CZ303274B6 - Zpusob vycištení luteinizacního hormonu - Google Patents
Zpusob vycištení luteinizacního hormonu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303274B6 CZ303274B6 CZ20022856A CZ20022856A CZ303274B6 CZ 303274 B6 CZ303274 B6 CZ 303274B6 CZ 20022856 A CZ20022856 A CZ 20022856A CZ 20022856 A CZ20022856 A CZ 20022856A CZ 303274 B6 CZ303274 B6 CZ 303274B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hlh
- chromatography
- column
- luteinizing hormone
- reverse phase
- Prior art date
Links
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 17
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 17
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 6
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012375 Ion exchange chromatography - high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 12
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 11
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 10
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 8
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 6
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010057021 Menotropins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- -1 anionic oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 231100000547 follicle rupture Toxicity 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000002332 leydig cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
- A61P5/34—Gestagens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Semiconductor Lasers (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob vycištení rekombinantního lidského luteinizacního hormonu (LH) ze vzorku, který zahrnuje spojené použití iontove výmenné chromatografie a vysoce úcinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi. Postup iontove výmenné chromatografie a vysoce úcinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi se provádí dvakrát. Následné použití gelového permeacního sloupce umožnuje vycištení od jakýchkoliv zbytkových stop znecištujících prímesí. Specifická biologická aktivita takto získaného luteinizacního hormonu je zvlášte vysoká a dosahuje približne 25 000 IU/mg.
Description
Předkládaný vynález se týká způsobu vyčištění luteinizačního hormonu (LH), zejména vyčištění rekombinantního luteinizačního hormonu (r-LH) ze vzorku surového rekombinantního LH, který zahrnuje kombinované použití iontově výměnné chromatografie a vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) na reverzní fázi.
Způsob vyčištění luteinizačního hormonu
Oblast techniky
Dosavadní stav techniky
Luteinizační hormon (LH) je gonadotropin, vylučovaný předním lalokem hypofyzy společně sjiným gonadotropinem, hormonem stimulujícím folikuly (FSH). Tyto hormony jsou heterodimery, sestávající z podjednotek alfa a beta, nekovalentně vázaných.
Tyto gonadotropiny stimulují normální funkci pohlavních žláz (gonád) a sekreci sexuálních hormonů jak u mužů, tak i u žen. U žen stimuluje hormon stimulující folikuly (FSH) vývoj a zrání folikulů a vajíčka. Během vývoje folikulu tento produkuje v rostoucích množstvích estrogen, který v polovině cyklu stimuluje uvolnění luteinizačního hormonu. LH vyvolává prasknutí folikulu s ovulací a přeměňuje folikul na žluté tělísko, corpus luteum, které vylučuje progesteron. U mužů stimuluje luteinizační hormon intersticiální buňky varlat k sekreci testosteronu, který má naopak přímý účinek na semenotvomé tubuly. Gonadotropní látky s luteinizační aktivitou či s aktivitou stimulující folikuly, nebo s oběma aktivitami, jsou používány při léčbě poruch plodnosti, zejména u žen, ale rovněž u mužů. Takové látky zahrnují chorionní gonadotropin, který vykazuje aktivitu LH a lidské menopauzové gonadotropiny, které vykazují jak aktivitu LH, tak i FSH. Z rekombinantní DNA získaný lidský luteinizační hormon (rechLH) se nyní testuje jako alternativa chorionní ho gonadotropinu nebo pro podávání spolu s FSH.
K izolaci a vyčištění luteinizačního hormonu byly používány různé metody, jako iontově výměnná chromatografie, imunoafinitní chromatografie a gelová filtrace (G. W. Jack, R. Blažek, K. James, J. E. Boyd a L. R. Mícklem; The automated production by immunoaffinity chromatography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and lutropin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987).
K izolaci těchto hormonů byla používána iontově výměnná chromatografie, ovšem tato metoda se zdá mít několik souvisejících problémů, způsobených značnou heterogenitou náboje luteinizačního hormonu v tkáni hypofyzy. Za prvé, vzhledem k tomu, že tyto glykoproteiny a FSH mají překrývající se náboje, je jejich úplné oddělení obtížné a pracné. Za druhé, vyčištění těchto hormonů jako jediného podílu může být značně obtížné (A. Stockell Hartree; M. Thomas, Β. E. Furnival, T. W. Bums a P. Langley; Thyroid-stimulating and lipolytc activities of purified preparations of human thyroid-stimulating hormone; Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972). Výsledkem je, že během čištění mohou být vybrány určité nabité formy hormonu, jak je uvedeno v případě LH (P. L. Storring, A. A. Zaidi, Y. G. Mistry, M. Lindberg, Β. E. Steming a E. Diczfalusy; Comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: differences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays, in vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339-347, 1982). Selektivní vyčištění bude dále komplikovat charakterizaci těchto heterogenních forem včetně strukturní analýzy jejich cukerných složek. Různý obsah an iontových oligosacharidů, které obsahují sialylové sulfátové skupiny, může být hlavní příčinou heterogenity náboje u luteinizačního hormonu.
Metody tradiční frakci onace byly popsány pro přípravu lidského močového luteinizačního hormonu (LH) s účinností 982 lU/mg pomocí biologického stanovení a 1 166 IU pomocí radioimunoassaye (S. Donini a P. Donini, Acta endocrin., Kodaň, 63, dodatek 142, 257-277, 1969).
