WO2021132957A1 - 여포 자극 호르몬의 정제 방법 - Google Patents

여포 자극 호르몬의 정제 방법 Download PDF

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WO2021132957A1
WO2021132957A1 PCT/KR2020/017999 KR2020017999W WO2021132957A1 WO 2021132957 A1 WO2021132957 A1 WO 2021132957A1 KR 2020017999 W KR2020017999 W KR 2020017999W WO 2021132957 A1 WO2021132957 A1 WO 2021132957A1
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chromatography
fsh
purification
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less
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PCT/KR2020/017999
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지황우
여수빈
설삼숙
박진형
방연정
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주식회사 엘지화학
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying follicle-stimulating hormone with high yield and high purity.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • Human FSH is used in the treatment of anovulatory women, stimulation of polyfollicular development (superovulation), and formulations for assisted conception such as IVF, ICSI, GIFT or CIFT.
  • Human FSH is also used to stimulate follicular maturation in women who produce low or no FSH, and to stimulate spermatogenesis in men with oligospermia.
  • FSH treatment requires repeated injections, and highly purified FSH formulations can be administered subcutaneously, allowing self-administration by the patient, thereby increasing patient convenience and compliance.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • the purification method of the present invention by effectively arranging the purification process sequence, the yield of FSH can be improved, the ability to remove impurities is maximized, and the efficiency of process operation can be increased.
  • One aspect embodying the present invention is a method of purifying follicle stimulating hormone (FSH) in high yield and high purity.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • the purification method comprises the steps of (a) immunoaffinity chromatography (IAC); (b) hydrophobic interaction chromatography (HIC); and (c) anion exchange chromatography (AEX).
  • IAC immunoaffinity chromatography
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • AEX anion exchange chromatography
  • the purification method of the present invention may be one in which steps (a) to (c) are performed only once and additionally the same or different chromatography is not performed.
  • the other chromatography is selected from the group consisting of size exclusion chromatography, dye affinity chromatography, reverse phase chromatography, and cation exchange chromatography. It may be any one or more, but is not limited thereto.
  • the purification method of the present invention is significant in that even if steps (a) to (c) are performed only once, the host cell-derived protein (impurity) can be removed and the purification yield can be improved.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • LH luteinising hormone
  • FSH and LH belong to a group of heterodimeric glycoproteins consisting of two non-covalently linked ⁇ - and ⁇ -chains encoded by separate genes. Both ⁇ - and ⁇ -chains are glycosylated.
  • the ⁇ -subunit consists of 92 amino acid residues, whereas the ⁇ -subunit consists of 111 amino acid residues, each of which has two potential asparagine-linked glycosylation sites.
  • Human FSH is used in the treatment of anovulatory women, stimulation of polyfollicular development (superovulation), and formulations for assisted conception such as IVF, ICSI, GIFT or CIFT. Human FSH is also used to stimulate follicular maturation in women who produce low or no FSH, and to stimulate spermatogenesis in men with oligospermia.
  • patients receive daily injections of FHS or variant (about 75-450 IU FSH/day) for about 6 to about 12 days.
  • patients receive daily injections of FSH or a variant (about 150-600 IU FSH/day) for about 6 to about 12 days.
  • the number of purification processes is simplified by improving the yield by effectively arranging the purification process sequence, maximizing the ability to remove host cell-derived proteins (impurities), and maximizing the removal of impurities through optimization of the column washing process steps. and to increase the efficiency of process operation.
  • step (a) is a step of immunoaffinity chromatography (IAC).
  • immunoaffinity chromatography refers to preparing an antibody against a physiologically active substance to be purified, covalently binding it to a solid carrier, and then applying a sample containing the physiologically active substance to be purified to the antibody.
  • IAC immunoaffinity chromatography
  • the immunoaffinity chromatography for FSH purification is performed using any protein that includes an FSH-specific protein, that is, a protein that binds to the Alpha subunit or Beta subunit of FSH, and has structural, physical, and chemical properties similar thereto. It refers to an exchange resin that uses the principle of selectively collecting only FSH using a column made by binding it to an appropriate matrix.
  • Immunoaffinity chromatography for FHS purification includes, but is not limited to, Thermo's CaptureSelect FHS resin, and in general, any resin used for immunoaffinity chromatography that specifically binds FSH can be used.
  • This method has the advantage of rapidly and quantitatively obtaining a physiologically active substance compared to conventional methods, such as gel filtration and ion exchange chromatography.
  • immunoaffinity chromatography may be to perform any one or more steps of an equilibration step, a sample injection step, a washing step, an elution step, and a resin washing step.
  • a buffer in the pH range of 7 to 8 may be used, and the number of moles of Tris of 10 to 50 mM may be used, for example, Tris, PBS, MOBS (3-morpholinopropane-1-sulfonic). acid), sulfonate, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), TES, phosphate, and/or isopropanol. can, but is not limited thereto.
  • the equilibration step refers to a step of creating an environment such as an appropriate pH and salt concentration in the column in order to attach the FSH contained in the culture solution to the column.
  • step (a) it is possible to remove other impurities including host cell-derived proteins, except for FSH, among various proteins adsorbed in the column through one or more washing steps, and specifically, washing three or more times
  • the steps may be performed, but are not limited to the number of steps.
  • the washing step refers to a step of removing other impurities, including host cell-derived proteins, except for FSH, from among various proteins adsorbed into the column. It is possible to remove not only host cell-derived proteins but also culture medium components.
  • a multi-step washing step was introduced. Specifically, a buffer in the pH range of 7 to 8 can be used, and the buffer solution in the pH range can be applied to all of the equilibration step, the washing step, and the elution step.
  • impurities having non-specific properties or having weak specific properties or impurities having relatively weak hydrophobicity properties to the immunoaffinity chromatography resin can be removed, and a mole number of 2 mM to 50 mM Tris can be used. and specifically, 2 mM to 10 mM Tris mole number may be used, but is not limited thereto.
  • the washing solution of the first washing step is Tris (Tris), PBS, MOBS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), sulfonate (Sulfonate), HEPES (2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1) -yl]ethanesulfonic acid), TES, phosphate (Phosphate), and / or may be to include any one or more selected from the group consisting of isopropanol (Isopropanol), but is not limited thereto.
  • impurities having relatively weak ionic binding strength to the immunoaffinity chromatography resin can be removed, and 10 mM to 50 mM Tris moles can be used, specifically, 10 mM to 30 mM Tris moles can be used. can, but is not limited thereto.
  • a salt concentration in the range of 0.5 M or more and 3 M or less, specifically, a salt concentration of 0.5 M to 1.5 M may be used.
  • sodium sulfate, sodium chloride, ammonium sulfate, ammonium chloride, and/or magnesium chloride may be used, and more specifically sodium chloride (Sodium Chloride) may be used, but is not limited thereto.
  • impurities with relatively weak immune affinity than FSH can be removed from the affinity chromatography resin, and 10 mM to 50 mM Tris moles can be used, and specifically, 10 mM to 30 mM Tris moles can be used. can be used, but is not limited thereto.
  • a salt concentration in the range of 0.01 M or more and 0.5 M or less, specifically, a salt concentration of 0.1 M to 0.3 M may be used, but is not limited thereto.
