NO328693B1 - Fremgangsmate for rensing av LH fra en prove, rekombinant LH med spesifikk aktivitet, anvendelse av rekombinant LH i fremstilling av medikamenter og farmasoytiske preparater omfattende rekombinante LH. - Google Patents
Fremgangsmate for rensing av LH fra en prove, rekombinant LH med spesifikk aktivitet, anvendelse av rekombinant LH i fremstilling av medikamenter og farmasoytiske preparater omfattende rekombinante LH. Download PDFInfo
- Publication number
- NO328693B1 NO328693B1 NO20023963A NO20023963A NO328693B1 NO 328693 B1 NO328693 B1 NO 328693B1 NO 20023963 A NO20023963 A NO 20023963A NO 20023963 A NO20023963 A NO 20023963A NO 328693 B1 NO328693 B1 NO 328693B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- recombinant
- phase hplc
- column
- exchange chromatography
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 title description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 17
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 17
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 13
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims 1
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims 1
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 abstract description 57
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 abstract description 57
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 abstract description 57
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 15
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 12
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 11
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 11
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 11
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 8
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 8
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 4
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 4
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 4
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 4
- 108010057021 Menotropins Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- -1 anionic oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- NOJOIAIHUITBDB-UHFFFAOYSA-N azanium;propan-2-ol;acetate Chemical compound [NH4+].CC(C)O.CC([O-])=O NOJOIAIHUITBDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000003204 ejaculatory duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
- A61P5/34—Gestagens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Semiconductor Lasers (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av
Luteiniserende hormon (LH) fra en prøve, og som innbefatter en kombinert anvendelse av ionebytterkromatografi med et anionbytterharpiks og reversfase HPLC. Oppfinnelsen gjelder også rekombinant LH med spesifikk aktivitet, anvendelse av rekombinante LH i fremstilling av medikamenter og farmasøytiske preparater omfattende rekombinante LH.
Luteiniserende hormon (LH) er et gonadotropin som skilles ut av hypofyseforlappen sammen med et annet gonadotropin, det follikkel-stimulerende hormonet (FSH). Disse hormonene er heterodimerer som består av ikke-kovalent bundne a og P underenheter.
Disse gonadotropinene stimulerer den normale funksjonen av gonadene og utskillelsen av kjønnshormoner både hos menn og kvinner. Hos kvinner vil det follikkelstimulerende hormonet stimulere utviklingen og modningen av folliklene og eggene. Etter hvert som follikkelen utvikler seg vil den produsere østrogen i økende mengder som midt i menstruasjons syklusen vil stimulere frigjøringen av LH. Dette gjør at follikkelen brister med eggløsning og omdanner follikkelen til corpus luteum som utskiller progesteron. Hos menn vil det luteiniserende hormonet stimulere de interstitiale cellene i testiklene til å utskille testosteron, som så igjen har en direkte effekt på de sædførende kanalene. Gonadotrofiske stoffer med luteiniserende eller follikkelstimulerende aktivitet eller begge, blir brukt ved behandlingen av manglende fertilitet, i alt vesentlig hos kvinner, men også hos menn. Slike stoffer innbefatter korionisk gonadotropin som har LH-aktivitet og humane menopausale gonodotropiner som har både LH- og FSH-aktivitet. Et rekombinant DNA-avledet humant luteiniserende hormon (rechLH) er blitt undersøkt som et alternativ til koreonisk gonadotropin, eller for administrering sammen med FSH.
Det har vært brukt forskjellige fremgangsmåter for å isolere og rense LH, f.eks. ioneutbytning, gelfiltrering og immunoaffinitetskromatografi (Jack, G. W., Blazek, R., James, K., Boyd, J.E. & Micklem, L.R. The automated production by immunoaffinity chromography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and luttropin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987).
Ionebytterkromatografi er blitt brukt for isoleringen av disse hormonene, men denne fremgangsmåten har imidlertid flere interrelaterte problemer som har sin årsak i en betydelig ladningsheterogenitet på LH i hypofysevevet. Fordi disse glykoproteinene og FSH har overlappende ladninger, så er deres fullstendige separasjon meget vanskelig og arbeidskrevende å oppnå. Videre vil rensingen av disse hormonene som enkeltfraksjoner være vanskelig (Stockell Hartree, A., Thomas, M., Furnival, B.E., Burns, T.W. & Langley, P. Thyroid-stimulating and lipolytic activities of purified preparations of human thyroid-stimulating hormone. Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972). Som et resultat av dette vil disse ladede former av hormonet kunne velges ut under rensingen, noe som har vært foreslått i forbindelse med LH (Storring, P.L. Zaidi, A.A., Mistry, Y.G. Lindberg, M., Stenning, B.E. & Diczfalusy, E.A. comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: differences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays, in vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339-347, 1982). Selektiv rensing vil ytterligere komplisere karakteriseringen av disse heterogene formene, dette innbefatter blant annet strukturanalysen av deres karbohydratkomponenter. Variasjonen i innholdet av anioniske oligosakkarider som inneholder sialyl og sulfatgrupper, kan være hovedårsaken til den ladningsheterogenitet som observeres i LH.
