RS50416B - Prečišćeni lh - Google Patents

Abstract

Preces za prečišćavanje LH iz uzorka, naznačen time što se koristi jonoizmenjivačka hromatografíja sa anjonsko izmenjivačkom smolom i HPLC obrnutih faza. Prijava sadrži 3 nezavisna i 13 zavisnih patentnih zahteva.

Description

STANJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na proces prečišćavanja luteinizirajućeg hormona (LH), pre svega prečišćavanja rekombinantog LH (r-LH) iz uzorka sirovog rekombinantog LH, gde se kombinuju upotreba hromatograifje jonske izmene i HPLC reverzne faze. Luteinizirajući hormon (LH) jeste gonadotropin koji se sekretuje u prednjem režnju hipofize zajedno sa drugim gonadotropinom, hormonom za stimulaciju folikula (FSH). Ovi hormoni su heterodimeri i sastoje se od kovalentno vezanih a i p podjedinica.

Ovi gonadotropini stimulišu normalno funkcionisanje gonada i sekreciju polnih hormona i kod muškaraca, i kod žena. Kod žena, hormonom za stimulaciju folikula stimuliše se razvoj i sazrevanje folikula i ovuma. Kako se folikul razvija, on proizvodi estrogen u sve većim količinama što sredinom ciklusa dovodi do stimulacije oslobađanja LH. Ovo dovodi do prskanja folikula sa ovulacijom i konvertuje folikul u žuto telo koje sekretuje progesteron. Kod muškaraca, luteinizirajući hormon stimuliše intersticijalne ćelije testisa da luče testosteron, koji za uzvrat ima direktno dejstvo na seminiferozne tubule. Gonadotrofične supstance sa luteinizirajućom ili folikulo-stimulirajućom aktivnošću ili sa obe aktivnosti, koriste se za lečenje poremećaja plodnosti, pre svega kod žena, ali i kod muškaraca. Ovakve supstance uključuju horionski gonadotropin koji poseduje LH aktivnost i humane menopauzalne gonadotropine koji poseduju i LH i FSH aktivnost. Rekombinantni humani luteinizirajući hormon izveden iz DNK (rechLH) je ispitivan kao alternativa horionskom gonadotropinu ili za davanje u kombinaciji sa FSH.

Različite metode su korišćene za izolovanje i prečišćavanje LH, kao što su jonska

izmena, gel-filtracija i imunoafinitetska hromatografija (Jack, G.W., Blazek R., James K, Boyd J.E. & Micklem L.R.: Automatska produkcija humanih hipofiznih glikoproteinskih hormona tirotropina, folitropina i leutropina imunoafinitetskom hromatografijom. Journal of Chemical Technologv and Biotechnology 39, 45-58,1987).

Hroraatografija jonskom izmenom je korišćena za izolaciju ovih hormona, međutim, ova metoda izgleda ima nekoliko vezanih problema koje izaziva značajna heterogenost prisustva LH u hipofiznom tkivu. Prvo, budući da se ovi glikoproteini i FSH preklapaju, teško je i naporno potpuno ih odvojiti (Stockell Hartee, A. Thomas M., Furnival B.E., Burns T.W: & Langlev P.: Tiroidostimulirajuće i lipolitičke aktivnosti prečišćenih preparata humanog tiroidostimulirajućeg hormona, Journal of Endocrinologv 53,95-100, 1972). Kao rezultat, određeni naelektrisani oblici hormona mogu da se odaberu tokom prečišćavanja kako se preporučuje u slučaju LH (Storring P.L., Zaidi A.A., Mistrv Y.G., Lindberg M, Stenning B.E. & Diczfelusv E.A.: Poređenje preparata visoko prečišćenog humanog luteinizirajućeg hormona: razlike u potencijama luteinizirajućeg hormona kako se određujein vivobioesejima,in vitrobioesejima i imunoesejima. ActaEndocrinologica 101, 339-347,1982). Selektivna purifikacija će dalje komplikovati karakterizaciju ovih heterogenih formi, uključujući i strukturnu analizu njihovih ugljenohidratnih komponenti. Varijacije u sadržaju anjonskih oligosaharida koji sadrže sijalil i sulfatne grupe mogu biti glavni uzroci heteorgenog naelektrisanja LH.

