EA008924B1

EA008924B1 - Способ очистки фсг

Info

Publication number: EA008924B1
Application number: EA200601029A
Authority: EA
Inventors: Мара Росси
Original assignee: Арес Трейдинг С.А.
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2007-08-31
Also published as: NO330774B1; NO20063304L; UA90664C2; IL176328A; CN100554277C; AU2004309040B2; BRPI0417992A; KR101160985B1; CN1890265A; EP1697412A1; IL176328A0; BRPI0417992B8; US20070129295A1; KR20060135656A; EP1697412B1; JP2008500273A; WO2005063811A1; CA2544333A1; EA200601029A1; DE602004023757D1

Abstract

Данное изобретение обеспечивает способ очистки рекомбинантного ФСГ.

Description

Область техники

Данное изобретение относится к области очистки белков, в частности к очистке фолликулостимулирующего гормона (ФСГ).

Уровень техники

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) является инъецируемым белком, относящимся к классу гонадотропинов. ФСГ используют в лечении бесплодия и репродуктивных нарушений как в случае пациентов-женщин, так и в случае пациентов-мужчин.

В природе ФСГ продуцируется гипофизом. Для фармацевтического применения ФСГ может быть получен рекомбинантным методом (рФСГ) или он может быть выделен из мочи женщин в постклимактерическом периоде (мФСГ).

ФСГ используют в случае пациентов-женщин для индукции овуляции (01) и для регулируемой гиперстимуляции яичников (СОН) для вспомогательных репродуктивных технологий (АКТ). В типичной схеме лечения для индукции овуляции пациенту вводят 1 раз в день инъекции ФСГ или варианта (примерно 75-300 МЕ ФСГ/день) в течение периода примерно 6 - примерно 12 дней. В типичной схеме лечения для регулируемой гиперстимуляции яичников пациенту вводят 1 раз в день инъекции ФСГ или варианта (примерно 150-600 МЕ ФСГ/день) в течение периода примерно 6 - примерно 12 дней.

ФСГ используют также для индукции сперматогенеза в случае мужчин, страдающих от олигоспермии. Схема лечения, использующая 150 МЕ ФСГ 3 раза в неделю в комбинации с 2500 МЕ хГЧ (хорионического гонадотропина человека), была успешной в достижении улучшения количества сперматозоидов у мужчин, страдающих от гипогонадотропного гипогонадизма (Витдиекк с1 а1.; 8иЬси1апеик ке1Г-абтйпк1га1юп оГ ЫдЫу рипПеб ГоШс1е кйпшкЦшд йогтопе апб йитап сйопошс допабойорЫп Гог 1йе 1геа1теп1 оГ та1е йуродопабойорЫс йуродопаб18т. 8рашкй Со11аЬогайуе Огоир оп Ма1е НуродопабойорЫс Нуродопаб1кт; Нит. Кергоб.; 1997, 12, 980-6).

Вследствие важности ФСГ в лечении нарушений бесплодия, желательным является обеспечение ФСГ высокой чистоты и высокой удельной активности. Лечение ФСГ требует повторных инъекций. Высокочистые препараты ФСГ могут вводиться подкожно, что делает возможным самовведение пациентом, увеличивая, таким образом, удобство и соблюдение пациентом режима и схемы лечения.

йупсй е1 а1. (Тйе ехйасйоп апб ритгйсайоп оГ йитап рйийату ГоШс1е-8Йтц1айпд йогтопе апб 1и1е1п181пд йогтопе; Ас1а Епбосгшо1одюа, 1988, 288, 12-19) описывают способ для очистки гипофизарного ФСГ человека. Этот способ включает анионо- и катионообменную хроматографию и гель-фильтрационную хроматографию. Авторы сообщают, что этот способ приводит к гипофизарному ФСГ, имеющему удельную активность 4990 МЕ (иммуноанализ)/мг, с 16 МЕ/мг ЛГ (лютеинизирующего гормона). Содержание белка определяли либо по сухому весу, либо в растворе по поглощению при 280 нм (принимая, что А²⁸⁰1 _см для 1 г/л равно 1).

\У0 98/20039 (1В8А ΙπκΙίΙυΙ Вюсйпшс.|ие. 8А) описывает способ очистки ФСГ из мочи человека, исходя из экстрактов мочи, называемых менопаузальными гонадотропинами человека (йМО). Этот способ использует ионообменную хроматографию на слабощелочных анионообменных смолах типа ДЭАЭ с последующей аффинной хроматографией на смоле, имеющей в качестве лиганда антрахинон. Сообщается, что этот способ дает ФСГ из мочи, не содержащий ЛГ и имеющий удельную активность 6870 МЕ (иммуноанализ)/мг. Содержание белка определяли, принимая, что водный раствор 1 мг/мл белка имеет оптическую плотность 0,62 при 277 нм в кварцевых кюветах с длиной пути 1 см.

\У0 00/63248 (1пк1йи1о Маккопе 8А) описывает способ очистки гонадотропинов, в том числе ФСГ, из мочи человека. Этот способ включает следующие стадии: ионообменную хроматографию с сильной катионной смолой типа сульфопропильной, ионообменную хроматографию с сильной анионной смолой и гидрофобную хроматографию (Н1С). Сообщается о получении препарата ФСГ, имеющего удельную активность 8400 МЕ/мг (81ее1шап-Рой1еу ше1йоб: Аккау оГ 1йе ГоШс1е кйши1айпд йогтопе Ьакеб оп 1йе аидтеп!айоп \\йй йитап сйопошс допабойорйш; Епбосппо1оду; 1953, 53, 604-616) и биологическую активность, меньшую, чем 1 МЕ, ЛГ (способ увеличения массы семенных пузырьков крысы: Уап Не11 Н., Маййцкеп К. & О.А. ОуетЬеек; Ас1а Епбостшок 1964, 47, 409), на 75 МЕ ФСГ. Содержание белка определяли по способу Лоури (О.Н. Ьомгу е1 а1., 1. Вю1. Сйет., 1951, 193, 265).

В И8 5990288 (Микюк е1 а1.) описан способ очистки ФСГ из биологических проб, таких как гипофиз человека или постменопаузальная моча человека. Этот способ использует аффинную хроматографию с красителем. Сообщается, что этот способ приводит к получению ФСГ гипофиза человека, имеющего удельную активность 7066 МЕ (иммуноанализ)/мг и менее чем 1 МЕ (иммуноанализ)/мг ЛГ, а мочевой ФСГ имеет удельную активность 6298 МЕ (иммуноанализ)/мг) и менее чем 3 МЕ (иммуноанализ)/мг ЛГ. Содержание белка определяли по поглощению при 280 нм (принимая, что А²⁸⁰1 см для 1 г/л равна 1).

Сй1Ьа е1 а1. (1ко1айоп апб ратйа1 сйагайепкайоп оГ ЬН, Е8Н апб Т8Н Ггош сапше рйийату д1апб; Епбосппо1. 1., 1997, 44, 205-218) описывают способ очистки гонадотропинов гипофиза собачьих, в том числе ФСГ, с использованием аффинной хроматографии с конканавалином А (СопА), гидрофобной хроматографии (Н1С) и хроматографии с иммобилизованным ионом металла (Си⁺⁺). Сообщается, что полученный ФСГ имеет удельную активность 2,17 МЕ/г белка с использованием радиорецепторного анализа на ФСГ для измерения биологической активности и набора для анализа белков ВюКаб (ВюКаб ЬаЬога1о1тек СА И8А)

- 1 008924 для определения содержания белка.

