CN110204615B

CN110204615B - 一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110204615B
Application number: CN201910366135.2A
Authority: CN
Inventors: 谭峰; 刘淑贤; 鲁代强; 伍蜜蜜; 毛懿杰; 胡昕
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2019-05-05
Filing date: 2019-05-05
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2039-05-05
Also published as: CN110204615A

Abstract

本发明涉及一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，所述多克隆抗体的编码序列为SEQ NO.1。本发明多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Western blot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

Description

一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

刚地弓形虫是一种世界范围内广泛分布的机会性致病原虫。目前对弓形虫病的治疗仍以药物为主，但均存在副作用强、治疗时间长、根治率低等缺陷。因此，寻找调控虫体生长发育关键的靶蛋白将为虫体致病机制研究、药物靶点研发提供理论依据。

蛋白质的泛素化是一个或多个泛素分子与靶蛋白共价连接，这一反应共有3种泛素酶参与，即泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)与泛素连接酶(E3)。其中，E1将泛素分子激活后，泛素途径得以启动，泛素再依次经E2与E3的相互作用，最终被转运至待降解靶蛋白残基上，从而形成泛素链标记的蛋白质底物，此过程即为蛋白泛素化修饰。

蛋白质泛素化是蛋白翻译后修饰的一种常见形式，在真核生物中，泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用，同时它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。

已经证实泛素化-蛋白酶体介导的蛋白质降解在弓形虫细胞分裂周期中具有重要作用，因为蛋白酶体的抑制严重破坏了复制的多个阶段，最近发布的弓形虫泛素组也揭示了许多泛素化蛋白质以周期依赖性的方式在转录水平受到调节。前期研究中，通过生物信息学分析，本申请人发现弓形虫基因组中有一个注释为泛素激活酶(ubiquitinactivating enzyme,E1或 Uba1)，本申请人曾采用同源重组方法试图敲除该基因，但并未成功，表明该蛋白是虫体生长发育过程中的关键基因。

因此，为了在后续研究中观察该蛋白的定位与功能，本发明以逆转录PCR(RT-PCR)扩增获得编码弓形虫Uba1(TgUba1)蛋白第210至750位氨基酸的编码基因片段，构建原核表达质粒，并利用表达的重组蛋白制备特异性兔抗TgUba1多克隆抗体。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种刚地弓形虫泛素激活酶1 (TgUba1)多克隆抗体及其制备方法和应用，该多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Western blot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1 蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，所述多克隆抗体的编码序列为SEQ NO.1。

如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，步骤如下：

⑴弓形虫速殖子的收集

复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为所需速殖子；

⑵目的基因片段的扩增

收集速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取RNA逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行TgUba1^210-750编码序列，即SEQ NO.2的PCR扩增；反应体系为：cDNA 1μl，10nmol/L 上、下游引物即SEQ NO.3和SEQ NO.4各0.5μl，2×Ex Taq酶混合物12.5μl，加去离子水至25μl；反应条件为：95℃1min；95℃30s，60℃30s，72℃1.5min，共35个循环； 72℃7min；扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳，观察到有明显的、大小正确的目的条带后表明扩增成功，利用切胶回收获得PCR产物；

⑶原核表达质粒的构建和鉴定

用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物，酶切完全的载体和目的片段经 1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16℃条件下连接过夜；经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于含50μg/ml卡那霉素的 LB固体培养基上，筛选阳性克隆，提取质粒；重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液测序；

⑷TgUba1^210-750蛋白诱导表达与鉴定

将测序正确的质粒pET28b-TgUba1^210-750热激法转化感受态细胞后，涂板于含50μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，自含50μg/ml卡那霉素的诱导培养基中37℃振荡培养24h；将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃、12000×g离心10min，取上清行质量百分数为10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗，1:1000，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，1:50000；待鉴定出有明显预期目标大小的目的条带后进行下一步实验；

⑸蛋白纯化和免疫

将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1^210-750蛋白，以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫；免疫3 次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测；待血清效价大于1:32000后，常规心脏取血，收集血清进行抗体纯化，即得刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，于－80℃保存。

