KR20240064367A - TGF-β3 단백질의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대장균에서 TGF-β3 단백질을 고효율 및 고순도로 분리정제하기 위한 전처리방법 및 이를 포함하는 TGF-β3 단백질 정제방법에 대한 것이다.
본 발명의 전처리방법 및 이를 포함하는 정제방법을 사용하는 경우 대장균을 이용하기 때문에 동물세포 배양방법 대비 공정이 간단하고 높은 생산성을 기대할 수 있으므로, 대장균으로부터 고효율로 고순도의 TGF-β3 단백질을 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 전처리방법 및 이를 포함하는 정제방법을 사용하는 경우 대장균을 이용하기 때문에 동물세포 배양방법 대비 공정이 간단하고 높은 생산성을 기대할 수 있으므로, 대장균으로부터 고효율로 고순도의 TGF-β3 단백질을 분리 및 정제할 수 있다.
Description
본 발명은 대장균에서 TGF-β3 단백질을 고효율 및 고순도로 분리정제하기 위한 전처리방법 및 이를 포함하는 TGF-β3 단백질 정제방법에 대한 것이다.
형질전환 성장인자-β(TGF-β)의 아형인 TGF-β3 는 내배엽 발달, 기관형성, 상피 증식, 세포외 기질 합성 및 면역 반응을 비롯한 다양한 생물학적 과정에 필수적이다. 본질적으로, TGF-β3 는 TGF-β1/Smad 신호 전달 경로에 관여하여 중간엽 계통 세포를 자극하고, 상피 또는 신경외배엽 계통 세포를 억제하고, 피부 상처 후 복구, 리모델링 및 잠재적 흉터를 조절한다.
생체 활성 인간 TGF-β3 는 원핵 및 진핵 발현 시스템 모두에서 대규모로 생산하기가 어렵다. 후자는 수율이 낮고 방법론적으로 복잡하고 비용이 많이 드는 반면 전자는 비활성 봉입체를 생성하기 때문이다. 따라서 고순도 TGF-β3 를 제조하기 위해서는 새롭고 확장 가능하며 시간과 비용을 절약할 수 있는 생산 플랫폼이 시급히 필요하다.
본 발명자들은 고순도 TGF-β3 를 제조하기 위해서는 새롭고 확장 가능하며 시간과 비용을 절약할 수 있는 생산 플랫폼을 제공하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 전처리방법 및 이를 포함하는 정제방법을 사용하는 경우 고효율로 고순도의 TGF-β3 를 분리 및 정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장균에서 TGF-β3 단백질을 고효율 및 고순도로 분리정제하기 위한 전처리방법 및 이를 포함하는 TGF-β3 단백질 정제방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 i) 대장균 배양액에서 대장균을 회수하는 단계;
ii) 상기 회수한 대장균을 파쇄하여 TGF-β3 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;
iii) 상기 봉입체를 세척하는 단계;
iv) 상기 세척한 봉입체를 가용화(solubilization)하는 단계; 및
v) 상기 가용화된 봉입체를 재접힘(refolding) 반응 시키는 단계;
를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제를 위한 전처리방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii) 의 파쇄는 800 ~ 1200 bar 의 압력으로 1 ~ 5회 파쇄하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 세척은 1 ~ 5 회 세척하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 세척은 계면활성제로 세척한 후 증류수로 세척하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 가용화는 요소(Urea), DTT(1,4-dithiothreitol) 및 트리스(Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 가용화하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 가용화는 pH 7 ~ pH 9 인 버퍼로 가용화하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 가용화는 버퍼로 1 ~ 24 시간 동안 가용화하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 CHES(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), NaCl, 환원형 글루타티온(Glutathione reduced), 산화형 글루타티온(Glutathione oxidized), CHAPS, L-아르기닌(L-Arginine) 및 D-소르비톨(D-Sorbitol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 재접힘 반응시키는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 pH 8.5 ~ pH 10.5 인 버퍼로 재접힘 반응시키는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 버퍼로 1일 ~ 12일 동안 재접힘 반응시키는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 최종 농도가 0.1 ~ 2.0 g/L 되도록 반응시키는 것이다.
본 발명은 또한, i) 대장균 배양액에서 대장균을 회수하는 단계;
ii) 상기 회수한 대장균을 파쇄하여 TGF-β3 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;
iii) 상기 봉입체를 세척하는 단계;
iv) 상기 세척한 봉입체를 가용화(solubilization)하는 단계;
v) 상기 가용화된 봉입체를 재접힘(refolding) 반응 시키는 단계;
vi) 상기 재접힘된 TGF-β3 를 포함하는 용액을 정제하는 단계; 및
vii) 상기 정제된 용액을 여과하는 단계;
를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 vi) 의 정제는,
a) 1차 정제로서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
b) 2차 정제로서 멀티모달 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
c) 3차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
를 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 vii)의 여과는 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration)인 것이다.
