JPH1036399A - 新規な性腺刺激ホルモン及びその製造法 - Google Patents
新規な性腺刺激ホルモン及びその製造法Info
- Publication number
- JPH1036399A JPH1036399A JP8212197A JP21219796A JPH1036399A JP H1036399 A JPH1036399 A JP H1036399A JP 8212197 A JP8212197 A JP 8212197A JP 21219796 A JP21219796 A JP 21219796A JP H1036399 A JPH1036399 A JP H1036399A
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- Japan
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- subunit
- mutant
- sequence
- amino acid
- gonadotropin
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な性腺刺激ホルモンの提供。
【解決手段】 ｅＣＧのα及びβ−サブユニットから構
成され、βサブユニットがＣ末端ペプチド配列を除去し
た変異型βサブユニットであることを特徴とする、実質
的にＦＳＨ活性を増強した新規な性腺刺激ホルモン。 【効果】 ＦＳＨ活性が相対的に上昇し、ＬＨ活性が相
対的に低下した性腺刺激ホルモンが提供される。
成され、βサブユニットがＣ末端ペプチド配列を除去し
た変異型βサブユニットであることを特徴とする、実質
的にＦＳＨ活性を増強した新規な性腺刺激ホルモン。 【効果】 ＦＳＨ活性が相対的に上昇し、ＬＨ活性が相
対的に低下した性腺刺激ホルモンが提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウマ絨毛性ゴナド
トロピン（ｅＣＧ）を構成するサブユニットの遺伝子を
部位特異的に改変し、その変異型遺伝子を発現ベクター
に組み込み、ほ乳動物細胞などの糖蛋白の製造に適した
宿主に導入することにより、ＦＳＨ／ＬＨ活性を制御し
た新規な組換え型ｅＣＧ変異体、その遺伝子および組換
え型ｅＣＧ変異体の製造法を提供する。
トロピン（ｅＣＧ）を構成するサブユニットの遺伝子を
部位特異的に改変し、その変異型遺伝子を発現ベクター
に組み込み、ほ乳動物細胞などの糖蛋白の製造に適した
宿主に導入することにより、ＦＳＨ／ＬＨ活性を制御し
た新規な組換え型ｅＣＧ変異体、その遺伝子および組換
え型ｅＣＧ変異体の製造法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】ｅＣＧは妊馬の内膜杯で合成され絨毛膜
から分泌される性腺刺激ホルモンで、ヒトや動物の受胎
促進や過剰排卵誘起に用いられる。他の性腺刺激ホルモ
ンに比べて分子量が大きく、腎臓のろ過装置を通過でき
ないために、血清中にのみ認められる。ｅＣＧの現行製
造法としては、妊馬の血清を原料として、ｅＣＧを分泌
している時期の血清を採取し、エタノール沈澱法などに
より分離精製する方法が一般的に用いられている。
から分泌される性腺刺激ホルモンで、ヒトや動物の受胎
促進や過剰排卵誘起に用いられる。他の性腺刺激ホルモ
ンに比べて分子量が大きく、腎臓のろ過装置を通過でき
ないために、血清中にのみ認められる。ｅＣＧの現行製
造法としては、妊馬の血清を原料として、ｅＣＧを分泌
している時期の血清を採取し、エタノール沈澱法などに
より分離精製する方法が一般的に用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ｅＣＧは卵胞刺激ホル
モン（ＦＳＨ）様活性と黄体形成ホルモン（ＬＨ）様活
性の両方の活性を有するが、妊娠初期から中期にかけて
血清中に分泌されるｅＣＧでは、両活性およびその活性
比の変動が大きい。そのために、製剤化の過程でロット
間に活性比のばらつきが生じ、これが薬効のばらつきや
副作用が生じる原因となっている。
モン（ＦＳＨ）様活性と黄体形成ホルモン（ＬＨ）様活
性の両方の活性を有するが、妊娠初期から中期にかけて
血清中に分泌されるｅＣＧでは、両活性およびその活性
比の変動が大きい。そのために、製剤化の過程でロット
間に活性比のばらつきが生じ、これが薬効のばらつきや
副作用が生じる原因となっている。
【０００４】特に、受胎促進や過剰排卵誘起用に医薬品
として用いる場合には、ｅＣＧが有するＬＨ様活性は、
卵胞嚢腫などの副作用を生ずる原因と考えられているの
で、その活性の制御や低減が強く望まれている。また、
ｅＣＧの様な性腺刺激ホルモンでは、投与する対象や疾
患によって要求される特性が異なるので、ＦＳＨやＬＨ
の活性やその比率、それぞれの活性半減期など、天然ｅ
ＣＧの有する固有の性質を改良または制御することがで
きれば、より幅広い医薬品としての応用が可能になると
期待される。
として用いる場合には、ｅＣＧが有するＬＨ様活性は、
卵胞嚢腫などの副作用を生ずる原因と考えられているの
で、その活性の制御や低減が強く望まれている。また、
ｅＣＧの様な性腺刺激ホルモンでは、投与する対象や疾
患によって要求される特性が異なるので、ＦＳＨやＬＨ
の活性やその比率、それぞれの活性半減期など、天然ｅ
ＣＧの有する固有の性質を改良または制御することがで
きれば、より幅広い医薬品としての応用が可能になると
期待される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ｅＣＧを構成
するサブユニットの遺伝子に変異を導入し、その変異型
遺伝子を組み込んでなる発現ベクターをほ乳動物細胞な
どの糖タンパク質の製造に適した宿主に導入し、ｅＣＧ
変異体を製造することにより、ＦＳＨ／ＬＨ活性を制御
した新規な組換え型ｅＣＧ変異体を作製することができ
るという発見に基づく。
するサブユニットの遺伝子に変異を導入し、その変異型
遺伝子を組み込んでなる発現ベクターをほ乳動物細胞な
どの糖タンパク質の製造に適した宿主に導入し、ｅＣＧ
変異体を製造することにより、ＦＳＨ／ＬＨ活性を制御
した新規な組換え型ｅＣＧ変異体を作製することができ
るという発見に基づく。
【０００６】一般に、性腺刺激ホルモンは、非共有結合
で結合したαおよびβ−サブユニットからなるヘテロ２
量体の糖蛋白ホルモンである。ウマ絨毛性ゴナドトロピ
ン（ｅＣＧ）も同様なヘテロ２量体からなる糖蛋白ホル
モンである。α−サブユニットはウマ由来の他の性腺刺
激ホルモンと共通であるが、β−サブユニットがホルモ
ン間で異なり、これが生物活性の相違の構造的基礎をな
している。α−サブユニットは９６アミノ酸残基からな
り、５６番目と８２番目のＡｓｎ残基に糖鎖が結合して
いる。一方、β−サブユニットは、１４９アミノ酸残基
からなり、１３番目のＡｓｎ残基に１本、Ｃ末端領域の
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ残基に４〜１０本の糖鎖が結合してい
る。
で結合したαおよびβ−サブユニットからなるヘテロ２
量体の糖蛋白ホルモンである。ウマ絨毛性ゴナドトロピ
ン（ｅＣＧ）も同様なヘテロ２量体からなる糖蛋白ホル
モンである。α−サブユニットはウマ由来の他の性腺刺
激ホルモンと共通であるが、β−サブユニットがホルモ
ン間で異なり、これが生物活性の相違の構造的基礎をな
している。α−サブユニットは９６アミノ酸残基からな
り、５６番目と８２番目のＡｓｎ残基に糖鎖が結合して
いる。一方、β−サブユニットは、１４９アミノ酸残基
からなり、１３番目のＡｓｎ残基に１本、Ｃ末端領域の
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ残基に４〜１０本の糖鎖が結合してい
る。
【０００７】ｅＣＧは、ほ乳動物の下垂体および胎盤由
来の糖蛋白の中で最も高度にグリコシル化されており、
その分子量の約４５％が糖部分に由来する。また、ｅＣ
Ｇは、ウマ以外の種では、ＬＨレセプターだけでなくＦ
ＳＨレセプターにも結合し、ＦＳＨおよびＬＨ様の生物
活性を示す。ｅＣＧとウマＬＨは、アミノ酸配列は同一
であるが、その生物学的作用は異なり、糖鎖構造の違い
が生物活性を規定する典型的な例と考えられている。
来の糖蛋白の中で最も高度にグリコシル化されており、
その分子量の約４５％が糖部分に由来する。また、ｅＣ
Ｇは、ウマ以外の種では、ＬＨレセプターだけでなくＦ
ＳＨレセプターにも結合し、ＦＳＨおよびＬＨ様の生物
活性を示す。ｅＣＧとウマＬＨは、アミノ酸配列は同一
であるが、その生物学的作用は異なり、糖鎖構造の違い
が生物活性を規定する典型的な例と考えられている。
【０００８】糖鎖構造が機能発現に大きく影響する例は
数多く知られているが、機能発現と糖鎖構造の相関ある
いはその分子論的基礎に関してはほとんど知見は蓄積さ
れていない。また、ｅＣＧがｅＬＨあるいはｈＣＧと極
めて構造的に類似しているにもかかわらず、ウマ以外の
種においてＦＳＨとＬＨの両方のホルモン様活性を発現
する機構については全く解明されていなかった。まして
や、その活性および活性比を制御できるかどうかについ
ては全く知られていなかった。特に、β−サブユニット
に存在するＯ−結合型糖鎖が複数結合したＣ末端ペプチ
ドが、ｅＣＧのＦＳＨ活性の増強に関与することは全く
知られていなかった。
数多く知られているが、機能発現と糖鎖構造の相関ある
いはその分子論的基礎に関してはほとんど知見は蓄積さ
れていない。また、ｅＣＧがｅＬＨあるいはｈＣＧと極
めて構造的に類似しているにもかかわらず、ウマ以外の
種においてＦＳＨとＬＨの両方のホルモン様活性を発現
する機構については全く解明されていなかった。まして
や、その活性および活性比を制御できるかどうかについ
ては全く知られていなかった。特に、β−サブユニット
に存在するＯ−結合型糖鎖が複数結合したＣ末端ペプチ
ドが、ｅＣＧのＦＳＨ活性の増強に関与することは全く
知られていなかった。
【０００９】絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のβ−サブ
ユニットには、Ｏ−結合型糖鎖が複数結合したＣ（カル
ボキシ）末端ペプチドの延長が種間で共通に存在する
が、この領域がｅＣＧの活性に関与しているかどうかに
ついては全く知られていなかった。ゴナドトロピン類の
Ｃ末端ペプチドの役割については、ヒトＣＧに関して詳
しく調べられている。ヒトＣＧのＣ末端ペプチドは、血
中半減期の維持に重要であるが、サブユニットの会合や
ヘテロダイマーの分泌、in vitroでのレセプターへの結
合やステロイドの放出活性には全く関与していない（例
えば、F.A.Fares,et al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.