而且，所述步骤⑴中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。

而且，所述步骤⑴中弓形虫为RH株。

而且，所述步骤⑷中感受态细胞为Rosatte(D E3)感受态细胞。

如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白中的应用。

而且，所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。

如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在研究TgUba1的蛋白功能方面中的应用。

如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在研究与TgUba1相互作用的相关蛋白的功能方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果是：

1、通过对该抗体的一系列效价及特异性检测证明，本发明多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Westernblot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

2、本发明方法利用重组TgUba1^210-750蛋白作为抗原，成功制备了兔抗TgUba1多克隆抗体。

由于TgUba1全长包括1092个氨基酸残基，其编码基因序列共有3279bp。因此在PCR扩增中存在一定难度。通过生物信息学分析发现该蛋白无信号肽，无跨膜区域，其中第39～40、 160～169与927～933位氨基酸处疏水性较强，因此，本发明方法通过表达210～750位氨基酸作为抗原进行免疫。通过常规分子生物学与免疫程序，证实所表达的蛋白可以诱导动物产生高滴度的多克隆抗体。最关键的是，本发明证实该多克隆抗体可特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白，其中IFA实验表明，即使全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，该抗体也能识别。因此，可以利用该多克隆抗体可以进行免疫共沉淀结合质谱分析，免疫电镜、IFA 以及Western blot等实验，进一步研究TgUba1的蛋白功能，探寻与TgUba1相互作用的一系列蛋白等。

附图说明

图1为本发明中TgUba1^210-750基因编码序列(即SEQ NO.1)的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析检测结果图；其中A为从弓形虫cDNA样本中扩增TgUba1^210-750基因PCR结果图； B为重组质粒pET28b-TgUba1^210-750PCR鉴定结果图；

图2为本发明中抗重组TgUba1^210-750的多克隆抗体(即本发明刚地弓形虫泛素激活酶1 (TgUba1)多克隆抗体)制备结果图；其中，A为纯化后重组TgUba1^210-750蛋白SDS-PAGE结果图；B为免疫4次后兔血清间接ELISA检测结果图；C.为两个多克隆抗体纯化后间接ELISA检测结果图；D为两个纯化后多克隆抗体Western blot检测结果图；

图3为本发明中抗TgUba1^210-750多克隆抗体(即本发明刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1) 多克隆抗体)识别弓形虫天然TgUba1蛋白的鉴定结果图；其中，A为Western blot分析结果图，B为IFA鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

⑴弓形虫速殖子的收集

⑵目的基因片段的扩增

⑶原核表达质粒的构建和鉴定

⑷TgUba1^210-750蛋白诱导表达与鉴定

⑸蛋白纯化和免疫

较优地，所述步骤⑴中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。

较优地，所述步骤⑴中弓形虫为RH株。

较优地，所述步骤⑷中感受态细胞为Rosatte(D E3)感受态细胞。

较优地，所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。

如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体能够应用在研究TgUba1的蛋白功能方面中。

如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体能够应用在研究与TgUba1 相互作用的相关蛋白的功能方面中。

更具体地，如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，步骤如下：

1材料和方法

1.1材料

1.1.1虫株、载体、菌株和实验动物刚地弓形虫RH株、原核表达载体pET28b、大肠埃希菌(E.coli)DH5α和Rosatte均为常规市售产品。日本大耳白兔购自温州医科大学实验动物中心。

1.1.2RT-PCR引物的设计与合成根据ToxoDB中TgUba1基因编码序列(登录号为TGGT1_290290)用Primer Premier 5.0软件设计引物，上、下游引物分别为：TgUba1^210-750-F: 5’-CGCTCTAGAATGCCTTTCCAGGACGGCGA-3’(即SEQ NO.3)和TgUba1^210-750-R:5’-CGCAAGCTTATGGCCTTCTGAAGTGCGGTGG-3’(即SEQ NO.4)。下划线部分分别为限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1弓形虫速殖子的收集复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现精神萎靡、闭目和毛发竖起等病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为实验所需速殖子。