본 발명의 전처리방법 및 이를 포함하는 정제방법을 사용하는 경우 대장균을 이용하기 때문에 동물세포 배양방법 대비 공정이 간단하고 높은 생산성을 기대할 수 있으므로, 대장균으로부터 고효율로 고순도의 TGF-β3 단백질을 분리 및 정제할 수 있다.
도 1 은 가용화 시간에 따른 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 밴드가 TGF-단량체(monomer) 사이즈에 나타났으며 가용화 시간에 따른 패턴 변화는 나타나지 않았다.
도 2 는 재접힘 농도 및 시간에 따른 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 밴드가 TGF-이량체(dimer) 사이즈에 나타났으며 재접힘 농도 및 시간에 따른 패턴의 변화는 관측되지 않았다.
도 3 은 TGF-β3 표준액(레인 1), 목적 단백질 TGF-β3(레인 2)에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 본 발명의 목적 단백질이 고순도로 정제된 것을 확인할 수 있었다(M: 단백질 마커).
도 2 는 재접힘 농도 및 시간에 따른 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 밴드가 TGF-이량체(dimer) 사이즈에 나타났으며 재접힘 농도 및 시간에 따른 패턴의 변화는 관측되지 않았다.
도 3 은 TGF-β3 표준액(레인 1), 목적 단백질 TGF-β3(레인 2)에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 본 발명의 목적 단백질이 고순도로 정제된 것을 확인할 수 있었다(M: 단백질 마커).
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 고순도 TGF-β3 를 분리 및 정제하기 위하여, 대장균에 대한 최적의 전처리 단계를 도출하였으며, 본 발명의 전처리 단계를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제방법은 대장균으로부터 고효율로 고순도 TGF-β3 를 분리 및 정제할 수 있다.
특히, 본 발명자들은 고순도 TGF-β3 를 분리 및 정제하기 위한 방법을 도출한 후, 더 나아가 공정 시간을 단축할 수 있는 공정방법을 추가적으로 완성함으로써 보다 효율적인 TGF-β3 단백질의 정제방법을 제공할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 전처리방법 및 정제방법을 이용하는 경우 대장균 2.5L 배양을 진행하여 1 ~ 1.5 g 의 TGF-β3 단백질을 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명은 i) 대장균 배양액에서 대장균을 회수하는 단계;
ii) 상기 회수한 대장균을 파쇄하여 TGF-β3 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;
iii) 상기 봉입체를 세척하는 단계;
iv) 상기 세척한 봉입체를 가용화(solubilization)하는 단계; 및
v) 상기 가용화된 봉입체를 재접힘(refolding) 반응 시키는 단계;
를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제를 위한 전처리방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii) 의 파쇄는 800 ~ 1200 bar 의 압력으로 1 ~ 5회 파쇄하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 단계 ii) 의 파쇄는 1000 bar 의 압력으로 2 ~ 3 회 파쇄하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 세척은 1 ~ 5 회 세척하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 단계 iii)의 세척은 2 ~ 3 회 세척하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 세척은 계면활성제로 세척한 후 증류수로 세척하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 계면활성제는 Tween20 일 수 있다.
상기 계면활성제로 세척하는 것은 1 ~ 24 시간 동안 수행될 수 있으며 보다 바람직하게는 2 ~ 18 시간 수행될 수 있다.
상기 증류수로 세척하는 것은 1 ~ 3 회 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 ~ 2 회 수행될 수 있다.