- I CZ 303274 B6
K vyčištění luteinizaěního hormonu z hlavního podílu a z vedlejších podílů, získaných během preparace hormonu stimulujícího tbl i kuly z menopauzální moči, byl použit imunoabsorbent králičího antiséra vůči vyčištěnému lidskému chorionnímu gonadotropinů (HCG) (H. van Hell, A. H. W. M. Schuurs a F. C. Hollander; In Symposium on gonadotrophíns, New York, 17.6. 1971.
Vydavatelé Β. B. Saxena, C. G. Beling a Η. M. Gandy. New York: John Wiley a syn, lne, 1972). Získaný preparát měl vyšší potenciál LH, ale rovněž vyšší poměry FSH:LH, než tomu bylo u preparátu, které připravili Donini a Donini (1969).
Rekombinantní luteinizační hormon má tu výhodu, že je zbaven ostatních gonadotropních horio monů, jako FSH a TSH (hormon stimulující štítnou žlázu, thyroid stimulating hormone). Surový preparát rekombinantního LH ovšem obsahuje veškeré ostatní proteiny a znečišťující látky z buněk, použitých v jeho rekombinantní výrobě a proto je vysoce žádoucí způsob, který umožňuje dosáhnout absolutní čistoty rekombinantního luteinizaěního hormonu.
Podstata vynálezu
Autoři vynálezu nyní zjistili, že surový preparát LH, získaný ze vzorku kultivačního média, získaného po procesu rekombinace nebo z surového koncentrátu moči po menopauze, může být io vyčištěn do takového stupně, že výsledný luteinizační hormon prakticky neobsahuje proteiny a/nebo jiné znečišťující látky, obsažené v surovém preparátu LH. V závislosti na výchozím materiálu jsou protein a jiné znečišťující látky lidského původu (výchozí materiál: lidské menopauzální gonadotropiny) nebo původem z hostitelské buňky, například CHO, v případě hostitelské buňky CHO (vaječníkové buňky čínského křečka, chinese hamster ovary cells).
Způsob vyčištění je založen na použití iontově výměnné chromatografie a HPLC na reverzní fázi. Další volitelné použití gelového filtračního sloupce umožňuje odstranění jakýchkoliv zbytkových stop příměsí z čistého preparátu LH. Optimální výsledky se získají při použití dvou stupňů iontově výměnné chromatografie a dvou stupňů H PLC na reverzní fázi.
Způsob podle vynálezu může být využit k vyčištění rekombinantního LH, při němž se vychází ze vzorku kultivačního média, získaného po procesu rekombinace, tak, že výsledný, vysoce vyčištěný LH prakticky neobsahuje například proteiny z fetálního hovězího séra, FBS, které jsou často obsaženy v kultivačním médiu, ani nukleové kyseliny nebo jiné znečišťující látky, přítomné v hostitelských buňkách, použitých v procesu rekombinace.
Způsob podle vynálezu může být použit jak pro vyčištění močového LH, přičemž se vychází ze surového koncentrátu moči po menopauze, tak i pro vyčištění LH jiných druhů, zvláště savčích, včetně například hovězího, koňského, prasecího, ovčího, krysího, myšího a opičího LH.
Předmětem předkládaného vynálezu je proto poskytnutí způsobu vyčištění luteinizaěního hormonu ze vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje kombinované použití iontově výměnné chromatografie a HPLC na reverzní fázi. Způsob zahrnuje kroky, v nichž je vzorek (pokud je to nezbytné, zahuštěný) podroben iontově výměnné chromatografie a eluát je podroben HPLC na reverzní fází. Kromě toho může být prováděn další krok, v němž je eluát nanášen na gelový permeační sloupec (pro gelovou filtraci).
V závislosti na čistotě výchozího preparátu se iontově výměnná chromatografie a HPLC na reverzní fázi pro získání optimálních výsledků procesu vyčištění s výhodou provádějí dvakrát.
Takový proces může zahrnovat kroky, v nichž se
a) vzorek podrobí chromatografii na koloně iontoměniče DEAE Sepharosy,
b) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na koloně iontoměniče Q- Sepharosy, a
c) eluát z předchozího kroku se podrobí vysoce výkonné kapalinové chromatografii s náplní Silica C 18 na reverzní fázi, a
d) eluát z předchozího kroku se podrobí vysoce výkonné kapalinové chromatografie s náplní Siliea C 18 na reverzní fázi, a
e) eluát z předchozího kroku se podrobí gel ové permeacní chromatografii.
V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu se eluce na DEAE Sepharose při iontově výměnné chromatografii provádí v sodném fosforečném pufru při pH 8.
Eluce na Q-Sepharose při iontově výměnné chromatografii se s výhodou provádí v amonném acetátovém pufru pri pH 7,5.
Krok (c) HPLC na reverzní fázi se s výhodou provádí se soustavou 2-propanol/acetát amonný jako mobilní fází.
Krok (d) HPLC na reverzní fázi se s výhodou provádí se soustavou 2-propanol/Tris-HCl jako mobilní fází.
Luteinizační hormon podle předkládaného vynálezu je s výhodou lidský LH a nejvýhodnější je to rekombinantní lidský LH, získaný z kultivačního média savčích buněk (s výhodou buněk CHO), použitého v procesu rekombinace.