  • sodium sulfate, sodium chloride, ammonium sulfate, ammonium chloride, and/or magnesium chloride may be used, and more specifically, magnesium chloride. can be used, but is not limited thereto.
  • the elution step means a step of recovering the FSH bound to the resin.
  • magnesium chloride MgCl 2
  • a salt concentration of 1.5 M to 2.5 M in a buffer of pH 7 to 8 may be used.
  • sodium sulfate, sodium chloride, ammonium sulfate, ammonium chloride, and/or magnesium chloride may be used, and more specifically, magnesium chloride. can be used, but is not limited thereto.
  • a glycine buffer having a pH of 2.5 to 3.5 may be used, but is not limited thereto.
  • the resin cleaning (CIP) step means a step to block carryover by completely removing residual FSH, microorganisms and other impurities remaining in the column.
  • step (b) is a step of hydrophobic interaction chromatography (HIC).
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • Hydrophobic interaction chromatography refers to an exchange resin using a reversible interaction between a protein and a hydrophobic surface of a medium. Proteins are differentially separated from each other while binding to the column under conditions of high ionic strength, that is, high salt concentration, and gradually lowering the ionic strength.
  • hydrophobic interaction chromatography may be to perform any one or more steps of a sample injection step, an equilibration step, a washing step, an elution step, and a resin washing step.
  • hydrophobic interaction chromatography is phenyl, octyl, (iso)propyl ((iso)propyl), butyl (butyl) and ethyl (ethyl) It refers to a method of separation using a hydrophobic interaction between a matrix having a hydrophobic functional group, such as, and a certain molecule.
  • the resin of the hydrophobic interaction chromatography has a functional group selected from the group consisting of phenyl, octyl, (iso)propyl, butyl and ethyl. may be one, but is not limited thereto, and may be any resin generally used for hydrophobic interaction chromatography.
  • the equilibration step of the hydrophobic interaction chromatography refers to the step of creating an environment such as an appropriate pH and salt concentration in the column to attach the FSH contained in the eluate obtained from the immunoaffinity chromatography to the column.
  • a salt concentration of 1.5 M to 2.5 M may be used, and for example, sodium sulfate, sodium chloride, ammonium sulfate, and/or ammonium chloride may be used.
  • a buffer in the pH range of 7 to 8 may be used, and a number of moles of Tris of 10 mM to 50 mM may be used. This can be applied to all of the equilibration step, the washing step, and the elution step.
  • an eluate obtained by immunoaffinity chromatography may be used.
  • an equilibration buffer was used in the washing step, which is to remove impurities non-specifically bound to the resin.
  • the elution step refers to a step of recovering the FSH bound to the resin. Salt-free or low salt concentrations may be required to inhibit the hydrophobic interaction between FSH and the resin.
  • a buffer in the pH range of 7 to 8 may be used, and the number of moles of Tris of 10 to 50 mM may be used, but is not limited thereto.
  • the resin cleaning (CIP) step refers to a step to block carryover by completely removing residual FSH, microorganisms and other impurities remaining in the column. Residual FSH may be removed with purified water, and sodium hydroxide (NaOH), phosphoric acid, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • step (b) impurities such as host cell proteins that were not removed in step (a) are further removed to further increase the purity of FSH.
  • host cell proteins can be more effectively removed by using a filtration device capable of removing host cell-derived proteins using a hydrophobic reaction, etc., which has a different separation mechanism from the immunoaffinity chromatography method of step (a). .
  • the term “host cell protein (HCP)” is a protein different from the FSH, and usually refers to a protein derived from a host cell.
  • HCPs are preferably excluded from the initial antibody or protein preparation.
  • the removed host cell protein is a concept that includes all impurities except for the FSH to be purified, and may include not only the host cell protein itself, but also DNA derived from the host cell, factors for cell growth, and the like. Therefore, when the host cell protein is removed, only the protein to be purified can be purified with high purity.
  • step (c) is a step of anion exchange chromatography (AEX).
  • Ion exchange chromatography refers to an exchange resin using the reversible interaction of the net charge between the medium and the protein surface, that is, the difference in ionic bond strength.
  • Typical strong ion exchangers include Q and SP, and weak ion exchangers include DEAE, ANX, and CM. Substitute selectivity because each has a different pH range that is sufficiently charged.
  • the ion exchange resin is divided into an anion exchange resin and a cation exchange resin, and specifically, an anion exchange resin is used in the present invention.
  • anion exchange chromatography refers to chromatography using a column filled with an anion exchange resin, and in the above step, anion exchange chromatography is performed to remove impurities, specifically the host. Cellular proteins can be further removed and isoforms with a desired isoelectric point can be selectively isolated.
  • the anion exchange resin refers to a synthetic resin that is added to another aqueous solution to exchange a specific anion in the aqueous solution with its own anion, and the anion exchange column can adsorb a protein having an anion above its isoelectric point.
  • FSH fluoride-semiconductor
  • the protein (FSH) is attached to the anion exchange resin, and the target protein, that is, FSH, is separated when the eluate is passed after washing. steps can be performed.
  • anion exchange resin those commonly used in the art may be used, but not limited thereto, but specifically Q sepharose, quaternary aminoethyl or quaternary amine (Q), etc. may be used. , more specifically, Q Fast Flow TM may be used.
  • Anion exchange chromatography for the purposes of the present invention may be to perform any one or more steps of a sample injection step, an equilibration step, a washing step, an elution step, and a resin washing step.
  • the equilibration step refers to the step of creating an environment of appropriate pH and salt concentration in the column to attach the FSH obtained from the hydrophobic interaction chromatography to the column.
  • a buffer in the pH range of 7 to 8 may be used, and the number of moles of Tris of 10 mM to 50 mM may be used, but is not limited thereto.
  • the buffer solution may be applied to both the equilibration step and the elution step except for the washing step.
  • the washing step refers to a step of removing impurities adsorbed in the column.
  • isoforms other than isoforms having a desired isoelectric point can be selectively removed.
  • a buffer in the pH range of 5 to 6 may be used, and 1 mM to 100 mM of acetate, specifically, 10 mM to 50 mM of acetate may be used, but the number of moles is not limited thereto.
  • acetate, citrate, etc. may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the elution step refers to a step of recovering the FSH bound to the resin. It may be a salt concentration of 0.05 to 0.2 mol in a buffer solution of pH 7 to 8, for example, sodium sulfate, sodium chloride, ammonium sulfate, and/or ammonium chloride (Ammonium chloride). ) may be used, but is not limited thereto.
  • the resin cleaning (CIP) step refers to a step to block carryover by completely removing residual FSH, microorganisms and other impurities remaining in the column.
  • NaOH sodium hydroxide
  • phosphoric acid etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the host cell protein to be removed is a concept that includes all impurities except for the FSH to be purified as described above, and includes not only the host cell protein itself, but also the host cell-derived DNA and factors for cell growth. can do. Therefore, when the host cell protein is removed, only FSH to be purified can be purified with high purity.
  • the FSH purification method of steps (a) to (c), that is, a three-step column process it is possible to finally purify high-purity and high-yield FSH from which impurities, particularly host cell proteins, are efficiently removed.
  • any one of a concentration and a dialysis process and a filtration process may be additionally performed after steps (a) to (c), but is not limited thereto.
  • it may include a virus filtering process and a process of exchanging a buffer with a stock buffer solution (UF/DF), but is not limited thereto.