\νϋ 88/10270 (ΙηδΙίΙιιΙο άί Кгсегса Секаге 8егоио 8РЛ) описывает способ очистки ФСГ человека из мочи. Этот способ включает иммунохроматографию с ФСГ-специфическими иммобилизованными моноклональными антителами, связанными с сефарозой 4В дивинилсульфоном, с последующей обращенно-фазовой ВЭЖХ. Полученный ФСГ не содержит ЛГ и других мочевых белков и имеет удельную активность 6200 МЕ/мг лиофилизированного порошка (способ 81ее1таи-РоЫеу). Этот препарат ФСГ был первым препаратом ФСГ, пригодным для подкожного введения, вследствие его высокой чистоты.

Таким образом, потребность в новых способах очистки ФСГ сохраняется.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение нового способа очистки рекомбинантного ФСГ или варианта ФСГ.

В первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или варианта ФСГ, включающий стадии:

(1) ионообменной хроматографии;

(2) хроматографии с иммобилизованным ионом металла;

(3) гидрофобной хроматографии (Н1С), которые могут проводиться в любом порядке.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1 показывает технологическую схему очистки рФСГч.

Фиг. 2 показывает профиль элюции для хроматографии неочищенного рФСГч на Ц-сефарозе ЕЕ, определенный посредством ΘΌ при 280 нм.

Фиг. 3 показывает профиль элюции для 1МАС-хроматографии частично очищенного рФСГч, определенный посредством ΘΌ при 280 нм.

Фиг. 4 показывает профиль элюции для хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе частично очищенного рФСГч, определенный посредством ΘΌ при 280 нм.

Фиг. 5 показывает профиль элюции для хроматографии на фенилсефарозе частично очищенного рФСГч, определенный посредством ΘΌ при 280 нм.

Фиг. 6 показывает профиль элюции для КРС-стадии (ОФХ-стадии) с использованием КРС(ОФХ)колонки 8оигсе 30.

Аббревиатуры

Следующие аббревиатуры использовали в описании данного изобретения.

ФСГ: фолликулостимулирующий гормон рФСГ: рекомбинантный ФСГ

ФСГч: ФСГ человека рФСГч: рекомбинантный ФСГ человека

ВУ: объем слоя

ДЭАЭ: диэтиламиноэтил

1МАС: аффинная хроматография с иммобилизованным ионом металла

ΘΌ: оптическая плотность

Н1С: гидрофобная хроматография

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография

1КМА: иммунорадиометрический анализ

КД или кД: килодальтон

НСР: белок клетки-хозяина, белки, возникающие из клетки-хозяина, используемой для экспрессии ФСГ

1РС: применяемые в способе контроли

ОФ-ВЭЖХ: обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография

О ЕЕ: анионный обмен на Р-сефарозе ЕЕ

Подробное описание изобретения

Данное изобретение обеспечивает способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или ФСГ-варианта, предусматривающий стадии:

(1) ионообменной хроматографии;

Способ очистки данного изобретения позволяет получать очищенный ФСГ с чистотой, сравнимой с известными продуктами ФСГ, такими как Соиа1-Е (8егоио) и Ме1гобш-НР (8егоио). Исходным материалом для очистки является рекомбинантный ФСГ.

Предпочтительные варианты изобретения

Способ очистки данного изобретения включает стадию ионообменной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления стадию ионообменной хроматографии проводят с сильной анионообменной колонкой, особенно предпочтительно со смолой четвертичного аммония, такой как Ц-сефароза ЕЕ (Агиегайат Вюкаеисек), или со смолой, имеющей сходные характеристики, следующим образом.

Тип ионообменника Сильный анион

Общая емкость (ммоль/мл) 0,18-0,25

- 2 008924

Предел исключения (глобулярные белки)

Форма гранул

Структура гранул рН-стабильность в рабочем режиме рН-стабильность очистки

Линейная скорость тока при 25°С, 1 бар, высота слоя 15 см, колонка ХК 50/30

4х10⁶

Сферические, диаметр 45-165 мкм

Сшитая агароза, 6%

2-12

1-14

400-700 см/ч

На этой стадии ионообменной хроматографии элюцию предпочтительно проводят с использованием буфера, имеющего слабощелочной рН (например, при или около 7,2 - при или около 9,0 или при или около 8,0 - при или около 9,0, наиболее предпочтительно при или около 8,5). Подходящие буферы включают, например, боратный буфер, триэтаноламин/иминодиуксусную кислоту. Наиболее предпочтительным является боратный буфер при рН при или около 8,5. Концентрация разновидностей элюирующего буфера находится предпочтительно в диапазоне при или около 10 - при или около 100 мМ, более предпочтительно при или около 25 - при или около 75 мМ, наиболее предпочтительно при или около 50 мМ.

Перед этой стадией ионообменной хроматографии может быть желательным проведение стадии ультрафильтрации для концентрирования неочищенного ФСГ. Ультрафильтрацию (или диафильтрацию) проводят с использованием мембраны, имеющей предел отсечения при или около 3-10 кД, наиболее предпочтительно 5 кД.

Способ данного изобретения включает также стадию хроматографии с иммобилизованным ионом металла. В предпочтительном варианте осуществления стадию хроматографии с иммобилизованным ионом металла проводят с использованием смолы, имеющей тридентатные хелатные группы, такие как, например, иминодиуксусная кислота (ГОА), и ион двухвалентного металла, М²⁺, такой как Си²⁺, Ζη²⁺, Νί²⁺, Са²⁺, Мд²⁺ и Со²⁺, предпочтительно Си²⁺. Эта хелатирующая ион металла группа присоединена к подходящему твердому носителю, такому как, например, сефароза. Особенно предпочтительными смолами являются хелатирующая сефароза РР (Атегайат Вюкаеисек) или другие смолы, имеющие сходные характеристики, такие как следующие.

Состав

Размер частиц

Лиганд

Химия связывания

Емкость иона металла рН-стабильность (в рабочем режиме) рН-стабильность (краткосрочная) Давление/свойства потока

Сшитая в высокой степени 6% агароза

45-165 мкм

Группы иминодиуксусной кислоты на спейсере

Эпокси

30-37 мкмоль Си²⁺/мл

3-13

2-14

Матрикс-основа 200-400 см/ч, 1 бар (100 кПа), колонка ХК 50/60, высота слоя 25 см

Элюция на этой стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла должна проводиться с использованием буфера, содержащего имидазол, фосфат или ацетат, особенно предпочтительно ацетат, например ацетат аммония. рН элюента предпочтительно должен быть при или около 7,5 - при или около 10, более предпочтительно при или около 8,0 - при или около 9,5, особенно предпочтительно при или около 9. Концентрация буферящих молекул в элюенте предпочтительно должна быть при или около 0,1 при или около 2М, более предпочтительно при или около 0,5 - при или около 1М, наиболее предпочтительно при или около 0,75М.

Этот способ включает также стадию гидрофобной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления стадию гидрофобной хроматографии проводят на смоле, такой как фенилсефароза РР Н8 (Атегайат Вюкаеисек), или на смоле, имеющей сходные характеристики, такие как следующие.

Матрикс Средний размер частиц Гидрофобный лиганд Плотность лиганда

Сшитая в высокой степени 6% агароза 90 мкм Фенил 40

рН-стабильность (краткосрочная) 2-14 рН-стабильность (долгосрочная и рабочий диапазон) 3-13

Элюцию на стадии гидрофобной хроматографии предпочтительно проводят с использованием буфера, имеющего слабощелочной рН (например, при или около 7,2 - при или около 9, более предпочтительно при или около 7,5 - при или около 8,5, наиболее предпочтительно при или около 8,25). Особенно предпочтительным элюентом является ацетат аммония (50 мМ)/сульфат аммония (0,25М), предпочтительно при или около рН 8,25.