Vynález poskytuje způsob vyčištění (výroby) luteinizační ho hormonu, zvláště pak vyčištění rekombinantního LH ze surového preparátu kultivačního média z procesu rekombinace. Získá se tak r-hLH o vysokém stupni čistoty a vysoké specifické aktivitě, který prakticky neobsahuje proteiny fetálního hovězího séra (FBS), které mohou být přítomny v kultivačním médiu a neobsahuje ani nukleové kyseliny nebo jiné znečišťující látky, obsažené v hostitelských buňkách, užívaných v procesu rekombinace.
Vynález je určen pro využití biologických materiálů, zvláště surových směsí s obsahem LH a jiných příměsových proteinů, které zde byly zmíněny, jako vzorků výchozího materiálu. Příklady, které jsou podrobněji popsány níže, používají vzorky výchozího materiálu s obsahem r-hLH, získané ze supematantu kultivačního média z bioreaktoru. Alternativně je vzorkem lidský menopauzový gonadotropin (hMG), surový koncentrát moči po menopauze.
Vzorek je tvořen čerstvě shromážděným supematantem média buněčné kultury, vymytým z bioreaktoru. S výhodou se pročistí filtrací. Surový roztok pak může být zahuštěn, pokud je to nezbytné, a podroben ultrafiltraci k odstranění materiálu, majícího molekulové hmotnosti nižší než 10. Ultrafiltrace také umožňuje změnu pufru na fosforečnan sodný o pH 8.
Po předběžných krocích je vzorek podroben iontově výměnné chromatografii a HPLC na reverzní fázi, které se s výhodou provádějí každá dvakrát. První iontově výměnný krok se s výhodou provádí na DEAE Sepharose. To je zásadní „flow-through“ krok pro LH, (což znamená, že rhLH se nachází v proteklém podílu), v němž se odstraní značný podíl proteinů odlišných od LH, Druhý iontově výměnný krok se s výhodou provádí na sloupci Q-Sepharosy. Jedná se rovněž o „flow-4hrough“ krok pro LH a slouží k odstranění možné DNA a proteinových znečišťujících látek z hostitelských buněk nebo média. V upřednostňovaném ztělesnění se tento krok provádí při teplotě přibližně 5 °C za použití acetátu amonného jako elučního pufru o pH 7,5.
Chromatografie na reverzní fázi Siliea Cl 8 se s výhodou rovněž provádí dvakrát aje účinná k odstranění stopových množství znečišťujících látek pocházejících z FBS, buněčného proteinu a endotoxinu. Krok první HPLC se s výhodou provádí za použití soustavy 2-propanol/acetát amonný jako mobilní fáze. Krok druhé HPLC na reverzní fázi se s výhodou provádí za použití soustavy 2-propanol/Tris-HCl jako mobilní fáze. Zadržovaný roztok se poté zahustí a může být zpětně získán za použití hydrogenuhličitanu amonného o pH 8. Zahuštěný produkt se s výhodou podrobí gelové permeacní chromatografii (gelové filtraci) na sloupci Sephacryl SlOO HR.
-3CZ 303274 B6
V tomto kroku se provádí rozdělení na základě molekulové hmotnosti za použití hydrogenuhiičitanu amonného o pH 8 jako eluentu.
Eluát se pak podrobí filtraci k odstranění virových příměsí a následně ultraťíltraci na membrá5 nách, oddělujících částice o menší molekulové hmotnosti než 10 kDa, v sodném fosforečném pufru o pH 8. Po filtraci se vyčištěné množství (šarže) luteinizačního hormonu s výhodou skladuje v sterilních lahvích při nízké teplotě.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 i? Reakční činidla kyselina octová (ledová), v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) acetát amonný, v analytické čistotě hydrogenuhličitan amonný, v analytické čistotě (dle brit. lékopisu) zo dihydrogenfosforečnan sodný, v analytické čistotě kyselina chlorovodíková, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) kyselina fosforečná, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu)
2-propanol, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) chlorid sodný, v analytické čistotě (dle evr. lékopisu) hydrogenfosforečnan sodný, v analytické čistotě pelety hydroxidu sodného, v analytické Čistotě (dle evr. lékopisu) kyselina trifluoroctová (TFA), v čistotě pro HPLC
Tris jhydroxyrnethyi)arninomethan, v analytické čistotě voda pro injekce (WFI), (dle evr. lékopisu)
Souhrnné blokové schéma postupu čištění
Tabulka 1 je blokovým schématem, které sumarizuje postup čištění r—hLH, přičemž zdůrazňuje operační principy každého z jednotlivých kroků.