상기 증류수로 세척하는 것은 1 ~ 24 시간 동안 수행될 수 있으며 보다 바람직하게는 2 ~ 18 시간 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 가용화는 요소(Urea), DTT(1,4-dithiothreitol) 및 트리스(Tris(hydroxymethyl)aminomethane; Tris) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 가용화하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 가용화는 pH 7 ~ pH 9 인 버퍼로 가용화하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 pH 7.5 ~ pH 8.5 인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iv)의 가용화는 버퍼로 1 ~ 24 시간 동안 가용화하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 단계 iv)의 가용화는 버퍼로 3 ~ 24 시간 동안 가용화하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 CHES(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), NaCl, 환원형 글루타티온(Glutathione reduced), 산화형 글루타티온(Glutathione oxidized), CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), L-아르기닌(L-Arginine) 및 D-소르비톨(D-Sorbitol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 재접힘 반응시키는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 CHES, NaCl, 환원형 글루타티온(Glutathione reduced) 및 산화형 글루타티온(Glutathione oxidized) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 재접힘 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 pH 8.5 ~ pH 10.5 인 버퍼로 재접힘 반응시키는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 버퍼는 pH 9 ~ pH 10 인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 버퍼로 1일 ~ 12일 동안 재접힘 반응시키는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 버퍼로 3일 ~ 12일 동안 재접힘 반응시키는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 최종 농도가 0.1 ~ 2.0 g/L 되도록 반응시키는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 최종 농도가 0.1 ~ 1.5 g/L 되도록 반응시키는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 최종 농도가 0.1 ~ 0.5 g/L 되도록 반응시키는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 최종 농도가 0.1 ~ 0.3 g/L 되도록 반응시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 대장균 배양액에서 대장균을 회수하는 단계;
ii) 상기 회수한 대장균을 파쇄하여 TGF-β3 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;
iii) 상기 봉입체를 세척하는 단계;
iv) 상기 세척한 봉입체를 가용화(solubilization)하는 단계;
v) 상기 가용화된 봉입체를 재접힘(refolding) 반응 시키는 단계;
vi) 상기 재접힘된 TGF-β3 를 포함하는 용액을 정제하는 단계; 및
vii) 상기 정제된 용액을 여과하는 단계;
를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 i) 내지 v) 는 상기 전처리방법에 포함된 단계와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 vi) 의 정제는,
a) 1차 정제로서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
b) 2차 정제로서 멀티모달 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
c) 3차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 vii)의 여과는 여과는 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration)인 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
대장균 세포 수득
pTT-TGFβ3 플라스미드를 이용하여 형질변환시킨 대장균(E.coli BL21 (DE3)) 균주를 종배양 및 본배양하고, 본배양 공정액을 원심분리하여 대장균 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 Buffer A (20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8.0±0.2)에 첨가한 뒤 현탁하였다.
세포 파쇄
<2-1> 세포 파쇄 횟수 설정
상기 [실시예 1] 의 세포회수액을 고압파쇄기를 이용해 1000 bar의 압력으로 총 3회 파쇄를 진행하였다. 파쇄 과정 중 파쇄 전, 1회 파쇄 후 수득한 배양액, 2회 파쇄 후 수득한 배양액, 3회 파쇄 후 수득한 배양액을 각각 1 mL 샘플링 하여 600 nm에서의 OD를 측정하였다. 또한 파쇄 후의 배양액을 수득할 때, 각 단계에서 수득한 배양액의 무게를 측정하였다. 배양액의 무게와 측정한 600 nm에서의 OD를 이용하여 하기 [수학식 1] 과 같이 파쇄율을 계산하였다.
[수학식 1]
세포파쇄율 (%)=100-{(세포파쇄액 세포농도 (OD600)) / (세포파쇄 전 (세포회수액)세포농도 (OD600))} × 100
그 결과, 하기 [표 1] 과 같이 2차 파쇄 시 파쇄율은 약 13% 증가하였고 3차 파쇄 시 파쇄율은 약 4% 증가한 것을 확인할 수 있었다.
| 파쇄 단계 | Dilution factor | OD600 | Total volume (kg) | Dilution factor ⅹ OD ⅹ w | 파쇄율 (%) |
| 파쇄 전 | 100 | 0.5944 | 5.48 | 325.7 | 0 |
| 1차 | 50 | 0.5086 | 5.68 | 144.4 | 55.7 |
| 2차 | 50 | 0.3344 | 6.19 | 103.5 | 68.2 |
| 3차 | 50 | 0.2690 | 6.74 | 90.7 | 72.2 |
<2-2> 세포 파쇄 공정
상기 [실시예 1] 의 세포회수액을 세포파쇄기에 주입하며 1000±200 bar의 압력으로 1차 세포파쇄를 진행하였다. 1차 세포파쇄액은 5 L 비커에 수거하고, 수거된 세포파쇄액은 교반하여 보관하였다. 1차 세포파쇄액을 세포농도 측정에 사용하였다.
상기 [수학식 1] 에 따라 세포파쇄율을 계산하여 수치를 확인하였다.
1차 세포파쇄액을 세포파쇄기에 주입하며 1000±200 bar의 압력으로 2차 세포파쇄를 진행하였다. 2차 세포파쇄액은 10 L 비커에 수거하고, 수거된 세포파쇄액은 교반하여 보관하였다. 2차 세포파쇄액을 세포농도 측정에 사용하였다. 상기 [수학식 1] 에 따라 세포파쇄율을 계산하여 수치를 확인하였다.
봉입체 세척
<3-1> 세척 조건 설정
HCP(Host Cell Protein) 및 HCD(Host Cell DNA) 를 제거하기 위한 세척 단계로서, 세척 버퍼, 세척 단계 및 세척 시간에 따른 비교실험을 진행하고자 하였다.
세척 버퍼는 다음과 같다: i) 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8.0, ii) 20 mM Tris, 5 mM EDTA, 1% Tween20 (v/v) pH 8.0, iii) 20 mM Tris, 5 mM EDTA, 1.5% Tween20 (v/v) pH 8.0, iv) 20 mM Tris, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100 (v/v) pH 8.0.