  • the content of the host cell protein may be specifically, 0.001 to 50 ppm, specifically 0.01 to 40 ppm, 0.1 to 30 ppm, 1 to 30 ppm, 3 to 25 ppm, 5 to 20 ppm, , more specifically 0.01 to 12 ppm, but is not limited thereto.
  • Example 2-2 shows that the content of the host cell protein decreased to less than 200 ppm after the first purification step, less than 50 ppm after the second purification step, and less than 15 ppm after the third purification step (implementation).
  • the method may be to equilibrate the column with a buffer solution of pH 7 or more to pH 8 or less before sample injection in steps (a) to (c).
  • the buffer solution is specifically, Tris (Tris), PBS, MOBS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), sulfonate (Sulfonate), HEPES (2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] It may be any one or more salts selected from the group consisting of ethanesulfonic acid), TES, and phosphate, and more specifically, may be Tris, but is not limited thereto.
  • the method may perform the step of washing one or more times with a washing solution in the range of pH 4 or higher to pH 8 or lower in steps (a) to (c). This is to remove primary impurities from the culture medium and to increase the purity of the sample.
  • the washing solution is sodium phosphate, potassium chloride, magnesium chloride, potassium phosphate, sodium chloride, Tris, MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl ]ethanesulfonic acid), citrate, acetate, succinate, sodium citrate, sodium acetate, sodium succinate, sodium sulfate, It may include one or more salts selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium chloride, and/or magnesium chloride, but is not limited thereto.
  • FSH separated using the purification method of the present application may mean a purity of 90% or more, specifically, a purity of 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, It may be 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, and more specifically, it may be 99% or more, but is not limited thereto.
  • the term “purity” refers to pure FSH from which impurities have been removed. For example, when purity is 92%, it means that the remaining 8% is impurities.
  • the purity may simply indicate the purity of the material separated from the elution solution, but the % of the final purity may vary depending on what % of the purity of the loaded sample is.
  • the purity of the FSH can be analyzed through HPLC or SDS-PAGE analysis after purification from the elution solution, but is not limited thereto.
  • FSH purified by the purification method of the present application may be used as a therapeutic protein.
  • therapeutic protein refers to a general term for proteins commonly used in biomedical science, and means having various physiological activities. The physiological activity serves to correct abnormal conditions due to deficiency or excessive secretion of substances involved in functional regulation in vivo by adjusting genetic expression and physiological functions, and may include general protein therapeutics. .
  • the FSH protein was purified by purification methods in 15 cases. Purification was performed up to step 1, step 2, or step 3 according to the test, and the purified liquid for each step was collected.
  • Example 1-2 Purification conditions for each step
  • IAC process step used buffer Injection volume (CV) equilibrium 20 mM Tris pH7.6 7 sample injection Culture solution or pre-purified solution - equilibrium 20 mM Tris pH7.6 5 wash 1 5 mM Tris pH7.6 7 wash 2 20mM Tris pH7.6/1M NaCl 5 wash 3 20mM Tris pH7.6/0.2M MgCl 2 7 dissolution 20mM Tris pH7.6/2M MgCl 2 7 CIP 0.5M Acetic acid 5
  • CV buffer Injection volume
  • HIC process step used buffer Injection volume (CV) equilibrium 20 mM Tris pH7.6/2 M NaCl 5 sample injection Culture or pre-purified solution - equilibrium 20 mM Tris pH7.6/2 M NaCl 3 dissolution 20 mM Tris pH7.6 10 Regeneration WFI 5 CIP 0.5 N NaOH 5
  • AEX process step used buffer Injection volume (CV) equilibrium 20 mM Tris pH7.6 5 sample injection Culture or pre-purified solution - equilibrium 20 mM Tris pH7.6 3 wash 30 mM Sodium Acetate pH 5.6 10 equilibrium 20 mM Tris pH7.6 5 dissolution 20 mM Tris pH7.6/0.1 M NaCl 10 CIP 0.5 N NaOH 5
  • Immobilization is performed using Kinetics buffer and Biotinylated anti-FSH antibody.
  • Example 2-2 HCP analysis conditions and analysis results
  • the purified solution was concentrated and buffer exchanged with purified water by centrifugation using an Amicon Centrifugal Filter. Protein quantitative analysis of the buffer-exchanged sample was performed using the Octet Qk analysis equipment of Example 2-1. HCP content analysis was performed using the concentrated and buffer-exchanged purified solution. For HCP analysis, Cygnus'"CHO Host Cell Protein 3 rd Generation" Kit was used. The analysis method is as follows.
  • TMB Substrate 100 ⁇ L of TMB Substrate is loaded into each plate well. React at 24 ⁇ 4 °C for 30 min.
  • Stop the reaction by adding 100 ⁇ L of Stop solution to each plate well.
  • the HCP content of each purification process step was calculated in ppm unit.
  • the purity of FSH was analyzed through SE-HPLC analysis. Acetonitrile was added to sodium phosphate solution to prepare a mobile phase of pH 7.0. Then, the sample was injected after equilibrating the column. Purity was confirmed by the peak that came out after the mobile phase was sufficiently flowed. The purity for each purification step is shown in FIG. 1 .
  • the oxide content of FSH was analyzed through RP-HPLC analysis. Potassium phosphate mobile phase (A) and acetonitrile were added to potassium phosphate to prepare a mobile phase (B) of pH 2.5. Then, the sample was injected after equilibrating the column. The oxide content was confirmed by the peaks generated by flowing the two mobile phases under a concentration gradient condition. The oxide content for each purification step is shown in FIG. 2 .

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Abstract

본 발명은 여포 자극 호르몬을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

여포 자극 호르몬의 정제 방법
본 발명은 여포 자극 호르몬을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.
다양한 치료제로 사용될 수 있는 다양한 단백질 치료 의약품들은 재조합 단백질로 제조하는 연구뿐만 아니라, 이의 임상 적용 및 상용화가 계속되고 있다.
이 중 재조합 단백질 중 한 예인, 여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone, FSH)은 하수체 전엽(anterior pituitary)의 생식선자극성세포(gonadotropic cells)로부터 생성되고, 순환계로 방출되는 호르몬으로, 여성의 난모 세포 성숙 및 남성의 정자 생성의 제어에 있어서 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone, LH)과 함께 작용한다. 인간 FSH는 무배란 여성의 치료, 다난포 발생(과배란)의 자극, 및 IVF, ICSI, GIFT 또는 CIFT과 같은 보조 수정(assisted conception)용 제제에 이용된다. 또한, 인간 FSH는 FSH를 낮게 생성하거나 또는 생성하지 못하는 여성의 여포 성숙을 자극하고, 정자과소증을 앓는 남성의 정자생성을 자극하는데 이용된다.
생식 이상 치료에 있어서 FSH의 중요성 때문에, 고순도 및 고특이적 활성의 재조합 FSH 제공이 필요한 실정이다. FSH 치료는 반복적인 주사를 필요로 하며, 고도로 정제된 FSH 제제는 피하로 투여될 수 있어, 환자에 의한 자기-투여를 가능하게 함으로써 환자 편의성 및 순응성을 높일 수 있다.
