CN116143901A - 一种促卵泡激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促卵泡激素的纯化方法，它包括如下步骤：取含促卵泡激素的培养液进行亲和层析，亲和层析液低pH孵育后再进行复合阴离子交换层析，收集复合阴离子交换层析液，即得。本发明将去除细胞和细胞碎片等固体杂质的含有FSH或FSH‑CTP细胞培养液上清进行亲和层析，低pH病毒灭活，以及复合模式层析，收集得到的促卵泡激素收率高，SEC纯度单体峰含量高，解离亚基少。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种促卵泡激素的纯化方法。
背景技术
卵泡刺激素又称促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)，是由垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，受下丘脑分泌的促卵泡激素释放激素控制，FSH是一种异源二聚体糖蛋白，由非共价结合的α亚基和β亚基组成，一般认为α亚基主要负责信号传导，β亚基主要与生理功能有关，α亚基和β亚基单独都不具有生物活性，二者结合在一起引起结构变化，才具有生物活性，其生理功能是促使卵巢(或精巢)发育，促进卵泡(或精子)的生成和释放。
国内促卵泡激素有每天给药1次的短效FSH，以及可7天给药1次的FSH-CTP。FSH-CTP与FSH类似，需要在下游纯化工艺中尽量除去各种杂质，减少蛋白的解离降解，提高蛋白纯度，以达到不同产品的纯度、质量需求。
目前对促卵泡激素的纯化工艺研究报道较多，例如CN102448979B公开了可适于长效FSH的纯化工艺，其步骤包括：阴离子交换层析，疏水作用层析和染料亲和层析，这些步骤以任意顺序进行。刘晓航等，重组人长效促卵泡激素FSH-CTP的纯化工艺研究及鉴定[J],生物技术进展,2016,6(3),219～223中公开了为获得高纯度的重组人长效促卵泡激素FSH-CTP，收集表达FSH-CTP的CHO细胞培养上清，经过染料亲和层析、DEAE阴离子交换层析以及疏水层析三步层析制备。CN114867740A公开了纯化促卵泡激素的方法，其步骤包括：(a)进行免疫亲和层析(IAC)；(b)进行疏水相互作用层析(HIC)；和(c)进行阴离子交换层析(AEX)。其中免疫亲和层析(IAC)包括清洗步骤，其中清洗进行至少3次。
在已经公开的这些促卵泡激素纯化方法中都存在着如下问题：1)至少需要经过三步层析纯化才能得到纯度和质量符合要求的rhFSH或者FSH-CTP药液；2)层析步骤之间需要对样品进行额外处理，如通过超滤步骤进行缓冲液置换(洗脱液中的高浓度盐)、或者大量稀释以降低盐浓度，这都使得纯化生产操作过于复杂。
因此，本领域需要开发一种成本低，步骤少，操作简便，质量稳定的促卵泡激素的纯化方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种促卵泡激素的纯化方法，它包括如下步骤：
取含促卵泡激素的培养液进行亲和层析，亲和层析液低pH孵育后再进行复合阴离子交换层析，收集复合阴离子交换层析液，即得。
进一步地，所述亲和层析是培养液上样于以CaptureSelect FollicleStimulating Hormone(FSH)Affinity Matrix为填料的层析柱，用pH值4.5±0.1的含盐乙酸水溶液洗脱；所述含盐乙酸水溶液中乙酸浓度为10～50mM，盐浓度为0.3～0.5M。
进一步地，所述盐为氯化镁，浓度0.3M。
进一步地，所述低pH孵育是亲和层析液在温度18～26℃，pH值3.7～3.8的条件下孵育60～90min，再调pH值至7.1～7.3。
进一步地，所述复合阴离子交换层析是低pH孵育后的亲和层析液上样于以Diamond Mix-A为填料的层析柱，用含盐Tris缓冲液淋洗；所述含盐Tris缓冲液中盐浓度为0.25～0.3M。
更进一步地，所述含盐Tris缓冲液为含氯化钠的Tris缓冲液，pH值7.2，Tris浓度20mM，氯化钠浓度0.3M。
进一步地，所述复合阴离子交换层析液从UV280上升至50mAu/mm开始收集，UV280下降至50mAu/mm结束收集。
进一步地，所述培养液是去除固体杂质的含促卵泡激素的细胞培养液。
更进一步地，所述促卵泡激素为长效促卵泡激素(FSH-CTP)或短效促卵泡激素(FSH)。
通过本发明纯化方法收集得到的复合阴离子交换层析液，还需进行除病毒过滤、超滤、除菌过滤步骤，除病毒过滤目的是清除样品中潜在的病毒，超滤的目的是将样品浓缩到目的浓度，以便于后续置换为制剂成品所需的缓冲液配方，除菌过滤目的是为去除潜在的微生物，具体操作除病毒过滤、超滤和除菌过滤均为本领域常规技术。
本发明在使用CaptureSelect Follicle Stimulating Hormone(FSH)AffinityMatrix填料进行亲和层析纯化FSH或FSH-CTP时，采用通常的两种洗脱方法，即在中性pH条件以高浓度(通常2M)氯化镁进行洗脱；以及极端低pH进行洗脱(通常pH3.0)发现：中性条件洗脱的样品含有高浓度的氯化镁，无法直接衔接诸如结合-洗脱模式的离子交换层析和疏水层析等层析步骤，需要在后续层析步骤前对样品进行诸如超滤换液、稀释等处理，而极端低pH会造成蛋白α亚基和β亚基解离。经过大量的试验研究发现将两种洗脱方式有机结合起来能够很好地规避这些问题。