A., 89, 4304 (1992); P.S.LaPolt, et al., Endocrino
logy, 131 ,2514 (1992)）。
ユニットには、Ｏ−結合型糖鎖が複数結合したＣ（カル
ボキシ）末端ペプチドの延長が種間で共通に存在する
が、この領域がｅＣＧの活性に関与しているかどうかに
ついては全く知られていなかった。ゴナドトロピン類の
Ｃ末端ペプチドの役割については、ヒトＣＧに関して詳
しく調べられている。ヒトＣＧのＣ末端ペプチドは、血
中半減期の維持に重要であるが、サブユニットの会合や
ヘテロダイマーの分泌、in vitroでのレセプターへの結
合やステロイドの放出活性には全く関与していない（例
えば、F.A.Fares,et al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.
A., 89, 4304 (1992); P.S.LaPolt, et al., Endocrino
logy, 131 ,2514 (1992)）。
【００１０】本発明者らは、鋭意研究を行った結果、驚
くべきことに、ｅＣＧを構成するサブユニットの遺伝子
に変異を導入することにより、ＦＳＨ／ＬＨ活性を制御
した新規な組換え型ｅＣＧ変異体が得られることを見い
出した。すなわち、ｅＣＧを構成するβサブユニットに
存在するＯ−結合型糖鎖が結合したＣ末端ペプチド配列
を除去することにより、ＬＨ活性を維持しＦＳＨ活性が
著しく増強された新規な性腺刺激ホルモンを作製するこ
とができるということを見い出し本発明を完成させるに
至った。
くべきことに、ｅＣＧを構成するサブユニットの遺伝子
に変異を導入することにより、ＦＳＨ／ＬＨ活性を制御
した新規な組換え型ｅＣＧ変異体が得られることを見い
出した。すなわち、ｅＣＧを構成するβサブユニットに
存在するＯ−結合型糖鎖が結合したＣ末端ペプチド配列
を除去することにより、ＬＨ活性を維持しＦＳＨ活性が
著しく増強された新規な性腺刺激ホルモンを作製するこ
とができるということを見い出し本発明を完成させるに
至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】ｅＣＧは、αとβの２つのサブユ
ニットからなるヘテロ二量体である。αサブユニットは
野性型のαサブユニットであり、例えば配列表の配列番
号：１に示すアミノ酸配列を有する。βサブユニットは
Ｃ−末端側が欠失したものであり好ましくは野性型βサ
ブユニットのＣ−末端が欠失したものである。例えば配
列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列において、その
Ｃ−末端側の３９個以下のアミノ酸残基が除去されたも
のである。さらに詳しくは、配列表の配列番号：２のア
ミノ酸番号１のアミノ酸から、アミノ酸番号１１０〜１
１９のいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を有する
ものが挙げられる。具体例として、配列表の配列番号：
２のアミノ酸番号１から１１１まで、１１４まで又は１
１７までのアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
ニットからなるヘテロ二量体である。αサブユニットは
野性型のαサブユニットであり、例えば配列表の配列番
号：１に示すアミノ酸配列を有する。βサブユニットは
Ｃ−末端側が欠失したものであり好ましくは野性型βサ
ブユニットのＣ−末端が欠失したものである。例えば配
列表の配列番号：２に示すアミノ酸配列において、その
Ｃ−末端側の３９個以下のアミノ酸残基が除去されたも
のである。さらに詳しくは、配列表の配列番号：２のア
ミノ酸番号１のアミノ酸から、アミノ酸番号１１０〜１
１９のいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を有する
ものが挙げられる。具体例として、配列表の配列番号：
２のアミノ酸番号１から１１１まで、１１４まで又は１
１７までのアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００１２】その生産に利用するα及びβの各サブユニ
ットをコードする遺伝子は、既知の配列を利用して一般
的な方法、例えば、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーシ
ョンにより遺伝子ライブラリーからクローニングするこ
とができる（Fiddes, J. & Goodman, H. M., Nature, 2
81:351-356 (1979).; Godine, J. E., et al., J. Bio
l. Chem., 257:8368-8371 (1982).; Golos, T. G., et
al., DNA and Cell Biology, 10:367-380 (1991).; Ste
wart, F., et al., J. Endocrinol., 115:341-346 (198
7).; Sherman, G. B., et al., Mol. Endocrinol., 6:9
51-959 (1992).)。
ットをコードする遺伝子は、既知の配列を利用して一般
的な方法、例えば、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーシ
ョンにより遺伝子ライブラリーからクローニングするこ
とができる（Fiddes, J. & Goodman, H. M., Nature, 2
81:351-356 (1979).; Godine, J. E., et al., J. Bio
l. Chem., 257:8368-8371 (1982).; Golos, T. G., et
al., DNA and Cell Biology, 10:367-380 (1991).; Ste
wart, F., et al., J. Endocrinol., 115:341-346 (198
7).; Sherman, G. B., et al., Mol. Endocrinol., 6:9
51-959 (1992).)。
【００１３】遺伝子ライブラリーは、常法に従って妊馬
の胎盤組織から抽出したｍＲＮＡから逆転写酵素を用い
て作製したｃＤＮＡライブラリーを用いてもよいし、市
販のｃＤＮＡライブラリーを購入して用いてもよい。サ
ブユニットをコードする遺伝子への変異の導入は、目的
のアミノ酸配列へ変換されれば特に方法は限定されない
が、ミスマッチプライマーを用い、カッセト変異法、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ修復法やＰＣＲ増幅法により部位特異
的に変異を導入する方法が好適に用いられる。
の胎盤組織から抽出したｍＲＮＡから逆転写酵素を用い
て作製したｃＤＮＡライブラリーを用いてもよいし、市
販のｃＤＮＡライブラリーを購入して用いてもよい。サ
ブユニットをコードする遺伝子への変異の導入は、目的
のアミノ酸配列へ変換されれば特に方法は限定されない
が、ミスマッチプライマーを用い、カッセト変異法、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ修復法やＰＣＲ増幅法により部位特異
的に変異を導入する方法が好適に用いられる。
【００１４】また、変異の導入は、β−サブユニットの
糖鎖の結合したＣ末端ペプチドを除去することを目的と
しているので、遺伝子レベルで導入された変異がどのよ
うなものであっても、要はβ−サブユニットの糖鎖のＣ
末端ペプチドが除去できればよい。除去すべきペプチド
は、β−サブユニットのＣ末端領域にあり、実質的にＦ
ＳＨ活性の増強に寄与するものであればその範囲は問わ
ないが、アミノ酸番号１１１〜１２０番目以降のペプチ
ドを除去すると良好な結果が得られる。特に、１１５番
目以降のペプチドを除去すると好適な結果が得られる。
糖鎖の結合したＣ末端ペプチドを除去することを目的と
しているので、遺伝子レベルで導入された変異がどのよ
うなものであっても、要はβ−サブユニットの糖鎖のＣ
末端ペプチドが除去できればよい。除去すべきペプチド
は、β−サブユニットのＣ末端領域にあり、実質的にＦ
ＳＨ活性の増強に寄与するものであればその範囲は問わ
ないが、アミノ酸番号１１１〜１２０番目以降のペプチ
ドを除去すると良好な結果が得られる。特に、１１５番
目以降のペプチドを除去すると好適な結果が得られる。
【００１５】遺伝子を効率的に発現させてタンパク質を
生産させるためには、宿主細胞内で機能するプロモータ
ーの支配下に目的遺伝子を連結すればよい。遺伝子の発
現に用いるプロモーターは、実質的に細胞内で発現可能
なものであれば、特に制約なく用いることができるが、
高い生産量を得るためには、強力な活性を有するプロモ
ーターを利用することが望ましい。
生産させるためには、宿主細胞内で機能するプロモータ
ーの支配下に目的遺伝子を連結すればよい。遺伝子の発
現に用いるプロモーターは、実質的に細胞内で発現可能
なものであれば、特に制約なく用いることができるが、
高い生産量を得るためには、強力な活性を有するプロモ
ーターを利用することが望ましい。
【００１６】好適なプロモーターの例としては、サイト
メガロウィルス主要ＩＥ遺伝子プロモーターやラウス肉
腫ウィルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０Ｅ遺伝子プロ
モーター、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝
子プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺
伝子プロモーター、ヒトβ−アクチン遺伝子プロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、熱ショックタンパ
ク質プロモーター、マウス乳がんウィルスプロモータ
ー、フィブロネクチンプロモーターなどを挙げることが
できる。これらのプロモーターは、それぞれ単独で用い
てもよいし、また異なるプロモーターを２種並べて用い
たり、２種のプロモーターを融合させて用いてもよい。
メガロウィルス主要ＩＥ遺伝子プロモーターやラウス肉
腫ウィルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０Ｅ遺伝子プロ
モーター、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝
子プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ遺
伝子プロモーター、ヒトβ−アクチン遺伝子プロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター、熱ショックタンパ
ク質プロモーター、マウス乳がんウィルスプロモータ