1.2.2目的基因片段的扩增收集RH株速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取0.5μgRNA按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板进行TgUba1^210-750编码序列的PCR 扩增。反应体系为：cDNA 1μl，上、下游引物(10nmol/L)各0.5μl，2×Ex Taq酶混合物 12.5μl，加去离子水至25μl。反应条件为：95℃1min；95℃30s，60℃30s，72℃1.5min，共35个循环；72℃7min。扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3原核表达质粒的构建和鉴定用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR 产物。酶切完全的载体和目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16℃条件下连接过夜。经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于LB固体培养基(含卡那霉素50μg/ml)，筛选阳性克隆，提取质粒。重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4TgUba1^210-750蛋白诱导表达与鉴定将测序正确的质粒pET28b-TgUba1^210-750热激法转化Rosatte感受态细胞后，涂板于LB固体培养基(含卡那霉素50μg/ml)，挑取阳性克隆，自诱导培养基(含卡那霉素50μg/ml)37℃振荡培养24h。将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃12000×g离心10min，取上清行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗(1:1000)，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗(1:50 000)。

1.2.5蛋白纯化和免疫将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1^210-750蛋白。以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫。免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测。待血清效价大于1:32000后，常规心脏取血，收集血清按常规方法进行抗体纯化，于－80℃保存备用。

1.2.6间接ELISA检测抗体效价以重组TgUba1^210-750蛋白5μg/ml、100μl/孔，包被酶标板(37℃，2h)，洗涤后以300μl/孔的3％BSA-PBS于4℃封闭过夜；以300μl/孔的PBST 洗涤3次后，按100μl/孔加入倍比稀释的血清样品(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，37℃孵育1h；洗涤后按100μl/孔加入HRP标记的羊抗兔二抗(1:10000)，37℃孵育0.5h；洗涤后加入TMB显色液，于37℃孵育5min，最后加入50μl/孔的2M HCl 终止反应，于OD450波长下读数。

1.2.7多抗识别天然TgUba1

(1)Western blot检测：收集弓形虫RH株速殖子，超声裂解虫体后，取上清经10％SDS-PAGE电泳、15V转膜25min、5％脱脂奶粉封闭2h后，以免疫前血清作为阴性对照，以纯化后兔抗TgUba1多克隆抗体(1:2000)作为一抗孵育过夜，羊抗兔HRP-IgG(1:100000) 作为二抗孵育45min，电化学发光试剂(ECL)显色，观察结果。

(2)间接免疫荧光法(IFA)检测：收集弓形虫虫株进行IFA检测，兔抗TgUba1多克隆抗体(1:1000)作为一抗孵育过夜，荧光染料FITC标记的羊抗兔抗体IgG(1:5000)作为二抗孵育45min，DAPI染色5min，反应结束后，以50％甘油封片，荧光显微镜下观察。免疫前兔血清作为阴性对照。

2结果

2.1TgUba1^210-750编码基因的PCR扩增结果TgUba1^210-750基因编码序列的理论大小为1623bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条清晰、单一、大小约1600bp的特异性扩增条带，与预计片段大小相符(图1A)。挑取3个单克隆菌落提质粒，重组质粒经PCR 鉴定，其中1号克隆菌在约1600bp处有单一目的条带(图1B)。将1号克隆菌送公司测序，证实其测序结果与TgUba1^210-750编码序列完全一致。

2.2抗重组TgUba1^210-750的多克隆抗体制备鉴定正确的阳性菌经自诱导培养基诱导后以镍柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE分析结果显示，纯化后在理论位置可见大量条带较单一的目的蛋白，其分子量约60kDa，与预期结果吻合(图2A)。将其作为免疫原免疫动物4次后取血清进行抗体效价检测，结果表明两只兔的血清中均产生了高滴度的多克隆抗体(图2B)，将抗体纯化后再次进行间接ELISA检测，证实纯化后抗体效价可达1:64000以上(图2C)。最后，将两个抗体与免疫原进行Westernblot检测，证实两个抗体即使在1:32000也能在60kDa 处产生特异性条带(图2D)。