국제공개공보 WO 2006/051070 A1는 하기 단계: 1) 염료 친화성 크로마토그래피, 2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및 3) 역상 크로마토그래피를 포함하는 재조합 FSH의 정제 방법 및, FSH를 1) 음이온 교환 크로마토그래피, 2) 염료 친화성 크로마토그래피, 3) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 4) 역상 크로마토그래피 및 5) 음이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 FSH의 정제 방법에 관한 것이다.
국제공개공보 WO 2005/063811 A1는 1) 이온교환 크로마토그래피; 2) 고정된 금속 이온 크로마토그래피(immobilized metal ion chromatography); 및 3) 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 포함하는 재조합 인간 FSH의 정제 방법에 관한 것이다.
국제공개공보 WO 2007/065918 A2는 임의의 순서로 수행될 수 있는, 크로마토그래피 단계: 염료 친화성 크로마토그래피, 약 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 강 음이온 교환 크로마토그래피(strong anion exchange chromatography)를 포함하는 FSH 정제 방법에 관한 것이다.
이처럼 재조합 FSH 및 FSH 변이체의 새로운 정제 방법에 대한 계속 진행중인 요구가 있다. 특히, FSH의 정제를 위해 Capture 단계에서 염료 친화성 크로마토그래피를 주로 사용한다. 상기 염료 친화성 크로마토그래피를 사용하면 배양액 속의 배지 성분을 제거하고 목적 단백질을 회수하는 능력이 우수한 반면에 숙주세포 유래의 불순물을 제거하는 능력이 떨어지는 단점이 있다. 이러한 불순물은 다양하고 매우 복잡해서 하나로 특정지을 수 없기 때문에 목적 단백질의 품질을 변화시킬 위험이 높고, 또한 이러한 변화를 제어하기도 어렵다. 또한, 다량의 불순물을 추가로 제거하기 위해서 Capture 단계 이후에 복잡한 정제 단계가 요구되고 수율 감소의 원인이 된다.
본 발명자들은 고순도, 고수율의 FSH를 얻을 수 있는 새로운 정제방법을 개발하고자 노력한 결과, 정제 공정 순서를 효과적으로 배열함으로써 수율을 향상시키고 불순물의 제거능을 최대화하는 동시에 공정 운용의 효율성을 증대시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone; FSH)을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 정제 방법에 따르면 정제 공정 순서를 효과적으로 배열함으로써 FSH의 수율을 향상시키고, 불순물의 제거능을 최대하는 동시에, 공정 운용의 효율을 증대할 수 있다.
도 1은 SE-HPLC 순도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 RP-HPLC 산화물 함량 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone; FSH)을 고수율 및 고순도로 정제하는 방법이다.
구체적으로, 상기 정제 방법은 (a) 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography; IAC)하는 단계; (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography; HIC)하는 단계; 및 (c) 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography; AEX)하는 단계 순으로 수행되는 정제 방법일 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 (a) 내지 (c) 단계를 1회만 수행하고 추가로 동일하거나 다른 크로마토그래피를 수행하지 않는 것일 수 있다.
상기 다른 크로마토그래피는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 염료 친화성 크로마토그래피(dye affinity chromatography), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 및 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법은 (a) 내지 (c) 단계를 1회만 수행하더라도 숙주세포 유래 단백질 (불순물)을 제거하고, 정제 수율을 향상시킬 수 있다는 점에서 의의가 크다고 할 수 있다.
본 발명의 용어, “여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone; FSH)”은 하수체 전엽(anterior pituitary)의 생식선자극성세포(gonadotropic cells)로부터 생성되고, 순환계로 방출되는 호르몬이다. FSH는 여성의 난모 세포 성숙 및 남성의 정자 생성의 제어에 있어서 황체 형성 호르몬(luteinising hormone, LH)과 함께 작용한다. FSH 및 LH는 개별적인 유전자에 의하여 코딩되는 2개의 비공유적으로 연결된(non-covalently linked) α- 및 β- 사슬로 이루어진 헤테로다이머 당단백질(heterodimeric glycoproteins)의 군에 속한다. α- 및 β-사슬은 모두 글리코실화된다(glycosylated). α-서브유닛은 92개 아미노산 잔기로 이루어진 반면에, β-서브유닛은 111개 아미노산 잔기로 이루어지며, 이들 각각은 2개의 잠재적인 아스파라긴-연결 글리코실화 자리(asparagine-linked glycosylation sites)를 갖는다.
인간 FSH는 무배란 여성의 치료, 다난포 발생(과배란)의 자극, 및 IVF, ICSI, GIFT 또는 CIFT과 같은 보조 수정(assisted conception)용 제제에 이용된다. 또한, 인간 FSH는 FSH를 낮게 생성하거나 또는 생성하지 못하는 여성의 여포 성숙을 자극하고, 정자과소증을 앓는 남성의 정자생성을 자극하는데 이용된다.
배란 유도를 위한 전형적인 치료계획에서, 환자는 약 6일에서 약 12일 동안 FHS 또는 변이체(약 75 내지 450 IU FSH/일)를 매일 주사로 투여받는다. 과배란 유도(controlled ovarian hyperstimulation)를 위한 전형적인 치료계획에서, 환자는 약 6일에서 약 12일 동안 FSH 또는 변이체(약 150 내지 600 IU FSH/일)를 매일 주사로 투여받는다.
즉, FSH 치료는 반복적인 주사를 필요로 하므로, 고도로 정제된 FSH 제제가 필요한 실정이다.
본 발명에서는 이를 위해, 정제 공정 순서를 효과적으로 배열함으로써 수율을 향상시키고, 숙주세포 유래 단백질 (불순물)의 제거능을 최대화하고, 컬럼의 세척 공정 단계의 최적화를 통해 불순물 제거를 극대화함으로써 정제 공정 갯수를 간소화하고 공정 운용의 효율성을 증대하고자 하였다.
상기 여포 자극 호르몬을 정제하는 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저 (a) 단계는 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography; IAC)하는 단계이다.
본 발명에서 사용된 "면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography; IAC)"는 정제하고자 하는 생리활성물질에 대한 항체를 제조하여 고형담체에 공유결합시킨 후 정제하고자 하는 생리활성물질을 포함하는 시료를 항체-담체 복합체에 첨가하여 생리활성물질을 항체에 흡착시키고 적당한 방법으로 세척한 후 용출제를 첨가하여 목적물질을 용출 수득하는 방법을 의미한다. 본 발명에서 FSH 정제를 위한 면역 친화성 크로마토그래피는 FSH-특이적 단백질 즉, FSH의 Alpha subunit 또는 Beta subunit과 결합하는 단백질을 포함하고, 이와 구조적, 물리적, 화학적으로 유사한 특성을 갖는 어떠한 단백질을 이용하여 적절한 매트릭스에 결합시켜서 만든 컬럼을 이용하여 선택적으로 FSH만을 포집하는 원리를 이용한 교환 수지를 말한다.
FHS 정제를 위한 면역 친화성 크로마토그래피는 Thermo社의 CaptureSelect FHS resin 등이 있으나 이에 제한되지 않으며 일반적으로 FSH를 특이적으로 결합하는 면역 친화성 크로마토그래피에 사용하는 수지이면 어떤 것이든 가능하다.
이러한 방법은 기존의 방법, 즉 겔여과법(Gel Filtration), 이온교환 크로마토그래피법 등의 방법에 비하여 생리활성물질을 신속하게 정량적으로 얻을 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 목적상 면역친화성 크로마토그래피는 평형단계, 시료주입단계, 세척단계, 용출단계 및 레진세척단계 중 어느 하나 이상의 단계를 수행하는 것일 수 있다.