ー、フィブロネクチンプロモーターなどを挙げることが
できる。これらのプロモーターは、それぞれ単独で用い
てもよいし、また異なるプロモーターを２種並べて用い
たり、２種のプロモーターを融合させて用いてもよい。
【００１７】ｅＣＧを生産するために用いる宿主として
は、要は糖鎖が結合しかつゴナドトロピン活性を有する
ｅＣＧを安定に生産する能力を有するものであれは、特
に制約なく用いることができるが、好適な細胞株として
は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、新生
仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウス乳がん細胞（Ｃ
−１２７）、マウス線維芽細胞（ＬおよびＮＩＨ３Ｔ
３）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＶ−１）、ヒト子
宮頸部がん由来細胞（ＨｅＬａ）、マウス骨髄腫細胞
（Ｓｐ２／０）、ヒトＢリンパ芽球様細胞（Ｎａｍａｌ
ｗａ）、ラット下垂体腫瘍細胞（ＧＨ３）などを挙げる
ことができる。
は、要は糖鎖が結合しかつゴナドトロピン活性を有する
ｅＣＧを安定に生産する能力を有するものであれは、特
に制約なく用いることができるが、好適な細胞株として
は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、新生
仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウス乳がん細胞（Ｃ
−１２７）、マウス線維芽細胞（ＬおよびＮＩＨ３Ｔ
３）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＶ−１）、ヒト子
宮頸部がん由来細胞（ＨｅＬａ）、マウス骨髄腫細胞
（Ｓｐ２／０）、ヒトＢリンパ芽球様細胞（Ｎａｍａｌ
ｗａ）、ラット下垂体腫瘍細胞（ＧＨ３）などを挙げる
ことができる。
【００１８】遺伝子の導入に用いるベクターとしては、
目的の遺伝子の発現に必要なプロモーター、エンハンサ
ー、ポリＡシグナル、選択マーカーなどを備えているも
のであれば制約なく用いることができるが、市販のベク
ターをそのままあるいは改良して用いることもできる。
特に好ましいベクターとしては、ｐＣＭＶ（Pharminge
n, USA)、ｐＡＢＷＮ（Niwa, H., et al., Gene, 108:1
93-200 (1991).)などを挙げることができる。また、遺
伝子の細胞内への導入法については特に制約はなく、一
般的な方法、例えば、リン酸カルシウムゲル共役沈澱法
やリポソーム法などを用いることができる。
目的の遺伝子の発現に必要なプロモーター、エンハンサ
ー、ポリＡシグナル、選択マーカーなどを備えているも
のであれば制約なく用いることができるが、市販のベク
ターをそのままあるいは改良して用いることもできる。
特に好ましいベクターとしては、ｐＣＭＶ（Pharminge
n, USA)、ｐＡＢＷＮ（Niwa, H., et al., Gene, 108:1
93-200 (1991).)などを挙げることができる。また、遺
伝子の細胞内への導入法については特に制約はなく、一
般的な方法、例えば、リン酸カルシウムゲル共役沈澱法
やリポソーム法などを用いることができる。
【００１９】導入した遺伝子を増幅することにより、遺
伝子のコピー数を増大させた高発現株を得ることができ
る。一般的には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）を薬剤増幅マーカーとして、段階的にＤＨＦＲに対
する阻害剤であるメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を増
大させることにより、遺伝子を増幅することができる
が、グルタミンシンテターゼ遺伝子を増幅マーカーとし
て、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）で増幅する方
法や、ウシパピローマウィルスゲノムの69％からなるＤ
ＮＡが細胞中で環状の二本鎖ＤＮＡのエピソームとして
安定に存在することを利用して、薬剤耐性マーカー遺伝
子（例えば、弱いプロモーター制御下の変異型ネオマイ
シンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）とともにベク
ターを導入することにより、宿主染色体へ組み込んで増
幅する方法などを用いることもできる。
伝子のコピー数を増大させた高発現株を得ることができ
る。一般的には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）を薬剤増幅マーカーとして、段階的にＤＨＦＲに対
する阻害剤であるメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を増
大させることにより、遺伝子を増幅することができる
が、グルタミンシンテターゼ遺伝子を増幅マーカーとし
て、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）で増幅する方
法や、ウシパピローマウィルスゲノムの69％からなるＤ
ＮＡが細胞中で環状の二本鎖ＤＮＡのエピソームとして
安定に存在することを利用して、薬剤耐性マーカー遺伝
子（例えば、弱いプロモーター制御下の変異型ネオマイ
シンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）とともにベク
ターを導入することにより、宿主染色体へ組み込んで増
幅する方法などを用いることもできる。
【００２０】また、目的物質の生産性を高めるために、
制御遺伝子やがん遺伝子を導入して、プロモーターやエ
ンハンサーを活性化する方法を利用することもできる。
また、αおよびβの各サブユニット遺伝子は同一の発現
ベクター上にコードされていてもよいし、異なる発現ベ
クター上にコードされていてもよい。異なる発現ベクタ
ーに各サブユニット遺伝子がコードされている場合は、
両組換えプラスミドを同時に宿主に導入してもよいし、
別々の細胞に導入後得られた各サブユニットからヘテロ
ダイマーを再構成してもよい。
制御遺伝子やがん遺伝子を導入して、プロモーターやエ
ンハンサーを活性化する方法を利用することもできる。
また、αおよびβの各サブユニット遺伝子は同一の発現
ベクター上にコードされていてもよいし、異なる発現ベ
クター上にコードされていてもよい。異なる発現ベクタ
ーに各サブユニット遺伝子がコードされている場合は、
両組換えプラスミドを同時に宿主に導入してもよいし、
別々の細胞に導入後得られた各サブユニットからヘテロ
ダイマーを再構成してもよい。
【００２１】培養方法や培養条件には特に制約はなく、
要は宿主細胞が増殖し、導入した遺伝子が発現し、所定
の位置に糖鎖が結合し、かつ生物学的に活性な変異型ｅ
ＣＧが得られればよい。培養するための培地としては、
有血清培地、無血清培地またはそれらを適宜組み合わせ
て用いることができる。培養液からの単離精製は、ｅＣ
Ｇまたは他の性腺刺激ホルモンの精製に用いる通常の方
法を用いることができる。例えば、硫安沈澱、吸着沈
澱、エタノール沈澱などの沈澱法、ゲルろ過、陰イオン
または陽イオン交換クロマト、逆相クロマト、疎水クロ
マトなどの各種クロマト工程を適宜組み合わせて用いる
ことができる。
要は宿主細胞が増殖し、導入した遺伝子が発現し、所定
の位置に糖鎖が結合し、かつ生物学的に活性な変異型ｅ
ＣＧが得られればよい。培養するための培地としては、
有血清培地、無血清培地またはそれらを適宜組み合わせ
て用いることができる。培養液からの単離精製は、ｅＣ
Ｇまたは他の性腺刺激ホルモンの精製に用いる通常の方
法を用いることができる。例えば、硫安沈澱、吸着沈
澱、エタノール沈澱などの沈澱法、ゲルろ過、陰イオン
または陽イオン交換クロマト、逆相クロマト、疎水クロ
マトなどの各種クロマト工程を適宜組み合わせて用いる
ことができる。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもの
でない。参考例１ ．ＰＣＲによるＥＣＧ遺伝子のクローニング １．プライマーの設計と合成 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してｅＣＧ遺伝
子をクローニングするために、反応に用いるプライマー
の遺伝子配列を以下のように設計し、ＤＮＡ Oligo-100
0 synthesizer(Beckman Instruments, Inc., USA）を用
いて化学合成した。
に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもの
でない。参考例１ ．ＰＣＲによるＥＣＧ遺伝子のクローニング １．プライマーの設計と合成 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してｅＣＧ遺伝
子をクローニングするために、反応に用いるプライマー
の遺伝子配列を以下のように設計し、ＤＮＡ Oligo-100
0 synthesizer(Beckman Instruments, Inc., USA）を用
いて化学合成した。
【００２３】ｅＣＧα−サブユニット遺伝子に対するプ
ライマーは以下のように設計した。ヒト、ラット、ベン
ガルザル（Fiddes, J. & Goodman, H. M., Nature, 28
1:351-356 (1979).; Godine, J. E., et al., J. Biol.
Chem., 257:8368-8371 (1982).; Golos, T. G., et a
l., DNA and Cell Biology, 10:367-380 (1991).）のプ
レ−α−サブユニットの遺伝子配列情報を基に、４残基
のシグナル配列を含むｅＣＧα−サブユニットに対する
Ｎ末端側（＋鎖）混合プライマー：５'-ＡＧＧＡＧ（Ｃ
／Ａ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＴＡ
Ｃ−３' （配列番号：３）（開始コドンの９塩基上流か
ら１２塩基下流）を合成した。また、Ｃ末端付近の配列
情報（Stewart, F., et al., J. Endocrinol., 115:341
-346 (1987).）を基に、Ｃ末端側（−鎖）プライマー：
５'-ＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴ-
３' （配列番号：４）（終始コドンの１８塩基下流から
３塩基上流）を合成した。
ライマーは以下のように設計した。ヒト、ラット、ベン
ガルザル（Fiddes, J. & Goodman, H. M., Nature, 28
1:351-356 (1979).; Godine, J. E., et al., J. Biol.