2.3多抗识别天然TgUba1Western blot实验结果表明，以免疫前血清作为阴性对照，制备的2株抗重组TgUba1^210-750的多克隆抗体可见一特异性条带，表明均能特异性识别弓形虫 RH株的TgUba1蛋白(见图3A)。选取1号多抗进行IFA验证，进一步证明该多克隆抗体能特异性识别天然的TgUba1蛋白。不仅如此，经DAPI染核后对比发现，TgUba1蛋白多分布于虫体胞浆内(图3B)。

相关讨论：

本发明利用重组TgUba1^210-750蛋白作为抗原，成功制备了兔抗TgUba1多克隆抗体。通过对该抗体的一系列效价及特异性检测证明，所制备的多克隆抗体效价高、特异性强。随后的 Western blot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于 TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

Uba1免疫原蛋白(210-750AAs)编码序列(SEQ NO.1)：

cctttccaggacggcgacttcgtcgtcttccgcgaagtccagggcatggagatcaacgacttgcaacccatgcagatccgtgtgacggg taagcacagcttccagatcggagacaccaccgcgttctccccgtacgtctccggaggcatcgcgcgacaggtgaagatgccccagacgatcc gcttcaagtcctacgaggcatcgtgtcgcgctcccgtggctgcgggtgaagcgatgctgatcgtcccggacctgggcaagttcggacagtcgg agcagcttcacctggccttccaagcggtcttgaatttccgcgaccggaacggcggaaacgcccatgcgcttcctccccacccgctcgacgcgg ctcgcgcaggcagccagcaggcagctgtggctgcgtgcgttgcggaggcgcagcgcctgaatggggaggcgaagcagctggcggaacga ggcgaacagggagtggttttcgtcgatcaggtcgacgagaagctcgtcgcgaacgtcgccgcctacgcccagtgccagatctcgccgatggc tgcgttcgtcggcggcgtgcttgctcaagaagtcgtcaagttcactggaaaattctcgccgctgcgcggcttcctctacatggacgccttcgagg cgctcctctctccggaggcaaaggccgcattgggagagacaggaaaacaccgagaaaagtacagcatcgacagtcgctacgcagatcaagtt gcactcttcggatccgagttccaacatgctctcggacgcacgcatgcctttgttgtcggtgccggcgcgctcggctgtgagctcctcaaaagtctc gctctcatgggctgcgggtgcggacctgaaaaagaaggaaaagtcactgtcacagacatggatcgaatcgaagtctccaacctcaatcgacag ttcctctttcgcagagaacatgtcgggaaggccaagagcgtcactgccgccgcttctgtgcaaaccatgaatcctgaccttcagatcgtggctctc gaagaccgcgtcggagtcgagacagaggcaaccgtcttcactgacgacttctggcgaagccagcacatcatcgtcaatgctctggacaacatt caggcgcgacaatatgtcgatggtcgctgcgtctggttcggcttgcctctgctcgaaagtggaactcttggaaccaagggaaatgttcaggtggt gctacccttcatgacgcaatgttactccgacagcgcagatcctcccgaggagtcgattcctctctgcacgcttcgccatttcccgcatgcaattga gcataccatcgagtgggctcgagattgcttccagggtgtcttttgcgacgccgtcagcgagccgaacaagtttcgagaaaacccacaaaagtac ctcgaacgcctccgaggagaaggcattctctcagtgcagaaggaccgactggagaagattcgggacctggtctctcagtggcaggacaaaga gacgaaggcgttttctccgccctcgttcgaacgctgcgtagagaaggccgtttttctctttcaagatttattcttcaatcaaatctctcaacttctctact ccttcccgctggaccaccgcacttcagaaggc

SEQ NO.2：Uba1氨基酸序列，其中红色标记处为所表达蛋白的氨基酸序列(210-750)