Vanlige fraksjoneringsmetoder er blitt beskrevet for fremstillingen av humant luteiniserende hormon fra urin (LH) med en styrke på 982 i.u./mg, ved hjelp av biologiske prøver og 1166 i.u. med en radioimmunologisk prøve (Donini S. & Donini P. Acta endocr., Copenh. 63, Suppl. 142, 257-277, 1969). Et immunoabsorpsjonsmiddel av kanin antiserum til renset humant korionisk gonadotropin (HCG) ble brukt for å rense LH fra hovedfraksjonen og sidefraksjonene som ble oppnådd under fremstillingen av follikkelstimulerende hormon (FSH) fra menopausal urin (van Hell, H., Schuurs A.H.W.M. & den Hollander, F.C., In Symposium on gonadotrophins, New York, 17 June 1971. Eds B.B. Saxena, C.G. Beling & H.M. Gandy. New York: John Wiley & Son, Inc., 1972). Det fremstilte preparatet hadde høyere LH-styrke, men også høyere FSH:LH forhold enn det som var fremstilt av Donini & Donini (1969).
Teknikkens stand er også beskrevet i WO 9002757, WO 9820039, J. Evangelista Dyr and J. Suttnar, "Separation and purification of recombinant proteins", J. Chromatography B, Vol.699,1997, s.383-401 og i K.A. Barnthouse et al., "Cation-exchange displacement chromatography for purification of recombinant protein therapeutics from variants", J. Biotechnol., Vol.66,1998, s.125-136.
Rekombinant LH har den fordelen at det ikke inneholder andre gonadotropinhormoner, såsom FSH og TSH. Det urene preparatet av rekombinant LH inneholder imidlertid mange andre proteiner og forurensninger fra den eller de celler som er brukt under dets rekombinante produksjon, og en fremgangsmåte for å oppnå en absolutt renhet på det rekombinante luteiniserende hormonet, er følgelig sterkt ønskelig.
En har nå funnet at et urent preparat av LH, fremstilt eller avledet av en prøve fra dyrkningsmediet oppnådd etter den rekombinante prosessen, eller fra et urent konsentrat av post-menopausal urin, kan renses i så høy grad, at det resulterende LH praktisk talt er fritt for proteiner og/eller andre forurensninger som var tilstede i det urene LH-preparatet. Avhengig av utgangsmaterialet så kan proteinene og alle forurensningene være av human opprinnelse (utgangsmaterialet: humane menopausale gonadotropiner), eller kan stamme fra vertscellene, f.eks. CHO, hvis f.eks. CHO-vertsceller har vært anvendt.
Renseprosessen er basert på bruken av ionebytterkromatografi og reversfase HPLC. En eventuell ytterligere anvendelse av en gelpermeabilitetskolonne gjør det mulig å fjerne eventuelle gjenværende spor av forurensninger fra det rene LH-preparatet. Det oppnås optimale resultater når det anvendes to trinn med ionebytterkromatografi og to trinn med reversfase HPLC.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for rensingen av rekombinant LH ved å starte ut med en prøve fra et dyrkningsmedium oppnådd etter en rekombinant prosess, slik at det resulterende, svært rene LH er praktisk talt fritt, f.eks. fra FBS-proteiner som ofte forefinnes i dyrkningsmediet, nukleinsyrer eller andre forurensninger som måtte være tilstede i de vertsceller, som brukes i den rekombinante prosessen.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes såvel som for rensingen av LH fra urin ved å starte ut med et urent konsentrat av post-menopausal urin, som for rensingen av LH fra andre arter, da spesielt pattedyr, f.eks. storfe, hest, svin, sau, rotte, mus og ape.
Det er derfor en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for rensing av LH fra en prøve, som innbefatter en kombinert anvendelse av ionebytterkromatografi og reversfase HPLC. Fremgangsmåten innbefatter trinn hvor prøven (eventuelt konsentrert) underkastes ionebytterkromatografi, hvoretter eluatet underkastes reversfase HPLC. Det kan eventuelt utføres et ytterligere trinn ved at eluatet påsettes en gelpermeabilitetskolonne.
Avhengig av renheten på utgangspreparatet kan ionebytterkromatografien og den reverse fase HPLC utføres to ganger, for å oppnå optimale resultater fra renseprosessen. En slik prosess eller fremgangsmåte kan innbefatte følgende trinn: (a) eluering av prøven gjennom en DEAE Sepharose
ionebytterkromatografikolonne; (b) eluering gjennom en Q-Sepharose ionebytterkromatografikolonne; (c) eluering gjennom en Silica Cl8 reversfase HPLC-kolonne; (d) igjen eluering gjennom en Silica Cl8 reversfase HPLC-kolonne (eventuelt med et annet elueringsmiddel enn det som har vært brukt i trinn (c)); og
(e) eluering gjennom en gelpermeabilitetskolonne.
I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen blir elueringen gjennom DEAE Sepharose ionebytterkolonnen utført i en natriumfosfatbuffer ved pH 8.
Elueringen gjennom Q-Sepharose ionebytterkolonnen blir fortrinnsvis utført i ammoniumacetatbuffer ved pH 7,5.
Det reverse fase HPLC-trinnet (c) blir fortrinnsvis utført med 2-propanol/ammoniumacetat som mobil fase.
Det reverse fase HPLC-trinnet (d) blir fortrinnsvis utført med 2-propanol/tris-HCl som mobil fase.