После стадии гидрофобной хроматографии можно проводить стадию обращенно-фазовой хроматографии (ВРС, (ОФХ)). ОФХ предпочтительно проводят с использованием смолы, такой как 80ИК.СЕ 30

- 3 008924

ВРС (/Атегкйат Βίοδοίοηοοδ). Элюцию предпочтительно проводят с использованием буфера, такого как ацетат аммония, предпочтительно при слабощелочном рН, например при или около 7-8,5, более предпочтительно при или около 7,5 или 7,6. Буферный раствор предпочтительно содержит при или около 525% (объем/объем) предпочтительно при или около 10-20% смешивающегося с водой органического растворителя, предпочтительно С₁-С₃ спирта, наиболее предпочтительно 2-пропанола (изопропанола).

Стадии ионообменной хроматографии, хроматографии с иммобилизованным ионом металла и гидрофобной хроматографии (Н1С) могут проводиться в любом порядке, хотя предпочтительно проводят сначала стадию ионообменной хроматографии. Остальные стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла и гидрофобной хроматографии (Н1С) могут проводиться в любом порядке, хотя предпочтительным является показанный ниже порядок:

(1) ионообменная хроматография, (2) хроматография с иммобилизованным ионом металла и (3) гидрофобная хроматография (Н1С).

В следующем предпочтительном варианте осуществления между стадией (2) и стадией (3) проводят дополнительную стадию ионообменной хроматографии (2а), особенно предпочтительно со слабой анионообменной смолой, такой как, например, обменная смола, несущая диаминоэтильные группы, в частности ДЭАЭ-сефароза ББ. В особенно предпочтительном варианте осуществления эти стадии проводят в указанном ниже порядке:

(1) ионообменная хроматография, (2) хроматография с иммобилизованным ионом металла, (2а) вторая стадия ионообменной хроматографии и (3) гидрофобная хроматография (Н1С).

В особенно предпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения предусматривает стадии, характеризуемые следующим образом:

(1) ионообменная хроматография (предпочтительно на сильной анионообменной смоле, такой как О-сефароза ББ), (2) хроматография с иммобилизованным ионом металла (предпочтительно на хелатирующей сефарозе ББ, с использованием Си²⁺ в качестве иона металла), (2а) вторая стадия ионообменной хроматографии (предпочтительно на слабой анионообменной смоле, такой как ДЭАЭ-сефароза ББ) и (3) гидрофобная хроматография (Н1С) (предпочтительно на фенилсефарозе ББ Н8).

Вторую стадию ионообменной хроматографии (2а) предпочтительно проводят с использованием буфера, содержащего ацетат аммония, в качестве элюента, предпочтительно при рН при или около 8,5. Предпочтительно аммонийацетатный буфер имеет концентрацию, равную или около 0,05 - равную или около 0,5М, более предпочтительно равную или около 0,11М.

В следующем предпочтительном варианте осуществления после любой из стадий хроматографии (особенно предпочтительно после стадии обращенно-фазовой хроматографии) пробу ФСГ подвергают концентрированию ультрафильтрацией. Ультрафильтрацию (или диафильтрацию) предпочтительно проводят с использованием мембраны, имеющей предел отсечения молекулярной массы, равный или около 3-10 кД, наиболее предпочтительно равный или около 5 кД.

В особенно предпочтительном варианте осуществления проводят следующие стадии в указанном ниже порядке:

(0) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения молекулярной массы, равный или около 5 кД), (1) ионообменная хроматография (предпочтительно на О-сефарозе ББ), (2) хроматография с иммобилизованным ионом металла (предпочтительно на хелатирующей сефарозе ББ и с Си²⁺), (2а) вторая стадия ионообменной хроматографии (предпочтительно на ДЭАЭ-сефарозе ББ), (3) гидрофобная хроматография (Н1С) (предпочтительно на фенилсефарозе ББ Н8), (4) обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) (предпочтительно на 8оигсе 30 ВРС) и (5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения 5 кД).

Может быть желательным проведение нанофильтрации пробы ФСГ для гарантии того, что очищенный препарат ФСГ не содержит вирусов. Нанофильтрация может быть выполнена на любой стадии способа очистки, однако, предпочтительно проводить нанофильтрацию после 2-ой стадии ионообменной хроматографии, или после обращенно-фазовой хроматографии, или после гидрофобной хроматографии. Нанофильтрация может выполняться более чем 1 раз, например она может выполняться дважды.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения включает следующие стадии:

(0) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения, равный или около 5 кД), (1) ионообменная хроматография (предпочтительно на О-сефарозе ББ), (2) хроматография с иммобилизованным ионом металла (предпочтительно на хелатирующей сефа

- 4 008924 розе РР и с Си²⁺), (2а) вторая стадия ионообменной хроматографии (предпочтительно на ДЭАЭ-сефарозе РР), (3) гидрофобная хроматография (Н1С) (предпочтительно на фенилсефарозе РР Н8), (4) обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) (предпочтительно на 8оигсе 30 КРС) и (5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей предел отсечения 5 кД), (6) нанофильтрация.

Хранение/лиофилизация

Жидкая композиция, полученная описанным выше способом очистки и содержащая очищенный ФСГ, может быть заморожена для хранения в таком виде, в каком она получена, или после очистки элюат может быть подвергнут лиофилизации («сушке вымораживанием») для удаления растворителя. Полученные жидкость или лиофилизированный продукт называют «общей массой ФСГ».

Композиции ФСГ

Неочищенные ФСГ или ФСГ-вариант данного изобретения или очищенные в соответствии со способом данного изобретения должны быть подготовлены для инъекции, внутримышечной или подкожной, предпочтительно подкожной.

Композиция ФСГ может быть лиофилизированной, и в этом случае ее растворяют в воде для инъекций непосредственно перед инъекцией. Композиция ФСГ может быть также жидкой композицией, и в этом случае она может вводиться непосредственно, без предварительного растворения.

Композиция ФСГ может находиться в виде дозы для однократного введения или в виде доз для многократного введения. Если она находится в виде доз для многократного введения, она должна предпочтительно содержать бактериостатический агент, такой как, например, бензиловый спирт, мета-крезол, тимол или фенол, предпочтительно бензиловый спирт или мета-крезол. Композиции однократной дозы могут также содержать бактериостатический агент.

ФСГ данного изобретения может быть приготовлен с известными эксципиентами и стабилизаторами, например сахарозой или маннитом. Он может также содержать антиоксидант, такой как метионин. Он может дополнительно содержать поверхностно-активное вещество, такое как Твин (предпочтительно Твин 20) или Плуроник (предпочтительно Плуроник Р66).

В особенно предпочтительной многодозовой композиции ФСГ, полученный способом данного изобретения, готовят растворением его в воде для инъекций с сахарозой, фосфатным буфером (рН 7), Плуроником Р68, метионином и мета-крезолом или бензиловым спиртом.

Показания

ФСГ данного изобретения пригоден для применения во всех режимах лечения, в которых назначают ФСГ. Он особенно пригоден для подкожного введения в индукции овуляции, регулируемой гиперстимуляции яичников для вспомогательных репродуктивных технологий и в лечении олигоспермии. Он может быть использован вместе с другими гонадотропинами, такими как ЛГ и хГЧ (хорионический гонадотропин человека). Он может быть также использован с соединениями, которые увеличивают реакцию на ФСГ, такими как цитрат кломифена, ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол, летрозол, фадрозол и ΥΜ-511.

Последовательности

8ЕО ΙΌ N0: 1: α-субъединица гликопротеина человека

8Е0 ΙΌ N0: 2: β-субъединица ФСГч

8Е0 ΙΌ N0: 3: вариант 1 β-субъединицы ФСГч

8Е0 ΙΌ N0: 4: вариант 2 β-субъединицы ФСГч

8Е0 ΙΌ N0: 5: вариант 3 β-субъединицы ФСГч

Фолликулостимулирующий гормон, или ФСГ, в данном контексте относится к ФСГ человека (ФСГч), продуцируемому в виде полноразмерного зрелого белка. ФСГ является димером, состоящим из альфа-субъединицы гликопротеина человека и бета-субъединицы ФСГ человека. Последовательность белка альфа-субъединицы ФСГ человека представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 1, а последовательность белка бетасубъединицы ФСГ человека представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 2.