면역 친화성 원리를 이용하기 위해서는 pH 7 내지 8 범위의 완충액을 사용할 수 있고, 10 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으며, 일 예로 트리스(Tris), PBS, MOBS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), 술폰산염(Sulfonate), HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), TES, 인산염(Phosphate), 및/또는 이소프로판올(Isopropanol) 등의 완충액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 평형단계는 배양액에 포함된 FSH를 컬럼에 붙이기 위해서 컬럼 안을 적절한 pH, 염농도 등의 환경을 만드는 단계를 의미한다.
본 발명의 목적상 상기 (a)단계에서는 1회 이상의 세척단계를 통해 컬럼 내 흡착된 다양한 단백질 중 FSH를 제외하고 숙주세포 유래 단백질을 포함한 기타 불순물을 제거할 수 있으며, 구체적으로는 3회 이상의 세척단계를 수행할 수 있으나, 그 횟수에 제한되지 않는다.
세척단계는 컬럼 내에 흡착된 다양한 단백질 중에 FSH를 제외하고 숙주세포 유래 단백질을 포함한 기타 불순물을 제거하는 단계를 의미한다. 숙주세포 유래 단백질뿐만 아니라 배양액 성분도 제거할 수 있다. 본 실시 예에서는 다단계의 세척 단계를 도입하였다. 구체적으로, pH 7 내지 8 범위의 완충액을 사용할 수 있고, 상기 pH 범위의 완충액은 평형단계, 세척단계, 용출단계에 모두 적용될 수 있다.
일 예로, 세척 1단계에서는 면역 친화성 크로마토그래피 레진에 비특이적 성질을 갖거나 특이적 성질이 약한 불순물 또는 Hydrophobicity의 특성이 상대적으로 약한 불순물을 제거할 수 있으며, 2 mM 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 2 mM 내지 10 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 세척 1단계의 세척용액은 트리스(Tris), PBS, MOBS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), 술폰산염(Sulfonate), HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), TES, 인산염(Phosphate), 및/또는 이소프로판올(Isopropanol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
세척 2단계에서는 면역 친화성 크로마토그래피 레진에 이온 결합력이 상대적으로 약한 불순물을 제거할 수 있으며, 10 mM 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 10 mM 내지 30 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 0.5 M 이상 3 M 이하 범위의 염농도, 구체적으로는 0.5 M 내지 1.5 M의 염농도를 사용할 수 있다. 일 예로 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및/또는 염화 마그네슘(Magnesium chloride) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로 염화 나트륨(Sodium Chloride)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
세척 3단계에서는 친화성 크로마토그래피 레진에 FSH 보다 면역 친화력이 상대적으로 약한 불순물을 제거할 수 있으며, 10 mM 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 10 mM 내지 30 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 0.01 M 이상 0.5 M 이하 범위의 염농도, 구체적으로는 0.1 M 내지 0.3 M의 염농도를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및/또는 염화 마그네슘(Magnesium chloride) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로 염화 마그네슘을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용출단계는 레진에 결합된 FSH를 회수하는 단계를 의미한다. FSH와 레진 간 면역 친화력을 상쇄하기 위해서 염화 마그네슘(MgCl2)를 사용할 수 있으며, 구체적으로, pH 7 내지 8 범위의 완충액에 1.5 M 내지 2.5 M의 염농도 조건일 수 있다. 일 예로 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및/또는 염화 마그네슘(Magnesium chloride) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 구체적으로 염화 마그네슘을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 FSH를 용출하기 위한 다른 방법으로 pH 2.5 내지 3.5의 글라이신(Glycine) 완충액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
레진세척(CIP)단계는 컬럼 내에 남아있는 잔여 FSH나 미생물 그리고 기타 불순물을 완전히 제거하여 캐리오버를 차단하기 위한 단계를 의미한다. 시트르산(Citric acid), 아세트산(Acetic acid), 인산(Phosphoric acid), PAB, 우레아(Urea), 구아니딘 염산(Guanidine Hydrochloride), 및/또는 이소프로판올(Isopropanol) 수산화나트륨(NaOH), 및/또는 에탄올(Ethanol) 등을 이용할 수 있으며, 특히 0.1 M 내지 1 M의 아세트산을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 여포 자극 호르몬을 정제하는 방법에서, (b) 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography; HIC)하는 단계이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 단백질과 매질의 소수성 표면 간의 가역적인 상호작용을 이용한 교환 수지를 말한다. 이온 강도가 높은 즉, 염농도가 높은 조건에서 컬럼에 결합되고 이온 강도를 점차 낮게 만들면서 차별적으로 단백질을 서로 분리한다.
본 발명의 목적상 소수성 상호작용 크로마토그래피는 시료주입단계, 평형단계, 세척단계, 용출단계 및 레진세척단계 중 어느 하나 이상의 단계를 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography; HIC)"는 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)등의 소수성 기능기를 갖는 지지체(matrix)와 어떤 분자간의 소수성 상호작용을 이용하여 분리하는 방법을 의미한다.
구체적으로, 상대적으로 약한 소수성 표면(역상 수지의 훨씬 더 강한 소수성 표면과 비교하여)을 갖는 HIC 수지를 이용하여 수행될 수 있다. 소수성 표면 특성을 갖는 단백질은 통상적으로 에테르, 페닐, 부틸 또는 헥실기를 갖는 그러한 수지에 끌린다. 본 발명에서 소수성 상호작용 크로마토그래피의 수지는 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 일반적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용하는 수지이면 어떤 것이든 가능하다.
소수성 상호작용 크로마토그래피의 평형단계는 면역 친화성 크로마토그래피에서 얻은 용출액에 포함된 FSH를 컬럼에 붙이기 위해서 컬럼 안을 적절한 pH, 염농도 등의 환경을 만드는 단계를 의미한다. 이때 1.5 M 내지 2.5 M의 염농도를 사용할 수 있으며, 일 예로 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 및/또는 염화 암모늄(Ammonium chloride)등을 사용할 수 있다. 또한, pH 7 내지 8 범위의 완충액을 사용할 수 있고, 10 mM 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있다. 이는 평형단계, 세척단계, 용출단계에 모두 적용될 수 있다.
시료 주입 단계에서는 면역 친화성 크로마토그래피로 얻은 용출액을 사용할 수 있다.
본 발명의 목적상 세척단계에서는 평형 완충액을 사용하였으며, 이는 레진에 비특이적으로 결합한 불순물을 제가하기 위함이다.