Metode konvencionalnog frakcionisanja su opisane za pripremu humanog urinarnog luteinizirajućeg hormona (LH) jačine 982 i.j./mg po biološkom eseju i 1166 ij. radioimunoeseju (Donini S. 8c Donini P. Acta Endocr. Copenh. 63, Suppl. 142,257-277, 1969). Imunoapsorbent zečjeg antiseruma za prečišćeni humani horionski gonadotropin (hCH) korišćen je za prečišćavanje LH iz glavne i bočnih frakcija dobijenih tokom pripreme folikulostimulirajućeg hormona (FSH) iz urina menopauzalnih žena (van Hell, H., Schuurs A.H.W.M. & den Hollander F.C. Na Simpozijumu o gonadotropinima, Njujork, 17. juna 1971, Urednici B.B. Saxena, CG. Beling & HM. Gandy, Njujork: John Wiley & Son, Inc. 1972). Dobijeni preparati bili su jači, ali su imali i veći odnos FSH:LH od onih koje su pripremali Donini S. & Donini P. (1969).

Rekombinantni LH ima tu prednost daje lišen drugih gonadotropinskih hormona, kao što su FSH i TSH. Međutim, sirovi preparati rekombianntog LH sadrže sve druge proteine i zagađivače ćelija koje se koriste u rekombinantoj produkciji i metode za postizanje apsolutne čistoće rekombinantog luteinizirajućeg hormona su veoma preporučljive.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Mi smo sada utvrdili da sirovi preparat LH, dobijen iz uzorka medijuma kulture dobijenog po procesu rekombinacije ili iz sirovog koncentrata urina postmenopauzalnih žena može da se prečisti u tolikoj meri da dobijeni LH bude praktično bez proteina i/ili drugih zagađivača sadržanih u sirovom preparatu LH. Zavisno od početnog materijala, proteini i drugi zagađivači su humanog porekla (početni materijal: humani post-menopauzalni gonadotropini) ili porekla ćelije domaćina, na pr. CHO u slučaju daje CHO ćelija domaćin.

Proces prečišćavanja se zasniva na korišćenju hromatografije jonske izmene i HPLC reverzne faze. Opciona dodatna upotreba gel permeacijske kolone omogućuje uklanjanje svih rezidualnih tragova zagađivača čistog preparata LH. Optimalni rezultati se postižu kada se obavljaju hromatograifja jonske izmene i dvostepena HPLC reverzne faze. Proces ovog pronalaska može da se koristi za prečišćavanje rekombinantog LH, počinjući od uzorka medijuma kulture dobijenog po procesu rekombinacije, kao što je taj daje rezultujući visoko prečišćeni LH praktično potpuno bez sadržaja, na primer, FBS proteina koji se obično nalaze u medijumu kulture, nukleinskih kiselina ili drugih kontaminantih materija koje se nalaze u ćeliji domaćina koje se koriste za proces rekombinacije.

Proces ovog pronalaska može da se koristi i za prečišćavanje urinarnog LH počinjući od sirovog koncentrata urina post-menopauzalnih žena, i za prečišćavanje LH drugih vrsta, pre svega sisara, uključujući na primeri i goveda, konje, svinje, ovce, pacova, miša i majmuna.

Prema tome, predmet ovog pronalaska jeste da se obezbedi proces prečišćavanja LH iz uzorka koji obuhvata kombinovanu upotrebu hromatografije jonske razmene i HPLC reverzne faze. Ovaj proces obuhvata korake podvrgavanja uzorka (ako je neophodno koncentrovanog) hromatografiji jonske razmene i potom podvrgavanje eluata HPLC reverzne faze. Dodatni korak nanošenja eluata na gel permeacijsku kolonu može da se obavi dodatno.