MATPQESSGAAAHIDTDLYSRQIGAFGLETMGKLITLRVLISGMRGVGAECAKNLILAG PNTVVLHDPAPCEMRDLGSNFCLTEEHVKKGVSRAEASKNYLAELNQYVTVDVLPDEKLT QEVVSRFDVVIVTEAGNEELKKINAFCRSASKPVGFIAANVFGLAASVFVDLGERFVCLDS DGEEPREVIVAGITHERAATVHTHTDKLLPFQDGDFVVFREVQGMEINDLQPMQIRVTGKH SFQIGDTTAFSPYVSGGIARQVKMPQTIRFKSYEASCRAPVAAGEAMLIVPDLGKFGQSEQL HLAFQAVLNFRDRNGGNAHALPPHPLDAARAGSQQAAVAACVAEAQRLNGEAKQLAERG EQGVVFVDQVDEKLVANVAAYAQCQISPMAAFVGGVLAQEVVKFTGKFSPLRGFLYMDAF EALLSPEAKAALGETGKHREKYSIDSRYADQVALFGSEFQHALGRTHAFVVGAGALGCELL KSLALMGCGCGPEKEGKVTVTDMDRIEVSNLNRQFLFRREHVGKAKSVTAAASVQTMNP DLQIVALEDRVGVETEATVFTDDFWRSQHIIVNALDNIQARQYVDGRCVWFGLPLLESGTL GTKGNVQVVLPFMTQCYSDSADPPEESIPLCTLRHFPHAIEHTIEWARDCFQGVFCDAVSEPNKFRENPQKYLERLRGEGILSVQKDRLEKIRDLVSQWQDKETKAFSPPSFERCVEKAVFLFQ DLFFNQISQLLYSFPLDHRTSEGTLFWAPPKRPPTPISFDANDPASLDFVVAASNLFAFNFGLP AVRDVSKIQAIAARVAIPQFTPKRLHINTDDAEKPNGSGPPGASFAAPHPSLSLSAEAEEEVV AGLEKHLLATADLEKMVFVPVEFEKDDDTNFHIDLVHAASTLRAMNYKIPCCDRNKTKIIA GRIIPAIATTTAMITGLVSLELLKTVTYKQRKLEDFKNAFANLALPLWLFSEPMPPNRVVDKD FDPVACGPIRAMPKGFSCWDKIQVDIPGCTVQQLCEFLEEKFDVEVNILSVGNFCLYNSFLPVHKQQRFKRSIVELIEEVTKTSGQKSVAVESSCSAKSDGVDVLLPTICVLNK

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1623

<212> DNA/RNA

<213> 多克隆抗体的编码序列(Unknown)