LH-preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis humant LH, og mest foretrukket rekombinant humant LH avledet eller fremstilt fra det dyrkningsmdium for pattedyrceller (fortrinnsvis CHO-celler) som ble brukt i den rekombinante prosessen.
Det er videre en hensikt med foreliggende oppfinnelse tilveiebringe et farmasøytisk preparat eller sammensetning som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av det rekombinante LH på fremstilt ved hjelp av den rekombinante prosess som er beskrevet ovenfor, sammen med egnede fortynningsmidler, f.eks. sukrose, som er nødvendig for å stabilisere det frysetørkede produktet. Den farmasøytiske sammensetningen eller preparatet av rekombinant LH, er spesielt godt egnet for subkutan administrering.
Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for rensningen av LH, da spesielt rensingen av rekombinant LH fra et urent preparat fra dyrkningsmediet i en rekombinant prosess, r-hLH blir fremstilt med høy renhetsgrad og høy spesifikk aktivitet, praktisk talt fritt for føtalt bovint serum (FBS) proteiner hvis disse er tilstede i dyrkningsmediet, og fra nukleinsyrer eller andre forurensninger som er tilstede i de vertsceller, som er brukt i den rekombinante prosessen.
Oppfinnelsen kan anvendes på biologiske materialer og prøver, da spesielt urene blandinger som inneholder LH og andre forurensende proteiner, og disse prøvene vil her bli betegnet som startprøver. De eksempler som er detaljert beskrevet i det etterfølgende, bruker startprøver som inneholder r-hLH, oppnådd fra dyrkningssupernatantmediet fra en bioreaktor. Alternativt er prøven humant menopausalt gonadotropin (hMG), eller et urent konsentrat av post-menopausal urin.
Prøven består av nylig innsamlet celledyrkningskultur supernatant medium som har vært fremstilt i en bioreaktor. Prøven er fortrinnsvis klaret ved filtrering. Den urene løsningen kan så konsentreres hvis dette er nødvendig og underkastes ultrafiltrering for å fjerne materialer og forbindelser med molekylvekter lavere enn 10.
Ultrafiltreringen gjør det også mulig å skifte bufferen til natriumfosfat, pH 8.
Etter disse preliminære trinnene blir prøven så underkastet ionebytterkromatografi og reversfase HPLC, som fortrinnsvis begge to blir utført to ganger. Det første ionebyttertrinnet blir fortrinnsvis utført med DEAE-Sepharose. Dette er i alt vesentlig et LH "gjennomstrømnings"trinn, hvor størsteparten av ikke-LH proteinene blir eliminert. Det andre ionebyttertrinnet blir fortrinnsvis utført med en Q-Sepharosekolonne. Dette er også et LH "gjennomstrømnings"trinn, og er utformet slik at det fjerner eventuell DNA og forurensninger fra vertscellen og proteiner fra mediet. I en foretrukken utførelse blir dette trinnet utført ved ca. 5 °C og eluering med ammoniumacetatbuffer ved pH 7,5.
Reversfasekromatografi på Silica Cl8 blir også fortrinnsvis utført to ganger og er meget effektivt for å fjerne spormengde av FBS, celleproteiner og endotoksinforurensninger. Det første HPLC-trinnet blir fortrinnsvis utført med 2-propanol/ammoniumacetat som den mobile fasen. Det andre reverse fase HPLC-trinnet blir fortrinnsvis utført ved å bruke 2-propanol/tris-HCl som den mobile fasen. Retentatløsningen blir så konsentrert og kan innvinnes med ammoniumhydrogenkarbonat pH 8. Det konsentrerte produktet blir så fortrinnsvis underkastet gelpermeabilitetskromatografi på Sephacryl Sl00 HR. I dette trinnet er separasjonen basert på molekyl vekt, og oppnås ved eluering med ammoniumhydrogenkarbonat pH 8, hvoretter eluatet så underkastes en filtrering for å fjerne virusforurensninger, deretter en ultrafiltrering på membraner med 10 kD grense i en natriumfosfatbuffer pH 8. Etter filtrering blir den rensede LH-masseløsningen fortrinnsvis lagret i sterile flasker ved lav temperatur.
Oppfinnelsen gjelder således en fremgangsmåte for rensing av LH fra en prøve, som er kjennetegnet ved at den omfatter anvendelsen av ionebytterkromatografi med et anionbytterharpiks og reversfase-HPLC.
Videre vedrører oppfinnelsen rekombinant LH, som er kjennetegnet ved at den har en spesifikk biologisk aktivitet på fra 20522 til 31229 IU/mg.
Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av rekombinant LH ifølge oppfinnelsen i fremstillingen av et medikament til behandling av en fertilitetsforstyrrelse.
Endelig gjelder oppfinnelsen et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av rekombinant LH ifølge oppfinnelsen, og passende eksipienser derav.
EKSEMPEL 1
Reagenser
Iseddik, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)
Ammoniumacetat, analytisk kvalitet
Ammoniumhydrogenkarbonat, analytisk kvalitet (B.P.) Dibasisk natriumfosfat, analytisk kvalitet
Saltsyre, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)
Fosforsyre, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)
2-propanol, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)
Natriumklorid, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)
Monobasisk natriumfosfat, analytisk kvalitet Natriumhydroksidpellets, analytisk kvalitet (Ph.Eur.) Trifluoreddiksyre (TFA), HPLC-kvalitet Tris-(hydroksymetyl) aminometan, analytisk kvalitet
Vann for injeksjon (WFI) (Ph.Eur.)