Zavisno od čestoće polaznog preparata, hromatografija jonske razmene i HPLC reverzne faze se po mogućstvu obavlja dva puta da bi se dobili optimalni rezultati iz procesa prečišćavanja. Ovakav proces može da obuhvati sledeće korake: (a) eluciju uzorka HPLC kroz hromatografsku kolonu za jonsku izmenu DEAE Sepharose; (b) eluciju kroz hromatografsku kolonu za jonsku izmenu Q-Sepharose;

(c) eluciju kroz kolonu HPLC reverzne faze Sepharose Cl 8

(d) ponovo elucija kroz kolonu HPLC reverzne faze Sepharose Cl 8 (opciono

drugačijim eluentom nego u koraku (C), i

(e) eluciju kroz gel-permeacijsku kolonu.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, elucija kroz hromatografsku kolonu za jonsku izmenu DEAE Sepharose obavlja se u natrijum fosfatnom puferu na pH 8.

Elucija kroz hromatografsku kolonu za jonsku izmenu Q-Sepharose po mogućstvu se obavlja u amonijum acetatnom puferu na pH 7,5.

Korak reverzne faze HPLC (c) po mogućstvu se obavlja 2-propanol/amonijum acetatom kao mobilnom fazom.

Korak reverzne faze HPLC (d) po mogućstvu se obavlja 2-propanol/Tris-HCl kao mobilnom fazom.

LH ovog pronalaska je po mogućstvu humani LH i ako je moguće rekombinanti humani LH dobijen iz medijuma kulture ćelija sisara (po mogućstvu CHO ćelija) koje se koriste za proces rekombinacije.

Dalje, cilj je ovog pronalaska da obezbedi farmaceutski sastav koji će biti terapijski efektivna količina rekombinantnog LH pripremljenog procesom rekombinacije kako je gore opisano, zajedno s odgovarajućim ekscipijentom, kao što se saharoza, neophodna za stabilizaciju liofilizovanih proizvoda. Farmaceutski sastav rekombinantnog LH je posebno pogodan za supkutanu primenu.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za prečišćavanje LH, pre svega za prečišćavanje rekombinantnog LH iz sirovog preparata medijuma kulture procesom rekombinacije. r-hLH se dobija visokim stepenom čistoće i visoke specifične aktivnosti, praktično potpuno bez sadržaja proteina fetalnog goveđeg seruma (FBS) ako su prisutni u medijumu kulture i nukleinskih kiselina ili drugih zagađivača sadržanih u ćeliji domaćinu koja se koristi u rekombinantnom procesu.

Ovaj pronalazak je namenjen korišćenju s biološkim materijalima, pre svega sirovim mešavinama sa sadržajem LH i drugim zagađujućim belančevinama koje su ovde nazvane uzorcima početnog materijala. Dole detaljno opisani primeni koriste kao početni materijal r-hLH dobijen iz medijuma supematanta ćelijske kulture iz bioreaktora. Alternativno, uzorak je humani menopauzalni gonadotropin (hMG), sirovi koncentrat urina post-menopauzalnih žena.

Ovaj uzorak se sastoji od sveže prikupljenenog medijuma supematanta ćelijske kulture perfundovan kroz bioreaktor. Ovo se, po mogućstvu, klarifikuje filtracijom. Sirovi rastvor se onda može koncentrovati, ako je neophodno, i podvrgava ultrafiltraciji da se ukloni materijal koji ima molekulsku težinu ispod 10. Ultrafiltracija omogućuje i da se pufer promeni na natrijum fosfat, pH 8.

Po preliminarnim koracima, uzorak se onda podvrgava hromatografiji jonske izmene i HPLC reverzne faze, gde se svaka od ovih procedura obavlja dva puta. Prvi korak jonske izmene obavlja se, po mogućstvu, sa DEAE Sepharose. Ovo je u suštini jedan korak «protoka» LH u kojima se eliminiše veliki deo ne-LH proteina. Drugi korak jonske izmene se po mogućstvu sprovodi s kolonom Q-Sepharose. I ovo je jedan korak «protoka» LH i osmišljen je da se ukloni potencijalni DNK i ćelije domaćina ili zagađivači proteina medijuma. U preporučenom obliku ovaj korak se obavlja na oko 5°C elucijom amonijum acetatnim puferom na pH 7,5.