용출단계는 레진에 결합된 FSH를 회수하는 단계를 말한다. FSH와 레진 간 소수성 상호작용을 억제하기 위해서는 염이 없거나 낮은 염농도가 필요할 수 있다. 또한, pH 7 내지 8 범위의 완충액을 사용할 수 있고, 10 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
레진세척(CIP)단계는 컬럼 내에 남아있는 잔여 FSH나 미생물 그리고 기타 불순물을 완전히 제거하여 캐리오버를 차단하기 위한 단계를 말한다. 정제수로 잔여 FSH를 제거할 수 있으며, 또한 수산화나트륨(NaOH), 인산(Phosphoric acid) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 (b)단계에서는 (a)단계에서 제거하지 못한 숙주세포 단백질 등의 불순물을 더욱 제거하여 FSH의 순도를 보다 높이기 위한 목적을 가진다. 본 단계에서는, (a)단계의 면역친화성 크로마토그래피법과 분리기전이 다른, 소수성 반응 등을 이용한, 숙주 세포 유래 단백질을 제거할 수 있는 여과 장치를 이용하여 숙주세포 단백질을 보다 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명에서 용어, “숙주세포 단백질(Host cell protein; HCP)”은, 당해 FSH와 상이한 단백질로서, 통상적으로 숙주세포로부터 유래하는 단백질을 의미한다. 의약품으로 사용될 수 있는 항체 또는 단백질에서는, HCP는 최초 항체 또는 단백질 제제로부터 배제되는 것이 바람직하다. 상기 제거되는 숙주세포 단백질은 정제하고자 하는 FSH를 제외한 불순물을 모두 포함하는 개념이며, 숙주세포 단백질 자체만이 아닌 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포생장을 위한 인자 등을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 상기 숙주세포 단백질을 제거하면 정제하고자 하는 단백질만을 고순도로 정제할 수 있다.
상기 여포 자극 호르몬을 정제하는 방법에서, (c) 단계는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography; AEX)하는 단계이다.
이온 교환 크로마토그래피는 매질과 단백질 표면의 순전하의 가역적인 상호 작용 즉, 이온 결합 강도의 차이를 이용한 교환 수지를 말한다.
강한 이온 교환기는 대표적으로 Q, SP가 있고, 약한 이온 교환기는 DEAE, ANX, CM 등이 있다. 각자 충분한 전하를 띠는 pH 범위가 다르기 때문에 대체가능한 선택성이 있다. 이온 교환수지는 음이온 교환수지와 양이온 교환수지로 나뉘고 본 발명에서는 구체적으로, 음이온 교환수지를 사용하였다.
본 발명에서 사용된 "음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography; AEX)"는 음이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 이용한 크로마토그래피를 의미하며, 상기 단계에서는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물, 구체적으로는 숙주세포 단백질을 추가로 제거할 수 있고 목적하는 등전점을 갖는 동형체를 선택적으로 분리할 수 있다.
상기 음이온 교환 수지는 다른 수용액에 첨가되어 수용액 속의 특정 음이온과 자신의 음이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지를 의미하며, 음이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 음이온을 띠는 단백질을 흡착시킬 수 있다. 본 발명의 FSH의 경우, 등전점이 낮으므로 중성 pH의 완충액을 사용할 경우 단백질(FSH)이 음이온 교환 수지에 붙게 되고, 세척 후에 용출액을 통과시킬 때 목적단백질 즉, FSH가 분리되는 원리로 제3정제 단계를 수행할 수 있다.
상기 음이온 교환 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 구체적으로는 큐 세파로오스(Q sepharose), 4급 아미노에틸 또는 4급 아민(Q) 등을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 Q 패스트 플로우(Q Fast Flow)TM를 사용할 수 있다.
본 발명의 목적상 음이온 교환 크로마토그래피는 시료주입단계, 평형단계, 세척단계, 용출단계 및 레진세척단계 중 어느 하나 이상의 단계를 수행하는 것일 수 있다.
평형단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 얻은 FSH를 컬럼에 붙이기 위해서 컬럼 안을 적절한 pH, 염농도 등의 환경을 만드는 단계를 말한다. pH 7 내지 8 범위의 완충액을 사용할 수 있고, 10 mM 내지 50 mM의 Tris 몰수를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충액은 세척단계를 제외한 평형단계, 용출단계에 모두 적용될 수 있다.
세척단계는 컬럼 내에 흡착된 불순물을 제거하는 단계를 말한다. 또한, 목적하는 등전점을 갖는 동형체 이외의 동형체를 선택적으로 제거할 수 있다. pH 5 내지 6 범위의 완충액을 사용할 수 있고, 1 mM 내지 100 mM의 아세트산염(Acetate), 구체적으로는 10 mM 내지 50 mM의 아세트산염(Acetate) 몰수를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 일 예로 아세트산염(Acetate), 구연산염(Citrate) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용출단계는 레진에 결합된 FSH를 회수하는 단계를 말한다. pH 7 내지 8 범위의 완충액에 0.05 내지 0.2 몰의 염농도 조건일 수 있으며, 일 예로 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 및/또는 염화 암모늄(Ammonium chloride) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
레진세척(CIP)단계는 컬럼 내에 남아있는 잔여 FSH나 미생물 그리고 기타 불순물을 완전히 제거하여 캐리오버를 차단하기 위한 단계를 말한다. 일 예로 수산화나트륨(NaOH), 인산(Phosphoric acid) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제거되는 숙주세포 단백질은 상기에서 언급한 바와 같이 정제하고자 하는 FSH를 제외한 불순물을 모두 포함하는 개념이며, 숙주세포 단백질 자체만이 아닌 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포생장을 위한 인자 등을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 상기 숙주세포 단백질을 제거하면 정제하고자 하는 FSH만을 고순도로 정제할 수 있다.
본 발명에 따라 상기 (a) 내지 (c) 단계의 FSH 정제 방법, 즉 3단계 컬럼 공정을 거치면 최종적으로 불순물, 특히 숙주세포 단백질이 효율적으로 제거된 고순도 및 고수율의 FSH를 정제할 수 있다.
본 발명은 (a) 내지 (c) 단계 이후에 농축 및 투석 공정, 여과 공정 중 어느 하나의 공정을 추가로 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Virus filtering 공정과 원액 완충용액으로 버퍼를 교환하는 공정(UF/DF)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
최종 정제 후에 숙주세포 단백질의 함량은 구체적으로, 0.001 내지 50 ppm일 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 40 ppm, 0.1 내지 30 ppm, 1 내지 30 ppm, 3 내지 25 ppm, 5 내지 20 ppm 일 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.01 내지 12 ppm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 숙주세포 단백질의 함량이 제1정제 단계 후에는 200 ppm 미만, 제2정제 단계 후에는 50 ppm 미만, 제3정제 단계 후에는 15 ppm 미만으로 감소함을 확인하였다(실시예 2-2). 특히, 면역친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 순서의 단 3단계 만으로도 12ppm 이하의 HCP를 나타낼 수 있음을 확인하여, 본 발명의 방법의 우수한 효과를 확인하였다(실시예 2-2).
상기 방법은 (a) 단계 내지 (c) 단계에서 시료주입 전에 pH 7 이상 내지 pH 8 이하의 완충용액으로 칼럼을 평형시키는 것 일 수 있다. 상기 완충용액은 구체적으로, 트리스(Tris), PBS, MOBS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), 술폰산염(Sulfonate), HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), TES, 인산염(Phosphate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염일 수 있으며, 더욱 구체적으로 트리스(Tris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법은 (a) 단계 내지 (c) 단계에서 pH 4 이상 pH 8 이하 범위의 세척용액으로 1회 이상 세척하는 단계를 수행할 수 있다. 이는 배양액에서 1차적인 불순물을 제거하고 시료의 순도를 높이기 위한 것이다. 상기 세척용액은 인산나트륨, 염화칼륨, 염화 마그네슘, 인산칼륨, 염화나트륨, 트리스, MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), 구연산염(Citrate), 아세트산염(Acetate), 숙신산염(Succinate), 구연산 나트륨(Sodium citrate), 아세트산 나트륨(Sodium acetate), 숙신산 나트륨(Sodium succinate), 황산 나트륨(Sodium sulfate), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및/또는 염화 마그네슘(Magnesium chloride)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 정제 방법을 이용하여 분리된 FSH는 순도가 90% 이상인 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 순도 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "순도"는 불순물이 제거된 순수한 FSH를 의미하는 것으로, 일 예로 순도가 92%라고 하면 나머지 8%가 불순물인 것을 의미한다. 또한, 순도는 용출용액에서 분리된 물질의 순도를 단순히 나타내는 것일 수 있으나, 로딩한 시료의 순도가 몇 %인지에 따라서도 최종 순도의 %가 달라질 수 있다.