Chem., 257:8368-8371 (1982).; Golos, T. G., et a
l., DNA and Cell Biology, 10:367-380 (1991).）のプ
レ−α−サブユニットの遺伝子配列情報を基に、４残基
のシグナル配列を含むｅＣＧα−サブユニットに対する
Ｎ末端側（＋鎖）混合プライマー：５'-ＡＧＧＡＧ（Ｃ
／Ａ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＡＴＧＧＡＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＴＡ
Ｃ−３' （配列番号：３）（開始コドンの９塩基上流か
ら１２塩基下流）を合成した。また、Ｃ末端付近の配列
情報（Stewart, F., et al., J. Endocrinol., 115:341
-346 (1987).）を基に、Ｃ末端側（−鎖）プライマー：
５'-ＣＡＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴ-
３' （配列番号：４）（終始コドンの１８塩基下流から
３塩基上流）を合成した。
【００２４】一方、ｅＣＧβ−サブユニット遺伝子に対
しては、既知の配列情報（Sherman,G. B., et al., Mo
l. Endocrinol., 6:951-959 (1992)．）を基に、Ｎ末端
側（＋鎖）プライマー：５'-ＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧ
ＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ-３' （配列番号：５）（開
始コドンの９塩基上流から１５塩基下流）とＣ末端側
（−鎖）プライマー：５'-ＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧ
ＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧ-３' （配列番号：６）（終始コ
ドンの８塩基下流から１５塩基上流）を合成した。
しては、既知の配列情報（Sherman,G. B., et al., Mo
l. Endocrinol., 6:951-959 (1992)．）を基に、Ｎ末端
側（＋鎖）プライマー：５'-ＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＴＧ
ＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ-３' （配列番号：５）（開
始コドンの９塩基上流から１５塩基下流）とＣ末端側
（−鎖）プライマー：５'-ＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧ
ＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧ-３' （配列番号：６）（終始コ
ドンの８塩基下流から１５塩基上流）を合成した。
【００２５】２．ウマ胎盤組織からのｍＲＮＡの抽出 妊娠７０日の北海道野生馬（３才）を全身麻酔下で開腹
し、胎盤組織から内膜杯（endometrical cup）を摘出し
た。冷凍庫で凍結保存した後、Sambrookらの方法（Samb
rook, J., et al., Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Press, Cold Spr
ing Harbor. (1989)．）に従って内膜杯からＲＮＡを抽
出し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法を用いて精製した。
し、胎盤組織から内膜杯（endometrical cup）を摘出し
た。冷凍庫で凍結保存した後、Sambrookらの方法（Samb
rook, J., et al., Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Press, Cold Spr
ing Harbor. (1989)．）に従って内膜杯からＲＮＡを抽
出し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法を用いて精製した。
【００２６】３．ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成は、Ｍ−ＭｕＬＶ（Moloney Murine Leu
kemia Virus)由来の逆転写酵素を利用したFirst-strand
cDNA synthesis kit （Pharmacia LKB Biotechnology,
Uppsala, Sweden）を用いて行った。５μｇのＲＮＡを
含む溶液を６５℃で加熱した後、氷中で急冷した。熱変
性ＲＮＡにｃＤＮＡ反応液１１μｌ、ＤＴＴ１μｌ、Ｍ
−ＭｕＬＶプライマー１μｌを加え、３７℃で１時間保
温した。得られた反応混合物をＰＣＲ増幅にそのまま用
いた。
kemia Virus)由来の逆転写酵素を利用したFirst-strand
cDNA synthesis kit （Pharmacia LKB Biotechnology,
Uppsala, Sweden）を用いて行った。５μｇのＲＮＡを
含む溶液を６５℃で加熱した後、氷中で急冷した。熱変
性ＲＮＡにｃＤＮＡ反応液１１μｌ、ＤＴＴ１μｌ、Ｍ
−ＭｕＬＶプライマー１μｌを加え、３７℃で１時間保
温した。得られた反応混合物をＰＣＲ増幅にそのまま用
いた。
【００２７】４．ＰＣＲによる遺伝子クローニング ＰＣＲ（Quick Thermo−II、Nippon Genetics 、Tokyo)
による遺伝子断片の増幅は２．５unitのｐｆｕポリメラ
ーゼ（Stratagene, CA, USA)を用いて、変性（９１℃、
１分）、アニール（３７℃、１分）、伸長（７２℃、２
分）のサイクルを３０回繰り返して行った。ＰＣＲで増
幅した各ＤＮＡ断片を、１ｍＭＥＤＴＡを含む４０ｍＭ
Ｔris-酢酸緩衝液を用いたアガロースゲル（１％）電気
泳動で解析した。得られたＤＮＡ断片が、塩基配列から
予想される泳動位置（α−サブユニット遺伝子：３８７
ｂｐ；β−サブユニット遺伝子：５２４ｂｐ）に検出さ
れることを確認した。
による遺伝子断片の増幅は２．５unitのｐｆｕポリメラ
ーゼ（Stratagene, CA, USA)を用いて、変性（９１℃、
１分）、アニール（３７℃、１分）、伸長（７２℃、２
分）のサイクルを３０回繰り返して行った。ＰＣＲで増
幅した各ＤＮＡ断片を、１ｍＭＥＤＴＡを含む４０ｍＭ
Ｔris-酢酸緩衝液を用いたアガロースゲル（１％）電気
泳動で解析した。得られたＤＮＡ断片が、塩基配列から
予想される泳動位置（α−サブユニット遺伝子：３８７
ｂｐ；β−サブユニット遺伝子：５２４ｂｐ）に検出さ
れることを確認した。
【００２８】５．ＰＣＲ断片のサブクローニングと塩基
配列の決定 ＰＣＲ断片をｐＵＣ１１９（宝酒造、京都）のＳmaＩサ
イトに挿入し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（Stratagen
e, CA, USA)に導入した。得られた形質転換体から組換
えプラスミドを抽出し、QIA prep-spin plasmid kit
（QIAGEN, Chatsworth, USA)で精製した。ｅＣＧαおよ
びβ−サブユニットをコードする組換えプラスミドを、
それぞれ、ｐＵＣｅＣＧα１およびｐＵＣｅＣＧβ１と
命名した。各組換えプラスミドの挿入断片の塩基配列を
ジデオキシ・チェイン・ターミネーション法で解析し、
所定の配列を有することを確認した。
配列の決定 ＰＣＲ断片をｐＵＣ１１９（宝酒造、京都）のＳmaＩサ
イトに挿入し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（Stratagen
e, CA, USA)に導入した。得られた形質転換体から組換
えプラスミドを抽出し、QIA prep-spin plasmid kit
（QIAGEN, Chatsworth, USA)で精製した。ｅＣＧαおよ
びβ−サブユニットをコードする組換えプラスミドを、
それぞれ、ｐＵＣｅＣＧα１およびｐＵＣｅＣＧβ１と
命名した。各組換えプラスミドの挿入断片の塩基配列を
ジデオキシ・チェイン・ターミネーション法で解析し、
所定の配列を有することを確認した。
【００２９】実施例１．変異型ｅＣＧ発現ベクターの構
築と細胞への導入 １．各サブユニット遺伝子の５' 末端へのＸhoＩサイト
の導入 ｅＣＧのαおよびβ−サブユニット遺伝子断片の５' 末
端にＰＣＲ増幅法により制限酵素ＸhoＩ切断部位を付加
した。ｐＵＣｅＣＧα１を鋳型として、ＸhoＩサイトと
Kozakサイト（Kozak, M., Cell, 44:283 (1986).)を含
む５' 側プライマー（ｅＣＧαＸｈｏ）：５'-ＧＴＡＣ
ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡ
- ３' （配列番号：７）とＭ１３逆鎖プライマー：５'-
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ- ３' （配列番
号：８）を用いてαサブユニット遺伝子を増幅し、５'
末端にＸｈｏＩサイトと Kozakサイトを導入した。
築と細胞への導入 １．各サブユニット遺伝子の５' 末端へのＸhoＩサイト
の導入 ｅＣＧのαおよびβ−サブユニット遺伝子断片の５' 末
端にＰＣＲ増幅法により制限酵素ＸhoＩ切断部位を付加
した。ｐＵＣｅＣＧα１を鋳型として、ＸhoＩサイトと
Kozakサイト（Kozak, M., Cell, 44:283 (1986).)を含
む５' 側プライマー（ｅＣＧαＸｈｏ）：５'-ＧＴＡＣ
ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡ
- ３' （配列番号：７）とＭ１３逆鎖プライマー：５'-
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ- ３' （配列番
号：８）を用いてαサブユニット遺伝子を増幅し、５'
末端にＸｈｏＩサイトと Kozakサイトを導入した。
【００３０】同様に、ｐＵＣｅＣＧβ１を鋳型として、
ＸhoＩサイトと Kozakサイトを含む５' 側プライマー
（ｅＣＧβＸｈｏ）：５'-ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣ
ＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ- ３' （配列番号：
９）とＭ１３逆鎖プライマー：５'-ＣＡＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＴＡＴＧＡＣ- ３' （配列番号：８）を用いてβサ
ブユニット遺伝子を増幅し、５' 末端にＸhoＩサイトと
Kozakサイトを導入した。ＰＣＲフラグメントをｐＵＣ
１１９のＳmaＩサイト連結した。挿入断片のＰＣＲ増幅
で生じたｐＵＣ１１９ベクターの重複部分をＰstＩで切
断し連結することにより欠失させた。２種類の生成プラ
スミド（ｐＵＣｅＣＧαＸｈｏ、ｐＵＣｅＣＧβＸｈ
ｏ）の挿入断片を解析し、ｅＣＧαおよびβサブユニッ
トの５' 末端にＸhoＩサイトが存在することを確認し
た。
ＸhoＩサイトと Kozakサイトを含む５' 側プライマー
（ｅＣＧβＸｈｏ）：５'-ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣ
ＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ- ３' （配列番号：
９）とＭ１３逆鎖プライマー：５'-ＣＡＧＧＡＡＡＣＡ
ＧＣＴＡＴＧＡＣ- ３' （配列番号：８）を用いてβサ
ブユニット遺伝子を増幅し、５' 末端にＸhoＩサイトと
Kozakサイトを導入した。ＰＣＲフラグメントをｐＵＣ
１１９のＳmaＩサイト連結した。挿入断片のＰＣＲ増幅
で生じたｐＵＣ１１９ベクターの重複部分をＰstＩで切
断し連結することにより欠失させた。２種類の生成プラ
スミド（ｐＵＣｅＣＧαＸｈｏ、ｐＵＣｅＣＧβＸｈ
ｏ）の挿入断片を解析し、ｅＣＧαおよびβサブユニッ
トの５' 末端にＸhoＩサイトが存在することを確認し
た。
【００３１】２．ｅＣＧβ−サブユニト遺伝子への変異
の導入 Ｏ−結合型糖鎖を含むβ−サブユニットのＣ末端ペプチ
ド（β−ＣＴＰ）を欠失させるために、ｐＵＣｅＣＧβ
Ｘｈｏを鋳型として、ＳalＩサイトを含むβ−ＣＴＰプ