HPLC reverzne faze na Silica Cl8 takođe se, po preporuci obavlja dva puta i efikasno uklanja tragove FBS, ćelijskih proteina i endotoksinskih zagađivača. Prvi HPLC korak se po mogućstvu obavlja 2-propanol/amonijum acetatom kao mobilnom fazom. Drugi korak HPLC reverzne faze se, po mogućstvu obavlja korišćenjem 2-propanol/Tris-HCl kao mobilnom fazom. Dobijeni rastvor se onda koncentriše i može da se dobije s amonijum hidrogen karbonatom, pH 8. Ovaj koncentrovani proizvod se onda, po mogućstvu, gel permeacijskoj hromatografiji na Sephacrvl S100HR. U ovom koraku, separacija zasnovana na veličini molekula se postiže elucijom s amonijum hidrogen karbonatom pH 8, a eluat se onda podvrgava filtraciji da se uklone virusni kontaminanti, onda ultrafiltraciji na membranama s 10 kD granicom u natrijum fosfatnom puferu, pH 8. Po filtraciji, prečišćeni LH u masi po mogućstvu se čuva u sterilnim bočicama na niskoj temperaturi.

PRJMER 1

Reagensi

Sirćetna kiselina (glacijalna), analitička čistoća (Ph. Eur.)

Amonijum acetat, analitička čistoća

Amonijum vodonik karbonat analitička čistoća (B.P.)

Di-bazni natrijum fosfat, analitička čistoća

Hlorovodonična kiselina, analitička čistoća

Fosforna kiselina, analitička čistoća (Ph. Eur.)

2-propanol, analitička čistoća (Ph. Eur.)

Natrijum hlorid, analitička čistoća (Ph. Eur.)

Monobazni natrijum fosfat, analitička čistoća

Pelete natrijum hidroksida, analitička čistoća (Ph. Eur.) Trifluorosirćetna kiselina (TFA), HPLC čistoća

Tris-(hidroksimetil) aminometan, analitička čistoća

Voda za injekcije

Rezime procesa prečišćavanja, dijagram protoka

Na Tabeli 1 je prikazan dijagram na kome se rezimira proces prečišćavanja r-hLH iznoseći principe rada u svakom od međukoraka.

Klarifikacija, koncentracija, dijaliza i filtracija ubranog materijala (Prvi korak)

U ovom koraku (Prvi korak) pufer se menja i dobija kontrolisani sastav i postiže se preliminarna koncentracija. Ovaj korak se obavlja na oko +5°C i ponavlja individualno za svako ubiranje tokom proizvodnog ciklusa bioreaktora. Preporučeni raspon temperature je 5 ±3 °C.

(i) Klarifikacija ubranog materijala

Po prijemu sveže prikupljenog medijuma kulture iz bioreaktora ovaj materijal se po mogućstvu procesira gde se počinje klarifikacijom rastvora supematanta filtracijom.

(ii) Koncentrovanje/dijaliza ubranog materijala

Membrane, koje se čuvaju u 0,05 M natrijum hidroksidu između serija, ispiraju se vodom za injekcije dok pH ne spadne na oko 8.

Pufer za postizanje ravnoteže, 0,025 M natrijum fosfat pH 8 zamenjuje vodu: Kada se jednom kondicionira, sirovi rastvor r-hLH iz bioreaktora se koncentriše i dijalizira da se ukloni materijal koji ima molekulsku težinu ispod 10 kD (membranska granica 10 kD).

Koncentrat za ispiranje se čuva na oko -15°C.