Использование термина «рекомбинантный» относится к препаратам ФСГ, которые получают с использованием рекомбинантной технологии ДНК (см., например, А0 85/01958). Одним примером способа экспрессии ФСГ с использованием рекомбинантной технологии является трансфекция эукариотических клеток ДНК-последовательностями, кодирующими альфа- и бета-субъединицу ФСГ, независимо от того, обеспечены ли они на одном векторе или на двух векторах, причем каждая субъединица имеет отдельный промотор, как описано в европейских патентах с номерами ЕР 0211894 и ЕР 0 487512. ДНК, кодирующей ФСГ, может быть кДНК, или она может содержать интроны. Другим примером использования рекомбинантной технологии для получения ФСГ является получение с использованием гомологичной рекомбинации для встраивания гетерологичного регуляторного сегмента в функциональной связи в эндогенные последовательности, кодирующие одну или обе субъединицы ФСГ, как описано в европейском патенте с номером ЕР 0505500 (АррНеб Векеагсй 8уЧеш5 ΛΒ8 Но161ид XV). Рассматриваются также такие способы, как способы, описанные в А0 99/57263 (Тгаиккагуойс Тйегар1е8), в которых одну из этих

- 5 008924 субъединиц встраивают гетерологично в клетку, а другая субъединица экспрессируется активацией геномных последовательностей встраиванием гетерологичного регуляторного сегмента гомологичной рекомбинацией. Способ данного изобретения может быть использован для очистки ФСГ, экспрессируемого с использованием любого из этих способов.

Выражение «рекомбинантная клетка» относится к клетке, полученной вставкой гетерологичной ДНК, в том числе любым из вышеуказанных способов генетических манипуляций.

Предпочтительно ФСГ продуцируется рекомбинантно в клетках яичника китайского хомячка (СНО), трансфецированных вектором или векторами, содержащими ДНК, кодирующую альфа-субъединицу гликопротеина человека и бета-субъединицу ФСГ. ДНК, кодирующая альфа- и бета-субъединицы, может присутствовать на одном и том же или на различных векторах.

Выражение «ФСГ-вариант» включает в себя молекулы, отличающиеся по аминокислотной последовательности, схеме гликозилирования или межсубъединичной связи от ФСГ человека, но проявляющие ФСГ-активность. Примеры включают СТР-ФСГ, продолжительно действующий модифицированный рекомбинантный ФСГ, состоящий из а-субъединицы дикого типа и гибридной β-субъединицы, в которой карбоксиконцевой пептид хГЧ был сшит с С-концом β-субъединицы ФСГ, как описано в ЬаРоЙ е! а1., Еибостто1оду; 1992, 131, 2514-2520; или К1еш е! а1., Пеуе1ортеи1 апб С11агае1спха1юп оГ 1оид-ас11ид тесотЬтаи! НЕ8Н адошк!; Нитаи Кергоб. 2003, 18, 50-56. Включен также одноцепочечный СТР-ФСГ, одноцепочечная молекула, состоящая из следующих последовательностей (от Ν-конца к С-концу):

вФСГ вхГЧ-СТР (113-145) аФСГ где вФСГ обозначает β-субъединицу ФСГ, вхГЧ СТР (113-145) обозначает карбоксиконцевой пептид хГЧ и аФСГ обозначает α-субъединицу ФСГ, как описано К1ет е! а1. (РНаттасоктейск апб рНаттасобуиатюк оГ ктдк-сНаш гесотЫиаи! Нитап Го1йс1е-8бти1абид Ногтопе согИайипд (Не Нитап сНопотс доиабо!горЫи сагЬоху1егтта1 рерббе т (Не гНекик тоикеу; ЕебИйу & 8!етййу; 2002, 77, 1248-1255). Другие примеры ФСГ-вариантов включают молекулы ФСГ, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, включенные в а- и/или β-субъединицу, как описано в ΧνΟ 01/58493 (Махудеи), и молекулы ФСГ с межсубъединичными 8-8-связями, как описано в XVО 98/58957. Дополнительные примеры ФСГ-вариантов включают в себя химерные молекулы, содержащие последовательности из ФСГ и последовательности из хГЧ или ЛГ, такие, как описанные в νΟ 91/16922 и νΟ 92/22568.

ФСГ-варианты, указанные здесь, включают в себя также делеции карбоксиконца бета-субъединицы, которые являются более короткими, чем полноразмерный зрелый белок 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2. Делеции карбоксиконца бета-субъединицы человека обеспечены в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, 4 и 5. Понятно, что карбоксиконцевые варианты бета-цепи образуют димеры с известной альфа-субъединицей с образованием гетеродимера ФСГ-варианта.

В предпочтительном варианте осуществления ФСГ продуцируется рекомбинантно в клетках СНО.

В предпочтительном варианте осуществления очищенный ФСГ, полученный в соответствии со способом данного изобретения, является подходящим для подкожного введения, что делает возможным самовведение пациентом.

Выражение «неочищенный рекомбинантный ФСГ» обозначает супернатант культуры клеток от рекомбинантных клеток, экспрессирующих ФСГ, до его очистки на какой-либо хроматографической стадии. Это выражение включает неочищенную форму супернатанта (выделенную из клеток), а также концентрированный, и/или отфильтрованный, и/или ультраотфильтрованный супернатант.

Термин «биологическая активность» в отношении активности ФСГ обозначает способность композиции ФСГ индуцировать биологические реакции, ассоциированные с ФСГ, такие как увеличение массы яичников в анализе 8!ее1таи-РоЫеу (Аккау оГ (Не Го1йс1е 8Йти1а!тд Ногтоие Ьакеб ои (Не аидтеи1айои \\ЙН Нитаи сНопотс доиабо!горЫи; Еибостто1оду; 1953, 53, 604-616); или рост фолликулов у пациентаженщины. Рост фолликулов у пациента-женщины может быть оценен при помощи ультразвука, например в отношении количества фолликулов, имеющих средний диаметр 16 или около 16 мм в день 8 стимуляции. Биологическую активность оценивают относительно общепринятого стандарта ФСГ.

Содержание ЛГ в препарате ФСГ может быть измерено, например, с использованием ЛГ-специфического иммуноанализа, такого как Эе1Па НЬН 8рес ^а11ас Оу, Тигки, Еш1анб).

Термин «удельная активность», при упоминании в отношении ФСГ, обозначает биологическую активность в МЕ препарата в общепризнанном биологическом анализе на ФСГ, таком как биоанализ 8!ее1таиРоН1еу, разделенную на количество белка, определенного анализом на содержание общего белка, таким как анализ Лоури (О.Н. Ьотету, N.1. КокеЬгоидй, А.Ь. Еатг аиб КП. Каиба11 (1951) 1. Вю1. Сйет., 193: 265; Наг!гее Е.Е. (1972), Аиа1. ВюсНет. 48: 422; 1.К. Пи11еу аиб Р.А. Спехе (1975) Аиа1. ВюсНет. 64: 136), анализ Бредфорда (ВгебГогб. М.М. (1976) Аиа1. ВюсНет. 72, 248), или по оптической плотности при 280 нм. Предпочтительно ФСГ данного изобретения имеет удельную активность, большую или около 4000 МЕ/мг, более предпочтительно большую или около 6000 МЕ/мг, даже более предпочтительно большую или около 700 МЕ/мг, даже еще более предпочтительно большую или около 8000 МЕ/мг, где биологическую активность измеряют в соответствии с биоанализом 8!ее1таи-РоН1еу и содержание белка измеряют по ΟΌ при 280 нм.