<400> 1

cctttccagg acggcgactt cgtcgtcttc cgcgaagtcc agggcatgga gatcaacgac 60

ttgcaaccca tgcagatccg tgtgacgggt aagcacagct tccagatcgg agacaccacc 120

gcgttctccc cgtacgtctc cggaggcatc gcgcgacagg tgaagatgcc ccagacgatc 180

cgcttcaagt cctacgaggc atcgtgtcgc gctcccgtgg ctgcgggtga agcgatgctg 240

atcgtcccgg acctgggcaa gttcggacag tcggagcagc ttcacctggc cttccaagcg 300

gtcttgaatt tccgcgaccg gaacggcgga aacgcccatg cgcttcctcc ccacccgctc 360

gacgcggctc gcgcaggcag ccagcaggca gctgtggctg cgtgcgttgc ggaggcgcag 420

cgcctgaatg gggaggcgaa gcagctggcg gaacgaggcg aacagggagt ggttttcgtc 480

gatcaggtcg acgagaagct cgtcgcgaac gtcgccgcct acgcccagtg ccagatctcg 540

ccgatggctg cgttcgtcgg cggcgtgctt gctcaagaag tcgtcaagtt cactggaaaa 600

ttctcgccgc tgcgcggctt cctctacatg gacgccttcg aggcgctcct ctctccggag 660

gcaaaggccg cattgggaga gacaggaaaa caccgagaaa agtacagcat cgacagtcgc 720

tacgcagatc aagttgcact cttcggatcc gagttccaac atgctctcgg acgcacgcat 780

gcctttgttg tcggtgccgg cgcgctcggc tgtgagctcc tcaaaagtct cgctctcatg 840

ggctgcgggt gcggacctga aaaagaagga aaagtcactg tcacagacat ggatcgaatc 900

gaagtctcca acctcaatcg acagttcctc tttcgcagag aacatgtcgg gaaggccaag 960

agcgtcactg ccgccgcttc tgtgcaaacc atgaatcctg accttcagat cgtggctctc 1020

gaagaccgcg tcggagtcga gacagaggca accgtcttca ctgacgactt ctggcgaagc 1080

cagcacatca tcgtcaatgc tctggacaac attcaggcgc gacaatatgt cgatggtcgc 1140

tgcgtctggt tcggcttgcc tctgctcgaa agtggaactc ttggaaccaa gggaaatgtt 1200

caggtggtgc tacccttcat gacgcaatgt tactccgaca gcgcagatcc tcccgaggag 1260

tcgattcctc tctgcacgct tcgccatttc ccgcatgcaa ttgagcatac catcgagtgg 1320

gctcgagatt gcttccaggg tgtcttttgc gacgccgtca gcgagccgaa caagtttcga 1380

gaaaacccac aaaagtacct cgaacgcctc cgaggagaag gcattctctc agtgcagaag 1440

gaccgactgg agaagattcg ggacctggtc tctcagtggc aggacaaaga gacgaaggcg 1500

ttttctccgc cctcgttcga acgctgcgta gagaaggccg tttttctctt tcaagattta 1560

ttcttcaatc aaatctctca acttctctac tccttcccgc tggaccaccg cacttcagaa 1620

ggc 1623

<210> 2

<211> 1092

<212> PRT

<213> Uba1氨基酸序列(Unknown)

<400> 2

Met Ala Thr Pro Gln Glu Ser Ser Gly Ala Ala Ala His Ile Asp Thr

1 5 10 15

Asp Leu Tyr Ser Arg Gln Ile Gly Ala Phe Gly Leu Glu Thr Met Gly

20 25 30

Lys Leu Ile Thr Leu Arg Val Leu Ile Ser Gly Met Arg Gly Val Gly

35 40 45

Ala Glu Cys Ala Lys Asn Leu Ile Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val Val

50 55 60

Leu His Asp Pro Ala Pro Cys Glu Met Arg Asp Leu Gly Ser Asn Phe

65 70 75 80

Cys Leu Thr Glu Glu His Val Lys Lys Gly Val Ser Arg Ala Glu Ala

85 90 95

Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Asn Gln Tyr Val Thr Val Asp Val