Hromatografija jonske izmene na DEAE Sepharose CL-6B (Drugi korak) Hromatografski korak je jedan korak protoka r-hLH gde se eliminiše veliki deo ne- r-hLH proteina a rastvor se dalje koncentriše i dijalizira. Stadijumi hromatografije gde proizvod prolazi kroz kolonu se obavlja u hladnoj prostoriji. (i) Hromatografija jonske izmene na DEAE Sepharose CL-6B Kolona je ispunjena blago naelektrisanom smolom za jonsku izmenu, dietil amino etan (DEAE) Sepharose, uravnotežena prvi put sa 0,15 M natrijum fosfata pH 8. Preporučeni raspon pH je 8 ±0,3.

Ova kolona se onda kondicionira tekućim puferom, 0,025M natrijum fosfatom, pH 8. Preporučeni raspon je 8 ±0,3.

Rastvor r-hLH se puni u kolonu kroz filter aparat, koji se nalazi na koloni kao zaštita.

Kolona se puni 0,025 M natrijum fosfatom, pH 8. Preporučeni raspon pH je 8 ±0,3. Hromatografski proces se prati spektrofotometrijski na 280 nm.

Vodeći efluent se odbacuje dok bazalna linija prolazi na oznaci apsorbance od 5%. Nevezana frakcija sa sadržajem r-hLH se prikuplja dok se bazalna linija ne spusti do 10%.

(ii) Ultrafiltracija

Aparat za ultrafiltraciju, opremljen membranom za odvajanje na 10 kD, čuvanom u NaOH 0,05M se ispire vodom za injekcije dok pH permeata ne bude oko 8.

Voda se zamenjuje puferom za ekvilibrisanje 0,08 M amonijum acetata pH 7,5 Preporučeni raspon pH je 7,5 ±0,3.

Rastvor r-hLH koji se dobije hromatograifjom jonske izmene se ultrafiltrira kroz membranu od 100 kD, pa se prikuplja frakcija permeata.

Ultrafilter se ispire alikvotima 0,08 M amonijum acetata pH 7,5, a sve frakcije ispiraka se prikupljaju u rastvor permeata.

(iii) Koncentracija/dijaliza

Aparat za ultrafiltraciju opremljen membranom za odvajanje na 10 kD čuvanom u NaOH 0,05M se ispire vodom za injekcije dok pH permeata ne bude oko 8.

Voda se zamenjuje puferom za ekvilibrisanje 0,08 M amonijum acetata pH 7,5 Rastvor r-hLH se koncentriše. Amonijum acetat 0,08M pH 7,5 se dodaje u zadržani rastvor koji se onda koncentruje. Dijaliza se nastavlja sve dok pH i provodljivost zadržanog rastvora ne budu isti kao oni dolazećeg pufera. Uzima se rezultujući zadržani rastvor.

Hromatografija jonske izmmene na Q Sepharose Fast Flow (Treći korak)

Ovaj korak je takođe i r-hLH korak «protoka» i ima za cilj da ukloni potencijalnu DNK i ćelije domaćina ili proteinske kontaminante medijuma.

(i) Ekvilibrisanje kolone

Kondicioniranje kolone se obavlja tekućim puferom, 0,08 M amonijum acetatnim puferom, pH 7,5. Preporučeni raspon pH je 7,5 0,3.

(ii) Korak prečišćavanja r-hLH na Q Sepharose FF

Rastvor r-hLH se puni kroz filter aparat koji se nalazi na koloni Q Sepharose kao zaštita.

Ova kolona se dalje pere 0,08 M amonijum acetatom pH 7,5.

Vodeći efluent se odbacuje dok bazalna linija prolazi na oznaci apsorbance od 5%. Nevezana frakcija sa sadržajem r-hLH se prikuplja dok se bazalna linija ne spusti na 10%.

Rastvor r-hLH iz trećeg koraka može da se čuva u zamrznutom stanju za naknadnu upotrebu. Ako se čuva na temperaturi od -15°C ili nižoj, intermedijat se topi na +5 ± 3°G, tipično tokom perioda od 24 ±8 sati pre nego što se preduzme HPLC reverzne faze (Četvrti korak).