- 6 008924

Примеры

Очистка

Следующий пример обеспечивает очищенный рФСГч (рекомбинантный ФСГ человека), полученный из концентрированного неочищенного рФСГч, продуцируемого в биореакторах на 15 и 75 л.

Технологическая схема процесса очистки, описанная подробно в следующих разделах, представлена на фиг. 1. Полученный очищенный рФСГч назван «общей массой рФСГч».

Для всех буферов рН и величины проводимости приводятся для +25°С; т.е. определение величины проводимости выполняли с использованием прибора, снабженного датчиком температуры, и полученную величину автоматически компенсировали в отношении разности температур и относили к +25°С.

Что касается измерений проводимости, корреляционный коэффициент температуры всегда устанавливали на 2.

Стадия 0. Диафильтрация концентрированного неочищенного рФСГч.

Оборудование.

Система ультрафильтрации типа РеШсоп Μίηί (Мййроте или равноценная).

Ультрафильтрационная мембрана при пределе отсечения молекулярной массы 5 кД в полиэфирсульфоне типа ΒΙΟΜΑΧ (Мййроте или равноценная), 0,1 м².

Перистальтический насос (типа МаЧегПех или равноценный).

Материалы.

Концентрированный неочищенный рФСГч.

Исходное количество: 200-400 мг ФСГ, определенное при помощи иммуноанализа ΌΕΕΡΙΑ на ФСГ (из биореактора на 75 л).

Шарики гидроксида натрия - Мегск.

Очищенная вода (Мо6и1аЬ или равноценная).

Борная кислота.

Декагидрат тетрабората натрия.

Гидроксид натрия (шарики).

Боратный буфер (50 мМ борат натрия рН 8,5±0,1): 3,06 г борной кислоты и 10 г дигидрата тетрабората натрия добавляли к 900 мл очищенной воды при перемешивании и доводили до 1 л.

Процедура ультрафильтрации.

Все операции выполняли в условиях охлаждения (3-8°С). Концентрированный неочищенный рФСГч (1-1,5 л) ультрафильтровали при следующих условиях.

Буфер: 50 мМ борат натрия рН 8,5±0,1, проводимость 1,9±0,2 мС/см.

Ток пермеата: 15-25 мл/мин.

Давление на входе: 1,5-2,2 бар.

Трансмембранное давление: 1,5-1,8 бар, где трансмембранное давление (ТМР)=(давление на входе+давление на выходе)/2.

Раствор рФСГч концентрировали до объема 1 л.

Фракцию ретентата разбавляли 1 объемом очищенной воды и опять концентрировали до 1 л (промывка).

Стадию промывки повторяли еще 2 раза.

Проводимость пермеата проверяли и, если она была менее чем 1,5 мС/см, эту пробу переводили в следующую стадию, в противном случае стадию промывки повторяли.

Проводимость пермеата: <1,5 мС/см.

объем фракции ретентата разбавляли до 2 объемов уравновешивающим буфером и опять концентрировали до исходного объема.

Эту операцию повторяли еще 2 раза.

рН и проводимость пермеата проверяли и, если рН и проводимость этой фракции пермеата были 8,5±0,1 и 1,9±0,2 мС/см, соответственно, этот пермеат переводили в следующую стадию, в противном случае эту стадию промывки повторяли.

рН пермеата: 8,5±0,1.

Проводимость пермеата: 1,9±0,2 мС/см.

Фракцию ретентата собирали и ультрафильтр промывали тремя аликвотами уравновешивающего буфера, собирая и объединяя промывки с фракцией ретентата таким образом, чтобы иметь конечный собранный объем около 0,6-1,2 л.

Собранный объем: 0,6-1,2 л.

Эту фракцию обозначали как «Исходный материал О».

5x0,5 мл проб хранили при -20°С для 1РС.

Объем этой фракции измеряли (ее можно хранить при +5±3°С в течение не более чем 2 дней).

Эти пробы анализировали следующим образом: ΟΌ при 280 нм, рН, проводимость и содержание рФСГч при помощи иммуноанализа (ОЕЬР1А) и ОФ-ВЭЖХ.

Стадия 1. Анионный обмен на О-сефарозе РР.

Оборудование.

- 7 008924

Хроматографическая колонка ХК 50/20.

Холодная комната.

УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (ЛтсгФат В|О5С1СПСС5 или равноценный).

УФ-спектрофотометр (Ыитабхи или равноценный).

рН-метр (Мс1го1ип или равноценный).

Кондуктометр (Ме1тоЬт или равноценный).

Весы (Мей1етТо1ебо или равноценные).

Материалы.

Концентрированный неочищенный рФСГч из стадии ультрафильтрации.

Исходное количество: 200-400 мг ФСГ согласно ΌΕΤΡΙΑ.

Шарики гидроксида натрия - Мегск.

Очищенная вода (Мойи1аЬ или равноценная).

Борная кислота.

Декагидрат тетрабората натрия.

Гидроксид натрия (шарики).

Хлорид натрия.

Ледяная уксусная кислота.

Буферы.

Уравновешивающий буфер: 50 мМ борат натрия рН 8,5±0,1, проводимость 1,9±0,2 мС/см. Элюирующий буфер: 50 мМ борат натрия, 0,13М ЫаС1 рН 8,5+0,1, проводимость 16±1,5 мС/см. Разделяющий раствор: 1,5М ЫаС1.

Дезинфицирующий раствор 1: 0,1М уксусная кислота.

Дезинфицирующий раствор 2: 0,5М ЫаОН.

Раствор для хранения: 0,01М ЫаОН.

Набивка колонки.

Колонку набивали смолой О-ЗерНагоке Рак! Иоте в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры:

Диаметр 5 см

Высота слоя 11 см±10%

Объем слоя 190-240 мл

Процедура очистки.

Все процедуры выполняли при следующих условиях:

Температура 3-8°С

Линейная скорость тока 240-280 см/ч

Дезинфицирование колонки.

Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ (объемом слоя колонки) 0,5М ЫаОН, затем промывали 3 ВУ очищенной воды.

Уравновешивание колонки.

Колонку промывали 6-7 или более ВУ уравновешивающего буфера, 50 мМ борат натрия рН 8,5±0,1, проводимость 1,9±0,2 мС/см.

рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, пока параметры эффлюента колонки не находились в пределах следующих желаемых величин: рН 8,5±0,1, проводимость 1,9+0,2 мС/см.

Получение исходного материала.

Концентрированный и диафильтрованный рФСГч, полученный из стадии ультрафильтрации, оттаивали в количестве, указанном в разделе «Материал».

рН и проводимость проверяли и пробы сохраняли для 1РС (5x0,5 мл).

Нанесение.

Этот исходный материал наносили на уравновешенную колонку.

Промывание.

После завершения нанесения пробы колонку промывали 2-3 ВУ уравновешивающего буфера. Этот объем собирали и регистрировали, и пробы сохраняли для 1РС 5x0,5 мл, и эту фракцию выбрасывали.

Элюция.

Элюцию начинали 50 мМ боратом натрия, 0,13М ЫаС1 рН 8,5±0,1, проводимость 16±1,5 мС/см. рФСГч начинал элюироваться после 0,7-1,0 ВУ от начала.

4,5 ВУ элюированной фракции собирали с обнаружением двух пиков согласно хроматографическому профилю, изображенному на фиг. 2.

Этот объем регистрировали и пробы сохраняли для 1РС (5x0,5 мл).

Эта фракция могла храниться при 4°С в течение не более 2 дней.

Эта фракция содержит полуочищенный рФСГч.

- 8 008924

Стадия (2). 1МАС на хелатирующей сефарозе ЕЕ.

Оборудование.

Хроматографическая колонка С10/40 (Атегайат Вю5С1епее5).

Перистальтический насос (типа т1шр1и8 2 Оукоп или равноценный).

УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (Атетзйат В1О5С1епее или равноценный).

Холодная комната.

рН-метр (Ме!тойт или равноценный).

Кондуктометр (Ме!тойт или равноценный).

Весы (Мей1етТо1ебо или равноценные).

Перистальтический насос (типа Ма51егПе.х или равноценный).

Материалы.

рФСГч после О 8ерйаго5е ЕЕ.

Шарики гидроксида натрия - Мегек.

Очищенная вода (Моби1аЬ или равноценная).

Борная кислота.

Декагидрат тетрабората натрия.

Гидроксид натрия (шарики).

Хлорид натрия.

ЭДТА.

Ацетат аммония.

Сульфат меди.

25% раствор аммиака.

Буферы.

Раствор для загрузки металла: 0,2М сульфат меди.

Подкисленная вода: 1 мл ледяной уксусной кислоты добавляли к 1 л очищенной воды при перемешивании.

Уравновешивающий буфер: 50 мМ борат натрия рН 8,25±0,1, 0,5М ЫаС1.

Элюция: 0,75М ацетат аммония рН 9,0+0,1, проводимость ±0,5 мС/см.

Регенерирующий раствор: 0,5М ЫаС1, 50 мМ ЭДТА.

Дезинфицирующий раствор: 0,5М ЫаОН.

Раствор для хранения: 0,01М ЫаОН.

Набивка колонки.

Колонку набивали смолой Сйе1аБпд 8ер11аго5е Еа5! Е1о\т в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры:

Диаметр 10 мм

Высота слоя 22±10%

Объем слоя 16-20 мл

Процедура очистки.

Температура 5±3°С

Линейная скорость тока 240-300 см/ч

Дезинфицирование колонки.

Загрузка колонки.

Колонку промывали 5-6 или более ВУ подкисленной воды, пока рН не становился <4,5 (согласно рН-индикатору). Затем колонку промывали 3 ВУ 0,2М сульфата меди и опять 4-5 ВУ подкисленной воды, пока величина оптической плотности (280 нм) не достигала фона.

Уравновешивание колонки.

Колонку промывали 6 или более ВУ уравновешивающего буфера, 50 мМ фосфат натрия рН 8,25±0,1, 0,5М ЫаС1, проводимость 50±5 мС/см.

рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, если параметры эффлюента колонки находились за пределами следующих желаемых величин: рН 8,25±0,1, проводимость 50±5 мС/см.

Получение исходного материала.

рФСГч, полученный из стадии О-8ер11аго5е ЕЕ, доводили до рН 8,25±0,1 добавлением 35% ортофосфорной кислоты и проводимость доводили до 50±5 мС/см добавлением ЫаС1. Пробы брали для 1РС (5х0,5 мл).

Нанесение.

Исходный материал наносили на колонку, уравновешенную, как описано выше.

Промывание.

- 9 008924

После завершения нанесения пробы колонку промывали 5-10 ВУ уравновешивающего буфера: 50 мМ фосфат натрия рН 8,25±1,0, 0,5М ЫаС1, проводимость 50±5 мС/см.

Брали пробы (5x0,5 мл) для 1РС и эту фракцию выбрасывали.

Элюция.

Элюцию начинали 0,075М ацетатом аммония рН 9,0±0,1, проводимость 7,2±0,5 мС/см.

рФСГч начинал элюироваться в виде основного пика после 0,5 ВУ от старта.

5-7 ВУ собирали из основного пика, начиная, когда линия ΘΌ круто увеличивалась, приблизительно после того, как выбрасывали первые 0,5 ВУ.

Брали пробы для 1РС (5x0,5 мл) и эту фракцию хранили при 3-8°С в течение не более 2 дней.

Профиль элюции для 1МАС показан на фиг. 3.

Эта фракция содержала полуочищенный рФСГч.

Стадия (2а). Анионный обмен на ДЭАЭ-сефарозе ББ.

Оборудование.

Хроматографическая колонка УаШадс Ь 22/40.

Перистальтический насос (типа тйирй18 2 Сукой или равноценный).

Холодная комната.

УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (Атегкйат Вюкаепсек или равноценный).

УФ-спектрофотометр (Ычтабхи или равноценный).

рН-метр (Мебойт или равноценный).

Кондуктометр (Ме1тойт или равноценный).

Весы (Мей1етТо1ебо или равноценные).

Материалы.

рФСГч после 1МАС.

Шарики гидроксида натрия - Мегск.

Очищенная вода (Моби1ай или равноценная).

Гидроксид натрия (шарики).

Хлорид натрия.

Ацетат аммония.

25% раствор аммиака.

Буферы.

Уравновешивающий буфер: 0,11М ацетат аммония рН 8,5±0,1, проводимость ±0,5 мС/см.

Регенерирующий раствор: 0,5М ЫаС1.

Дезинфицирующий раствор: 0,5М ЫаОН.

Раствор для хранения: 0,01М ЫаОН.

Набивка колонки.

Колонку набивали смолой ΌΕΑΕ Берйагоке Бак! Б1о\у в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры:

Диаметр 22 мм

Высота слоя 16-17 см

Объем слоя 65-70 мл

Процедура очистки.

Температура 5±3°С

Линейная скорость тока 240-300 см/ч

Дезинфицирование колонки.

Уравновешивание колонки.

Колонку промывали 6 или более ВУ уравновешивающего буфера: 0,11М ацетат аммония рН 8,5±0,1, проводимость 10,2±0,5 мС/см.

рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, если параметры эффлюента колонки находились за пределами следующих желаемых величин: рН 8,5±0,1, проводимость 10,5±0,5 мС/см.

Получение исходного материала.

рФСГч, полученный из стадии 1МАС, доводили до рН 8,5±0,1 добавлением ледяной уксусной кислоты и проводимость доводили до 10,5±0,5 мС/см добавлением очищенной воды (1 объем воды является необходимым для доведения проводимости до желаемой величины. Пробы брали для 1РС (5x0,5 мл).

Нанесение.

Промывание.

После завершения нанесения пробы колонку промывали 3-6 ВУ уравновешивающего буфера:

- 10 008924

0,11М ацетат аммония рН 8,5±0,1, проводимость 10,2±0,5 мС/см.

Брали пробы (5x0,5 мл) для 1РС и эту фракцию хранили при +5±3°С в течение не более 2 дней. Профиль элюции для хроматографии на ΌΕΑΕ Берйагоке ЕЕ показан на фиг. 4.

Гидрофобное взаимодействие на Рйепу1 Зерйагоке ЕЕ НЗ.

Оборудование.

Хроматографическая колонка ХК 26/30.

Перистальтический насос (типа Ш1шр1и8 2 Оукоп или равноценный).

УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (Атегкйат Вю8С1еиее8 или равноценный).

Холодная комната.

УФ-спектрофотометр (δΐιίιηαάζιι или равноценный).

рН-метр (Ме1тойт или равноценный).

Кондуктометр (Ме!тойт или равноценный).

Весы (Мей1етТо1е6о или равноценные).

Перистальтический насос (типа Мак1егГ1ех или равноценный).

Материалы.

рФСГч после ΌΕΑΕ.

Шарики гидроксида натрия - Мегск.

Очищенная вода (Мо6и1ай или равноценная).

Гидроксид натрия (шарики).

Хлорид натрия.

Ацетат аммония.

Сульфат аммония.

25% раствор аммиака.

Буферы.

Уравновешивающий буфер: 50 мМ ацетат аммония, 1М сульфат аммония рН 8,25±0,1, проводимость 142±8 мС/см.

Промывной буфер: 50 мМ ацетат аммония, 0,9М сульфат аммония рН 8,25±0,1, проводимость 130±5 мС/см.

Элюирующий буфер: 50 мМ ацетат аммония, 0,25М сульфат аммония рН 8,25±0,1, проводимость 50±3 мС/см.