-4CZ 303274 B6
Tabulka 1: Blokové schéma, shrnující postup čištění rhLH
Kultivační médium z bioreaktoru krok
Ultrafiltrace (10 kD)
SHROMÁŽDĚNI ZAHUŠTĚNÉHO SUROVÉHO r-hLH krok
Spojený, zahuštěný, surový shromážděný r-hLH
DEAE SEPHAROSE CL-6B nenavázaný podíl obsahuje r-hLH
Ultrafiltrace (100 kD)
Ultrafiltrace (10 kD)
I krok
Q-SEPHAROSE FF nenavázaný podíl obsahuje r-hLH krok IV
PRVNÍ H
PLC NA REVERZNÍ FÁZI eluát obsahuje r-hLH krok V
DRUHA
HPLC NA REVERZNÍ FÁZI eluát obsahuje r-hLH krok VI
Ultrafiltrace (10 kD) i
SEPHACRYL S100 HR nenavázaný podíl obsahuje r-hLH
Ultrafiltrace (10 kD) zadržený podíl obsahuje r-hLH šarže ROZTOKU r-hLH
Vy čeření, zahuštění, dialýza a filtrace shromážděných množství (krok I)
V tomto kroku (krok I) se změní pufr tak, aby odpovídal kontrolovanému složení a dosáhne se předběžné koncentrace. Tento krok se provádí přibližně při 5 °C a opakuje se jednotlivě pro každé množství, shromážděné během produkčního cyklu bioreaktoru. Upřednostňované rozmezí io teplot je 5 ± 3 °C,
-5CZ 303274 B6 (i) vy Čeře ní shromážděných množství
Po každém získání čerstvě shromážděného kultivačního média z bioreaktoru se materiál s výhodou zpracovává nejprve vy čeřením roztoku supematantu prostřednictvím filtrace.
(ii) zahuštěn i/dialýza shromážděných množství
Membrány, uchovávané mezi jednotlivými Šaržemi v 0,05 mol x I 1 roztoku hydroxidu sodného, se promývají vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH neklesne na hodnotu přibližně 8.
Vodu nahradí ekvilibrační pufr, 0,025 mol x l 1 roztok fosforečnanu sodného o pH 8. Jednou io upravený surový roztok r-hLH z bioreaktoru se zahustí a dialyzuje se k odstranění materiálu, majícího molekulovou hmotnost menší než 10 kDa (za použití membrány, odstraňující podíl o molekulové hmotnosti menší než 10 kDa).
Výsledný koncentrát se uchovává pri teplotě přibližně -15 °C.
Iontově výměnná chromatografie na DEAE SEPHAROSE CL-óB (krok II)
Chromatografický krok je pro r-hLH krokem „flow—through“, protékání, ve kterém se eliminuje velký podíl proteinů odlišných od r-hLH a roztok se dále zahustí a dialyzuje. Chromatografické kroky, při nichž produkt prochází sloupcem, se provádějí v chlazené místnosti.
(i) iontově výměnná chromatografie na DEAE SEPHAROSE CL-6B
Sloupec jc naplněn slabě nabitou aniontově výměnnou pryskyřicí, diethylaminoethan Sepharosou (DEAE Sepharosou), ekvilibrovanou (uvedenou do rovnovážného stavu) nejprve 0,15 mol x I 1 ?s roztokem fosforečnanu sodného o pH 8. Upřednostňovaným rozmezí pH je 8 ± 0,3.
Poté se sloupec upraví elučním pufrem, 0,025 mol x Γ1 roztokem fosforečnanu sodného o pH 8. Upřednostňovaným rozmezím pH je 8 ± 0,3.
Na sloupec se nanese roztok r-hLH prostřednictvím filtračního zařízení, které je na sloupci umístěno jako ochrana.
Sloupec se naplní 0,025 mol x 1 1 roztokem fosforečnanu sodného o pH 8. Upřednostňovaným rozmezím pH je 8 ± 0,3. Chromatografický proces je monitorován spektrofotometricky pří vlno35 vé délce 280 nm.
Čelní část eluentu se odstraňuje tak dlouho, dokud základní čára (baseline) nedosáhne značky 5% absorbance.
Nenavázaný podíl, obsahující r-hLH, se shromažďuje tak dlouho, dokud základní čára neklesne na hodnotu 10% absorbance.
(ii) Ultrafiltrace
Ultrafiltrační zařízení, které je vybavené membránou, odstraňující podíly o menší molekulové 45 hmotnosti než 100 kDa, uchovávané v 0,05 mol x Γ1 roztoku NaOH, se promývá vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH proteklé kapaliny nemá hodnotu přibližně 8.
Voda se nahradí ekvilibračním pufrem, 0,08 mol x Γ1 roztokem acetátu amonného o pH 7,5. Upřednostňované rozmezí pHje7,5±0,3.
Roztok r-hLH, získaný z kroku iontově výměnné chromatografie, se ultrafiltruje přes membránu, oddělující podíly o menší molekulové hmotnosti než 100 kDa, a shromažďuje se proteklý podíl.
(iii) Zahuštění/dialýza
- 6 CZ 303274 B6
Ultrafiltrační zařízení, které je vybavené membránou, odstraňující podíly o menší molekulové hmotnosti než 10 kDa uchovávané v 0,05 mol x 1 1 roztoku NaOH, se promývá vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH proteklé kapaliny nemá hodnotu přibližně 8. Voda se nahradí ekvilibrač5 ním pufrem, 0,08 mol x I 1 roztokem acetátu amonného o pH 7,5.
Roztok r-hLH se zahustí. K zadrženému objemu se přidává acetát amonný (0,08 mol x Γ1, pH 7,5) a roztok se zahustí. Dialýza pokračuje do té doby, dokud hodnota pH a vodivost zadrženého podílu nejsou stejné jako hodnoty, které vykazuje dodávaný pufr. Výsledný zadržený podíl se io zachycuje.
Iontově výměnná chromatografie na Q-SEPHAROSE FF (krok III)
Tento krok je rovněž krokem typu r-hLH „flow-through^, to znamená, že r-hLH se nachází i? v proteklém podílu. Uvedený krok je určen k odstranění případné DNA a proteinů z hostitelských buněk média jako znečišťujících látek.