상기 [실시예 2] 의 세포파쇄액을 8000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 봉입체(IB)를 수득하였다. 수득한 IB의 무게를 측정하여 12등분 하고 하기 [표 1]의 각 조건에 따라 제조된 세척버퍼 400 mL에 현탁하였다. 각 조건에 맞는 시간 (16시간 또는 2 시간)동안 세척을 진행한 후, 8000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 1차 세척된 IB를 수득하였다. 이때 얻어진 상층액은 분석 시험을 위해 -20 ℃ 이하에서 보관하였다. 이후 1차 세척된 IB를 증류수(DW) 400 mL에 현탁하고 [표 2]의 조건에 맞는 시간 동안 2차 세척을 진행하였다. 2차 세척시간이 종료된 후 8000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 washed IB를 수득하였다. 이때 얻어진 상층액 또한 분석시험을 위해 -20 ℃ 이하에서 보관하였다.
| # | 1차 세척제 Tween20 함량 (%, v/v) |
1차 세척 시간 (세척 buffer) |
2차 세척 시간 (DW) |
| 1 | 1 | 2 hr | 2 hr |
| 2 | 1 | 2 hr | 16 hr |
| 3 | 1.5 | 2 hr | 2 hr |
| 4 | 1.5 | 2 hr | 16 hr |
| 5 | 1 | 16 hr | 2 hr |
| 6 | 1 | 16 hr | 16 hr |
| 7 | 1.5 | 16 hr | 2 hr |
| 8 | 1.5 | 16 hr | 16 hr |
| 9 | 0 | 16 hr | 16 hr |
| 10 | 0 | 16 hr | 2 hr |
| 11 | 1 (Triton X-100, 대조군) |
16 hr | 16 hr |
1차 세척 종료 후 수득한 상층액에 대해서는 1차 세척과정에서 impurity의 제거능에 대해 평가하기 위하여 잔류 HCP 및 HCD에 대한 분석을 진행하였다. 또한, 2차 세척 과정인 DW를 이용한 세척은 1차 세척에 사용한 세척제를 제거하기 위한 단계이므로 Tween20을 포함하고 있지 않은 조건 9, 10, 11을 제외한 분석시료에 대해 잔류 Tween20에 대한 분석시험을 진행하였다.
그 결과, 하기 [표 3] 에서 나타나는 바와 같이 1차 세척결과, Tween20이 포함된 세척제를 사용할 경우 세척제 농도, 세척 시간에 관계없이 모든 조건에서 99% 이상의 HCD가 제거되며, 기존 Triton X-100을 세척제로 사용한 조건 대비 더 많은 양의 HCD가 제거됨을 확인하였다. HCP 또한 Tween20을 세척제로 사용할 경우 농도와 시간에 관계없이 Triton X-100의 조건 대비 많은 양의 HCP가 제거됨을 확인하였다. Detergent를 포함하지 않은 세척 버퍼 (조건 9, 10)의 경우 HCP의 경우 기존 조건보다 좋은 제거능을 보였지만, HCD의 경우 control과 비슷한 수준의 제거능을 보였으며, Tween20이 포함된 세척조건 대비 제거능이 감소함을 확인할 수 있었다.
| Sample | HCD | HCP | ||
| HCD (ng/mL) | 잔존률 (%) | HCP (ng/mL) | 잔존률 (%) | |
| Pre-wash | 259,613.791 | N/A | 143,166.162 | N/A |
| 1st wash #1 | 2,275.783 | 0.88 | 5,210.316 | 3.64 |
| 1st wash #2 | 2,464.269 | 0.95 | 5,723.434 | 4.00 |
| 1st wash #3 | 1,878.886 | 0.72 | 6,206.174 | 4.33 |
| 1st wash #4 | 1,799.072 | 0.69 | 5,100.045 | 3.56 |
| 1st wash #5 | 1,388.818 | 0.53 | 5,890.344 | 4.11 |
| 1st wash #6 | 1,791.313 | 0.69 | 5,977.063 | 4.17 |
| 1st wash #7 | 2,228.834 | 0.86 | 10,220.406 | 7.14 |
| 1st wash #8 | 2,076.410 | 0.80 | 11,292.721 | 7.89 |
| 1st wash #9 | 3,604.744 | 1.39 | 11,998.432 | 8.38 |
| 1st wash #10 | 3,015.732 | 1.16 | 4,060.197 | 2.84 |
| 1st wash #11 | 3,251.600 | 1.25 | 15,550.686 | 10.86 |
또한, DW로 세척 시 시간 및 횟수에 관계없이 모든 조건에서 99.8% 이상의 Tween20 가 제거됨을 확인하였다.
