，图C2中的2表示加入相应浓度的抗体后；以上图D、E、F、G图中的表示方法均与图C相同。
由此图4结果可知，随着抗体浓度的增加，抗体与胞内抗原的结合率依次为76.3%、88.3%、96.6%、97.7%、98.2%。可见，当抗体浓度为1μg/106个细胞时，几乎所有细胞均可以与抗体结合。
三．鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于FCM直接法
（一）试剂及配制
1、PBS洗液：PBS中加入2％BSA, 0.01％的叠氮化钠；
2、破膜剂；
3、抗体：Alexa Fluor®647荧光标记的鼠抗人IL-37单克隆抗体；
4、固定液：1%的甲醛溶液；
（二）实验步骤
1、收取细胞：收集转染pcDNA3.1-IL-37-GFP的293-T细胞与培养基一起放入流式管中，1×106个细胞/管，加入3ml PBS洗液500g离心5min，弃上清，加入3ml PBS洗液一次，弃上清，扣干；
2、破膜：按照每管250μl的量加入破膜剂，充分混匀，4℃孵育20min。加入3ml PBS洗液震荡混匀，500g离心5min，弃上清，扣干；
3、孵育抗体：每管加100μl洗液，考虑到抗体标记的比例不能达到100%，因而加大抗体的实际使用浓度。抗体浓度选择2µg /106个细胞。加入抗体，震荡混匀，4℃孵育30min。加3ml PBS洗液重复洗涤两次，500g离心5min，弃上清，扣干。每管加入200ml 1%的甲醛溶液，固定，放入4℃待测；
4、结果：如图5所示，其中图A：转染空白质粒的293-T细胞；图B：转染pCDNA3.1-il37-GFP的293-T细胞；图C：抗体浓度为2μg/106个细胞，抗体与胞内抗原的结合率为90.1%
其中，图C中，图C1：转染后的293-T细胞孵育抗体后，胞内抗原与抗体的结合比例；图C2：转染后的293-T细胞未孵育抗体与孵育相应浓度抗体后的对比结果；图C2中的1表示未加入抗体的阴性对照，2表示加入相应浓度的抗体后。由此可知，标记的抗体与细胞内抗原结合良好，其与胞内抗原的结合率为90.1%。
四．鼠抗人IL-37单克隆抗体应用于IHC
（一）免疫组化（IHC）组成成分：
1. 固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液 (pH7.4) ；
配制：4g多聚甲醛溶于80ml 0.1M的磷酸（PB）缓冲液中，加热至60度左右助溶,滴加少许NaOH使溶液变清亮,最后定容至100ml,充分混匀调价PH，4度保存；
2. 防脱剂：多聚赖氨酸；
3. 抗原修复液：0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）；
配制：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸0.4g，加蒸馏水定容至1000ml；
4. 3%甲醇-H2O2溶液（(作用阻断过氧化物酶）：30% H2O2和80%甲醇溶液配制而成；
5. 显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液；
6. 山羊抗血清（封闭液，封闭非特异性染色）；
7. 抗体稀释液（稀释一抗，二抗，三抗）；
8. 一抗：鼠抗人IL-37单克隆抗体（单克隆1C6细胞株分泌）；
9. 二抗：生物素标记的兔抗鼠IgG；
10. 三抗：链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶溶液；
11. PBS（0.01M磷酸盐缓冲液 ，pH7.4)（配试剂，洗涤使用）；
配制：NaCl 8g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 3.48g，KCl 0.2g，溶于800mLH2O中，加去离子水定容至1000mL；
12. 0.1M PB（配试剂使用），配制：Na2HPO4·12H2O：14.5g；NaH2PO4·2H2O：1.5g
13. 其它试剂包括：二甲苯、梯度浓度乙醇、中性树胶，石蜡。
（二）采用SP法进行染色：
首先，乳腺癌组织经固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片等步骤进行切片制作过程，然后进行以下步骤：
1. 石蜡切片4um厚，用防脱片剂多聚赖氨酸处理过的载玻片捞片，置烤箱60℃，60min；
2. 切片脱蜡至水，PBS洗3×3min；