또한, 상기 FSH의 순도는 용출용액으로부터 정제 후 HPLC 또는 SDS-PAGE 분석 등을 통해 분석 할 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.
본 실시예에서는 본 발명의 정제방법인 IAC -> HIC -> AEX 순으로 공정을 진행하였을 때, 최종 수율이 가장 우수하고, HCP의 함량이 가장 낮음을 확인하였다. 이는 크로마토그래피 갯수가 증가할수록 정제 효율이 높아짐을 알 수 있을 뿐만 아니라, 3개의 동일한 크로마토그래피(면역친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피)를 이용하더라도 공정순서를 어떻게 진행하느냐에 따라 정제 효율에 차이가 있음을 시사하는 것이다.
또한, 본 출원의 정제 방법으로 정제된 FSH는 치료용 단백질로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "치료용 단백질"은 통상적으로 바이오 의학에 사용되는 단백질을 총칭하는 개념으로서, 다양한 생리활성을 가지는 것을 의미한다. 상기 생리활성은 유전표현과 생리기능을 조정하여 생체 내에서 기능조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아 주는 역할을 하는 것으로서, 일반적인 단백질 치료제를 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범주가 제한되는 것은 아니다.
실시예1: 정제 공정
실시예1-1: 정제 공정 순서
Test
No.		 1차 컬럼 2차 컬럼 3차 컬럼
1 IAC - -
2 IAC HIC -
3 IAC HIC AEX
4 IAC AEX -
5 IAC AEX HIC
6 HIC - -
7 HIC AEX -
8 HIC AEX IAC
9 HIC IAC -
10 HIC IAC AEX
11 AEX - -
12 AEX IAC -
13 AEX IAC HIC
14 AEX HIC -
15 AEX HIC IAC
위와 같이 FSH를 위한 정제 단계 및 공정 순서의 최적화를 위해서 15가지 경우의 정제 방법으로 FSH 단백질을 정제하였다. 테스트에 따라 1단계 또는 2단계 또는 3단계까지 정제를 수행하였고, 각 단계의 정제액을 수집하였다.
각 단계의 정제액은 다음 단계의 로딩 시료로 사용하기 때문에 필요에 따라서 AEX 공정을 위해서는 희석 또는 버퍼 교환, HIC 공정을 위해서는 Salt 첨가 등의 전처리를 수행할 수 있다. IAC, HIC, AEX 정제의 기본 공정 조건은 모두 동일하게 적용하였다.
실시예 1-2: 각 단계의 정제 조건
각 정제 공정에 사용한 버퍼와 세부 공정 조건은 아래 표 2 내지 표 4에 요약하였다.
IAC 공정
단계 사용버퍼 주입 부피(CV)
평형 20mM Tris pH7.6 7
시료 주입 배양액 또는 전단계 정제액 -
평형 20mM Tris pH7.6 5
세척 1 5mM Tris pH7.6 7
세척 2 20mM Tris pH7.6/1M NaCl 5
세척 3 20mM Tris pH7.6/0.2M MgCl2 7
용출 20mM Tris pH7.6/2M MgCl2 7
CIP 0.5M Acetic acid 5
HIC 공정
단계 사용버퍼 주입 부피(CV)
평형 20mM Tris pH7.6/2 M NaCl 5
시료 주입 배양액 또는 전단계 정제액 -
평형 20mM Tris pH7.6/2 M NaCl 3
용출 20mM Tris pH7.6 10
Regeneration WFI 5
CIP 0.5 N NaOH 5
AEX 공정
단계 사용버퍼 주입 부피(CV)
평형 20mM Tris pH7.6 5
시료 주입 배양액 또는 전단계 정제액 -
평형 20mM Tris pH7.6 3
세척 30 mM Sodium Acetate pH 5.6 10
평형 20mM Tris pH7.6 5
용출 20mM Tris pH7.6/0.1 M NaCl 10
CIP 0.5 N NaOH 5
실시예 2: 정제 결과 확인
실시예2-1: 수율 결과
Octet Qk 분석 장비를 이용하여 배양액과 정제액의 단백질 정량 분석을 수행하였다. Octet Qk를 이용한 방법은 항원/항체 반응을 이용한 정량 분석법으로 목적 단백질만을 정량할 수 있다. 분석 방법은 하기와 같다.
Kinetics 완충액(Pall-ForteBio 사)을 이용하여 Biosensor를 안정화 시킨다.
Kinetics 완충액과 Biotinylated anti-FSH Antibody를 이용하여 Immobilization을 진행한다.
Kinetics 완충액으로 적절히 희석한 샘플의 Quantitation을 진행한다. 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1.7 M MgCl2 완충액을 이용하여 Regeneration 시킨다.
Kinetics 완충액을 이용하여 Neutralization을 진행한다.
이후, 각 단계 별 정제액을 정량한 후에 수율을 분석하였다. 정제 공정 순서에 따른 최종 수율은 표 5에 요약하였다.
Case 정제 공정 순서 최종 수율
(%)
1 IAC -> HIC -> AEX 66.7
2 IAC -> AEX -> HIC 57.3
3 HIC -> AEX -> IAC 4.2
4 HIC -> IAC -> AEX 11.2
5 AEX -> IAC -> HIC 54.6
6 AEX -> HIC -> IAC 49.4
그 결과, 본 발명의 정제방법인 IAC -> HIC -> AEX (case 1)순으로 공정을 진행하였을 때, 최종 수율이 가장 우수함을 알 수 있었다. 이는 동일한 크로마토그래피(면역친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피)를 이용하더라도 공정순서를 어떻게 진행하느냐에 따라 수율의 차이가 있음을 알 수 있는 것이며, IAC -> HIC -> AEX 로 진행하는 공정순서가 가장 중요한 요소임을 시사하는 것이다.
실시예2-2: HCP 분석 조건 및 분석 결과
HCP 함량분석을 위한 전처리 단계로 정제액을 Amicon Centrifugal Filter로 원심분리 방법을 이용하여 정제수로 농축 및 버퍼교환을 하였다. 실시예 2-1의Octet Qk 분석 장비를 이용하여 버퍼교환 한 시료의 단백질 정량 분석을 수행하였다. 농축 및 버퍼교환한 정제액을 이용하여 HCP 함량 분석을 수행하였다. HCP 분석은 Cygnus 사의 “CHO Host Cell Protein 3rd Generation” Kit를 이용하였다. 분석 방법은 하기와 같다.