ライマー：５' - ＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＴ
ＧＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＣ- ３' （配列番号：１０）
とＭ１３順鎖プライマー：５'-ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＣＧＡＣ- ３' （配列番号：１１）を用いてＰＣＲ
を行った。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片はＸhoＩとＳal
Ｉで切断し、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏに挿入した。得られ
たプラスミドをｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰと命名した。ｐ
ＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰの塩基配列を解析し、所定の変異
が導入されたことを確認した。
の導入 Ｏ−結合型糖鎖を含むβ−サブユニットのＣ末端ペプチ
ド（β−ＣＴＰ）を欠失させるために、ｐＵＣｅＣＧβ
Ｘｈｏを鋳型として、ＳalＩサイトを含むβ−ＣＴＰプ
ライマー：５' - ＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＴ
ＧＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＣ- ３' （配列番号：１０）
とＭ１３順鎖プライマー：５'-ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＣＧＡＣ- ３' （配列番号：１１）を用いてＰＣＲ
を行った。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片はＸhoＩとＳal
Ｉで切断し、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏに挿入した。得られ
たプラスミドをｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰと命名した。ｐ
ＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰの塩基配列を解析し、所定の変異
が導入されたことを確認した。
【００３２】３．発現ベクターの構築 ほ乳動物系発現ベクターｐＡＢＷＮ（１１ｋｂ）は、β
−アクチンプロモーターに基づく強力なプロモーター、
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ゲノムの６９％のサ
ブ領域、および弱いプロモータに支配される変異型ネオ
マイシンホスフォトランスフェラーゼII遺伝子からな
り、ネオマイシンアナログＧ４１８への耐性を付与する
（Miyazaki, J. I., et al., Gene, 79:269-277 (198
9).; Niwa, H., et al., Gene, 108:193-200 (199
1).）。ｐＡＢＷＮのＢＰＶフラグメントをＨind III
で欠失させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｎot
Ｉリンカーを挿入してｐＡＢ２を作製した。ｐＵＣｅＣ
ＧαＸｈｏからｅＣＧα−サブユニットを含むＸhoＩ／
ＳalＩ断片を切り出し、ｐＡＢ２のＸhoＩサイトに導入
してｐＡＢ２ｅＣＧαを作製した。
−アクチンプロモーターに基づく強力なプロモーター、
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ゲノムの６９％のサ
ブ領域、および弱いプロモータに支配される変異型ネオ
マイシンホスフォトランスフェラーゼII遺伝子からな
り、ネオマイシンアナログＧ４１８への耐性を付与する
（Miyazaki, J. I., et al., Gene, 79:269-277 (198
9).; Niwa, H., et al., Gene, 108:193-200 (199
1).）。ｐＡＢＷＮのＢＰＶフラグメントをＨind III
で欠失させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Ｎot
Ｉリンカーを挿入してｐＡＢ２を作製した。ｐＵＣｅＣ
ＧαＸｈｏからｅＣＧα−サブユニットを含むＸhoＩ／
ＳalＩ断片を切り出し、ｐＡＢ２のＸhoＩサイトに導入
してｐＡＢ２ｅＣＧαを作製した。
【００３３】一方、ｐＡＢＷＮのネオマイシン耐性遺伝
子をＳalＩで欠失させ、ＮotＩリンカーを挿入してｐＡ
Ｂ３を作製した。ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏからｅＣＧβ−
サブユニットを含むＸhoＩ／ＳalＩ断片をｐＡＢ３のＸ
hoＩサイトに挿入してｐＡＢ３ｅＣＧβを作製した。ｐ
ＡＢ２ｅＣＧαとｐＡＢ３ｅＣＧβをＰvuＩとＮotＩで
切断し、ｅＣＧα−サブユニットｃＤＮＡを含む断片
（４．２ｋｂ）とβ−サブユニットｃＤＮＡを含む断片
（１０．２ｋｂ）を結合し、両サブユニットの同時発現
ベクターを作製し、ｐＡＢｅＣＧα／β（１４．４ｋ
ｂ）と命名した。
子をＳalＩで欠失させ、ＮotＩリンカーを挿入してｐＡ
Ｂ３を作製した。ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏからｅＣＧβ−
サブユニットを含むＸhoＩ／ＳalＩ断片をｐＡＢ３のＸ
hoＩサイトに挿入してｐＡＢ３ｅＣＧβを作製した。ｐ
ＡＢ２ｅＣＧαとｐＡＢ３ｅＣＧβをＰvuＩとＮotＩで
切断し、ｅＣＧα−サブユニットｃＤＮＡを含む断片
（４．２ｋｂ）とβ−サブユニットｃＤＮＡを含む断片
（１０．２ｋｂ）を結合し、両サブユニットの同時発現
ベクターを作製し、ｐＡＢｅＣＧα／β（１４．４ｋ
ｂ）と命名した。
【００３４】ｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰから変異型ｅＣＧ
β−サブユニットを含むＸhoＩ／ＳalＩ断片を切り出
し、ｐＡＢ３のＸhoＩサイトに挿入してｐＡＢ３ｅＣＧ
β−ＣＴＰを作製した。ｐＡＢ２ｅＣＧαとｐＡＢ３ｅ
ＣＧβ−ＣＴＰをＰvuＩとＮotＩで切断し、ｅＣＧα−
サブユニットｃＤＮＡを含む断片（４．２ｋｂ）とβ−
サブユニットｃＤＮＡを含む断片（１０．１ｋｂ）を結
合し、両サブユニットの同時発現ベクターを作製し、ｐ
ＡＢｅＣＧα／β−ＣＴＰ（１４．３ｋｂ）と命名し
た。
β−サブユニットを含むＸhoＩ／ＳalＩ断片を切り出
し、ｐＡＢ３のＸhoＩサイトに挿入してｐＡＢ３ｅＣＧ
β−ＣＴＰを作製した。ｐＡＢ２ｅＣＧαとｐＡＢ３ｅ
ＣＧβ−ＣＴＰをＰvuＩとＮotＩで切断し、ｅＣＧα−
サブユニットｃＤＮＡを含む断片（４．２ｋｂ）とβ−
サブユニットｃＤＮＡを含む断片（１０．１ｋｂ）を結
合し、両サブユニットの同時発現ベクターを作製し、ｐ
ＡＢｅＣＧα／β−ＣＴＰ（１４．３ｋｂ）と命名し
た。
【００３５】４．組換えプラスミドの細胞への導入 チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ja
panese Cancer Research Resources Bank, Tokyo）は、
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）を補い、１０％
（v/v)ＦＣＳを含むＨam'sＦ１２培地（Gibco BRL, Gai
thersburg, MD, USA）で加湿５％ＣＯ2インキュベータ
中３７℃で培養した。これらの細胞に、リポフェクトア
ミン法によりｐＡＢｅＣＧα／β−ＣＴＰを導入した。
panese Cancer Research Resources Bank, Tokyo）は、
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）、グルタミン（２ｍＭ）を補い、１０％
（v/v)ＦＣＳを含むＨam'sＦ１２培地（Gibco BRL, Gai
thersburg, MD, USA）で加湿５％ＣＯ2インキュベータ
中３７℃で培養した。これらの細胞に、リポフェクトア
ミン法によりｐＡＢｅＣＧα／β−ＣＴＰを導入した。
【００３６】６×１０5 個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む４
ｍｌ培養液を６０ｍｍシャーレに採取し、５０−８０％
コンフルエントになるまでＣＯ2 インキュベータ中３７
℃で２４時間培養した。感染の日に６μｇのＤＮＡと３
００μｌのＯpti-ＭＥＭＩ（Gibco BRL, USA）に懸濁し
た４０μｇのリポフェクトアミン（Gibco BRL, USA）を
１２×７５ｍｍ滅菌試験管で混合し、室温で３０分反応
させＤＮＡ／脂質複合体を形成させた。
ｍｌ培養液を６０ｍｍシャーレに採取し、５０−８０％
コンフルエントになるまでＣＯ2 インキュベータ中３７
℃で２４時間培養した。感染の日に６μｇのＤＮＡと３
００μｌのＯpti-ＭＥＭＩ（Gibco BRL, USA）に懸濁し
た４０μｇのリポフェクトアミン（Gibco BRL, USA）を
１２×７５ｍｍ滅菌試験管で混合し、室温で３０分反応
させＤＮＡ／脂質複合体を形成させた。
【００３７】この間、細胞を４ｍｌ無血清Ｏｐｔｉ−Ｍ
ＥＭＩ培地で１回洗浄した。複合体を含む各試験管に
１．８ｍｌのＯpti −ＭＥＭＩ培地を加えて穏やかに混
合し、洗浄した細胞に重層してＣＯ2 インキュベータ中
で３７℃で５時間培養した。その後、２倍濃度のＦＣＳ
を含む２．４ｍｌ生育培地を、感染混合物を除去せずに
加えた。感染２４時間後と７２時間後に、培養液の１／
３０量を新鮮な生育培地に移し継代培養した。
ＥＭＩ培地で１回洗浄した。複合体を含む各試験管に
１．８ｍｌのＯpti −ＭＥＭＩ培地を加えて穏やかに混
合し、洗浄した細胞に重層してＣＯ2 インキュベータ中
で３７℃で５時間培養した。その後、２倍濃度のＦＣＳ
を含む２．４ｍｌ生育培地を、感染混合物を除去せずに
加えた。感染２４時間後と７２時間後に、培養液の１／
３０量を新鮮な生育培地に移し継代培養した。
【００３８】５．感染クローンの選択とスクリーニング （１）Ｇ４１８選択 ８００μｇ／ｍｌのネオマイシンアナログＧ４１８（Gi
bco BRL, USA）を含む生育培地で感染後２週間培養する
ことにより、安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞感染体を選択し
た。大きくて生育の良好なコロニーをクローニングシリ
ンダでピックアップし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を
含む生育培地で４週間培養した。 （２）導入細胞のＲＴ−ＰＣＲ解析 得られたプラスミド導入細胞をＲＴ−ＰＣＲで解析し
た。上澄みを除去して細胞を回収し、Chomczynski の抽
出法（Chomczynski, P., Bio Techniques, 15:532-536
(1993).)を用いてtotal ＲＮＡを調製した。
bco BRL, USA）を含む生育培地で感染後２週間培養する
ことにより、安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞感染体を選択し
た。大きくて生育の良好なコロニーをクローニングシリ
ンダでピックアップし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を
含む生育培地で４週間培養した。 （２）導入細胞のＲＴ−ＰＣＲ解析 得られたプラスミド導入細胞をＲＴ−ＰＣＲで解析し
た。上澄みを除去して細胞を回収し、Chomczynski の抽
出法（Chomczynski, P., Bio Techniques, 15:532-536
(1993).)を用いてtotal ＲＮＡを調製した。
【００３９】５μｇのＲＮＡを用い、逆転写酵素により
ｃＤＮＡを合成し、下記のプライマーを用いてＰＣＲで
増幅した（Min, K. S., et al., J. Reprod. Dev., 40:
301-305(1994).）。αサブユニットに対しては、順鎖プ
ライマー（ｅＣＧαＸｈｏ）：５'-ＧＴＡＣＴＣＧＡＧ
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡ- ３' （配
列番号：７）と逆鎖プライマー（ｅＣＧα）：５'-ＣＡ
ＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴ- ３' （配列
番号：４）を用いた。また、βサブユニットに対して
は、順鎖プライマー（ｅＣＧβＸｈｏ）：５'-ＴＣＧＣ
ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ
- ３' （配列番号：９）と逆鎖プライマー（ｅＣＧ
β）：５'-ＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＡＴ
ＴＧＧ- ３' （配列番号：６）または変異β- サブユニ
ット逆鎖プライマー（ｅＣＧβ- ＣＴＰ）：５' - ＡＧ
ＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＣＡ
ＧＧＣ-３' （配列番号：１０）を用いた。ＰＣＲ産物
をアガロースゲル電気泳動で解析し、αおよびβサブユ
ニット遺伝子に対するプライマーによってＤＮＡ断片が
増幅され、所定の分子量を有することを確認した。
ｃＤＮＡを合成し、下記のプライマーを用いてＰＣＲで
増幅した（Min, K. S., et al., J. Reprod. Dev., 40:
301-305(1994).）。αサブユニットに対しては、順鎖プ
ライマー（ｅＣＧαＸｈｏ）：５'-ＧＴＡＣＴＣＧＡＧ
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡ- ３' （配
列番号：７）と逆鎖プライマー（ｅＣＧα）：５'-ＣＡ
ＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴ- ３' （配列
番号：４）を用いた。また、βサブユニットに対して
は、順鎖プライマー（ｅＣＧβＸｈｏ）：５'-ＴＣＧＣ
ＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧ
- ３' （配列番号：９）と逆鎖プライマー（ｅＣＧ
β）：５'-ＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＡＴ
ＴＧＧ- ３' （配列番号：６）または変異β- サブユニ
ット逆鎖プライマー（ｅＣＧβ- ＣＴＰ）：５' - ＡＧ
ＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＣＡ
ＧＧＣ-３' （配列番号：１０）を用いた。ＰＣＲ産物
をアガロースゲル電気泳動で解析し、αおよびβサブユ
ニット遺伝子に対するプライマーによってＤＮＡ断片が
増幅され、所定の分子量を有することを確認した。
【００４０】（３）導入細胞のノーザンブロット解析 次に、２０μｇのＲＮＡを用いてノーザンブロット解析
を行った。ノーザンブロットのプローブとして、ｅＣＧ
αとｅＣＧβ遺伝子のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（それぞれ
０．３８ｋｂと０．５２ｋｂ）を３，０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌの[ α−32Ｐ] ｄＣＴＰ（New England Nuclear, B
oston, MA, USA）でラベルした。２０μｇのＲＮＡを、
５０％ホルムアミドと６．５％ホルムアルデヒドを含む
電気泳動用緩衝液（２０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、
５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、６
５℃で１５分間加熱した。ＲＮＡをホルムアミドを含む
１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜、Ｈybon
d-Ｎ（Amersham, UK）に転写した。
を行った。ノーザンブロットのプローブとして、ｅＣＧ
αとｅＣＧβ遺伝子のＥcoＲＩ−ＰstＩ断片（それぞれ
０．３８ｋｂと０．５２ｋｂ）を３，０００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌの[ α−32Ｐ] ｄＣＴＰ（New England Nuclear, B
oston, MA, USA）でラベルした。２０μｇのＲＮＡを、
５０％ホルムアミドと６．５％ホルムアルデヒドを含む
電気泳動用緩衝液（２０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、
５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、６
５℃で１５分間加熱した。ＲＮＡをホルムアミドを含む
１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜、Ｈybon
d-Ｎ（Amersham, UK）に転写した。
【００４１】５０％ホルムアミド、０．０２％ＳＤＳ、
０．１％ラウロイルサルコシンを含む５×ＳＳＣ中で１
％のブロッキング試薬（Boehringer Mannheim Yamanouc
hi、Tokyo)を用いて４２℃で４時間プレハイブリダイゼ
ーション後、[ α−32Ｐ] ｄＣＴＰでラベルした各プロ
ーブを用いて一晩４２℃でハイブリダイズした。反応終
了後、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用いて２５℃
で５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用い
て６０℃で２０分間洗浄した（Sambrook, J.,et al., M
olecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed, Col
d Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. (198
9).)。Ｘ線フィルムを−８０℃で２４時間膜に対して密
着させて感光させた。それぞれ所定の位置にハイブリバ
ンドが得られることから、αおよびβ−サブユニット遺
伝子が発現していることを確認した。
０．１％ラウロイルサルコシンを含む５×ＳＳＣ中で１
％のブロッキング試薬（Boehringer Mannheim Yamanouc
hi、Tokyo)を用いて４２℃で４時間プレハイブリダイゼ
ーション後、[ α−32Ｐ] ｄＣＴＰでラベルした各プロ
ーブを用いて一晩４２℃でハイブリダイズした。反応終
了後、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用いて２５℃
で５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用い
て６０℃で２０分間洗浄した（Sambrook, J.,et al., M
olecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed, Col
d Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. (198
9).)。Ｘ線フィルムを−８０℃で２４時間膜に対して密
着させて感光させた。それぞれ所定の位置にハイブリバ
ンドが得られることから、αおよびβ−サブユニット遺
伝子が発現していることを確認した。
【００４２】実施例２．変異型ｅＣＧの生産と解析 １．変異型組換えｅＣＧの生産 安定な細胞（１×１０6 細胞）を７５ｃｍ2 培養フラス
コ中でpreconfluencyまで生育させ、Ｇ４１８を含まず
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）を添加した５ｍｌの無血清ＣＨＯ−Ｓ−
ＳＦＭII培地（Gibco BRL, USA）で１回洗浄した。２０
ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ中３７℃で４８時間培養した
後、培養培地を集め、１００，０００×ｇ、４℃で６０
分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた上澄みを、
膜濃縮装置 Amicon centriplus（Amicon, USA)を用い
て、５，０００ｒｐｍ、４℃、６０分の条件で７倍に濃
縮し、ラジオイムノアッセイとバイオアッセイに供し
た。
コ中でpreconfluencyまで生育させ、Ｇ４１８を含まず
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）を添加した５ｍｌの無血清ＣＨＯ−Ｓ−
ＳＦＭII培地（Gibco BRL, USA）で１回洗浄した。２０
ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ中３７℃で４８時間培養した
後、培養培地を集め、１００，０００×ｇ、４℃で６０
分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた上澄みを、
膜濃縮装置 Amicon centriplus（Amicon, USA)を用い
て、５，０００ｒｐｍ、４℃、６０分の条件で７倍に濃
縮し、ラジオイムノアッセイとバイオアッセイに供し
た。
【００４３】２．変異型組換えｅＣＧのラジオイムノア
ッセイによる定量 得られたｅＣＧをポリクローナル抗体Ａ５４０／Ｒ１Ｈ
（UCB-Bioproducts, SA, USA）を用いたラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）で定量した。２００μｌの０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（０．０１７ＭＮa2ＨＰＯ4 ・１２Ｈ
2 Ｏ，０．００３ＭＫＨ2 ＰＯ4 、０．９％（w/v)Ｎa
Ｃｌ、０．５％（w/v)ＢＳＡ、０．２％（w/v)Ｎa
Ｎ3)、１００μｌの標準ｅＣＧ（６．２５，１２．５，
２５，５０，１００，２００，４００ｎｇ）または所定
量のサンプル、１００μｌのウサギ抗ｅＣＧ抗血清（７
μｇ／ｍｌ）とＣloramin Ｔ法（Katayama, Y., et a
l., J. Biochem., 108:37-41 (1990).）により125Iでラ
ベルした１００μｌのｅＣＧ（２０，０００ｃｐｍ／１
００μｌ）を各試験管に加えた。
ッセイによる定量 得られたｅＣＧをポリクローナル抗体Ａ５４０／Ｒ１Ｈ
（UCB-Bioproducts, SA, USA）を用いたラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）で定量した。２００μｌの０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（０．０１７ＭＮa2ＨＰＯ4 ・１２Ｈ
2 Ｏ，０．００３ＭＫＨ2 ＰＯ4 、０．９％（w/v)Ｎa
Ｃｌ、０．５％（w/v)ＢＳＡ、０．２％（w/v)Ｎa
Ｎ3)、１００μｌの標準ｅＣＧ（６．２５，１２．５，
２５，５０，１００，２００，４００ｎｇ）または所定
量のサンプル、１００μｌのウサギ抗ｅＣＧ抗血清（７
μｇ／ｍｌ）とＣloramin Ｔ法（Katayama, Y., et a
l., J. Biochem., 108:37-41 (1990).）により125Iでラ
ベルした１００μｌのｅＣＧ（２０，０００ｃｐｍ／１
００μｌ）を各試験管に加えた。
【００４４】４℃で一晩インキュベートした後、５００
μｌの抗ウサギ沈降抗体を各試験管に加え、３０分間イ
ンキュベートし、２ｍｌのリン酸緩衝液を加え、３，０
００回転で１５分間遠心し、上澄みを吸引除去し、放射
活性をカウントした。得られた結果を、妊馬血清から精
製した天然型ｅＣＧおよび野生型組換えｅＣＧと比較し
たところ、変異型ｅＣＧは用いた抗体に対して天然型ｅ
ＣＧと全く同様の結合性を示した。また、各アッセイの
プロットから天然型ｅＣＧ換算で変異型ｅＣＧの濃度を
定量し、表１に示した。
μｌの抗ウサギ沈降抗体を各試験管に加え、３０分間イ
ンキュベートし、２ｍｌのリン酸緩衝液を加え、３，０
００回転で１５分間遠心し、上澄みを吸引除去し、放射
活性をカウントした。得られた結果を、妊馬血清から精
製した天然型ｅＣＧおよび野生型組換えｅＣＧと比較し
たところ、変異型ｅＣＧは用いた抗体に対して天然型ｅ
ＣＧと全く同様の結合性を示した。また、各アッセイの
プロットから天然型ｅＣＧ換算で変異型ｅＣＧの濃度を
定量し、表１に示した。
【００４５】３．組換えｅＣＧの糖鎖結合の解析 得られたｅＣＧの糖鎖の結合の有無を解析した。０．５
％ＳＤＳ、５０mM２−ＭＥ、５０mM Tris ・ HCl （pH7.