100 105 110

Leu Pro Asp Glu Lys Leu Thr Gln Glu Val Val Ser Arg Phe Asp Val

115 120 125

Val Ile Val Thr Glu Ala Gly Asn Glu Glu Leu Lys Lys Ile Asn Ala

130 135 140

Phe Cys Arg Ser Ala Ser Lys Pro Val Gly Phe Ile Ala Ala Asn Val

145 150 155 160

Phe Gly Leu Ala Ala Ser Val Phe Val Asp Leu Gly Glu Arg Phe Val

165 170 175

Cys Leu Asp Ser Asp Gly Glu Glu Pro Arg Glu Val Ile Val Ala Gly

180 185 190

Ile Thr His Glu Arg Ala Ala Thr Val His Thr His Thr Asp Lys Leu

195 200 205

Leu Pro Phe Gln Asp Gly Asp Phe Val Val Phe Arg Glu Val Gln Gly

210 215 220

Met Glu Ile Asn Asp Leu Gln Pro Met Gln Ile Arg Val Thr Gly Lys

225 230 235 240

His Ser Phe Gln Ile Gly Asp Thr Thr Ala Phe Ser Pro Tyr Val Ser

245 250 255

Gly Gly Ile Ala Arg Gln Val Lys Met Pro Gln Thr Ile Arg Phe Lys

260 265 270

Ser Tyr Glu Ala Ser Cys Arg Ala Pro Val Ala Ala Gly Glu Ala Met

275 280 285

Leu Ile Val Pro Asp Leu Gly Lys Phe Gly Gln Ser Glu Gln Leu His

290 295 300

Leu Ala Phe Gln Ala Val Leu Asn Phe Arg Asp Arg Asn Gly Gly Asn

305 310 315 320

Ala His Ala Leu Pro Pro His Pro Leu Asp Ala Ala Arg Ala Gly Ser

325 330 335

Gln Gln Ala Ala Val Ala Ala Cys Val Ala Glu Ala Gln Arg Leu Asn

340 345 350

Gly Glu Ala Lys Gln Leu Ala Glu Arg Gly Glu Gln Gly Val Val Phe

355 360 365

Val Asp Gln Val Asp Glu Lys Leu Val Ala Asn Val Ala Ala Tyr Ala

370 375 380

Gln Cys Gln Ile Ser Pro Met Ala Ala Phe Val Gly Gly Val Leu Ala

385 390 395 400

Gln Glu Val Val Lys Phe Thr Gly Lys Phe Ser Pro Leu Arg Gly Phe

405 410 415

Leu Tyr Met Asp Ala Phe Glu Ala Leu Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ala

420 425 430

Ala Leu Gly Glu Thr Gly Lys His Arg Glu Lys Tyr Ser Ile Asp Ser

435 440 445

Arg Tyr Ala Asp Gln Val Ala Leu Phe Gly Ser Glu Phe Gln His Ala

450 455 460

Leu Gly Arg Thr His Ala Phe Val Val Gly Ala Gly Ala Leu Gly Cys

465 470 475 480

Glu Leu Leu Lys Ser Leu Ala Leu Met Gly Cys Gly Cys Gly Pro Glu

485 490 495

Lys Glu Gly Lys Val Thr Val Thr Asp Met Asp Arg Ile Glu Val Ser

500 505 510

Asn Leu Asn Arg Gln Phe Leu Phe Arg Arg Glu His Val Gly Lys Ala

515 520 525

Lys Ser Val Thr Ala Ala Ala Ser Val Gln Thr Met Asn Pro Asp Leu

530 535 540

Gln Ile Val Ala Leu Glu Asp Arg Val Gly Val Glu Thr Glu Ala Thr

545 550 555 560

Val Phe Thr Asp Asp Phe Trp Arg Ser Gln His Ile Ile Val Asn Ala

565 570 575

Leu Asp Asn Ile Gln Ala Arg Gln Tyr Val Asp Gly Arg Cys Val Trp

580 585 590

Phe Gly Leu Pro Leu Leu Glu Ser Gly Thr Leu Gly Thr Lys Gly Asn

595 600 605

Val Gln Val Val Leu Pro Phe Met Thr Gln Cys Tyr Ser Asp Ser Ala

610 615 620

Asp Pro Pro Glu Glu Ser Ile Pro Leu Cys Thr Leu Arg His Phe Pro

625 630 635 640

His Ala Ile Glu His Thr Ile Glu Trp Ala Arg Asp Cys Phe Gln Gly

645 650 655

Val Phe Cys Asp Ala Val Ser Glu Pro Asn Lys Phe Arg Glu Asn Pro

660 665 670

Gln Lys Tyr Leu Glu Arg Leu Arg Gly Glu Gly Ile Leu Ser Val Gln

675 680 685

Lys Asp Arg Leu Glu Lys Ile Arg Asp Leu Val Ser Gln Trp Gln Asp

690 695 700

Lys Glu Thr Lys Ala Phe Ser Pro Pro Ser Phe Glu Arg Cys Val Glu

705 710 715 720

Lys Ala Val Phe Leu Phe Gln Asp Leu Phe Phe Asn Gln Ile Ser Gln

725 730 735

Leu Leu Tyr Ser Phe Pro Leu Asp His Arg Thr Ser Glu Gly Thr Leu

740 745 750

Phe Trp Ala Pro Pro Lys Arg Pro Pro Thr Pro Ile Ser Phe Asp Ala

755 760 765

Asn Asp Pro Ala Ser Leu Asp Phe Val Val Ala Ala Ser Asn Leu Phe

770 775 780

Ala Phe Asn Phe Gly Leu Pro Ala Val Arg Asp Val Ser Lys Ile Gln

785 790 795 800

Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala Ile Pro Gln Phe Thr Pro Lys Arg Leu

