CN104387470B - 一种抗弓形虫单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗弓形虫单克隆抗体及其制备方法与应用，属于生物制品领域。本发明通过人胚肺成纤维细胞培养弓形虫，对收获的弓形虫纯化后反复冻融，免疫小鼠，取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选得到一株稳定分泌弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9559，其分泌的单克隆抗体效价高，特异性好，可用于弓形虫的检测，也可用于制备检测弓形虫的试剂盒或诊断试剂，检测结果准确率高，在弓形虫诊断领域具有较好应用前景。

Description

一种抗弓形虫单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗抗弓形虫的单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株和应用，以及制备该单克隆抗体的方法。

背景技术

弓形虫又名刚地弓形虫，呈全球分布，在人和多种动物中都能造成广泛的流行，给人畜均造成严重的危害。弓形虫人群的感染率各地不同，许多国家和地区感染率为25％～50％，高者达80％以上，推算全球平均感染率在25％左右，占世界人口的四分之一。我国人群弓形虫感染率为4％～9％，被列为“TORCH综合征”的首要病原体，可经胎盘垂直传播造成流产，胎儿畸形，死胎等严重后果。

目前弓形虫的诊断检测方法很多，病原学方法是最准确的确诊手段，但是此方法灵敏度较低，易漏检。分子生物学诊断方法对实验室条件和操作人员技术要求较高，不适于广泛应用。酶联免疫吸附法(ELISA)具有简单、快速、结果明确、操作简单等优点，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个方向。因此，为了提高检测弓形虫的敏感性和特异性，建立一种快速、简易和特异性好的诊断方法是十分必要的，而制备出高亲和力的单克隆抗体是其前提。

在已报道的弓形虫单克隆抗体制备方法中，根据免疫小鼠的抗原和抗原的来源不同，有3种方法。一是通过表达弓形虫的某一个蛋白(P30、SAG1、SAG2、GRA3等)用做免疫小鼠的抗原来制备单抗，该方法制备的单抗抗体效价要低于用弓形虫做抗原制备的单抗。二是从淋巴细胞分离液中分离纯化弓形虫，破碎弓形虫用于免疫小鼠制备单克隆抗体。三是将弓形虫注射到小鼠腹腔，从抽取的腹水中分离纯化速殖子，破碎速殖子用于免疫小鼠制备单克隆抗体。第二种方法不适于弓形虫的大批量扩繁。第三种方法在弓形虫大批量制备过程中存在成本高，耗时长，得到的弓形虫数量不足等缺点。因此，第二种方法和第三种方法不易获取大量的速殖子用于制备弓形虫的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗弓形虫单克隆抗体的制备方法。

本发明的另一目的在于提供利用上述方法获得的能够稳定分泌高效抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的再一个目的在于提供一种生物活性高、特异性高的抗弓形虫单克隆抗体，用于检测弓形虫。

为了达到上述目的，本发明首先提供一种制备抗弓形虫单克隆抗体的方法，是采用人胚肺成纤维细胞培养弓形虫，收获的弓形虫纯化后再免疫小鼠，取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选杂交瘤细胞株制备腹水，得到抗弓形虫单克隆抗体。

本发明方法中，使用的人胚肺成纤维细胞是已经商品化应用的保藏编号为CGMCC.4875的人胚肺成纤维细胞。

具体地，本发明方法用含8％～10％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后弃掉原培养基，换成含1％～3％新生牛血清MEM，然后接种弓形虫，接种MOI为0.1～0.5，5～9天后，待细胞CPE达到80％以上时收获弓形虫。优选7天后收获弓形虫。

在本发明的制备抗弓形虫单克隆抗体的方法中，收获的弓形虫在纯化前还需灭活。在本发明的一个实施例中了，灭活方法是经56℃水浴灭活30min。

对收获并灭活后的弓形虫通过蔗糖梯度离心进行纯化。

具体的纯化方法为：将收获的弓形虫灭活后静置，去除细胞及细胞团；蔗糖密度梯度离心：先添加待离心的弓形虫样品，再加入低糖，再加入高糖，低糖和高糖按体积比1:1添加，其中低糖的质量分数为15％～20％，高糖的质量分数为50％～55％，10000g～20000g离心30min～60min。

纯化后的弓形虫虫体反复冻融5-10次后，与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，免疫注射小鼠。