Prosessdiagram som viser rensemetoden i sammendrag Tabell 1 er et prosessdiagram som viser r-hLH renseprosessen i sammendrag, og angir driftsprinsippene for hver av de mellomliggende trinnene. Klaring, konsentrasjon, dialyse og filtrering av innhøstede prøver (trinn I) I dette trinnet (trinn I) blir bufferen forandret til en med kontrollert sammensetning og det oppnås en preliminær konsentrasjon. Dette trinnet utføres ved ca. +5 °C og gjentas individuelt for hver innhøstet prøve under produksjonssyklusen i bioreaktoren. Et foretrukket temperaturområde er 5+3 °C.
(i) Klaring av innhøstede prøver
Ved mottagelse av nylig oppsamlet dyrkningsmedium fra en bioreaktor, blir prøven fortrinnsvis bearbeidet ved å starte med en klaring av supernatantløsningen ved filtrering.
(ii) Konsentrasjon/dialyse av innhøstede prøver
Membranene, som lagres i 05 M natriumhydroksid mellom porsjonene, vaskes med WFI inntil pH har sunket til ca. 8.
Vannet erstattes med ekvilibreringsbuffere, 0,025 M natriumfosfat, pH 8. Så snart dette er utført blir den urene r-hLH-løsningen fra bioreaktoren konsentrert og dialysert for å fjerne materialer og forbindelser med molekylvekter lavere enn 10 kD (membrangrense 10 kD).
Det resulterende konsentratet blir lagret ved ca. -15 °C.
Ionebytterkromatografi på DEAE Sepharose CL-6B (trinn II)
Dette kromatograferingstrinnet er et r-hLH "gjennomstrømnings"trinn, hvor størstedelen av de ikke-r-hLH proteinene blir eliminert, og løsningen blir ytterligere konsentrert og dialysert. Kromatografitrinnene hvor produktet føres gjennom kolonnen, utføres i et kaldt rom.
(i) Ionebytterkromatografi på DEAE Sepharose CL-6B
Kolonnen blir pakket med en svakt ladet anionbytterharpiks, dietylaminoetan (DEAE) sefarose som i første tilfelle blir ekvilibrert med 0,15 M natriumfosfat pH 8. Et foretrukket pH-område er 8+0,3.
Kolonnen blir så behandlet med strømmende buffer, 0,025 M natriumfosfat pH 8. Et foretrukket pH-område er 8+0,3.
r-hLH-løsningen blir påsatt kolonnen gjennom et filtreringsapparat som er plassert på kolonnen som en sikkerhetsforanstaltning.
Kolonnen blir tilført 0,025 M natriumfosfat pH 8. Et foretrukket pH-område er 8+0,3. Kromatografiprosessen blir kontrollert ved spektrofotometri ved 280 nm.
Den første effluenten eller den utstrømmende væsken blir kastet inntil basislinjen passerer 5 % merket for absorpsjon.
Den ubundne fraksjonen som inneholder r-hLH blir oppsamlet inntil basislinjen har sunket til 10 %.
(ii) Ultrafiltrering
Et ultrafiltreringsapparat utstyrt med en 100 kD grensemembran, lagret i NaOH 0,05 M, blir vasket med WFI inntil pH på permeatet er ca. 8.
Vannet erstattes med ekvilibreringsbufferen, 0,08 M ammoniumacetat pH 7,5. Et foretrukket pH-område er 7,5+0,3.
r-hLH-løsningen fra ionebytterkromatografi trinnet blir ultrafiltrert gjennom nevnte 100 kD membran og permeatfraksjonen blir så oppsamlet.
Ultrafilteret ble vasket med porsjoner av 0,08 M ammoniumacetat pH 7,5, og alle vaskefraksj onene ble slått sammen med permeatløsningen.
(iii) Konsentrasjon/dialyse
En ultrafiltreringsanordning utstyrt med en 10 kD grensemembran, lagret i 0,05 M NaOH, ble vasket med WFI inntil pH på permeatfraksjonen var ca. 8. Vannet ble så erstattet med ekvilibreringsbufferen, 0,08 M ammoniumacetat pH 7,5.
r-hLH-løsningen ble konsentrert. Ammoniumacetat 0,08 M pH 7,5 ble tilsatt retentatet og løsningen ble konsentrert. Denne dialysen ble fortsatt inntil pH og ledningsevnen for retentatet var den samme som for den innkommende bufferen. Det resulterende retentatet ble så innlemmet.
Ionebytterkromatografi på Q Sepharose Fast Flow (trinn III)
Dette trinnet er også en r-hLH "gjennomstrømnings"trinn og er utformet for å fjerne mulig DNA og proteinforurensninger fra vertscellene eller mediet.
(i) Kolonneekvilibrering
Kondisjonering av kolonnen ble utført med strømmende buffer, 0,08 M ammoniumacetatbuffer pH 7,5. Et foretrukket pH-område er 7,5+0,3.