3. 高温高压抗原修复：取足量0.01M柠檬酸缓冲液于压力锅中，加热至沸腾，将切片置入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热到工作温度和压力后开始计时。1.5min后压力锅离开热源，1min后自来水轻淋锅体冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗2次，洗2×3min；
4. 滴加3﹪甲醇-过氧化氢阻断过氧化物酶，室温孵育15min，冷PBS洗3×5min；
5. 滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余血清，不用冲洗；
6. 滴加按一定浓度稀释的1C6一抗（1：200抗体稀释液稀释），同时以PBS代替一抗作空白对照，4℃冰箱孵育过夜；
7. 冷PBS洗3×5min，滴加生物素标记的二抗（按说明书稀释），室温孵育10min；
8. 冷PBS洗3×5min，滴加链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶溶液（三抗，按说明书稀释），室温孵育10min；
9. 冷PBS洗3×5min，DAB显色，蒸馏水1ml，加显色试剂盒内A、B、C试剂各一滴，充分混匀，室温下避光显色3-10min（在显微镜下控制显色时间），蒸馏水洗涤;
10. 苏木素轻度复染，自来水返蓝15min，逐级脱水，透明，封片。
（三）结果判断：
1. 每一批免疫组化均设有已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照，阳性表达定位于细胞膜或细胞质，均呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。每一切片随机选择3个视野（×200），在显微镜（×400）下计数每个视野100个肿瘤细胞中阳性细胞的比例，非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞的比例，取3个视野的平均百分数为判定结果。光学显微镜下观察（见图6），根据棕黄色阳性信号的强弱和面积判断结果：阳性细胞﹤10﹪为阴性表达；10﹪～50﹪为阳性表达；﹥50﹪为强阳表达。结果判断：按阳性细胞百分率计分：阳性细胞﹤10﹪计0分；10﹪～50﹪计1分；﹥50﹪计2分。
2. 按染色强弱计分：淡黄色计0分；黄色计1分；棕黄色计2分。两项合并得0～1分为阴性；2～3分为阳性；4分为强阳性。
五．人IL-37双抗体夹心ELISA检测方法
人IL-37的双抗体夹心ELISA 检测试剂盒组分：
重组人IL-37蛋白标准品，鼠抗人IL-37单克隆抗体，兔抗人IL-37多克隆抗体，HRP标记的羊抗兔IgG，TMB显色液（Thermo公司），H2SO4终止液（Solarbio公司），包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6，Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，加蒸馏水定容至1 L，4℃保存），PBST洗涤液(1000ml PBS+500ul Tween 20)，5%脱脂奶粉（封闭液，5g奶粉+100mlPBST），3%脱脂奶粉（反应用稀释液，3g奶粉+100ml PBST），96孔corning可拆卸酶标板。
其中：包被缓冲液用于在96孔可拆卸酶标板上包被鼠抗人IL-37单克隆抗体；
5%脱脂奶粉用于单抗包板之后的封闭环节；
3%脱脂奶粉用于稀释反应物，如蛋白标准品，多抗，二抗，检测血清；
PBST洗涤液用于ELISA反应每一步的洗涤；
96孔可拆卸酶标板用于包被单克隆抗体；
重组IL-37蛋白标准品，倍比稀释后分别与单克隆抗体和多克隆抗体之间结合形成夹心复合物，通过加入HRP-羊抗兔IgG和酶适应性底物TMB后，H2SO4终止反应，通过吸光度值的变化得出Ag-Ab反应的标准曲线。
检测原理：利用抗原或抗体可通过多种机制吸附于酶标板的特点，将单克隆抗体用包被缓冲液稀释到一定浓度后加入到96孔板中，每孔100ul，4℃包被过夜。次日用5%脱脂奶粉37℃封闭2小时，封闭掉酶标板底部未包被上抗体的部分，消除非特异性吸附。加入标准品或检测血清利用抗原抗体间特异性结合原理使其与包被单抗结合后吸附于固相载体表面，洗涤去除孔中未结合的抗原，然后加入多克隆抗体，该抗体同样可以和抗原特异性结合，形成单抗-抗原-多抗的双抗夹心复合物，最后加入针对多克隆抗体Fc段的HRP-羊抗兔IgG，结合后该单抗-抗原-多抗-HRP-羊抗兔IgG复合物共同吸附于载体表面，加入酶适应性底物TMB，避光反应15min，酶催化底物显色，最后加入H2SO4终止显色，酶标仪检测各孔吸光度值，通过吸光度值的大小来反应各孔中抗原的含量。
5.1重组IL-37蛋白的诱导表达和多克隆抗体的制备
（1）蛋白的表达与纯化，免疫接种