0)の組成のバッファー中に２ｍｇ／ｍｌとなるようにｅ
ＣＧを溶解し、５分間煮沸した。この溶液を１０μｌと
り、５μｌの７．５％界面活性剤ノニデットＰ４０およ
び０．３単位のＮ−グリコシダーゼ（Genzyme 、USA)、
１０ミリ単位のＯ−グリコシダーゼ（Genzyme 、USA)、
１０ミリ単位のノイラミニダーゼ（Boehringer Mannhei
m)と蒸留水を加えて３０μｌとした。３７℃で１８時間
インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバ
ッファー（×４）（２５０mM Tris ・ HCl(pH6.8)、４０
％（W/V)グリセロール、２０％２−ＭＥ、１０％ＳＤ
Ｓ、０．００５％ＢＰＢ）を加え、反応を停止させた。
％ＳＤＳ、５０mM２−ＭＥ、５０mM Tris ・ HCl （pH7.
0)の組成のバッファー中に２ｍｇ／ｍｌとなるようにｅ
ＣＧを溶解し、５分間煮沸した。この溶液を１０μｌと
り、５μｌの７．５％界面活性剤ノニデットＰ４０およ
び０．３単位のＮ−グリコシダーゼ（Genzyme 、USA)、
１０ミリ単位のＯ−グリコシダーゼ（Genzyme 、USA)、
１０ミリ単位のノイラミニダーゼ（Boehringer Mannhei
m)と蒸留水を加えて３０μｌとした。３７℃で１８時間
インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバ
ッファー（×４）（２５０mM Tris ・ HCl(pH6.8)、４０
％（W/V)グリセロール、２０％２−ＭＥ、１０％ＳＤ
Ｓ、０．００５％ＢＰＢ）を加え、反応を停止させた。
【００４６】糖鎖分解処理サンプルを未処理サンプルと
比較して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）で分離し、抗αサブユニット抗体および抗
βサブユニット抗体を用いたウェスタンブロッティング
を行った。未処理の組換え型ｅＣＧの各サブユニット
は、いずれも、アミノ酸配列より予想される分子量より
高分子側に泳動し、糖鎖分解酵素で処理することにより
分子量が低下し、泳動位置はアミノ酸配列より予想され
る位置とほぼ一致した。これより、得られた組換え型ｅ
ＣＧのαおよびβサブユニットに糖鎖が結合しているこ
とを確認した。
比較して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）で分離し、抗αサブユニット抗体および抗
βサブユニット抗体を用いたウェスタンブロッティング
を行った。未処理の組換え型ｅＣＧの各サブユニット
は、いずれも、アミノ酸配列より予想される分子量より
高分子側に泳動し、糖鎖分解酵素で処理することにより
分子量が低下し、泳動位置はアミノ酸配列より予想され
る位置とほぼ一致した。これより、得られた組換え型ｅ
ＣＧのαおよびβサブユニットに糖鎖が結合しているこ
とを確認した。
【００４７】実施例３．変異型ｅＣＧの生物活性 １．Ｌｅｙｄｉｇ細胞を用いたＬＨ様活性の定量 組換え型ｅＣＧのＬＨ様活性を、ラットＬｅｙｄｉｇ細
胞を用いた in vitro培養系（Dufau, M. L., et al.,
J. Clin. Endocrinol. Metab., 39:610-613 (1974).)で
定量した。４匹の６０日齢ＳpragueＤawley(ＳＤ）ラッ
トからこう丸を摘出し、注意深くdecapsulate した。細
胞を０．２５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼと１ｍｇ／ｍｌ
のＢＳＡを含む１９９培地（Gibco BRL, USA）に懸濁
し、３４℃で３０分間１５０サイクル／分で振とうし
た。
胞を用いた in vitro培養系（Dufau, M. L., et al.,
J. Clin. Endocrinol. Metab., 39:610-613 (1974).)で
定量した。４匹の６０日齢ＳpragueＤawley(ＳＤ）ラッ
トからこう丸を摘出し、注意深くdecapsulate した。細
胞を０．２５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼと１ｍｇ／ｍｌ
のＢＳＡを含む１９９培地（Gibco BRL, USA）に懸濁
し、３４℃で３０分間１５０サイクル／分で振とうし
た。
【００４８】tubuleの分散が完了するや否や、試験管を
室温で５分間垂直におき、tubuleフラクションを沈降さ
せた。上澄みをナイロンガーゼで濾過し、６００×ｇで
１４分間遠心し、沈降したinterstitial cell を１９９
培地に再懸濁した。２４ウェルプレートの各ウェルに１
×１０6 個の細胞を含む０．５ｍｌの培地と０．１ｍｌ
の天然ｅＣＧ（２〜１２８ｎｇ）またはＲＩＡで定量し
た組換えサンプル（２〜１２８ｎｇ）を加えた。３４℃
で４時間振とうしながらインキュベートした後、２，５
００ｒｐｍで１０分間遠心し、テストステロンを含む培
養上清を得た。
室温で５分間垂直におき、tubuleフラクションを沈降さ
せた。上澄みをナイロンガーゼで濾過し、６００×ｇで
１４分間遠心し、沈降したinterstitial cell を１９９
培地に再懸濁した。２４ウェルプレートの各ウェルに１
×１０6 個の細胞を含む０．５ｍｌの培地と０．１ｍｌ
の天然ｅＣＧ（２〜１２８ｎｇ）またはＲＩＡで定量し
た組換えサンプル（２〜１２８ｎｇ）を加えた。３４℃
で４時間振とうしながらインキュベートした後、２，５
００ｒｐｍで１０分間遠心し、テストステロンを含む培
養上清を得た。
【００４９】培地中に分泌したテストステロンの濃度
は、塩田らの方法（Shiota, K., et al., Endocrine.
J., 38:541-549 (1991).)に従い、ＲＩＡ法で測定し
た。培養上清を２回ジエチルエーテルで抽出し、１ｍｌ
のアセトンで希釈し、混合物を二つに分割した。それぞ
れを試験管に入れ、５００μｌのアッセイ用緩衝液
（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％（w/
v)ＮａＣｌ、０．０５％（w/v)ＮａＮ3 、０．１％（w/
v)ゼラチン）、１，５００倍希釈した１００μｌの抗テ
ストステロン抗血清と１００μｌの 3Ｈ−テストステロ
ン（１０，０００ｃｐｍ）を加えた。４℃で一晩インキ
ュベート後、２００μｌの活性炭溶液（０．６２５％
（w/v)Ｎorita Ａ、アッセイ用緩衝液に溶解した０．０
６２５％（w/v)デキストランＴ−７０）を加え、４℃で
２０分間インキュベートした。
は、塩田らの方法（Shiota, K., et al., Endocrine.