(ii) r-hLH rensetrinn på Q-Sepharose FF
r-hLH-løsningen ble påsatt gjennom et filterapparat som var plassert på Q sefarosekolonnen som en sikkerhetsforanstaltning.
Kolonnen ble videre vasket med 0,08 M ammoniumacetat pH 7,5.
Den første effluenten ble kastet inntil basislinjen passerer 5 % absorpsjonsmerket.
Den ubundne fraksjonen som inneholdt r-hLH ble oppsamlet inntil basislinjen var sunket til 10 %.
r-hLH-løsningen fra trinn III kan lagres frosset inntil den skal brukes. Hvis den lagres ved en temperatur ved -15 °C eller lavere, så vil r-hLH-mellomproduktet bli opptint ved +5+3 °C, vanligvis over en periode på 24+8 timer før den behandles med reversfase HPLC (trinn IV).
Første preparative reverse fase HPLC (trinn IV)
Dette trinnet som utføres ved romtemperatur, vil effektivt fjerne spormengder av FBS/CHO-proteiner og endotoksinforurensninger.
(i) Kolonnepakking og harpiksaktivering
Kolonnen ble pakket med Cl8 storporet silika, og hvis den er ny, ble Cl8 harpiksen kondisjonert med 2-propanol.
(ii) Kolonneekvilibrering
Kolonnen ble ekvilibrert med 12,4 % vekt/vekt 2-propanol i 0,05 M ammoniumacetat buffer, pH 7. Et foretrukket pH-område er 7+0,2.
(iii) pH og volumjusteringen av r-hLH-løsningen fra trinn III
r-hLH-løsningen ble justert til pH 7 med konsentrert eddiksyre. Et foretrukket pH-område er 7+0,2.
Volumet på r-hLH-løsningen ble så justert ved å tilsette 2-propanol til en sluttkonsentrasjon av 2-propanol som tilsvarte 12,4 % vekt/vekt.
(iv) Filtrering av justert r-hLH-løsning
Filtreringsapparatet utstyrt med et 0,22 u.m filter ble vasket med 12,4 % vekt/vekt 2-propanol i 0,05 M ammoniumacetatbuffer pH 7. Et foretrukket pH-område er 7+0,2.
Filtrering av justert r-hLH-løsning
Kolonnen ble vasket med torsjoner av 12,4 % vekt/vekt 2-propanol i 0,05 M ammoniumacetatbuffer, pH 7, filtrert og hvoretter vaskeløsningen ble slått sammen med r-hLH-løsningen. Et foretrukket pH-område er 7+0,2.
(v) r-hLH-rensetrinn på den første C18 RP-HPLC-kolonnen
r-hLH-løsningen ble påsatt kolonnen, og kromatografien ble kontrollert ved hjelp av UV-spektrofotometri ved 280 nm.
Kolonnen ble tilført 12,4 % vekt/vekt 2-propanol i 0,05 M ammoniumacetatbuffer pH 7 inntil A280 var tilbake til basislinjen, hvoretter den ubundne fraksjonen ble kastet.
Eluering av r-hLH ble deretter utført med en 2-propanol-ammoniumacetat 0,05 M løsning som en mobil fase over en lineær gradient fra 14,7 % til 20,7 % vekt/vekt 2-propanol.
r-hLH ble fraksjonert når A28oStarter å øke. Alle fraksjoner av r-hLH-toppen hvis høyder var større enn 20 % av full skala, ble slått sammen.
Andre preparative reversfase HPLC-kolonne (trinn V)
Dette trinnet som utføres ved romtemperatur, vil effektivt fjerne spormengder av FBS/CHO-proteiner og endotoksinforurensninger.
(i) Kolonnepakking og harpiksaktivering
Kolonnen ble pakket med Cl8 storporet silika, og hvis den er ny, så ble Cl8 harpiksen kondisjonert med 2-propanol.
(ii) Kolonneekvilibrering
Kolonnen ble ekvilibrert i 14,7 % vekt/vekt 2-propanol i 0,5 M tris-HCl buffer, pH 7. Et foretrukket pH-område er 7+0,2.
(iii) Volum og pH-justeringer på r-hLH-løsningen fra trinn IV
2 M tris-HCl-buffer pH 7 ble tilsatt r-hLH-prøven for å bringe 2-propanol konsentrasjonen ned til omtrent den samme som i kolonneekvilibreringsbufferen (14,7% vekt/vekt).
r-hLH-løsning ble justert til pH 7 med HC1 12 M. Et foretrukket pH-område er 7+0,2.
r-hLH-rensetrinn på den andre C18 RP-HPLC-kolonnen.
r-hLH-løsningen ble påsatt kolonnen, og kromatogratien ble kontrollert ved hjelp av UV-spektrofotometri ved 280 nm.
Kolonnen ble tilsatt 14,7 vekt/vekt 2-propanol i 0,15 molar tris-HCl-buffer pH 7. Et foretrukket pH-område er 7+0,2. Den ubundne fraksjonen ble kastet.
Eluering av r-hLH ble deretter utført med 2-propanol/0,5 M tris-HCl som mobil fase over en lineær gradient fra 14,7 % til 20,7 % vekt/vekt av 2-propanol.
r-hLH-produktet ble fraksjonert når A280 starter å øke. Alle fraksjoner av r-hLH-toppen hvis høyder var større enn 20 % av full skala, ble slått sammen.