将含有IL-37质粒的大肠杆菌菌种按1:100接种于含有Kana的LB液体培养基，37℃摇菌过夜，12h~16h后，按照1:100的比例将摇好的菌液接种到500ml含Kana的LB培养基中，扩大培养至菌液OD值在0.55左右，取1ml菌液保留，作为空白对照，剩余菌液加入终浓度为1mmol/L的IPTG母液，继续摇菌约3h，取1ml菌液保留，作为诱导后对照，剩余菌液在10000g，离心20min，收集菌体沉淀，将该菌体沉淀在超声破碎仪上超声破碎，离心后分别取上清和沉淀样品，以诱导前和诱导后样品对为对照，进行SDS-PAGE电泳，分析得出该蛋白为可溶性蛋白，同时利用Ni-NAT亲和层析柱纯化得到目的蛋白。使用超滤离心管去咪唑与浓缩，用1×PBS来作为最后的蛋白储存液，BCA法测定蛋白含量，并调整浓度为1.0mg/mL，分装冻存保存于-80℃，作为免疫原。准备 2只雌性新西兰白兔，利用制备好的IL-37b蛋白免疫兔子,取1ml蛋白用等体积弗氏完全佐剂混合研磨乳化，制备成免疫原，第一周在兔双后腿足跖处注射抗原，每侧0.5ml。第二周同样取1ml蛋白用等体积弗氏不完全佐剂混合研磨乳化后在兔双后腿腘窝淋巴结处注射抗原，每侧0.5ml。第3-4周免疫时无需加入佐剂，直接取1ml蛋白分别在背部进行多点注射和大腿肌肉注射。末次免疫后1周于耳缘静脉取血，用间接ELISA法检测血清效价为一号兔子为1:128000，二号兔子为1:10000。以下选择一号兔所得多抗进行试验（见图7）。
（2）多克隆抗体的纯化与鉴定
使用饱和硫酸铵法对多抗进行初步纯化，透析袋透析，BCA法检测兔多抗浓度为9.45μg/μL，具体步骤按照说明书进行。WB检测抗体特异性，用表达IL-37真核质粒PcDNA3.1,转染293T细胞后48h，收集细胞煮沸法裂解细胞得到IL-37蛋白，用该蛋白上样进行电泳，上样量分别为5μl，10μl，20μl。然后用兔多克隆抗体（1:8000稀释）孵育，再加入羊抗兔二抗（1:5000）孵育后暗室曝光，结果显示在42KD出有条带产生，证明该多抗可以和真核表达IL-37蛋白结合（见图8）。
5.2．间接ELISA方法的建立
（1）酶标抗体工作浓度的确定：兔多抗以（1:4000、1:6000、1:8000、1:10000）不同浓度包被96孔板，4℃过夜，5%脱脂奶粉37℃封闭2小时，同时将HRP标记的羊抗兔IgG抗体进行一系列稀释(1：3000、1：5000、1：6000、1：8000）选取A450值接近1.0时的酶标抗体浓度1:5000为最佳工作浓度。
（2）抗原抗体工作浓度的确定：采用棋盘滴定法确定，将鼠抗人IL-37单克隆抗体（浓度1.8mg/mL，BCA法检测）稀释为1:100、1:200、1:400包被与ELISA板上。加入强阳性抗原（46.875μg/L，3%脱脂奶粉稀释）和阴性对照（3%脱脂奶粉），同时各浓度梯度抗原均设置一个复孔。将兔抗人IL-37多克隆抗体稀释为1:6000、1:8000、1:10000。选择强阳性抗原液的A450值在1.0左右，阴性参考的A450值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被单抗1:200稀释，多克隆抗体1:6000稀释为最佳工作浓度。
（3）封闭液的确定：分别用5%脱脂奶粉和1%BSA做封闭液，进行不同封闭液封闭效果的对比。按夹心ELISA具体步骤进行实验。反应后比较各组的阴阳对照孔A450值，计算P/N(阳性孔与阴性孔A450比值)，以确定最佳封闭液为5%脱脂奶粉。
（4）封闭时间的选择：分别采取 37℃封闭2h，4℃封闭过夜。按夹心ELISA具体步骤进行实验。反应后比较各组的阴阳对照孔A450值，计算P/N(阳性孔与阴性孔A450比值)，得出二者之间无明显差异，因此为节约时间选择37℃封闭2小时。
（5）测定范围的确定：将纯化的IL-37蛋白(0.6μg/μL)1:200稀释后进一步倍比稀释，如1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800直到1:409600进行测定，标准品浓度为1.465μg/L时测得的P/N值小于2.1，绘制标准曲线，确定线性范围为1.465~46.875μg/L，最小检出浓度为1.465μg/L（见图9）。
（6）重复性测定：①批内重复试验即在同一批包被的酶标板内对46.875μg/L（1:12800稀释）纯化的IL-37蛋白进行20次平行检测，测其A450，计算CV值。②批间重复试验：分5次检测46.875μg/L纯化抗原，每次设4个重复孔，测其A450，计算CV值。得出批内误差为6.6%，批间误差为11.1%（见表3）。
表3 重复性试验结果
批内重复性试验 批间重复性试验