Очищающий раствор: очищенная вода.

Дезинфицирующий раствор: 0,5М ЫаОН.

Раствор для хранения: 0,01М ЫаОН.

Набивка колонки.

Колонку набивали смолой Рйепу1 Зерйагоке Еак1 Е1о\т НЗ в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры:

Диаметр 34 мм

Высота слоя 14-15 см

Объем слоя 125-135 мл

Процедура очистки.

Температура 5±3°С

Линейная скорость тока 240-300 см/ч

Дезинфицирование колонки.

Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ (объемом слоя колонки) 0,5М ЫаОН, затем промывали 3-5 ВУ очищенной воды.

Уравновешивание колонки.

Колонку промывали 5-6 или более ВУ уравновешивающего буфера: 50 мМ ацетат аммония, 1М сульфат аммония рН 8,25±0,1, проводимость 140±8 мС/см.

рН и проводимость проверяли и промывание продолжали, пока параметры эффлюента колонки не находились в пределах следующих желаемых величин: рН 8,25±0,1, проводимость 140±8 мС/см.

Получение исходного материала.

К рФСГч, полученному из стадии ΌΕΑΕ, добавляли 1М сульфат аммония и рН доводили до 8,25±0,1 добавлением 25% раствора аммиака.

Брали пробы для 1РС (5x0,5 мл) и эту фракцию наносили на колонку Рйепу1.

Нанесение.

Промывание после нанесения.

После завершения нанесения пробы колонку промывали 3-6 ВУ уравновешивающего буфера: 0,5М ацетат аммония, 0,9М сульфат аммония, рН 8,25±0,1, проводимость 130±5 мС/см.

- 11 008924

Элюция.

Начинали элюцию элюирующим буфером.

рФСГч начинал элюироваться в виде основного пика после 0,5-0,8 ВУ от старта. 3-4 ВУ основного пика собирали, начиная при увеличении величины оптической плотности (280 нм), в соответствии с хроматографическим профилем, изображенным на фиг. 5.

Брали пробы для 1РС (5x0,5 мл) и хранили при +5±3°С в течение не более 1 дня.

Стадия (4). Обращенная фаза на 8оитее 30 КРС.

Оборудование.

Хроматографическая колонка: УаШаде Ь 22/40.

УФ-монитор (длина оптического пути 2,5 мм), снабженный двухканальным самописцем (АшепФаш Вю8С1епсе8 или равноценный).

Перистальтический насос (ιηίπίρΐιΐδ 2 Οίΐίδοη или равноценный).

УФ-спектрофотометр (81ιίιηαάζιι или равноценный).

рН-метр (Ме!тоЬт или равноценный).

Кондуктометр (Ме!тоЬт или равноценный).

Весы (Мей1етТо1ебо или равноценные).

Материалы.

Промежуточный продукт рФСГч после Н1С.

Смола 8оитсе 30 КРС (Атегайат Вюкаепсек).

Ацетат аммония - Мегск.

Ледяная уксусная кислота - Мегск.

Шарики гидроксида натрия - Мегск.

50% раствор ΝαΟΗ - !Т. Вакег.

25% раствор аммиака - Мегск.

2-пропанол - Мегск.

Шарики гидроксида натрия - Мегск.

Буферы.

Базовый буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,6±0,2, проводимость 6,5±0,5 мС/см.

Уравновешивающий буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,6±0,2, содержащий 13% 2-пропанол (об./об.).

Элюирующий буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,6±0,2, содержащий 20% 2-пропанол (об./об.). Регенерирующий буфер: 50 мМ ацетат аммония рН 7,6±0,2, содержащий 35% 2-пропанол (об./об.). Дезинфицирующий раствор: 0,5М ΝαΟΗ.

Раствор для хранения: 0,01М ΝαΟΗ.

Набивка колонки.

Колонку набивали смолой 8оитсе 30КРС в соответствии с инструкциями изготовителя. Упакованная колонка имела следующие размеры:

Диаметр 22 мм

Высота слоя 13-14 см

Объем слоя 49,4-53,2 мл

Процедура очистки.

Получение исходного материала.

Промежуточный продукт после Н1С наносили на колонку с 13% (об./об.) 2-пропанола.

Все операции выполняли при следующих условиях:

Температура Комнатная температура (+20±5°С)

Линейная скорость тока 300-450 см/ч

Дезинфицирование колонки.

Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ (объемом слоя колонки) 0,5М ΝαΟΗ, затем промывали 6 ВУ очищенной воды.

Уравновешивание колонки.

Колонку промывали 7-10 или более ВУ уравновешивающего буфера: 50 мМ ацетат аммония рН 7,6±0,2, содержащий 13% 2-пропанол (об./об.).

Нанесение.

Исходный материал рФСГч после Н1С, полученный, как описано выше, наносили на эту колонку. Промывание после нанесения.

После завершения нанесения пробы колонку промывали 7-10 ВУ уравновешивающего буфера.

Элюция.

Начинали элюцию элюирующим буфером.

рФСГч начинал элюироваться в виде основного пика после 0,5-0,8 ВУ от старта. 5-7 ВУ основного пика собирали, начиная при увеличении величины оптической плотности (280 нм), в соответствии с хроматографическим профилем, изображенным на фиг. 6. После завершения сбора этот раствор разбавляли

- 12 008924

1:2 очищенной водой для уменьшения процента 2-пропанола в контакте с рФСГч.

Эта фракция содержала очищенный рФСГч.

Регенерация колонки.

После завершения элюции колонку промывали по меньшей мере 3 ВУ регенерирующего буфера.

Брали пробы для 1РС (5x0,5 мл) и эту фракцию выбрасывали.

Дезинфицирование.

Колонку промывали по меньшей мере 1-2 ВУ воды с последующим промыванием 3 ВУ 0,5М ΝαΟΗ, ток прекращали на 1 ч и затем эту колонку промывали 6 ВУ очищенной воды.

Хранение.

Колонку промывали по меньшей мере 3 ВУ раствора для хранения, 0,01М ΝαΟΗ и хранили до следующего цикла.

Стадия (5). Ультрафильтрация общей массы.

Оборудование.

УБ'яПслу 200 РЕ8, ВС или Нубгокай, предел отсечения молекулярной массы 5 кД (Байопик). Перистальтический насос (типа МаДегПех или равноценный).

УФ-спектрофотометр (типа БЫтабги или равноценный).

рН-метр (типа Мей1егТо1ебо или равноценный).

Кондуктометр (типа Мейойт или равноценный).

Материалы.

рФСГч - элюат Н1С.

Шарики гидроксида натрия - Мегск (Μ1ΟΗ).

Очищенная вода (Моби1аЬ или равноценная).

Азот (рабочее давление 3 бар) - категории ИРР.

Буферы.

Раствор для диафильтрации: ультрафильтрацию рФСГч проводили с использованием очищенной воды.

Дезинфицирующий раствор: 0,5М Μ1ΟΗ.

Раствор для хранения: 0,05М Μ1ΟΗ.

Процедура.

Все операции выполняли в холодной комнате (+5±3°С).

Ультрафильтрация.

Раствор элюата рФСГч-Н1С рециркулировали в системе У1уайоте и концентрировали до объема, меньшего чем 20 мл.

Фракцию ретентата разбавляли 4 объемами очищенной воды и концентрировали до <20 мл.

Стадию промывки повторяли, как описано, 5-7 или более раз.

рН и проводимость пермеата были 7,1±0,2 и 6,2±0,5 мС/см, соответственно. Если результаты были вне этих величин, стадию промывания повторяли.

рН пермеата: 7,1±0,2.

Проводимость пермеата: 6,2±0,5 мС/см.

Фракцию ретентата собирали в объем, подходящий для получения конечной концентрации рФСГч посредством ΟΌ (280 нм) около 0,5-0,7 мг/мл.