Prvi pripremni HPLC reverzne faze (Četvrti korak)

Ovaj korak, koji se obavljana sobnoj temperaturi, efikasno uklanja tragove FBS/CHO proteina i endotoksinskih zagađivača.

(i) Punjenje kolone i aktivacija smole

Kolona se puni C18 silikom širokih pora i, ako je nova, C18 smola se kondicionira 2-propanolom.

(ii) Ekvilibracija kolone

Kolona se ekvilibrira 12,4% tež./tež. 2-propanolom u 0,05 M amonijum acetatnom puferu, pH 7. Preporučeni raspon pH je 7 ± 0,2. (iii) Podešavanje pH i zapremine za rastvor r-hLH iz trećeg koraka Rastvor r-hLH se podešava na pH 7 koncentrovanom sirćetnom kiselinom. Preporučeni raspon pH je 7 ± 0,2.

Zapremina rastvora r-hLH se onda podešava dodavanjem 2-propanola da bi se dobila finalna koncentracija 2-propanola koja odgovara 12,4% tež./tež.

(iv) Filtracija podešenog r-hLH rastvora

Aparat za filtraciju opremljen filterom od 0,22 um ispire se 12,4 % tež./tež. 2-propanolom u 0,05 M amonijumskom puferu, pH 7. Preporučeni raspon je 7±0,2. Filtrira se podešeni rastvor r-hLH.

Recipijent se ispire alikvotima od 12,4 % tež./tež. 2-propanola u 0,05 M amonijumskom puferu, pH 7, filtrira i ispirci se spajaju s rastvorom r-hLH. Preporučeni raspon je 7±0,2.

(v) Korak prečišćavanja r-hLH na prvoj koloni Cl8 RP-HLPC

Rastvor r-hLH se puni u kolonu i hromatografija se prati UV spktrofotometrijski na - 280 nm.

U kolonu se unosi 12,4 % tei/tež. 2-propanola u 0,05 M amonijumskom puferu, pH 7 sve dok se A280ne vrati na bazalnu liniju posle čega se nevezana frakcija odbacuje. Elucija r-hLH se posle ovoga radi sa 2-propanol/amonijum acetat 0,05 M mobilnom fazom po linearnom gradijentu od 14,7% do 20,7% tež./tež. 2-propanola.

r-hLH se frakciomše kada A2gopočne da se povećava. Sve frakcije r-hLH pika čije su visine veće od 20% pune skale se spajaju.

Druga pripremna kolona reverzne faze HPLC (Peti korak)

Ovaj korak, koji se obavlja na sobnoj temperaturi, efikasan je za uklanjanje tragova FBS/CHO proteina i endotoksinskih zagađivača.

(i) Pakovanje kolone i aktivacija smole

Kolona se pakuje C-18 silikom širokih pora i, ako je nova, Cl 8 smola se kondicionira 2-propanolom.

(ii) Ekvilibrisanje kolone

Kolona se ekvilibriše u 14,7% tež./tež. 2-propanolu u 0,5 M Tris-HCl puferu, pH 7. Preporučeni raspon pH je 7±0,2.

(iii) Podešavanje zapremine i pH rastvora r-hLH iz četvrtog koraka.

2M Tris-HCl pufer, pH 7, dodaje se u uzorak r-hLH da bi se koncentracija 2-propanola smanjila na otprilike istu koja je u puferu za ekvilibrisanje kolone (14,7% tež-/tež.

Rastvor r-hLH se podešava na pH 7 sa HC112 M. Preporučeni raspon pH je 7+0,2.

(iv) Korak prečišćavanja r-hLH na drugoj koloni Cl 8 RP-HPLC

Rastvor r-hLH se unosi u kolonu, a hromatografija se prati UV spektorfotometrijski na 280 nm.

U kolonu se unosi 14,7 % tež./tež. 2-propanola u 0,5 M Tris-HCl, pH 7 . Preporučeni raspon pH je 7±0,2. Zatim se nevezana frakcija odbacuje.