시료 내의 HCP 함량이 Standard 범위 안에 들도록 적절히 희석 버퍼로 희석한다.
anti-CHO:HRP를 Plate Well에 100 μL씩 로딩한다.
Standard 및 시료를 각 Well에 50 μL씩 로딩한다. 400 ~ 600 rpm으로 24 ± 4 ℃에서 2시간 동안 반응한다.
반응액을 버리고, Wash 버퍼로 4회 세척한다.
TMB Substrate를 Plate Well에 100 μL씩 로딩한다. 24 ± 4 ℃에서 30분 동안 반응한다.
Stop 용액을 Plate Well에 100 μL씩 첨가하여 반응을 종료한다.
측정한 목적 단백질 정량값과 HCP 함량을 이용하여 각 정제 공정 단계의 HCP 함량을 ppm 단위로 계산하였다.
Test
No.		 정제 공정 순서 최종 정제액 농도
(mg/mL)		 HCP
(ng/mL)		 HCP
(ppm)
배양액 (HCCF) 0.0113 95110.1 8416823.0
1 IAC 1.0685 190.6 178.4
2 IAC->HIC 1.0984 36.7 33.4
3 IAC->HIC->AEX 1.1875 12.6 10.6
4 IAC->AEX 1.0377 96.2 92.7
5 IAC->AEX->HIC 0.9506 55.0 57.9
6 HIC 0.2362 1914100.5 8103727.8
7 HIC->AEX 0.5244 2403125.9 4582619.9
8 HIC->AEX->IAC 0.4288 1392.8 3248.1
9 HIC->IAC 0.8382 815.0 972.3
10 HIC->IAC->AEX 0.5981 176.3 294.8
11 AEX 2.1599 11761441.5 5445363.9
12 AEX->IAC 0.9887 896.4 906.6
13 AEX->IAC->HIC 0.5316 96.1 180.8
14 AEX->HIC 3.2517 4178171.2 1284919.0
15 AEX->HIC->IAC 1.3911 1282.8 922.1
그 결과, 본 발명의 정제방법인 IAC -> HIC -> AEX (Test No. 3)순으로 공정을 진행하였을 때, HCP의 함량이 가장 낮음을 알 수 있었다. 또한, 단일 크로마토그래피를 이용하였을 때 보다 다수의 크로마토그래피를 이용할수록 HCP의 함량이 낮아짐을 알 수 있었다. 이를 통해 크로마토그래피 갯수가 증가할수록 정제 효율이 높아짐을 알 수 있을 뿐만 아니라, 3개의 동일한 크로마토그래피(면역친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피)를 이용하더라도 공정순서를 어떻게 진행하느냐에 따라 정제 효율에 차이가 있음을 알 수 있는 것이다.
특히, 3개의 동일한 크로마토그래피를 사용하더라도 HIC->AEX->IAC(Test No. 8)순으로 공정을 진행하였을 때는 본 발명의 정제방법인 IAC -> HIC -> AEX 로 진행하였을 때와 비교하여 HCP의 함량 차이가 3000배 이상 차이가 남을 알 수 있다. 이는 본 발명의 정제방법에서는 공정순서가 가장 중요한 요소임을 시사하는 것이다.
실시예 2-3: SE-HPLC 순도 분석 결과
SE-HPLC 분석을 통해 FSH의 순도를 분석하고자 하였다. 인산나트륨 용액에 Acetonitrile을 첨가하여 pH 7.0의 이동상을 제조하였다. 이후, 컬럼을 평형화 시킨후 시료를 주입하였다. 이동상을 충분히 흘려서 나온 피크로 순도를 확인하였다. 각 정제 단계 별 순도를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 정제 공정이 진행될수록 주피크인 Dimer 피크의 순도가 높아짐을 확인하였다.
실시예 2-4: RP-HPLC 산화물 함량 분석 결과
RP-HPLC 분석을 통해 FSH의 산화물 함량을 분석하고자 하였다. Potassium phosphate 이동상(A)과 Potassium phosphate에 Acetonitrile을 첨가하여 pH 2.5의 이동상(B)을 제조하였다. 이후, 컬럼을 평형화 시킨후 시료를 주입하였다. 두 이동상을 농도 구배 조건하에서 흘려주어 나온 피크로 산화물 함량을 확인하였다. 각 정제 단계 별 산화물 함량을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정제 공정이 진행될수록 산화물 피크가 낮아지면서 순도가 높아짐을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone; FSH)을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 하기의 순서로 수행되는 것인, 정제 방법:
    (a) 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography; IAC)하는 단계;
    (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography; HIC)하는 단계; 및
    (c) 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography; AEX)하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 내지 (c) 단계를 1회 수행하고, 추가로 동일하거나 다른 크로마토그래피를 수행하지 않는 것인, 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 다른 크로마토그래피는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 염료 친화성 크로마토그래피(dye affinity chromatography), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 및 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 각 단계의 크로마토그래피는 시료주입단계, 평형단계, 세척단계 및 용출단계 중 어느 하나 이상의 단계를 추가로 수행하는 것인, 정제 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 면역친화성 크로마토그래피는 FSH에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는 수지를 이용하여 수행되는 것인, 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 세척단계는 pH 7 이상 pH 8 이하 범위의 세척용액으로 1회 이상의 단계로 수행하는 것인, 정제 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 세척용액은 트리스(Tris), PBS, MOBS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), 술폰산염(Sulfonate), HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid), TES, 인산염(Phosphate), 및 이소프로판올(Isopropanol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 정제 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 세척용액은 2 mM 내지 50 mM의 몰농도 범위를 갖는 것인, 정제 방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 세척용액은 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및 염화 마그네슘(Magnesium chloride)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 세척용액은 0.1 M 이상 3 M 이하 범위의 염농도를 갖는 것인, 정제 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 용출단계는 pH 7 이상 pH 8 이하 범위의 완충액으로 수행되는 것인, 정제 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 용출용액은 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및 염화 마그네슘(Magnesium chloride)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 용출용액은 1.5 M 이상 2.5M 이하 범위의 염농도를 갖는 것인 것인, 정제 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 세척단계는 pH 4.5 이상 pH 6.5 이하 범위의 세척용액으로 수행하는 것인, 정제 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 세척용액은 구연산염(Citrate), 아세트산염(Acetate), 숙신산염(Succinate), 구연산 나트륨(Sodium citrate), 아세트산 나트륨(Sodium acetate), 및 숙신산 나트륨(Sodium succinate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 정제 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 세척용액은 20 mM 내지 40mM의 몰농도 범위를 갖는 것인, 정제 방법.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 내지 (c) 단계의 FSH 시료 적제 전에 pH 7 이상 pH 8 이하 범위의 pH를 갖는 완충용액으로 칼럼을 평형시키는 것인, 정제 방법.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 용출단계는 pH 7 이상 pH 8 이하의 범위의 완충액으로 수행되는 것인, 정제 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 용출용액은 황산 나트륨(Sodium sulfate), 염화 나트륨(Sodium Chloride), 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 염화 암모늄(Ammonium chloride), 및 염화 마그네슘(Magnesium chloride)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 용출용액은 0.05 M 이상 0.2M 이하 범위의 염농도를 갖는 것인 것인, 정제 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 방법에 의해 정제된 여포 자극 호르몬(FSH)의 순도는 HCP 값이 50ppm 이하인 것인, 정제 방법.
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