따라서, 최종 세척 공정으로 1차 세척 시 1% ~ 1.5% Tween20 을 사용하여 2 hr ~ 16 hr으로, 2차 세척 시 2hr ~ 16 hr 으로 진행하는 것으로 설정하였다.
<3-2> 세척 공정
1차 봉입체 세척으로, 상기 [실시예 2] 의 세포파쇄액을 4 ℃ 및 8000 rpm 으로 30분간 원심분리를 진행하였다. 원심분리를 통해 회수한 봉입체를 Buffer B (20 mM Tris, 5 mM EDTA, 1% (v/v) Tween20, pH 8.0±0.2)에 첨가한 후 하루 동안 실온에서 교반하여 세척하였다.
2차 봉입체 세척으로, 상기 1차 봉입체 세척 공정액을 4 ℃ 및 8000 rpm 으로 30분간 원심분리하였다. 원심분리를 통해 회수한 봉입체를 증류수(DW) 에 첨가한 후, 2±1시간동안 실온에서 300 rpm 으로 교반하여 봉입체 2차 세척을 진행하였다.
상기 2차 봉입체 세척 공정액을 4 ℃ 및 8000 rpm 으로 30분간 원심분리한 후 봉입체를 최종적으로 회수하여 그 무게를 측정하였다.
가용화
<4-1> 가용화 시간 설정
상기 [실시예 3] 에서 수득한 세척된 봉입체(IB) 를 6 M Urea, 100 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8.0에 첨가하여 24시간 동안 가용화를 진행하였다. 가용화가 시작된 후 3시간, 6시간, 9시간, 24시간이 지난 시점에서 가용화액을 1 mL 샘플링하여 분석 시험에 사용하였다. 시료분석은 660 nm assay kit를 이용한 농도분석(2회)과 SDS-PAGE를 진행하였다. 측정된 시료농도에 대해 시간에 따른 통계적 경향성이 있는지 확인하였다.
그 결과, 2회 측정한 농도에 대한 회귀분석 결과 p-value가 0.2674, 0.6116로 가용화액의 농도는 시간에 따른 통계적 유의성이 없는 것을 확인하였다. 이 결과를 기반으로 가용화 진행 시 3 ~ 24 시간 사이의 시간 동안 가용화 진행 시 시료 농도에 주는 영향은 없는 것으로 판단하였다. 또한, SDS-PAGE 분석결과 TGF-β3 단량체(monomer) 사이즈에 가용화 된 밴드를 확인하였고, 시간에 따른 SDS-PAGE 패턴의 변화는 관측되지 않아 가용화 시간의 영향이 없음을 확인하였다(도 1).
<4-2> 가용화 공정
Buffer C 1.2 L(6 M Urea, 100 mM DTT, 50 mM Tris pH 8.0±0.2)에 2.5 L 배양액으로부터 상기 수득한 봉입체 전량을 첨가하였다. 상기 가용화 용액을 16±4시간 동안 200 rpm 으로 교반하여 가용화 시켰다.
반응이 종료된 가용화액 5 mL를 15 mL conical tube에 2개 샘플링하여 1개는 냉동보관 (-20±5℃) 하였다. 샘플링한 가용화액 5 mL를 단백농도 분석(660 nm protein assay) 에 사용하였다.
재접힘
<5-1> 재접힘 조건 설정
0.7 M CHES(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), 1 M NaCl, 2 mM 환원형 글루타티온(Glutathione reduced, GSH), 0.4 mM 산화형 글루타티온(Glutathione oxidized, GSSG), pH 9.5의 재접힘 버퍼를 총 4 L 제조하였다. 버퍼 제조 시에는 우선 pH를 9.2로 적정한 후 저온실에서 O/N 방치 이후 pH를 9.5로 적정하였다. 제조된 재접힘 버퍼를 500 mL 씩 6개로 분주한다. 24시간 동안 가용화를 진행한 용액의 농도를 기반으로 재접힘 농도가 최종 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g/L가 되도록 가용화 용액을 첨가한다. 가용화 용액을 첨가하기전 분주된 재접힘 용액에서 첨가될 가용화액의 부피만큼을 먼저 덜어낸후 가용화 용액을 첨가하여 최종 부피가 500 mL로 유지되도록 하였다. 재접힘이 시작된 후 0일, 1일, 3일, 5일, 7일, 12일이 지난 시점에 재접힘 용액을 1 mL 샘플링하고 샘플링 한 재접힘 용액에 약 5 % 부피의 37 % HCl을 첨가하여 재접힘 반응을 종료하였다. 재접힘 반응 종료 후 13000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액을 -20 ℃ 이하에서 보관하고 분석시험에 사용하였다. 각 재접힘 기간에 맞게 반응이 진행된 샘플은 RP-HPLC의 main peak area를 계산하여 재접힘률을 분석하였다. 추가적으로 SDS-PAGE를 통해 시간에 따른 단량체(monomer)와 이량체(dimer)의 밴드 패턴의 변화가 있는지 확인하였다.