Elucija r-hLH se posle ovoga radi sa 2-propanol/ 0,5 M Tris-HCl mobilnom fazom po linearnom gradijentu od 14,7% do 20,7% tež./tež. 2-propanola.

r-hLH se frakcioniše kada A280počne da se povećava. Sve frakcije r-hLH pika čije su visine veće od 20% pune skale se spajaju.

(v) Dijaliza

Rastvor r-hLH iz drugog koraka Cl 8 RP-HPLC se razblažuje vodom za injekcije. Preporučuje se upotreba 8 zapremina vode za injekcije.

Razblaženi rastvor r-hLH se dijalizira ultrafiltracijom na membrani 10 kD (vidi stranu 7, šesti korak) prema vodi za injekcije. Alikvoti 0,5 M amonijum hidrogen karbonata pH 8 se potom dodaju i dijaliza se nastavlja dok se ne zadovolje karakteristike amonijum hidrogen karbonatnog pufera.

Retencioni rastvor se koncentriše do finalne zapremine od oko 1 L i uzima. Ultrafilter se ispire 0,5 M amonijum hidrogen karbonatom pH 8 a ultrafiltracijski ispirci se mešaju sa retencionim rastvorom i po želji dodatno koncentruju. Dodatne koncentracije zavise od veličine kolone koja se koristi u sledećem koraku, tj. šestom koraku.

Gelpermeacijska hromatografija na SephacrvI S100HR iultrafiltracija (Šesti

korak)

U ovom koraku, postiže se separacija na bazi molekulske veličine, a rastvor se podvrgava ultrafiltraciji. Sve operacije koje se obavljaju u ovom koraku obavljaju se na oko 5°C. Preporučeni raspon temperature je +5°C ± 3.

(i) Gel permeacijska hromatografija na SephacrvI S100 HR

Kolona se puni sa SephacrvI SI 00 HR i ekvilibriše u prvom slučaju sa vodom za injekcije. Zatim se kolona ekvilibriše 0,5 M amonijum hidrogen karbonatom, pH 8. Rastvor r-hLH se unosi u kolonu a hromatografija se prati UV spektorfotometrijski na 280 nm.

r-hLH se frakcioniše kada A280počne da se povećava. Sve frakcije r-hLH pika čije su visine veće od 20% pune skale se spajaju.

Rastvor r-hLH koji je dobijen elucijom iz kolone SephacrvI SI 00 HR se onda po mogućstvu propušta kroz filter, na prečišćavanje. Virosolve™, da se uklone virusni zagađivači.

(ii) Dijaliza i koncentracija r-hLH

Membrane (ultrafiltracijska membrana 10 kD) se čuva u 0,05 M natrijum hidroksidu između serija prečišćavanja, pa se ispire vodom za injekcije dok pH ne padne na oko 8.

Razblaženi rastvor r-hLH se dijalizira ultrafiltracijom na membrani 10 kD prema vodi za injekcije. Alikvoti 0,5 M natrijum fosfatnog pufera pH 8 se potom dodaju i dijaliza se nastavlja dok se ne zadovolje karakteristike natrijum fosfatnog pufera.

Ako je neophodno, retencioni rastvor se koncentriše do finalne zapremine od oko 0,5L i uzima. Ultrafilter se ispire 0,01 M natrijum fosfatnog pufera. pH 8 a ultrafiltracijski ispirci se mešaju sa retencionim rastvorom.

Dodatni opcioni koraci koncentracije LH mogu da se obavljaju zavisno od uslova skladištenja.

Rastvor r-hLH se filtrira, a filtrat se sakuplja u sterilne posude.

Sva količina r-hLH se po preporuci čuva u sterilnim bočicama na -15°C.

Reagensi, puferi, eluanti i hemikalije

Hromatografkse smole

Sledeće hromatografske smole se trenutno koriste u procesu prečišćavanja. Mogu se koristiti i ekvivalentne smole kao i procesi prečišćavanja.