本发明将去除细胞和细胞碎片等固体杂质的含有FSH或FSH-CTP细胞培养液上清进行亲和层析，低pH病毒灭活，以及复合模式层析，收集得到的促卵泡激素收率高，SEC纯度单体峰含量高，解离亚基少。
相对现有技术，本发明取得了如下有益效果：
1.仅用两步层析，就可以获得符合质量标准的原料药液；在简化了纯化步骤的前提下保证了原料药液的SEC纯度单体峰含量99.6％以上，解离亚基小于0.3％，收率为93％以上。
2.亲和层析洗脱方式的优化，两步层析之间不需要进行超滤换液、稀释等其它样品处理步骤，避免了繁杂的超滤换液、样品稀释过程，简化了纯化的过程，节省成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1促卵泡激素的纯化
取含长效促卵泡激素(FSH-CTP)的细胞培养液，去除细胞和细胞碎片，进行亲和层析，亲和层析液用醋酸或枸橼酸调pH值至3.7～3.8，26℃下孵育1h，然后用Tris回调pH值至7.1～7.3，再进行复合阴离子交换层析，收集复合阴离子交换层析液，即得；
亲和层析是去除细胞和细胞碎片的细胞培养液上样于以CaptureSelectFollicle Stimulating Hormone(FSH)Affinity Matrix为填料的层析柱，用pH值4.5±0.1的含0.3M氯化镁的10～50mM乙酸水溶液洗脱，收集得亲和层析液，具体操作步骤如下：
复合阴离子交换层析是低pH孵育后的亲和层析液上样于以Diamond Mix-A为填料的层析柱，用pH值7.2的含0.3M氯化钠的10～50mM Tris淋洗，从UV280上升至50mAu/mm开始收集，UV280下降至50mAu/mm结束收集，得复合阴离子交换层析液，具体操作步骤如下：
实施例2促卵泡激素的纯化
取含短效促卵泡激素(FSH)的细胞培养液，去除细胞和细胞碎片，进行亲和层析，亲和层析液用醋酸或枸橼酸调pH值至3.7～3.8，18℃孵育1.5h，然后用Tris回调pH值至7.1～7.3，再进行复合阴离子交换层析，收集复合阴离子交换层析液，即得；
亲和层析是去杂后的细胞培养液上样于以CaptureSelect FollicleStimulating Hormone(FSH)Affinity Matrix为填料的层析柱，用pH值4.5±0.1的含0.3M氯化镁的10～50mM乙酸水溶液洗脱，收集得亲和层析液，具体操作步骤如下：
复合阴离子交换层析是低pH孵育后的亲和层析液上样于以Diamond Mix-A为填料的层析柱，用pH值7.2的含0.3M氯化镁的10～50mM Tris缓冲液淋洗，从UV280上升至50mAu/mm开始收集，UV280下降至50mAu/mm结束收集，得复合阴离子交换层析液，具体操作步骤如下：
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1长效促卵泡激素(FSH-CTP)纯化方法
本发明长效促卵泡激素(FSH-CTP)氨基酸序列如下：
α亚基氨基酸序列：
APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ
KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS
β亚基氨基酸序列：
NSCELTNITI AIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKESSSSKAPPPSLPSPSRLPG PSDTPILPQ
长效促卵泡激素(FSH-CTP)制备参照公开号为WO1990009800A1中方法制备：
(ⅰ)FSH-CTP的α亚基表达载体构建；
(ⅱ)FSH-CTP的β亚基表达载体构建；
(ⅲ)构建的表达载体转染入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达获得FSH-CTP。
具体参见说明书17页第25行-20页第6行。
样品长效促卵泡激素(FSH-CTP)来源：成都景泽生物制药有限公司生产，批号为JZB36X20220602，细胞培养液上清，去除细胞和细胞碎片等固体杂质备用。
1、亲和层析：
填料：CaptureSelect Follicle Stimulating Hormone(FSH)Affinity Matrix
表1：亲和层析操作条件
2、低pH灭活步骤：
用醋酸或枸橼酸将上述亲和层析洗脱液pH调至3.7～3.8(低于3.7会造成明显的蛋白解离降解)，室温条件下孵育1h，然后用Tris回调pH至7.1～7.3备用。
3、复合模式层析步骤
将经上述低pH灭活后的收集液进行复合模式层析,收集穿透峰。
层析填料：Diamond Mix-A(博格隆)
Diamond Mix-A为一种复合配基的阴离子交换层析介质，与目标蛋白之间存在多种相互作用模式，包括离子交换、疏水作用以及氢键作用等。
表2：复合模式层析操作条件
4、各步骤纯化后收集液SEC纯度(％)及工艺残留结果如下表3所示
表3纯化后收集液检测结果
试验例2亲和层析洗脱步骤pH及盐浓度对层析结果的影响
考虑到高盐和低pH亲和层析存在的问题，本发明尝试降低洗脱液盐浓度，同时控制pH进行以下实验。