각 농도와 시간별로 샘플링 한 재접힘 공정액에 대한 RP-HPLC 분석을 수행하였다. 각 조건에 대해 RP-HPLC 상의 dimer peak의 %Area는 하기 [표 4] 와 같다.
| 0.1 g/L | 0.3 g/L | 0.5 g/L | 1.0 g/L | 1.5 g/L | 2.0 g/L | |
| Day 0 | 7.58 | 7.80 | 15.14 | 12.32 | 7.66 | 4.76 |
| Day 3 | 53.62 | 60.56 | 59.17 | 42.36 | 28.27 | N/A |
| Day 5 | 55.24 | 60.49 | 57.35 | 40.03 | 28.61 | |
| Day 7 | 55.81 | 61.03 | 60.11 | 43.17 | 34.04 | |
| Day 12 | 55.90 | 63.01 | 62.51 | 42.90 | 30.06 |
그 결과, 1.0 g/L 이상의 농도에서는 재접힘 반응이 진행되는 도중 많은 양의 aggregation이 형성되어 공정액이 매우 탁해짐을 관측하였다. 0.5 g/L이하의 농도에서 재접힘을 진행한 경우 약 55 ~ 60% 수준의 dimer efficiency를 보였으며, 3일차에서 12일까지 추가로 재접힘을 진행할 경우 최대 약 3%p 정도의 dimer efficiency가 증가한 것을 확인하였다.
추가적으로 SDS-PAGE를 이용하여 각 샘플에 대한 dimer efficiency를 확인하였다. SDS-PAGE 패턴의 변화는 관측되지 않아 재접힘 농도 및 시간의 영향이 없음을 확인하였다(도 2).
<5-2> 재접힘 공정
하기 [수학식 2]에 따라 단백농도 0.1 g/L로 재접힘 공정을 진행하기위한 가용화 공정액 투입량을 산출하였다.
[수학식 2]
가용화 공정액 투입량 (L)= (재접힘 공정 부피 (L) ×0.1 g/L)/(가용화 공정액의 단백질 농도 (g/L))
상기 [수학식 2] 로 도출한 가용화 공정액 투입량과 동일한 부피의 Buffer D를 50 L mobile tank에서 제한 후, 동량의 가용화 공정액을 투입하였다. 재접힘 약 72 시간 경과 후 재접힘 공정을 종료하였다. 3일간 재접힘을 진행한 공정액에 염산 용액으로 pH를 2.0±0.2로 조정하여 전처리한 후 capsule filter를 사용해 여과하였다.
최종 여과액을 15 mL conical tube에 5 mL씩 2개로 분주하여 아래 공정액 분석(총 단백질 농도, 660 nm protein assay)에 사용하였다. 공정액 분석 후 남은 시료는 냉동보관 (-20±5℃) 하였다. 최종 여과액은 정제 1 주입시료로 사용하기 전까지 저온에서 보관하였다.
정제 1_소수성 크로마토그래피
Buffer E(4 M Urea, 20 mM Na-AcOH, 0.1 M NaCl, pH 4.0±0.2) 를 2 CV 이상 컬럼에 주입하여 평형화를 진행하였다. 전처리된 재접힘 공정액 전량을 컬럼에 주입하였다. Buffer E를 컬럼에 10 CV 주입하여 unbound wash를 진행하였다.
Buffer F(20 mM Tris, pH 8.0±0.2)를 컬럼에 4 CV 주입하여 세척(wash)하였다.
Buffer G(4 M Urea, 20 mM Tris, pH 9.5±0.2) 를 컬럼에 3 CV 주입하여 용출(elution)하였다. Buffer G가 주입되는 시점부터 3 CV를 전량 용출액으로 회수하였다.
용출 종료 시점에서 elution 분획 5 mL를 15 mL conical tube에 분주하여 다음 공정액 분석에 사용하였다: 순도 (SDS-PAGE), 순도 (RP-HPLC) (IPC) 및 농도 (660 nm protein assay).
정제 2_다모드(멀티모달) 크로마토그래피
Buffer G(4 M Urea, 20 mM Tris-HCl, pH 9.5±0.2) 를 2 CV 이상 컬럼에 주입하여 평형화를 진행하였다. 상기 정제 1 용출액 전량을 컬럼에 주입하였다. Buffer G를 컬럼에 5 CV 주입하여 unbound wash를 진행하였다.
Buffer H(4 M Urea, 20 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, pH 9.5±0.2)를 컬럼에 10 CV 주입하여 세척(wash)하였다.