(i) Ekvilibrace sloupce
Úprava sloupce se provádí elučním pufrem, 0,08 mol x I1 acetátem amonným o pH 7,5. Upřed20 nostňované rozmezí pH je 7,5 ± 0,3.
(ii) Krok vyčištění r-hLH na Q-Sepharose FF
Roztok r-hLH se nanese prostřednictvím filtračního zařízení, které je umístěno na sloupci QSapharosy jako ochrana.
Sloupec se dále promývá 0,08 mol x Γ1 acetátem amonným o pH 7,5.
Protékající eluent se odstraňuje tak dlouho, dokud základní čára nedosáhne značky 5% absorbance.
Nenavázaný podíl, obsahující r-hLH je shromažďován tak dlouho, dokud základní čára neklesne na hodnotu 10% absorbance.
Roztok r-hLH z kroku III může být pro následné použití skladován zamražený. Pokud je sklado35 ván při teplotě -15 °C nebo nižší, meziprodukt r-hLH se rozmrazí pri +5 ± 3 °C, typicky během ± 8 hodin před prováděním HPLC na reverzní fázi (krok IV).
První preparativní HPLC na reverzní fázi (krok IV)
Tento krok, prováděný při teplotě místnosti, je účinný pro odstranění stopových množství příměsi proteinu FBS/CHO a endotoxinových příměsí.
(i) Plnění sloupce a aktivace pryskyřice
Sloupec je naplněn 08 silikou (oxidem křemičitým) se širokými póry a pokud je nový, je prys45 kyřice C18 upravena pomocí 2-propanolu.
(ii) Ekvilibrace sloupce
Sloupec se ekvilibruje 12,4% (hmotnost/hmotnost) 2-propanolem v 0,05 mol x Γ1 amonném acetátovém pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.
(iii) Úprava pH a objemu roztoku r-hLH z kroku III.
Roztok r—hLH se upraví na pH 7 koncentrovanou kyselinou octovou. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ±0,2.
-7CZ 303274 B6
Objem roztoku r-hLH se poté upraví přidáním 2 -propanolu k získání konečné koncentrace 2propanolu, rovnající se 12,4 % (hm./hm.).
(iv) Filtrace a úprava roztoku r-hLH s
Filtrační zařízení, vybavené filtrem o velikosti pórů 0,22 μιη, se promyje 2-propanolem (12,4%; hm./hm.) v 0,05 mol x I 1 amonném acetátovém pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí je 7 ± 0,2.
io Upravený roztok r-hLH se zfiltruje.
Recipient se promyje alikvotními částmi 2-propanolu (12,4%; hm./hm.) v 0,05 mol x T1 amonném acetátovém pufru o pH 7, zfiltruje se a promývací roztoky se připojí k roztoku r-hLH. Upřednostňované rozmezí je 7 ± 0,2.
(v) Krok vyčištění r-hLH na prvním sloupci Cl 8 RP—HPLC.
Roztok r-hLH se nanese na sloupec a průběh chromatografie se monitoruje prostřednictvím UV spektrofotometr i e při 280 nm.
2o Na sloupec se nanáší 2-propanol (12,4%; hm./hm.) v pufru, 0,05 mot x Γ1 acetátu amonném o pH 7, až do té doby, než se absorbance pri 280 nm (A2so) vrátí na základní linii, přičemž se nenavázaná frakce odstraňuje.
Eluce r-hLH se následně provádí mobilní fází, jíž je soustava 2-propanol/acetát amonný ( 0,05 mol x Γ1) s lineárním gradientem od 14,7% do 27,7% (hm./hm. 2-propanolu).
r-hLH se frakcionuje, jakmile A280 začne vzrůstat. Veškeré podíly r-hLH, vykazující vyšší maxima než 20 % plné škály, se spojují.
Druhá preparativní HPLC na reverzní fázi (krok V)
Tento krok, prováděný při teplotě místnosti, je účinný pro odstranění stopových množství proteinu FBS/CHO a endotoxinu jako znečišťujících látek.
(i) Plnění sloupce a aktivace pryskyřice
Sloupec je naplněn C18 silikou se širokými póry a pokud je nový, je pryskyřice 08 upravena pomocí 2-propanolu.
(ii) Ekvilibrace sloupce
Sloupec se ekvilibruje 14,7% (hmotnost/hmotnost) 2-propanolem v 0,5 mol x Γ1 Tris-HCI pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.
(iii) Úprava objemu a pH r-hLH roztoku z kroku IV mol x Γ1 Tris-HCl pufr o pH 7 se přidá ke vzorku r-hLH ke snížení koncentrace 2-propanolu na přibližně stejnou hodnotu, jakou má ekvilibraění pufr sloupce (14,7 % hm./hm.).
Roztok r-hLH se upraví na pH 7 prostřednictvím 12 mol x Γ1 HCI. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2.
(iv) Krok čištění r-hLH na druhém sloupci pro Cl 8 RP-HPLC
Roztok r-hLH se nanese na sloupec a průběh chromatografie se monitoruje prostřednictvím UV spektrofotometrie při 280 nm.
- 8 CZ 303274 B6
Na sloupec se přivádí 14,7% (hm./hm.) 2—propanol v 0,5 mol x I 1 Tris-HCI pufru o pH 7. Upřednostňované rozmezí pH je 7 ± 0,2. Nenavázaný podíl se odstraňuje.