Snabdevači su:

Amersham Pharmacia Biotech Waters Corporation

Bjorkgatan 30 34 Maple Street

S-751 84 Upsala Milford MA 757

Švedska SAD

REZULTATI

Biološka aktivnost

Biološka aktivnost različitih serija r-hLH po prečišćavanju metodom ovog pronalaska navedena je u Tabeli 2. Koncentracija proteina (mg LH proteina/ml) određena je spektrofotometrisjki na 276,5 nm korišćenjem eksperimentalno dobijene apsorptivnosti na bazi analize amino kiselinskih sekvenci a = 0,812.

Prosečna specifična aktivnost r-LH preparata je posebno visoka, i iznosi i do 25,000 IH/mg (proteina LH).

Formulacije

Formulacije sušene zamrzavanjem su razvijene sa visoko prečišćenim rekombinantnim LH prikazanim u ovom pronalasku.

Kao tipični primer, formulacija sušena zamrzavanjem jačine 75 U pripremljena je u vajlama DIN 2R korišćenjem saharoze kao ekscipijenta (Tabela 3) koja je bila stabilna nekoliko meseci kada je čuvana na 4°C.

Claims (17)

1. Proces za prečišćavanje LH iz uzorka, naznačen time što se koristi jonoizmenjivačka hromatografija sa anjonsko izmenjivačkom smolom i HPLC obrnutih faza.

2. Proces prema zahtevu 1, naznačen time što se sastoji od sledećih koraka: (a) podvrgavanje uzorka jonoizmenjivačkoj hromatografiji radi proizvodnje prvog eluata (b) podvrgavanje prvog eluata HPLC obrnutih faza radi proizvodnje drugog eluata (c) primena drugog eluata na gel permeativnu hromatografiju.

3. Proces prema zahtevu 1, naznačen time što su jonoizmenjivačka hromatografija i HPLC obrnutih faza izvršeni dva puta.

4. Proces prema zahtevu 1, naznačen time što se sastoji od sledećih koraka: (a) eluacija uzorka na DEAE sefaroznoj jonoizmenjivačkoj hromatografskoj koloni, (b) eluacija na Q-sefaroznoj jonoizmenjivačkoj hromatografskoj koloni, (c) eluacija na silikatnoj Cl8 koloni HPLC obrnutih faza, (d) dalja eluacije na silikatnoj Cl8 koloni HPLC obrnutih faza i (e) eluacija kroz gel permeativnu kolonu.

5. Proces prema zahtevu 4, naznačen time što je eluacija kroz DEAE sefaroznu jonoizmenjivačku hromatografiju proistekla iz sodijum-fosfatnog pufera pH 8.

6. Proces prema zahtevu 4, naznačen time što je eluacija kroz Q-sefaroznu jonoizmenjivačku hromatografiju izvršen u amonijum-acetatnom puferu pH 7.5.

7. Proces prema zahtevu 4, naznačen time što je korak HPLC obrnutih faza (c) izvršen sa 2-propanol/amonijum-acetatom kao mobilnom fazom.

8. Proces prema zahtevu 4, naznačen time što je korak HPLC obrnutih faza (d) izvršen sa 2-propanol/Tris-HCI kao mobilnom fazom.

9. Proces prema zahtevu 1, naznačen time što je LH humani LH.

10. Proces prema zahtevu 1, naznačen time što je uzorak kultura medijum iz CHO ćelija.

11. Rekombinantni hLH koji poseduje specifičnu bioaktivnost od 20522 do 31229 IU/mg.

12. Rekombinantni hLH prema zahtevu 11 naznačen time što poseduje specifičnu bioaktivnost od/oko 25000 IU/mg.

13. Upotreba rekombinantnog hLH prema zahtevu 11 ili 12 za pripremu medikamenata za lečenje problema sa plodnošću.

14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efektnu količinu rekombinantnog hLH prema zahtevu 11 ili 12 i odgovarajuće ekscipijente istih.

15. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 14, naznačen time što je ekscipijent sukroza.

16. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 15, naznačen time što sadrži Tween 20 disodijum fosfat dehidrat i monosodijum fosfat monohidrat.

17. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom zahtevu od 14 do 16, naznačen time što je za potkožnu primenu.