Buffer I(4 M Urea, 20 mM Na-AcOH, pH 4.0±0.2)를 컬럼에 3 CV 주입하여 용출(elution) 하였다. Buffer I가 0.5 CV가 컬럼에 주입된 시점부터 용출액 회수를 시작하여 3 CV가 흐를때까지 회수하였다.
용출 종료 시점에서 용출 분획 5 mL를 15 mL conical tube에 분주하여 다음 공정액 분석에 사용하였다: 순도 (SDS-PAGE), 순도 (RP-HPLC) (IPC) 및 농도 (660 nm protein assay).
정제 3_이온교환 크로마토그래피
<8-1> 이온교환 크로마토그래피
Buffer I(4 M Urea, 20 mM Na-AcOH, pH 4.0±0.2)를 2 CV 이상 컬럼에 주입하여 평형화를 진행하였다. 정제 2 용출액 전량을 컬럼에 주입하였다. Buffer I를 컬럼에 5 CV 주입하여 unbound wash를 진행하였다.
Buffer J(4 M Urea, 20 mM Na-AcOH, 0.2 M NaCl pH 4.0±0.2) 를 컬럼에 7 CV 주입하여 세척(wash)하였다.
Buffer K(4 M Urea, 20 mM Na-AcOH, 0.5 M NaCl pH 4.0±0.2) 를 컬럼에 5 CV 주입하여 용출(elution)을 실시하였다. Buffer K가 주입되는 시점부터 5 CV를 전량 용출액으로 회수하였다. 용출 시 collection이 완료되면 컬럼의 재생 및 보관 단계로 바로 넘어갈 수 있었다. 용출 종료 시점에서 용출 분획 5 mL를 15 mL conical tube에 분주하여 다음 공정액 분석에 사용하였다: 순도 (SDS-PAGE), 순도 (RP-HPLC) (IPC) 및 농도 (660 nm protein assay).
<8-2> 최종 정제 후 최종 수율
상기 최종 3차 정제 공정 후 수득한 TGF-β3 의 최종 수율은, 공정액 부피가 0.732 L 일 때, TGF-β3 단백질 농도가 0.977 g/L 이었으며 수득한 TGF-β3 단백량은 715.2 mg 이었다.
여과
한외여과/정용여과 시스템(ultrafiltration/diafiltration system, UF/DF system)에 membrane (10 kDa, 0.1 m2 * 1 장)을 장착하였다.
Buffer L(20 mM Na-OAc, pH 3.8±0.2)를 membrane에 주입하여 평형화를 진행하였다. Permeate 여과액의 pH가 3.8±0.3, 전기전도도 값이 2 bar 이하인 경우 평형화를 종료하였다.
농축(Ultrafiltration)을 위한 여과는 TMP([PFeed+PRet]/2) 2 bar 이하의 조건으로 진행하였다.
농축 부피는 하기 [수학식 3] 으로 계산하였다. 설정된 DS 농도는 1.0 g/L이지만 정제3 용출액과 DS 농도 분석법의 차이를 고려하여 설정된 농도의 2배로 농축 후 dilution 진행하였다.
[수학식 3]
농축 부피 = 정제3 용출액 내 rhTGF-β3 단백량 (g) / 2.0 g/L
농축 완료 후의 부피에 해당하는 Buffer L을 투입하여 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. Diafiltration 6 cycle 종료 시점에서 permeate 여과액의 pH가 3.8±0.2인 경우 여과 작업을 종료하였다. 부적합 시 diafiltration을 1 cycle씩 추가로 진행하며, 각 cycle 종료시점 permeate 여과액이 pH 기준에 적합한지 여부를 확인하였다.
라인회수를 위해 추가 농축을 진행하였다. Permeate 밸브를 잠근 후 Buffer L를 이용해 라인회수를 진행하였다.
A280 방법을 이용하여 회수액의 농도를 측정하고, 최종 원액의 농도가 1.0 g/L가 되도록 추가해야 할 Buffer L의 부피를 계산하여 첨가하였다. A280 단백질 농도 측정은 Cuvette에 500 μL의 DS를 넣은 후 Multi-spectrophotometer (ELISA reader)를 이용해 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도가 0.3 ~ 0.7을 벗어날 경우 희석배수를 조절하여 범위 안에 들도록 하였다. 측정된 흡광도에 희석배수를 곱하고 extinction coefficient인 1.841로 나누어 단백질 농도를 계산하였다. 계산된 부피만큼의 Buffer L로 dilution을 진행하고 A280 방법을 이용하여 최종 농도를 확인된 회수액은 0.2 μm bottle top filter를 이용하여 여과를 진행하였다.
농도가 확인된 여과액을 0.2 μm bottle-top filter (PES)를 사용해 멸균된 유리 bottle로 여과한 후, 최종 원액은 1.5 mL EP tube에 1 mL씩 50개로 분주하여 lot release test에 사용하였다.