(v) Dialyse
r-hLH-løsningen fra det andre Cl8 RP-HPLC trinnet ble fortynnet med WFI. Det ble fortrinnsvis brukt 8 volumer WFI.
Den fortynnede r-hLH-løsningen ble dialysert med ultrafiltrering på en 10 kD membran (se side 7, VI) mot WFI. Porsjoner av 0,5 M ammoniumhydrogenkarbonat pH 8 ble deretter tilsatt, og dialysen ble fortsatt inntil egenskapene for ammoniumhydrogenkarbonat ble oppfylt.
Retentatløsningen ble konsentrert til et sluttvolum på ca. 1 1 og så innvunnet. Ultrafilteret ble vasket med 0,5 M ammoniumhydrogenkarbonat pH 8, og vaskeløsningen etter ultrafiltreringen ble slått sammen med retentatet og ytterligere konsentrert. Den endelige konsentrasjonen er avhengig av størrelsen på den kolonnen som blir brukt i det neste trinnet, dvs. trinn VI.
Gelpermiteringskromatografi på Sephacryl S100 HR og ultrafiltrering (trinn
VI)
I dette trinnet blir det utført en separasjon basert på molekylstørrelse, og løsningen underkastes ultrafiltrering. Alle operasjoner i dette trinnet ble utført ved ca. +5°C. Et foretrukket temperaturområde er +5°C+3.
(i) Gelpermiteringskromatografi på Sephacryl Sl00 HR
Kolonnen ble pakket med Sephacryl Sl00 HR og ekvilibrert i første omgang med
WFI.
Kolonnen ble så ekvilibrert med 0,5 M ammoniumhydrogenkarbonat pH 8.
Kolonnen ble så tilsatt 0,5 M ammoniumhydrogenkarbonat pH 8. Den kromatografiske prosessen ble kontrollert ved hjelp av spektrofotometri ved 280 nm.
r-hLH ble fraksjonert når A280 starter å øke. Alle fraksjoner av r-hLH-toppen hvis høyde var større enn 20 % av full skala, ble slått sammen.
r-hLH-løsningen eluert fra Sephacryl Sl00 HR kolonnen, blir så fortrinnsvis filtrert, f.eks. gjennom Virosolve™, for å fjerne virusforurensningen.
(ii) Dialyse og konsentrasjon av r-hLH
Membranene (ultrafiltreringsmembraner 10 kD) lagret i 0,05 M natriumhydroksid mellom de enkelte rensinger, ble vasket med WFI inntil pH var sunket til ca. 8.
Den fortynnede r-hLH-løsningen ble så dialysert (ved ultrafiltreringsmembraner 10 kD) mot WFI. Porsjoner av 0,01 M natriumfosfatbuffer pH 8 ble så tilsatt, og dialysen ble fortsatt inntil egenskapene for natriumfosfatbufferen var oppfylt.
Hvis nødvendig kan retentatløsningen konsentreres til et sluttvolum på ca. 500 ml og blir så innvunnet. Ultrafilteret ble vasket med 0,01 M natriumfosfatbuffer pH 8, og ultrafiltervaskeløsningen blir så slått sammen med retentatet.
Et ytterligere eventuelt LH-konsentrasjonstrinn kan utføres avhengig av de betingelser som velges for lagringen.
r-hLH-løsningen blir filtrert, og filtratet oppsamlet i et sterilt kar.
Den rensede r-hLH-masseløsningen blir fortrinnsvis lagret i sterile flasker ved ca. -15°C.
Reagenser, buffere, elueringsmidler og kjemikalier
Kromatografiske harpikser
De følgende kromatografiske harpikser blir for tiden anvendt i renseprosessen. Tilsvarende harpikser kan også anvendes i renseprosessen.
Fabrikkantene er som følger:
Amersham Pharmacia Biotech,
Bjorkgatan 30
S-751 84 Uppsala Sverige
Waters Corporation
34 Maple Street
Milford, MA 01757 USA
RESULTATER
Biologisk aktivitet
Den biologiske aktiviteten på forskjellige porsjoner av r-LH etter rensingen ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte, er angitt i tabell 2. Proteinkonsentrasjonen (mg LH protein/ml) ble bestemt ved spektrofotometri ved 276,4 nm, ved å bruke den eksperimentelt bestemte absorpsjonsevnen, basert på en aminosyresekvensanalyse, a = 0,812.
Den midlere spesifikativiteten for r-LH-preparatet er spesielt høy, og er i middel ca. 25000 IU/mg (protein av LH).
Preparater
Frysetørkede preparater er blitt fremstilt med de høyrene rekombinante LH ifølge foreliggende oppfinnelse.
Som et typisk eksempel ble det fremstilt et frysetørket preparat med en styrke på 75 IU i ampuller DIN 2R, ved å bruke sukrose som fortynningsmiddel (tabell 3), og dette preparatet var stabilt ved 4°C i flere måneder.