805 810 815

His Ile Asn Thr Asp Asp Ala Glu Lys Pro Asn Gly Ser Gly Pro Pro

820 825 830

Gly Ala Ser Phe Ala Ala Pro His Pro Ser Leu Ser Leu Ser Ala Glu

835 840 845

Ala Glu Glu Glu Val Val Ala Gly Leu Glu Lys His Leu Leu Ala Thr

850 855 860

Ala Asp Leu Glu Lys Met Val Phe Val Pro Val Glu Phe Glu Lys Asp

865 870 875 880

Asp Asp Thr Asn Phe His Ile Asp Leu Val His Ala Ala Ser Thr Leu

885 890 895

Arg Ala Met Asn Tyr Lys Ile Pro Cys Cys Asp Arg Asn Lys Thr Lys

900 905 910

Ile Ile Ala Gly Arg Ile Ile Pro Ala Ile Ala Thr Thr Thr Ala Met

915 920 925

Ile Thr Gly Leu Val Ser Leu Glu Leu Leu Lys Thr Val Thr Tyr Lys

930 935 940

Gln Arg Lys Leu Glu Asp Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Ala Leu

945 950 955 960

Pro Leu Trp Leu Phe Ser Glu Pro Met Pro Pro Asn Arg Val Val Asp

965 970 975

Lys Asp Phe Asp Pro Val Ala Cys Gly Pro Ile Arg Ala Met Pro Lys

980 985 990

Gly Phe Ser Cys Trp Asp Lys Ile Gln Val Asp Ile Pro Gly Cys Thr

995 1000 1005

Val Gln Gln Leu Cys Glu Phe Leu Glu Glu Lys Phe Asp Val Glu Val

1010 1015 1020

Asn Ile Leu Ser Val Gly Asn Phe Cys Leu Tyr Asn Ser Phe Leu Pro

1025 1030 1035 1040

Val His Lys Gln Gln Arg Phe Lys Arg Ser Ile Val Glu Leu Ile Glu

1045 1050 1055

Glu Val Thr Lys Thr Ser Gly Gln Lys Ser Val Ala Val Glu Ser Ser

1060 1065 1070

Cys Ser Ala Lys Ser Asp Gly Val Asp Val Leu Leu Pro Thr Ile Cys

1075 1080 1085

Val Leu Asn Lys

1090

<210> 3

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 上游引物TgUba1210-750-F(Unknown)

<400> 3

cgctctagaa tgcctttcca ggacggcga 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA/RNA

<213> 下游引物(Unknown)

<400> 4

cgcaagctta tggccttctg aagtgcggtg g 31

Claims

1.一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：

弓形虫速殖子的收集

复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0 μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为所需速殖子；

目的基因片段的扩增

收集速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取RNA逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行TgUba1^210-750编码序列，即SEQ NO.2的PCR扩增；反应体系为：cDNA 1 μl，10 nmol/L上、下游引物即SEQ NO.3和SEQ NO.4各0.5 μl，2 × Ex Taq酶混合物12.5 μl，加去离子水至25 μl；反应条件为：95 ℃ 1 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共35个循环；72℃7 min；扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，观察到有明显的、大小正确的目的条带后表明扩增成功，利用切胶回收获得PCR产物；

原核表达质粒的构建和鉴定

用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物，酶切完全的载体和目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16 ℃条件下连接过夜；经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于含50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，筛选阳性克隆，提取质粒；重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液测序；

TgUba1^210-750蛋白诱导表达与鉴定

将测序正确的质粒pET28b-TgUba1^210-750热激法转化感受态细胞后，涂板于含50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，自含50 μg/ml卡那霉素的诱导培养基中37 ℃振荡培养24 h；将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃、12000×g离心10min，取上清行质量百分数为10 %的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗，1:1 000，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，1:50 000；待鉴定出有明显预期目标大小的目的条带后进行下一步实验；

蛋白纯化和免疫

将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1^210-750蛋白，以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1 mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5 mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫；免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测；待血清效价大于1 : 32 000后，常规心脏取血，收集血清进行抗体纯化，即得刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体，于－80℃保存。

2.根据权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤

中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。

3.根据权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤

中弓形虫为RH株。

4.根据权利要求1至3任一项所述的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤

中感受态细胞为Rosatte(DE3) 感受态细胞。

5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体在制备特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白制剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。