규격 평가
상기 [실시예 1] ~ [실시예 9] 공정을 통하여 최종적으로 분리 및 정제된 TGF-β3 에 대한 규격 평가를 진행하였으며, 그 결과는 하기 [표 5] 와 같다. 특히, 전기영동 결과 TGF-β3 표준액(레인 1)과 일치하고 추가적인 불순물 단백질이 확인되지 않아 목적 단백질인 TGF-β3(레인 2)가 고순도로 정제된 것을 확인할 수 있었다(도 3).
| 시 험 항 목 | 기 준 | 시 험 결 과 | 판 정 |
| 성상 | 무색의 투명하거나 약간 불투명한 용액이다. (Colorless, clear to slightly opaque solution) | 무색의 투명한 용액이다. | 적합 |
| pH | 3.8 ± 0.5 | 3.9 | 적합 |
| 엔도톡신 | 125.0 EU/mg 이하 | 0.1 EU/mg | 적합 |
| 전기영동 | 표준액의 주밴드와 비교하였을 때, 검액 주밴드가 동등한 위치에서 확인되어야 한다. | 표준액의 주밴드와 비교하였을 때, 검액 주밴드가 동등한 위치에서 확인된다. | 적합 |
| 웨스턴블럿팅 | 표준액의 주밴드와 비교하였을 때, 검액 주밴드가 동등한 위치에서 확인되어야 한다. | 표준액의 주밴드와 비교하였을 때, 검액 주밴드가 동등한 위치에서 확인된다. | 적합 |
| 단백질정량 (A280) | 측정치 (mg/mL) | 0.977 | 적합 |
| 활성 (Cell assay) | 1.9 x 107 IU/mg 이상 | 2.394 x 107 IU/mg | 적합 |
| 순도 (RP-HPLC) | 주피크의 % Area가 95.0% 이상이어야 한다. | 99.9% | 적합 |
| 순도 (SEC-HPLC) | 주피크의 % Area가 95.0% 이상이어야 한다. | 100.0% | 적합 |
| Host Cell Protein (HCP) | 100 ppm 이하 | 4 | 적합 |
Claims (14)
- i) 대장균 배양액에서 대장균을 회수하는 단계;
ii) 상기 회수한 대장균을 파쇄하여 TGF-β3 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;
iii) 상기 봉입체를 세척하는 단계;
iv) 상기 세척한 봉입체를 가용화(solubilization)하는 단계; 및
v) 상기 가용화된 봉입체를 재접힘(refolding) 반응 시키는 단계;
를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제를 위한 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 ii) 의 파쇄는 800 ~ 1200 bar 의 압력으로 1 ~ 5회 파쇄하는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 세척은 1 ~ 5 회 세척하는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 세척은 계면활성제로 세척한 후 증류수로 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 iv)의 가용화는 요소(Urea), DTT(1,4-dithiothreitol) 및 트리스(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 가용화하는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 iv)의 가용화는 pH 7 ~ pH 9 인 버퍼로 가용화하는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 iv)의 가용화는 버퍼로 1 ~ 24 시간 동안 가용화하는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 CHES(N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid), NaCl, 환원형 글루타티온(Glutathione reduced), 산화형 글루타티온(Glutathione oxidized), CHAPS, L-아르기닌(L-Arginine) 및 D-소르비톨(D-Sorbitol) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 포함된 버퍼로 재접힘 반응시키는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 pH 8.5 ~ pH 10.5 인 버퍼로 재접힘 반응시키는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 버퍼로 1일 ~ 12일 동안 재접힘 반응시키는 것을 특징으로 하는 전처리방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 v)의 재접힘 반응은 최종 농도가 0.1 ~ 2.0 g/L 되도록반응시키는 것을 특징으로 하는 전처리 방법.
- i) 대장균 배양액에서 대장균을 회수하는 단계;
ii) 상기 회수한 대장균을 파쇄하여 TGF-β3 봉입체(inclusion body)를 수득하는 단계;
iii) 상기 봉입체를 세척하는 단계;
iv) 상기 세척한 봉입체를 가용화(solubilization)하는 단계;
v) 상기 가용화된 봉입체를 재접힘(refolding) 반응 시키는 단계;
vi) 상기 재접힘된 TGF-β3 를 포함하는 용액을 정제하는 단계; 및
vii) 상기 정제된 용액을 여과하는 단계;
를 포함하는 TGF-β3 단백질의 정제방법.
- 제12항에 있어서, 상기 단계 vi) 의 정제는,
a) 1차 정제로서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
b) 2차 정제로서 멀티모달 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
c) 3차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제12항에 있어서, 상기 단계 vii)의 여과는 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration)인 것을 특징으로 하는 정제방법.
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