Claims (17)
1. Fremgangsmåte for rensing av LH fra en prøve,
karakterisert ved at den omfatter anvendelsen av ionebytterkromatografi med et anionbytterharpiks og reversfase-HPLC.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) underkaste prøven ionebytterkromatografi for å fremstille et første eluat; (b) underkaste det første eluatet en reversfase-HPLC for å fremstille et andre eluat; og (c) underkaste det andre eluatet en gelpermeteringskromatografi.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at ionebytterkromatografien og reversfase-HPLC blir utført to ganger.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) eluere prøven gjennom en DEAE-Sepharose ionebytterkromatografikolonne, (b) eluere gjennom en Q-Sepharose ionebytterkromatografikolonne, (c) eluere gjennom en Silica Cl8 reversfase-HPLC-kolonne, (d) eluere ytterligere gjennom en Silica Cl8 reversfase-HPLC-kolonne og (e) eluere gjennom en gelgjennomtrengningsskolonne.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,
karakterisert ved at elueringen gjennom DEAE-Sepharose ionebytterkromatografien skjer ut i natriumfosfatbuffer ved pH 8..
6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 4,
karakterisert ved at elueringen gjennom Q-Sepharose ionebytterkromatografien blir utført i ammoniumacetatbuffer ved pH 7,5.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 4,
karakterisert ved at reversfase-HPLC i trinn (c) blir utført med 2-propanol/ammoniumacetat som mobilfase.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 4,
karakterisert ved at reversfase-HPLC i trinn (d) blir utført med 2-propanol/Tris-HCl som mobilfase.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at LH er human LH.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at prøven er et dyrkningsmedium fra CHO-celler.
11. Rekombinant LH,
karakterisert ved at den har en spesifikk biologisk aktivitet på fra 20522 til 31229 IU/mg.
12. Rekombinant LH ifølge krav 11,
karakterisert ved at den har en spesifikk biologisk aktivitet på omtrent 25000 IU/mg.
13. Anvendelse av rekombinant LH ifølge krav 11 eller 12 i fremstillingen av et medikament til behandling av en fertilitetsforstyrrelse.
14. Farmasøytisk preparat,
karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av rekombinant LH ifølge krav 11 eller 12, og passende eksipienser derav.
15. Farmasøytisk preparat ifølge krav 14,
karakterisert ved at eksipiensen er sukrose.
16. Farmasøytisk preparat ifølge krav 15,
karakterisert ved at det ytterligere omfatter Tween 20, dinatriumfosfatdihydrat og mononatriumfosfatmonohydrat.
17. Farmasøytisk preparat ifølge ethvert av kravene 14-16, karakterisert ved at det er til subkutan administrering.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00103692 | 2000-02-22 | ||
| PCT/EP2001/000666 WO2001062774A2 (en) | 2000-02-22 | 2001-01-22 | Purified lh |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20023963L NO20023963L (no) | 2002-08-20 |
| NO20023963D0 NO20023963D0 (no) | 2002-08-20 |
| NO328693B1 true NO328693B1 (no) | 2010-04-26 |
Family
ID=8167926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20023963A NO328693B1 (no) | 2000-02-22 | 2002-08-20 | Fremgangsmate for rensing av LH fra en prove, rekombinant LH med spesifikk aktivitet, anvendelse av rekombinant LH i fremstilling av medikamenter og farmasoytiske preparater omfattende rekombinante LH. |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7053054B2 (no) |
| EP (2) | EP1261622B1 (no) |
| JP (1) | JP4959898B2 (no) |
| KR (1) | KR100808149B1 (no) |
| CN (1) | CN100480258C (no) |
| AT (1) | ATE356138T1 (no) |
| AU (1) | AU780377B2 (no) |
| BG (1) | BG65761B1 (no) |
| BR (2) | BRPI0108553B8 (no) |
| CA (1) | CA2399100C (no) |
| CY (1) | CY1108056T1 (no) |
| CZ (1) | CZ303274B6 (no) |
| DE (1) | DE60127100T2 (no) |
| DK (1) | DK1261622T3 (no) |
| EA (1) | EA004385B1 (no) |
| EE (1) | EE04932B1 (no) |
| ES (1) | ES2278722T3 (no) |
| HK (1) | HK1052014A1 (no) |
| HR (1) | HRP20020651B1 (no) |
| HU (1) | HU227007B1 (no) |
| IL (2) | IL151309A0 (no) |
| MX (1) | MXPA02007867A (no) |
| NO (1) | NO328693B1 (no) |
| PL (1) | PL207728B1 (no) |
| PT (1) | PT1261622E (no) |
| RS (1) | RS50416B (no) |
| SI (1) | SI1261622T1 (no) |
| SK (1) | SK287041B6 (no) |
| UA (2) | UA78676C2 (no) |
| WO (1) | WO2001062774A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200206108B (no) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SK287041B6 (sk) * | 2000-02-22 | 2009-10-07 | Laboratoires Serono Sa | Spôsob čistenia luteinizačného hormónu - LH zo vzorky, rekombinantný hLH, jeho použitie a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| EP1610803B8 (en) | 2003-03-04 | 2011-09-14 | AspenBio Pharma, Inc. | LH for use in maintaining one or more pregnancies by inducing accessory corpus luteum formation. |
| CN1283792C (zh) * | 2003-11-14 | 2006-11-08 | 余伟明 | 生物大分子组分相分离法 |
| EA008924B1 (ru) * | 2003-12-22 | 2007-08-31 | Арес Трейдинг С.А. | Способ очистки фсг |
| US20060148699A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-07-06 | Avi Tovi | Counterion exchange process for peptides |
| MX2007005327A (es) * | 2004-11-09 | 2007-08-02 | Ares Trading Sa | Metodo para purificacion de la hormona foliculo estimulante (hfe). |