优选地，反复冻融7次。

本发明方法中，纯化后的弓形虫共免疫小鼠4次。免疫后检测抗体效价，若抗体效价不低于1：10000，采用纯化后的弓形虫腹腔冲击小鼠，采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合技术筛选分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施例中，免疫小鼠的方法是将冻融后的蛋白用0.01mol/L的PBS稀释至终浓度为500μg/mL，使其与弗氏完全佐剂各取1mL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只；首次免疫后的第14天、28天用500μg/mL的弓形虫和弗氏不完全佐剂各取1mL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0.2mL/只；首次免疫后35天眼框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价，如果抗体效价不低于1：10000，则进行腹腔冲击，将500μg/mL的弓形虫注射到BALB/c小鼠腹腔，0.1mL/只。

本发明通过上述方法与采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合技术筛选得到分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2014年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)，分类命名为弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9559。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9559的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗弓形虫药物中的应用。

本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9559的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备检测弓形虫试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于检测弓形虫的试剂盒，含有本发明的单克隆抗体。

含有本发明单克隆抗体的用于检测弓形虫抗体的试剂盒或检测试剂也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种非疾病诊断目的的检测弓形虫的方法，是采用保藏编号为CGMCC No.9559的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行检测的。

本发明提供的一种制备弓形虫单克隆抗体的方法，通过人胚肺成纤维细胞培养弓形虫，对收获的弓形虫通过蔗糖梯度离心进行纯化，纯化后的弓形虫经反复冻融后，按弓形虫蛋白50μg/只免疫小鼠3次，50μg/只加强免疫一次，取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选合适的杂交瘤细胞株，用筛选的杂交瘤细胞制备腹水，获得弓形虫的单克隆抗体。该方法同已有的弓形虫单克隆抗体制备方法相比具有明显的优势：一是通过细胞培养解决了弓形虫大量培养的问题；二是通过蔗糖梯度离心获得纯度在90％以上的弓形虫；三是人胚肺成纤维细胞培养的弓形虫免疫原性要高于表达的弓形虫的某一个蛋白，容易筛选到合适的杂交瘤细胞株。本发明方法筛选得到一株稳定分泌弓形虫单克隆合适的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.9559，其分泌的单克隆抗体效价高，特异性好，可用于弓形虫的检测，也可用于制备检测弓形虫的试剂盒或诊断试剂，检测结果准确率高，在弓形虫诊断领域具有较好应用前景

附图说明

图1为接种弓形虫120h的人胚肺成纤维细胞(100×)

图2为SDS-PAGE鉴定实施例5的已纯化的单抗。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例中使用的人胚肺成纤维细胞保藏编号为CGMCC No.4875。BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1 免疫原制备与动物免疫(1)

1、用人胚肺成纤维细胞培养弓形虫(见图1)，并对收获的弓形虫进行浓缩纯化。

弓形虫培养：用含8％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后，弃掉原培养基，加入含1％新生牛血清MEM，接种弓形虫，接种MOI为0.1，7天后收获弓形虫。收获的弓形虫经56℃水浴灭活30min。

弓形虫纯化：静置45min，自然沉降去除细胞及细胞团；蔗糖密度梯度离心法去除细胞碎片：蔗糖密度梯度离心：先添加700ml弓形虫样品，再加入低糖溶液500ml，再加入高糖溶液500ml，其中低糖的质量分数为20％，高糖的质量分数为55％，20000g离心30min取样镜检纯化结果。在显微镜下观察(200×)到大量的弓形虫，没有杂质，纯度达到90％以上。

2、纯化好的弓形虫虫体反复冻融7次后，将冻融后蛋白为500μg/mL的弓形虫与弗氏完全佐剂各取1mL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只。

加强免疫；首次免疫后的第14天、28天用500μg/mL的弓形虫和弗氏不完全佐剂各取1mL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0.2mL/只。首次免疫后35天睛框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价。抗体效价为1：32768，不低于1：10000。

实施例2 免疫原制备与动物免疫(2)

1、用人胚肺成纤维细胞培养弓形虫，并对收获的弓形虫进行浓缩纯化。

弓形虫培养：用含9％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后弃掉原培养基，加入含2％新生牛血清MEM，接种弓形虫，接种MOI为0.5，5天后收获弓形虫。收获的弓形虫经56℃水浴灭活30min。

弓形虫纯化：静置30min，自然沉降去除细胞及细胞团；蔗糖密度梯度离心法去除细胞碎片：蔗糖密度梯度离心：先添加700ml弓形虫样品，再加入低糖溶液500ml，再加入高糖溶液500ml，其中低糖的质量分数为15％，高糖的质量分数为50％，10000g离心60min取样镜检纯化结果。在显微镜下观察(200×)到大量的弓形虫，没有杂质，纯度达到90％以上。