Брали пробы (10x0,5 мл) для анализа. Как пробы, так и общую массу хранили при -20°С.

Стадия (6). Стадия нанофильтрации для удаления вирусов.

Материалы и оборудование.

Промежуточный раствор рФСГч (после ΌΕΑΕ или подвергнутый ультрафильтрации после ВРС).

Предварительные фильтры с размером 47 мм типа Р1иогобте II ΡΤΚΌΙΌ (Ра11) или УУБР 0,1 мкм (М1Шроге).

Фильтры с размером 47 мм типа №Р (М1Шроге) или ΌΥ20 (Ра11).

Очищенная вода.

Бумажные рН-индикаторы.

Гидроксид натрия.

Регулируемый источник азота.

Изготовленная полностью из нержавеющей стали система фильтрации (М1Шроге).

Кремний- и 1удои-содержащая пробирка.

Буферы.

Дезинфицирующий раствор: 0,5М МЮН.

Процедура.

Все операции выполняли при комнатной температуре (+23±3°С).

Нанофильтрация.

Эту систему заполняли полученным после ΌΕΑΕ или подвергнутым ультрафильтрации после ВРС рФСГ, предварительно отфильтрованным на фильтрах 0,1 мкм. В начале фильтрования источник азота

- 13 008924 открывали, пока не получали начальное давление 0,5 бар, и вентиляционный клапан, расположенный на держателе (618С-До1бег), открывали для барботирования этой системы.

Как только появлялась первая капля раствора, вентиляционный клапан держателя закрывали и давление азота повышали до 2,3-2,8 бар.

Давление азота поддерживали при 2,3-2,8 бар и раствор фильтровали. Рабочие условия суммированы ниже.

Параметр	Диапазон
Проба	рФСГ после ϋΕΑΕ или подверг!	4УТЫЙ
ультрафильтрации после НРС
Давление азота	2,3-2,7 бар
	0,1-0,3 мл/мин с фильтром Ра11 на рФСГ после ϋΕΑΕ
	0,3-0,6 мл/мин с фильтром МИИроге на	рФСГ
Скорость тока	после ΟΕΆΕ
(мл/мин)	0,1-0,2 мл/мин с фильтром РаИ ультрафильтрованном после 0ΈΆΕ	на
	1-1,5 мл/мин с фильтром МИИроге ультрафильтрованном после НРС	на

Биологическая активность проб

Биологическую активность очищенного рФСГч измеряли с использованием способа прироста массы яичников §1ее1тап-РоЬ1еу. Удельную активность рассчитывали с использованием биологической активности, деленной на содержание белка, определенное по оптической плотности при 280 нм (принимая, что ε=9,95 М^-1 см^-1), а также с использованием биологической активности, деленной на содержание белка, определенное по способу Лоури. Удельная активность очищенной массы рФСГч показана в нижеследующей таблице.

Удельная активность общего очищенного рФСГч данного изобретения

Анализ	Проба
Концентрация белка согласно Об (мг/мл)	0,64
Удельная активность (биологическая активность/Οβ)	8876 МЕ/мг
Концентрация белка по способу Лоури (мг/мл)	0,75
Удельная активность (биологическая активность/Лоури)	7594 МЕ/мг

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

(1) анионообменной хроматографии на О Зерйагоке ЕЕ с 50 или около 50 мМ боратом, с 0,13 или около 0,13М №С1, рН при или около 8,5 в качестве элюента;

(1) ионообменной хроматографии;

1. Способ очистки рекомбинантного ФСГ человека или варианта ФСГ, предусматривающий стадии:
(2) аффинной хроматографии с иммобилизованным ионом металла элюата стадии (1) на хелатирующей Зерйагоке ЕЕ, с Си²⁺ в качестве иона металла и с 0,75 или около 0,75М ацетатом аммония, рН при или около 9 в качестве элюента;

(2а) анионообменной хроматографии элюата стадии (2) на ΌΕΆΕ Зерйагоке ЕЕ, с 0,11 или около 0,11М ацетатом аммония, рН при или около 8,5 в качестве элюента;

2. Способ по п.1, где ионообменную хроматографию проводят на сильной анионообменной смоле.

(2) хроматографии с иммобилизованным ионом металла и (3) гидрофобной хроматографии (Н1С).
(3) гидрофобной хроматографии элюата стадии (2а) на Рйеиу1 Зерйагоке ЕЕ НЗ с 50 или около 50 мМ ацетатом аммония, 0,25 или около 0,25М сульфатом аммония, рН при или около 8,25 в качестве элюента;

3. Способ п.2, где указанной анионообменной смолой является О ЗерДагоке ББ или смола, имеющая сходные свойства.
(4) обращенно-фазовой хроматографии элюата стадии (3) на Зоигсе 30 КРС с 50 или около 50 мМ ацетатом аммония, рН при или около 7,6, с 20 или около 20% 2-пропанолом (об./об.);

4. Способ по любому из пп.1-3, где ионообменную хроматографию проводят с использованием боратного буфера в качестве элюента.

5. Способ по п.4, где боратный буфер имеет рН 8,5 или около 8,5.

6. Способ по любому из пп.1-5, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят на смоле, имеющей тридентатные хелатирующие группы.

7. Способ п.6, где указанной хелатирующей группой является иминодиуксусная кислота.

8. Способ по любому из пп.1-7, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят

- 14 008924 на хелатирующей З1рйато8е ЕЕ или на смоле, имеющей сходные свойства.

9. Способ по любому из пп.1-8, где хроматографию с иммубилизованным ионом металла проводят с ионом металла, выбранным из Си²⁺, Ζη²⁺, Νί²⁺, Са²⁺, Мд²⁺ и Со²⁺.

10. Способ по любому из пп.1-8, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят с Си²⁺.

11. Способ по любому из пп.1-10, где хроматографию с иммобилизованным ионом металла проводят с использованием ацетата аммония в качестве элюента.

12. Способ по п.11, где содержащий ацетат аммония буфер имеет рН 9 или около 9.

13. Способ по любому из пп.1-12, где гидрофобную хроматографию (Н1С) проводят с использованием Рйеиу1 Зерйагоке ЕЕ НЗ или смолы, имеющей сходные свойства.

14. Способ по любому из пп.1-13, где гидрофобную хроматографию проводят с использованием смеси ацетат аммония (50 мМ)/сульфат аммония (0,25М) в качестве элюента.

15. Способ по любому из пп.1-14, включающий вторую стадию ионообменной хроматографии (2а), проводимую после стадии хроматографии с иммобилизованным ионом металла и перед стадией гидрофобной хроматографии (Н1С).

16. Способ по п.15, где вторую стадию ионообменной хроматографии проводят с использованием слабой анионообменной смолы.

17. Способ по п.16, где указанной слабой анионообменной смолой является смола ΌΕΆΕ Зерйагоке ЕЕ или смола, имеющая сходные свойства.

18. Способ по любому из пп.1-17, дополнительно включающий стадию обращенно-фазовой хроматографии (4), проводимую после стадии гидрофобной хроматографии (Н1С).

19. Способ по п.18, где обращенно-фазовую хроматографию проводят с использованием в качестве смолы Зоигсе 30 КРС или смолы, имеющей сходные свойства.

20. Способ по п.19, где обращенно-фазовую хроматографию проводят с использованием ацетата аммония (50 мМ, рН 7,6 или около 7,6) с 20% (об./об.) 2-пропанолом.

21. Способ по пп.18, 19 или 20, включающий стадию ультрафильтрации (5), проводимую после стадии обращенно-фазовой хроматографии.

22. Способ очистки рекомбинантного ФСГ человека, предусматривающий стадии:

(0) ультрафильтрации;
(5) ультрафильтрации элюата стадии (4) и (6) нанофильтрации ретентата стадии (5).