Eluce r-hLH se následně provádí mobilní fází, jíž je 2-propano 1/0,5 mol x 1 1 Tris-HCI s lineárním gradientem od 14,7 % do 20.7 % (hm./hm.) 2-propanolu.
r-hLH se frakcionuje, jakmile A2so začne vzrůstat. Veškeré podíly r-hLH. vykazující vyšší maxima než 20 % plné škály, se spojují.
(v) Dialýza
Roztok r-hLH z druhého kroku 08 RP—HPLC se naředí vodou pro injekce; s výhodnou se používá 8 objemů vody pro injekce.
Zředěný roztok r-hLH se dialyzuje ultrafiltrací na membráně 10 kDa (viz blokové schéma, krok V) vůči vodě pro injekce. Následně jsou přidávány alikvotní části 0,5 mol x Γ1 hydrogenuhličitanu amonného o pH 8 a dialýza pokračuje, dokud není dosaženo charakteristik amonného hydrogenuhličitanového pufru.
Zadržovaný roztok se zahustí na konečný objem přibližně 1 litr a uschová. Ultrafiltr se promyje 0,5 mol x Γ1 hydrogenuhličitanem amonným o pH 8 a podíly z promytí jsou spojeny se zahuštěným roztokem. Volitelně mohou být dále zahuštěny. Toto další zahuštění je závislé na velikosti sloupce, použitého v dalším kroku, tj. kroku VI.
Gelová permeační chromatografie na Sephacrylu S100 HR a ultrafiltrace (krok VI)
V tomto kroku se dosáhne rozdělení na základě molekulové hmotnosti a roztok podstoupí ultrafiltraci. Veškeré operace, prováděné v tomto kroku, probíhají při teplotě přibližně 5 °C. Upřednostňované rozmezí teploty je +5 ± 3 °C.
(i) Gelová permeační chromatografie na Sephacrylu S100 HR
Sloupec se naplní Sephacrylem S100 HR a nejprve se ekvilibruje vodou pro injekce.
Poté se sloupec ekvilibruje 0,5 mol x Γ1 hydrogenuhličitanem amonným o pH 8,0.
Na sloupec se přivádí 0,5 mol x Γ1 hydrogenuhličítan amonným o pH 8. Průběh chromatografie se monitoruje prostřednictvím spektrofotometrie při 280 nm.
r-hLH se frakcionuje, jakmile A28o začne vzrůstat. Veškeré podíly r-hLH, vykazující vyšší maxima než 20 % plné škály, se spojují.
Roztok r-hLH, eluovaný ze sloupce Sephacryl S100 HR, se poté s výhodou zfiltruje např. přes filtr Virosolve™ k odstranění virových znečišťujících látek.
(ii) Dialýza a zahuštění r-hLH
Membrány (ultrafiltrační membrány pro velikost 10 kDa), uchovávané mezi jednotlivým čištěním v 0,05 mol x L1 roztoku hydroxidu sodného, jsou promývány vodou pro injekce tak dlouho, dokud pH neklesne na hodnotu přibližně 8.
Zředěný roztok r-hLH se dialyzuje (ultrafiltrací na membráně o velikosti 10 kDa) proti vodě pro injekce. Následně jsou přidávány alikvotní části 0,01 mol x 1 1 sodného fosforečného pufru o pH 8 a dialýza pokračuje, dokud není dosaženo charakteristik tohoto fosforečného pufru.
-9CZ 303274 B6
Pokud je lo nezbytné, zadržovaný roztok se zahustí na konečný objem přibližně 500 ml a poté se schová. Ultraťíltr se promyje 0,01 mol x l 1 sodným fosforečným pufrem o pH 8 a objemy z promytí ultra filtrace se připojí k uschovanému roztoku.
Další volitelný krok zahuštění LH se může provádět v závislosti na podmínkách, které byly zvoleny pro skladování.
Roztok r-hLH se zfiltruje a filtrát se shromáždí do sterilní nádoby. Vyčištěné množství r-hLH se s výhodou skladuje ve sterilních lahvích při teplotě přibližně-15 °C.
Reakční činidla, pufry, eluenty a chemikálie Chromatografické pryskyřice
Ve způsobu vyčištění se běžně používají následující chromatografické pryskyřice. Stejně tak mohou být ve způsobu vyčištění použity i jiné odpovídající pryskyřice.
| Krok 11: | DEAE Sepharose CL-6N | (Pharmacia) |
| Krok lil: | Q-Sepharose Fast Flow | (Pharmacia) |
| Krok IV: | Cl8 Silica RP-HPLC | (Waters) |
| Krok V: | 08 Silica RP-HPLC | (Waters) |
| Krok VI: | Sephacryl S100 HR | (Pharmacia) |
Dodavateli jsou: Amersham Pharmacia Biotech, Bjorkgatan 30, S—751 84, Uppsala, Švédsko, a 25 Waters Corporation, 34 Maple Street, Milford, MA 01757, USA.
Výsledky
Biologická aktivita
Biologická aktivita různých šarží r-LH po vyčištění způsobem podle předkládaného vynálezu je uvedena v tabulce 2. Koncentrace proteinu (mg proteinu LH/ml) byla stanovena spektrofotometricky při 276,5 nm, za použití pokusně získané absorptivity (na základě analýzy aminokyselinových sekvencí) a = 0,812.