2、纯化好的弓形虫虫体反复冻融10次后，将冻融后蛋白为500μg/mL的弓形虫与弗氏完全佐剂各取1mL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只。

加强免疫；首次免疫后的第14天、28天用500μg/mL的弓形虫和弗氏不完全佐剂各取1mL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0.2mL/只。首次免疫后35天睛框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价。抗体效价为1:16384，不低于1：10000。

实施例3 免疫原制备与动物免疫(3)

1、用人胚肺成纤维细胞培养弓形虫，并对收获的弓形虫进行浓缩纯化。

弓形虫培养：用含10％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后弃掉原培养基，加入含2％新生牛血清MEM，接种弓形虫，接种MOI为0.1，6天后收获弓形虫。收获的弓形虫经56℃水浴灭活30min。

弓形虫纯化：静置60min，自然沉降去除细胞及细胞团；蔗糖密度梯度离心法去除细胞碎片：蔗糖密度梯度离心：先添加700ml弓形虫样品，再加入低糖溶液500ml，再加入高糖溶液500ml，其中低糖的质量分数为18％，高糖的质量分数为53％，15000g离心45min取样镜检纯化结果。在显微镜下观察(200×)到大量的弓形虫，没有杂质，纯度达到90％以上。

2、纯化好的弓形虫虫体反复冻融5次后，将冻融后蛋白为500μg/mL的弓形虫与弗氏完全佐剂各取1mL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只。

加强免疫；首次免疫后的第14天、28天用500μg/mL的弓形虫和弗氏不完全佐剂各取1mL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0.2mL/只。首次免疫后35天睛框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价。抗体效价为1:16384，不低于1：10000。

实施例4 细胞融合与建株

实施例1-3方法得到的免疫原的抗体效价均符合制备腹水的要求。本实施例采用实施例1方法制得的弓形虫对小鼠进行腹腔冲击，500μg/mL的弓形虫注射到BALB/c小鼠腹腔，0.1mL/只。

(1)骨髓瘤细胞的准备：细胞融合前两周复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天将细胞培养液去除，重新添加培养液。

(2)脾细胞制备：处死进行动物免疫的小鼠，按照常规方法制备小鼠脾细胞悬液。

(3)根据计数结果将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0分别加入适量无血清1640培养液，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞吹打均匀。

(4)将脾细胞与SP2/0细胞按2:1～5:1(本实施例为2:1)的比例混合于一支50ml离心管中，混匀。

(5)加无血清1640培养液至50ml，1500rpm离心5min，将上清尽量倒净，可用移液器将管口液体吸净。

(6)轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置于37℃水浴，准备融合。

(7)将37℃保温的1ml PEG1500，用滴管缓慢滴入离心管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。

(8)静置90s，立即在2～4min(本实施例为3min)内缓慢加入15ml无血清的1640培养基(37℃)，尽可能不搅动细胞。

(9)1500rpm离心5min，弃去上清。

(10)加入含10％胎牛血清的1640培养液，轻轻混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，每孔100μl。

(11)将培养板放到37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(12)融合第2天，添加HAT培养液，每孔100μl。

(13)每2～3天换一次HAT培养液，连续两周观察杂交瘤是否出现，两周后换用HT培养基，观察融合细胞的生长状况。

(14)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞覆盖孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。

(15)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系，命名为Tox-G1。将杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号CGMCC NO.9559，分类命名为：弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏时间：2014年8月12日；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

实施例5 单抗细胞株腹水制备与抗体效价检测及单抗的纯化

按常规方法将冻存的实施例4获得的杂交瘤细胞进行复苏，培养到细胞覆盖瓶底的80％左右时摇下细胞，计数5×10⁶个/mL，腹腔免疫BALB/c小鼠，0.5mL/只，制备腹水。

弓形虫单抗腹水鉴定：采用间接ELISA法检测抗体的效价。弓形虫5μg/ml包被过夜后检测腹水的抗体效价，抗体效价为10⁶。具体结果见表1。

表1 腹水中抗体效价检测结果

单抗纯化：将腹水经滤纸过滤初步去除杂质，用0.45μm的微孔滤器过滤腹水，进一步去除杂质。将腹水经Protein A层析柱进一步纯化，获得高纯度的单克隆抗体。将纯化的单克隆抗体经SDS-PAGE鉴定，结果见图2。

实施例6 弓形虫多克隆抗体的制备与纯化

用实施例1中得到的弓形虫抗原制备的方法获得的弓形虫作为抗原，免疫日本大耳白兔5只，免疫量按弓形虫1mg/只，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，颈背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔14天。通过心脏采血，37℃放置1h，4℃过夜，让血清自然析出。