A450平均值（） 2.11 2.23
A450标准差（SD） 0.14 0.26
变异系数（CV%） 0.066 0.117
5.3．间接ELISA方法的应用
（1）IL-37真核质粒PcDNA3.1-il37-GFP转染293T细胞48h后，荧光显微镜观察绿色荧光数量，同时使用细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白700μg，利用上述ELISA方法检测293T细胞表达的IL-37含量为250μg/L，占细胞总蛋白的百分比35.7%，该结果荧光显微镜所得初步结果一致。
（2）正常人40例，登革热病人40例，结核病人20例，进行血浆IL-37含量检测，取各标本血浆100μl，用上述建立好的ELISA方法，检测血浆IL-37的含量，每孔均设置一个复孔，同时使用IL-37纯化蛋白作为标准品，梯度稀释至最低检测限，由图10可知，该试剂盒可以用于炎症性疾病检测。
同样的原理，该试剂盒还可以用于检测由人IL-37介导的自身免疫系统疾病。
由此，本发明的抗人IL-37单克隆抗体可用于制备双抗体夹心ELISA 检测试剂盒，并通过双抗夹心ELISA检测方法，能够简单、快速、准确地检测出人血清中IL-37蛋白的表达水平，因此可用于临床样本检测，为疾病辅助诊断提供依据。
本发明的抗人IL-37单克隆抗体在临床上可用于制备治疗由人IL-37介导的自身免疫系统疾病和炎症性疾病的药物。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种分泌抗人IL-37单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCNO：C201683。
2.一种抗人IL-37单克隆抗体，其特征在于：所述抗人IL-37单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的。
3.一种人IL-37的双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
a）重组人IL-37蛋白标准品；
b）鼠抗人IL-37单克隆抗体；
c）兔抗人IL-37多克隆抗体；
d）HRP标记的羊抗兔IgG；
e）酶标板；
所述鼠抗人IL-37单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO：C201683的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的。
4.如权利要求3所述的一种人IL-37的双抗体夹心ELISA 检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以下试剂：
f）TMB显色液；
g）终止液；
h）包被缓冲液；
i）洗涤液；
j）封闭液；
k）稀释液。
5.如权利要求4所述的一种人IL-37的双抗体夹心ELISA 检测试剂盒，其特征在于：所述包被缓冲液为pH9.6、浓度为0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液。
6.如权利要求4所述的一种人IL-37的双抗体夹心ELISA 检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为PBST洗涤液，所述封闭液为含有体积百分比为5%的脱脂奶粉的PBST溶液，所述稀释液为含有体积百分比为3%的脱脂奶粉的PBST溶液。
7.如权利要求2所述的抗体在制备用于治疗由人IL-37介导的自身免疫系统疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，所述自身免疫系统疾病选自胰腺炎、炎性肌病、显微镜下多血管炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肝炎、韦格纳氏综合征、肠憩室病、强直性脊柱炎、硬皮病、系统性硬化症、银屑病关节炎、骨关节炎、异位性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、皮肤T细胞淋巴瘤、肾小球性肾炎、IgA 肾病、高敏移植患者、抗磷脂综合征、葡萄膜炎和哮喘、I 型糖尿病炎性肠病、类风湿型关节炎、系统性红斑狼疮或银屑病。
9.如权利要求2所述的抗体在制备用于治疗炎症性疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述炎症性疾病为登革热病、结核病或炎症性肠病。
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