Průměrná specifická aktivita preparátu r-LH je zvláště vysoká, dosahující přibližně 25 000 IU/mg (proteinu LH).
to Tabulka 2
Specifická aktivita r-hLH objemových Šarží
- 10CZ 303274 B6
| číslo šarže | specifická aktivita |
| [lU/mg] | |
| BLCA 9802 | 28173 |
| BLCA 9803 | 25819 |
| BLCA 9804 | 27472 |
| BLCA 9805 | 31229 |
| BLCA 9806 | 26995 |
| BLCA 9808 | 26279 |
| BLCA 9809 | 20522 |
| BLCA 9810 | 22275 |
| BLCA 9811 | 27642 |
| BLCA 9812 | 29941 |
| BLCA 9813 | 28345 |
| BLCA 9814 | 27581 |
| BLCA 9815 | 24541 | |
Prostředky
Vyvinuty byly lyofílizované prostředky s vysoce vyčištěným rekombinantním luteínizačním 5 hormonem podle předkládaného vynálezu.
Jako typický příklad byl za použití sacharózy jako přídavného činidla připraven lyofllizovaný prostředek o síle 75 IU v lahvičkách DIN 2R (tabulka 3), který byl stálý několik měsíců při teplotě 4 °C.
io
Tabulka 3
| přísady | jednotkové množství |
| aktivní přísada: | 3,4 pg (75 IU) |
| rekombinantní lidský LH | |
| další přísady: | |
| sacharóza | 47,75 mg |
| Tween 20 | 0,05g |
| dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného | 0,825 mg |
| monohydrát dihydrogenfosforečnanu sodného | 0,052 mg |
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY5 1. Způsob vyčištění luteinizačního hormonu ze vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, v nichž sea) vzorek podrobí chromatografii na koloně iontoměniče DEAE Sepharosy,b) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na koloně iontoměniče Q-Sepharosy, ac) eluát z předchozího kroku se podrobí vysoce výkonné kapalinové chromatografii s náplní Sílilo ca C 18 na reverzní fázi, ad) eluát z předchozího kroku se podrobí vysoce výkonné kapalinové chromatografie s náplní Silica C 18 na reverzní fázi, ae) eluát z předchozího kroku se podrobí gelové permeační chromatografii.15
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se eluce z kolony DEAE-Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii provádí v pufru s fosfátem sodným při pH 8.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se eluce z kolony Q-Sepharosy pro iontově výměnnou chromatografii provádí v pufru s octanem amonným při pH 7,5.
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se krok (c) vysoce účinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi provádí za použití soustavy 2-propanol/octan amonný jako mobilní fáze.25
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se krok (d) vysoce účinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi provádí za použití soustavy 2-propanol/Tris-HCl jako mobilní fáze.
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že luteinizaěním hormonem je lidsko ký luteinizační hormon.
- 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzorkem je živné prostředí pro pěstování buněk CHO.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00103692 | 2000-02-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022856A3 CZ20022856A3 (cs) | 2003-01-15 |
| CZ303274B6 true CZ303274B6 (cs) | 2012-07-11 |
Family
ID=8167926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022856A CZ303274B6 (cs) | 2000-02-22 | 2001-01-22 | Zpusob vycištení luteinizacního hormonu |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7053054B2 (cs) |
| EP (2) | EP1777231A3 (cs) |
| JP (1) | JP4959898B2 (cs) |
| KR (1) | KR100808149B1 (cs) |
| CN (1) | CN100480258C (cs) |
| AT (1) | ATE356138T1 (cs) |
| AU (1) | AU780377B2 (cs) |
| BG (1) | BG65761B1 (cs) |
| BR (2) | BR122012018280B8 (cs) |
| CA (1) | CA2399100C (cs) |
| CY (1) | CY1108056T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ303274B6 (cs) |
| DE (1) | DE60127100T2 (cs) |
| DK (1) | DK1261622T3 (cs) |
| EA (1) | EA004385B1 (cs) |
| EE (1) | EE04932B1 (cs) |
| ES (1) | ES2278722T3 (cs) |
| HR (1) | HRP20020651B1 (cs) |
| HU (1) | HU227007B1 (cs) |
| IL (2) | IL151309A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02007867A (cs) |
| NO (1) | NO328693B1 (cs) |
| PL (1) | PL207728B1 (cs) |
| PT (1) | PT1261622E (cs) |
| RS (1) | RS50416B (cs) |
| SI (1) | SI1261622T1 (cs) |
| SK (1) | SK287041B6 (cs) |
| UA (2) | UA78676C2 (cs) |
| WO (1) | WO2001062774A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200206108B (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE356138T1 (de) * | 2000-02-22 | 2007-03-15 | Applied Research Systems | Gereinigtes recombinantes hlh mit spezifischer bioaktivität und verfahren zu dessen reinigung |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| US10105417B2 (en) | 2003-03-04 | 2018-10-23 | Aspenbio Pharma, Inc. | Methods and kits for maintaining pregnancy, treating follicular cysts, and synchronizing ovulation using luteinizing hormone |
| CN1283792C (zh) * | 2003-11-14 | 2006-11-08 | 余伟明 | 生物大分子组分相分离法 |
| DE602004023757D1 (de) * | 2003-12-22 | 2009-12-03 | Ares Trading Sa | Methode zur reinigung von fsh |
| WO2006041945A2 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Novetide, Ltd. | A counterion exchange process for peptides |
| HRP20080464T3 (en) * | 2004-11-09 | 2008-10-31 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh |
| AU2005335900B2 (en) * | 2005-08-26 | 2012-03-29 | Ares Trading S.A. | Process for the preparation of glycosylated interferon beta |
| CA2625978A1 (en) | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Ares Trading S.A. | Method for purifying fsh or a fsh mutant |
| CA2702448A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Method for purifying fc-fusion proteins |