将待提取的血清经4℃13000rpm离心30min，收集上清。取20mL上清与等体积的PBS溶液混合，一边搅拌一边缓慢滴加40mL饱和硫酸铵于4℃过夜，使蛋白充分沉淀。4℃，13000rpm离心10min，弃上清，用12mLPBS溶解沉淀，再缓慢滴加8mL饱和硫酸铵，同时搅拌，4℃反应1h。4℃，13000rpm离心10min，弃上清，用13mLPBS溶解沉淀，滴加7mL饱和硫酸铵，4℃反应1h。4℃，13000rpm离心10min，弃上清，离心后所得沉淀用少许PBS(pH7.4)溶解。溶解液用超滤管进行超离，脱盐，浓缩，加甘油-20℃保存备用。

实施例7 双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测弓形虫

(1)0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释实例5制备的弓形虫单抗至包被浓度1μg/mL，加入酶标板100μL/孔，4℃过夜，甩干，用0.01mol/L PBST洗板3次。

(2)用10％小牛血清的PBS(0.01mol/L pH7.4)封闭，200μL/孔，37℃2h，甩干。

(3)加入弓形虫样品，3μg/mL、300ng/mL、30ng/mL、3ng/mL的待测样本各100μL/孔，并设置阴性对照，37℃孵育1h。

(4)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干；将实施例6制得的弓形虫多抗300倍稀释后加入酶标板(100μL/孔)，37℃1h。

(5)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干，加入20000倍稀释的商品化的HRP标记的羊抗兔二抗各100μL/孔，37℃1h。

(6)0.01mol/L PBST洗板5次，甩干，TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10min。

(7)加入2mol/L的硫酸50μL/孔终止反应，酶标仪630nm测吸光度。终点稀释法确定ELISA灵敏度：阴性样品为0.01mol/L PBST，检测灵敏度以样品值OD₆₃₀值为阴性值2倍的弓形虫样品浓度。

(8)该结果显示此ELISA方法的最低检测限为30ng/mL，对应的OD₆₃₀值为0.203。

实施例8 双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测弓形虫的特异性实验

(1)0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释实施例5得到的弓形虫单抗至包被浓度1μg/mL，加入酶标板100μL/孔，4℃过夜，甩干，用0.01mol/L PBST洗板3次。

(2)用10％小牛血清的PBS(0.01mol/L pH7.4)封闭，200μL/孔，37℃2h，甩干。

(3)加入待检样品，弓形虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、肉孢子虫各100μL/孔，并设置阴性对照，37℃孵育1h。

(4)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干；将实施例6制得的弓形虫多抗300倍稀释后加入酶标板(100μL/孔)，37℃1h。

(5)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干，加入20000倍稀释的商品化的HRP标记的羊抗兔二抗各100μL/孔，37℃1h。

(6)0.01mol/L PBST洗板5次，甩干，TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10min。

(7)加入2mol/L的硫酸50μL/孔终止反应，于630nm测吸光度。终点稀释法确定ELISA灵敏度：阴性样品为PBST，检测结果以样品值OD₆₃₀值为阴性值2倍判定为结果阳性。

(8)结果显示此ELISA方法特异性强，只能检测弓形虫，对柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、肉孢子虫无交叉。结果见表2。

表2 本发明单抗的特异性实验

实施例9 本发明单克隆抗体亚类测定

用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测实例5得到的单抗，按照试剂盒的说明书操作，结果显示实例5得到的单抗属于IgG1。

实施例10 杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

把冻存的杂交瘤细胞株Tox-G1复苏，传至20代，分别在第1代、第5代、第10代、第15代和第20代细胞长到80％时取细胞上清，采用间接ELISA法检测细胞上清抗体的效价。弓形虫5μg/ml包被过夜后检测细胞上清的抗体效价，结果见表3。

表3 本发明杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测结果

由表3可知，从实例4获得的杂交瘤细胞株Tox-G1传20代后分泌单克隆抗体的能力没有发生明显变化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9559。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备检测弓形虫试剂盒中的应用。

3.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

4.一种用于检测弓形虫或其抗体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的单克隆抗体。

5.含有权利要求3所述单克隆抗体的检测试剂。

6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求3所述的单克隆抗体在制备预防或治疗弓形虫药物中的应用。

7.一种非疾病诊断目的的检测弓形虫的方法，其特征在于，采用保藏编号为CGMCCNo.9559的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行检测。