样品：成都景泽生物制药有限公司生产，批号JZB36X20220602
实验过程：取FSH-CTP细胞培养液上清的样品，去除细胞和细胞碎片等固体杂质，洗脱步骤的洗脱条件按下表4进行，其他步骤按本发明实施例1中亲和层析操作条件进行。亲和层析结束，检测SEC纯度(％)及工艺杂质残留指标，结果见下表4。
表4不同洗脱液下的亲和层析液检测结果
由表4结果可知，在中性pH条件下降低氯化镁进行洗脱，收率明显降低；pH3.0进行洗脱收率也较低，同时洗脱峰有较多的聚合体和解离亚基，纯度明显下降；结合两种洗脱方式的实验组结果显示，从收率来看，当将pH降低到4.5时，氯化镁浓度降到0.3M仍然有较好的洗脱效果；各实验组从残留检测结果没有明显差异。
试验例3低pH病毒灭活对层析结果的影响
为了确定低pH病毒灭活操作参数，分别在pH3.5-3.8的条件下进行低pH孵育，表5记载了不同pH条件下，孵育不同时间后样品的纯度变化情况。
表5低pH病毒灭活条件及结果
由上表5结果可知，孵育pH越低、孵育时间越长，产生的解离亚基和聚合体越多，为了保护收率同时减少后续步骤除聚合体和解离亚基的压力，低pH病毒灭活条件设定为18～26℃，pH3.7～3.8，孵育60～90min。
试验例4复合模式层析条件对层析结果的影响
样品：批号JZB36X20220602(成都景泽生物制药有限公司)
实验过程：取含有FSH-CTP细胞培养液上清样品，去除细胞和细胞碎片等固体杂质，按照本发明实施例1操作依次进行亲和洗脱和低pH灭活，收集液分别按下表6的上样条件进行上样，其他条件按本发明实施例1中复合模式层析条件进行，复合模式层析，检测SEC纯度(％)及工艺杂质残留指标，结果见下表6。
表6复合模式层析条件及结果
上表6结果可以看出，收集复合模式层析穿透液的实验中，当样品氯化镁盐浓度降低到0.25M时，收率明显下降，当样品氯化镁浓度升高到0.35M时，HCP和HCD残留明显高于0.3M条件，同时发现，随着氯化镁浓度的升高，聚合体和解离亚基的含量也在升高。因此，为了保护收率同时控制聚合体、解离亚基和工艺杂质的量，确定用20mM Tris+0.3M MgCl2,pH7.2的上样条件为了工艺的连续性，因此也确定亲和层析步骤用20mM HAc+0.3MMgCl2,pH4.5条件进行洗脱。
由于氯化钠的成本比氯化镁更低，因此，复合模式层析的平衡缓冲液和淋洗缓冲液用20mM Tris+0.3M NaCl,pH7.2。
综上，本发明将去除细胞和细胞碎片等固体杂质的含有FSH或FSH-CTP细胞培养液上清上样于亲和层析柱，用10～50mM HAc+0.3MMgCl2,pH4.5±0.1洗脱，收集得到的亲和层析液低pH病毒灭活，再上样于复合阴离子层析柱，用20mM Tris+0.3M NaCl,pH7.2淋洗，收集得到的促卵泡激素收率高，SEC纯度单体峰含量高，解离亚基少。
Claims (9)
1.一种促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：
取含促卵泡激素的培养液进行亲和层析，亲和层析液低pH孵育后再进行复合阴离子交换层析，收集复合阴离子交换层析液，即得。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述亲和层析是培养液上样于以CaptureSelect Follicle Stimulating Hormone(FSH)Affinity Matrix为填料的层析柱，用pH值4.5±0.1的含盐乙酸水溶液洗脱；所述含盐乙酸水溶液中乙酸浓度为10～50mM，盐浓度为0.3～0.5M。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于：所述盐为氯化镁，浓度0.3M。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述低pH孵育是亲和层析液在温度18～26℃，pH值3.7～3.8的条件下孵育60～90min，再调pH值至7.1～7.3。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述复合阴离子交换层析是低pH孵育后的亲和层析液上样于以Diamond Mix-A为填料的层析柱，用含盐Tris缓冲液淋洗；所述含盐Tris缓冲液中盐浓度为0.25～0.3M。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于：所述含盐Tris缓冲液为含氯化钠的Tris缓冲液，pH值7.2，Tris浓度20mM，氯化钠浓度0.3M。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述复合阴离子交换层析液从UV280上升至50mAu/mm开始收集，UV280下降至50mAu/mm结束收集。
8.根据权利要求1～7任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述培养液是去除固体杂质的含促卵泡激素的细胞培养液。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于：所述促卵泡激素为长效促卵泡激素或短效促卵泡激素。
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