| US20100256337A1 (en) * | 2007-10-22 | 2010-10-07 | Merck Serono Sa | Method for purifying an fc-containing protein |
| CN101928342B (zh) * | 2009-06-18 | 2013-05-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途 |
| US10400019B2 (en) * | 2014-05-01 | 2019-09-03 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Keratin nanomaterials and methods of production |
| CN104569441B (zh) * | 2015-01-19 | 2016-02-03 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 |
| EP3969026A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-03-23 | Ceva Santé Animale | Compositions and methods for increasing reproduction performance in non human mammals using recombinant luteinizing hormone |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990002757A1 (en) * | 1988-09-02 | 1990-03-22 | Integrated Genetics, Inc. | Heteropolymeric protein |
| WO1993011788A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Gonadotropin containing pharmaceutical compositions with sucrose stabilizer |
| EP1261622A2 (en) * | 2000-02-22 | 2002-12-04 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Purified lh |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69029799T2 (de) * | 1989-02-21 | 1997-05-28 | Washington University, St. Louis, Mo. | Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen |
| US5087615A (en) * | 1989-03-17 | 1992-02-11 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Novel method of ovulation induction in humans |
| IT1287138B1 (it) * | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
| TW518235B (en) * | 1997-01-15 | 2003-01-21 | Akzo Nobel Nv | A gonadotropin-containing pharmaceutical composition with improved stability on prolong storage |
| CA2293731C (en) * | 1997-06-25 | 2010-01-12 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Disulfide cross-linking glycoprotein hormone analogs, and their preparation and use |
-
2001
- 2001-01-22 AT AT01907476T patent/ATE356138T1/de active
- 2001-01-22 HR HR20020651A patent/HRP20020651B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 JP JP2001562555A patent/JP4959898B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 KR KR1020027010624A patent/KR100808149B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 EP EP06016629A patent/EP1777231A3/en not_active Withdrawn
- 2001-01-22 MX MXPA02007867A patent/MXPA02007867A/es active IP Right Grant
- 2001-01-22 SK SK1205-2002A patent/SK287041B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 DK DK01907476T patent/DK1261622T3/da active
- 2001-01-22 CA CA2399100A patent/CA2399100C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 EA EA200200893A patent/EA004385B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 CZ CZ20022856A patent/CZ303274B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 SI SI200130709T patent/SI1261622T1/sl unknown
- 2001-01-22 CN CNB018053645A patent/CN100480258C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 HU HU0301814A patent/HU227007B1/hu unknown
- 2001-01-22 WO PCT/EP2001/000666 patent/WO2001062774A2/en active IP Right Grant
- 2001-01-22 IL IL15130901A patent/IL151309A0/xx unknown
- 2001-01-22 DE DE60127100T patent/DE60127100T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 PL PL362891A patent/PL207728B1/pl unknown
- 2001-01-22 BR BR122012018280A patent/BR122012018280B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 UA UA2002086889A patent/UA78676C2/xx unknown
- 2001-01-22 EE EEP200200464A patent/EE04932B1/xx unknown
- 2001-01-22 UA UAA200612399A patent/UA92145C2/uk unknown
- 2001-01-22 EP EP01907476A patent/EP1261622B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 US US10/204,554 patent/US7053054B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 ES ES01907476T patent/ES2278722T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 RS YUP-603/02A patent/RS50416B/sr unknown
- 2001-01-22 AU AU35436/01A patent/AU780377B2/en not_active Expired
- 2001-01-22 BR BRPI0108553A patent/BRPI0108553B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 PT PT01907476T patent/PT1261622E/pt unknown
-
2002
- 2002-07-31 ZA ZA200206108A patent/ZA200206108B/en unknown
- 2002-08-14 BG BG107001A patent/BG65761B1/bg unknown
- 2002-08-18 IL IL151309A patent/IL151309A/en active IP Right Grant
- 2002-08-20 NO NO20023963A patent/NO328693B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-11-28 US US11/287,341 patent/US20060079460A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-05-10 CY CY20071100638T patent/CY1108056T1/el unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990002757A1 (en) * | 1988-09-02 | 1990-03-22 | Integrated Genetics, Inc. | Heteropolymeric protein |
| WO1993011788A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Gonadotropin containing pharmaceutical compositions with sucrose stabilizer |
| EP1261622A2 (en) * | 2000-02-22 | 2002-12-04 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Purified lh |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chlenov a kol. (1993) J. Chromatogr. A 631, 261-267 * |
| Stanton a kol. (1993) J. Endocrinol. 138, 529-543 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ303274B6 (cs) | Zpusob vycištení luteinizacního hormonu | |
| AU2006200059A1 (en) | Process of purification of HCG and recombinant HCG purified by that method | |
| HK1052014B (en) | Purified lh | |
| HK1052016B (en) | Process of purification of hcg |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210122 |