| SI1917276T1 (en) * | 2005-08-26 | 2018-05-31 | Ares Trading S.A. | PROCEDURE FOR PREPARATION OF GLYCOSYLATED INTERFERONE BETA |
| US8604175B2 (en) | 2005-12-09 | 2013-12-10 | Ares Trading S.A. | Method for purifying FSH or a FSH mutant |
| CA2702448A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Method for purifying fc-fusion proteins |
| EP2203465A1 (en) * | 2007-10-22 | 2010-07-07 | Merck Serono S.A. | Method for purifying an fc-containing protein |
| CN101928342B (zh) * | 2009-06-18 | 2013-05-08 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途 |
| CN106999546A (zh) * | 2014-05-01 | 2017-08-01 | 弗吉尼亚技术知识资产公司 | 角蛋白纳米材料及其制备方法 |
| CN104569441B (zh) * | 2015-01-19 | 2016-02-03 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用 |
| US20220143131A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-05-12 | Ceva Sante Animale | Compositions and Methods for increasing Reproduction Performance in Non Human Mammals Using Recombinant Luteinizing Hormone |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0394363A1 (en) * | 1988-09-02 | 1990-10-31 | Integrated Genetics, Inc. | Heteropolymeric protein |
| EP0461200B1 (en) * | 1989-02-21 | 1997-01-22 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
| US5087615A (en) * | 1989-03-17 | 1992-02-11 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Novel method of ovulation induction in humans |
| IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
| IT1287138B1 (it) | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
| IL122732A0 (en) * | 1997-01-15 | 1998-08-16 | Akzo Nobel Nv | Liquid gonadotropin-containing formulation its preparation and a device containing same |
| SI0996629T1 (sl) * | 1997-06-25 | 2006-12-31 | Applied Research Systems | Analogi glikoproteinskega hormona povezanega z disulfidi, priprava in uporaba |
| SK287041B6 (sk) * | 2000-02-22 | 2009-10-07 | Laboratoires Serono Sa | Spôsob čistenia luteinizačného hormónu - LH zo vzorky, rekombinantný hLH, jeho použitie a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom |
-
2001
- 2001-01-22 SK SK1205-2002A patent/SK287041B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 US US10/204,554 patent/US7053054B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 PT PT01907476T patent/PT1261622E/pt unknown
- 2001-01-22 UA UA2002086889A patent/UA78676C2/xx unknown
- 2001-01-22 AT AT01907476T patent/ATE356138T1/de active
- 2001-01-22 SI SI200130709T patent/SI1261622T1/sl unknown
- 2001-01-22 EP EP01907476A patent/EP1261622B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 DK DK01907476T patent/DK1261622T3/da active
- 2001-01-22 BR BRPI0108553A patent/BRPI0108553B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 DE DE60127100T patent/DE60127100T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 BR BR122012018280A patent/BR122012018280B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 HU HU0301814A patent/HU227007B1/hu unknown
- 2001-01-22 ES ES01907476T patent/ES2278722T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 CZ CZ20022856A patent/CZ303274B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 EP EP06016629A patent/EP1777231A3/en not_active Withdrawn
- 2001-01-22 CA CA2399100A patent/CA2399100C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-22 RS YUP-603/02A patent/RS50416B/sr unknown
- 2001-01-22 IL IL15130901A patent/IL151309A0/xx unknown
- 2001-01-22 KR KR1020027010624A patent/KR100808149B1/ko active IP Right Grant
- 2001-01-22 MX MXPA02007867A patent/MXPA02007867A/es active IP Right Grant
- 2001-01-22 EE EEP200200464A patent/EE04932B1/xx unknown
- 2001-01-22 JP JP2001562555A patent/JP4959898B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 PL PL362891A patent/PL207728B1/pl unknown
- 2001-01-22 UA UAA200612399A patent/UA92145C2/uk unknown
- 2001-01-22 EA EA200200893A patent/EA004385B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 AU AU35436/01A patent/AU780377B2/en not_active Expired
- 2001-01-22 CN CNB018053645A patent/CN100480258C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 WO PCT/EP2001/000666 patent/WO2001062774A2/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-07-31 ZA ZA200206108A patent/ZA200206108B/en unknown
- 2002-08-01 HR HR20020651A patent/HRP20020651B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-08-14 BG BG107001A patent/BG65761B1/bg unknown
- 2002-08-18 IL IL151309A patent/IL151309A/en active IP Right Grant
- 2002-08-20 NO NO20023963A patent/NO328693B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-13 HK HK03104225.6A patent/HK1052014A1/xx unknown
-
2005
- 2005-11-28 US US11/287,341 patent/US20060079460A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-05-10 CY CY20071100638T patent/CY1108056T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20060079460A1 (en) | Purified LH | |
| AU2006200059A1 (en) | Process of purification of HCG and recombinant HCG purified by that method | |
| CN110563832A (zh) | 一种高纯度重组促卵泡刺激素纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CREP | Change of representative |
Representative=s name: ONSAGERS AS, POSTBOKS 6963 ST OLAVS PLASS, 0130 OS |
|
| MK1K | Patent expired |