J., 38:541-549 (1991).)に従い、ＲＩＡ法で測定し
た。培養上清を２回ジエチルエーテルで抽出し、１ｍｌ
のアセトンで希釈し、混合物を二つに分割した。それぞ
れを試験管に入れ、５００μｌのアッセイ用緩衝液
（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％（w/
v)ＮａＣｌ、０．０５％（w/v)ＮａＮ3 、０．１％（w/
v)ゼラチン）、１，５００倍希釈した１００μｌの抗テ
ストステロン抗血清と１００μｌの 3Ｈ−テストステロ
ン（１０，０００ｃｐｍ）を加えた。４℃で一晩インキ
ュベート後、２００μｌの活性炭溶液（０．６２５％
（w/v)Ｎorita Ａ、アッセイ用緩衝液に溶解した０．０
６２５％（w/v)デキストランＴ−７０）を加え、４℃で
２０分間インキュベートした。
【００５０】３０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した
後、上澄みをバイアルにデカンテーションで移し、それ
に３ｍｌのシンチレータ（トルエンに溶解した４．２％
（v/v)のＬiquifluor ＴＭ）を加え、放射活性を液体シ
ンチレータでカウントした。組換えｅＣＧの相対刺激活
性は、テストステロンの分泌を刺激する half-maximal
の濃度（ＥＤ５０）から求めた。得られた結果を、野生
型ｅＣＧと比較した。変異型ｅＣＧα／β−ＣＴＰで
は、野生型ｅＣＧと同様に２０−２００ｎｇ／ｍｌの濃
度範囲に渡ってｅＣＧ濃度に依存してテストステロンの
放出量が増加した。これらの結果より、変異型ｅＣＧの
相対活性を算出し、表１に示した。
後、上澄みをバイアルにデカンテーションで移し、それ
に３ｍｌのシンチレータ（トルエンに溶解した４．２％
（v/v)のＬiquifluor ＴＭ）を加え、放射活性を液体シ
ンチレータでカウントした。組換えｅＣＧの相対刺激活
性は、テストステロンの分泌を刺激する half-maximal
の濃度（ＥＤ５０）から求めた。得られた結果を、野生
型ｅＣＧと比較した。変異型ｅＣＧα／β−ＣＴＰで
は、野生型ｅＣＧと同様に２０−２００ｎｇ／ｍｌの濃
度範囲に渡ってｅＣＧ濃度に依存してテストステロンの
放出量が増加した。これらの結果より、変異型ｅＣＧの
相対活性を算出し、表１に示した。
【００５１】２．Granulosa 細胞を用いたＦＳＨ様活性
のバイオアッセイ in vitro バイオアッセイは、Dahlらの方法（Dahl, K.
D., et al., Methodsin Enzymology, 168:414-422 (198
9).)に従い、２１〜２２日齢ラット由来のGranulosa 細
胞を用いて行った。ＦＳＨで誘導される細胞中のアロマ
ターゼ活性によって19−ヒドロキシアンドロステンジオ
ンから生成するエストラジオールの量を測定した。約１
０ｍｇのＤＥＳを含むsilastic capsules （10mm）をＳ
Ｄラットに移植し、Granulosa 細胞の増殖を刺激した。
４日後、動物を頚部脱臼で犠牲にし、卵巣を切開し, de
capsulate した。 卵胞を２７ゲージ注射針で穿刺し、
granulosa 細胞を注意深くＭc Ｃoy's５ａ培地（Gibco
BRL, USA）に絞りだした。細胞を８００ｒｐｍで５分間
遠心し、上澄みを除去し、細胞を新鮮な培地で洗浄し、
再度遠心した。
のバイオアッセイ in vitro バイオアッセイは、Dahlらの方法（Dahl, K.
D., et al., Methodsin Enzymology, 168:414-422 (198
9).)に従い、２１〜２２日齢ラット由来のGranulosa 細
胞を用いて行った。ＦＳＨで誘導される細胞中のアロマ
ターゼ活性によって19−ヒドロキシアンドロステンジオ
ンから生成するエストラジオールの量を測定した。約１
０ｍｇのＤＥＳを含むsilastic capsules （10mm）をＳ
Ｄラットに移植し、Granulosa 細胞の増殖を刺激した。
４日後、動物を頚部脱臼で犠牲にし、卵巣を切開し, de
capsulate した。 卵胞を２７ゲージ注射針で穿刺し、
granulosa 細胞を注意深くＭc Ｃoy's５ａ培地（Gibco
BRL, USA）に絞りだした。細胞を８００ｒｐｍで５分間
遠心し、上澄みを除去し、細胞を新鮮な培地で洗浄し、
再度遠心した。
【００５２】細胞を同じ培地に再懸濁し、最終濃度を５
〜８×１０4 生細胞／60μｌに調整した。４００μｌの
ＧＡＢアッセイ培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミ
ン、１μＭアンドロステンジオン、１０-7Ｍ ＤＥＳ、
３０ｎｇ／ｍｌｈＣＧ、１μｇ／μｌインシュリン、
０．１２５ｍＭＭｉｘ in Ｍc Ｃoy's５ａ培地）を２４
ウェルプレートの各ウェルに加え、４０μｌのサンプル
（２〜６４ｎｇの天然ｅＣＧまたはＲＩＡで定量した組
換え型サンプル）と６０μｌの細胞懸濁液を加えた。細
胞は湿潤９５％エアーと５％ＣＯ2 雰囲気下で３日間培
養した。培養終了後、１，０００ｒｐｍで３分間遠心
し、エストラジオールを含む培養上清を得た。
〜８×１０4 生細胞／60μｌに調整した。４００μｌの
ＧＡＢアッセイ培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミ
ン、１μＭアンドロステンジオン、１０-7Ｍ ＤＥＳ、
３０ｎｇ／ｍｌｈＣＧ、１μｇ／μｌインシュリン、
０．１２５ｍＭＭｉｘ in Ｍc Ｃoy's５ａ培地）を２４
ウェルプレートの各ウェルに加え、４０μｌのサンプル
（２〜６４ｎｇの天然ｅＣＧまたはＲＩＡで定量した組
換え型サンプル）と６０μｌの細胞懸濁液を加えた。細
胞は湿潤９５％エアーと５％ＣＯ2 雰囲気下で３日間培
養した。培養終了後、１，０００ｒｐｍで３分間遠心
し、エストラジオールを含む培養上清を得た。
【００５３】培地中に放出されたエストラジオール濃度
はテストステロンと同様ＲＩＡ法で測定した。すなわ
ち、培地を２回ジエチルエーテルで抽出し、１ｍｌのア
セトンで希釈し、混合物を二つに分割した。それぞれを
試験管に入れ、５００μｌのアッセイ用緩衝液（０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％（w/v)ＮａＣ
ｌ、０．０５％（w/v)ＮａＮ3 、０．１％（w/v)ゼラチ
ン）、４，５００倍希釈した１００μｌの抗エストラジ
オール抗血清と１００μｌの 3Ｈ−エストラジオール
（１０，０００ｃｐｍ）を加えた。４℃で一晩インキュ
ベート後、２００μｌの活性炭溶液（０．６２５％（w/
v)Ｎorita Ａ、アッセイ用緩衝液に溶解した０．０６２
５％（w/v)デキストランＴ−７０）を加え、４℃で２０
分間インキュベートした。
はテストステロンと同様ＲＩＡ法で測定した。すなわ
ち、培地を２回ジエチルエーテルで抽出し、１ｍｌのア
セトンで希釈し、混合物を二つに分割した。それぞれを
試験管に入れ、５００μｌのアッセイ用緩衝液（０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．９％（w/v)ＮａＣ
ｌ、０．０５％（w/v)ＮａＮ3 、０．１％（w/v)ゼラチ
ン）、４，５００倍希釈した１００μｌの抗エストラジ
オール抗血清と１００μｌの 3Ｈ−エストラジオール
（１０，０００ｃｐｍ）を加えた。４℃で一晩インキュ
ベート後、２００μｌの活性炭溶液（０．６２５％（w/
v)Ｎorita Ａ、アッセイ用緩衝液に溶解した０．０６２
５％（w/v)デキストランＴ−７０）を加え、４℃で２０
分間インキュベートした。
【００５４】３，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し
た後、上澄みをバイアルにデカンテーションで移し、そ
れに３ｍｌのシンチレータ（トルエンに溶解した４．２
％（v/v)Ｌiquifluor ＴＭ）を加え、放射活性を液体シ
ンチレータでカウントした。組換えｅＣＧの相対刺激活
性は、エストラジオールの分泌を刺激する half-maxima
l の濃度（ＥＤ５０）から求めた。得られた結果を、野
生型ｅＣＧと比較した。変異型ｅＣＧでは、野生型ｅＣ
Ｇと異なり、培地に添加したｅＣＧ濃度に依存してエス
トラジオール濃度が著しく増加した。これらの結果よ
り、変異型ｅＣＧの相対活性を算出し、表１に示した。
た後、上澄みをバイアルにデカンテーションで移し、そ
れに３ｍｌのシンチレータ（トルエンに溶解した４．２
％（v/v)Ｌiquifluor ＴＭ）を加え、放射活性を液体シ
ンチレータでカウントした。組換えｅＣＧの相対刺激活
性は、エストラジオールの分泌を刺激する half-maxima
l の濃度（ＥＤ５０）から求めた。得られた結果を、野
生型ｅＣＧと比較した。変異型ｅＣＧでは、野生型ｅＣ
Ｇと異なり、培地に添加したｅＣＧ濃度に依存してエス
トラジオール濃度が著しく増加した。これらの結果よ
り、変異型ｅＣＧの相対活性を算出し、表１に示した。
【００５５】
【表１】
【００５６】実施例４．変異部位の異なる変異型ｅＣＧ
の作製と生物活性 １．α／β−ＣＴＰ１１２の作製 Ｏ−結合型糖鎖を含むβ−サブユニットのアミノ酸番号
１１２番目以降のＣ末端ペプチド（β−ＣＴＰ）を欠失
させるために、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏを鋳型として、Ｓ
alＩサイトを含むβ−ＣＴＰ１１２プライマー：５' -
ＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧ
ＧＧＣＴＧ- ３' （配列番号：１２）とＭ１３順鎖プラ
イマー：５'-ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ-
３' （配列番号：１１）を用いてＰＣＲを行う以外は、
実施例１と同様の方法を用いてα／β−ＣＴＰ１１２を
作製した。
の作製と生物活性 １．α／β−ＣＴＰ１１２の作製 Ｏ−結合型糖鎖を含むβ−サブユニットのアミノ酸番号
１１２番目以降のＣ末端ペプチド（β−ＣＴＰ）を欠失
させるために、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏを鋳型として、Ｓ
alＩサイトを含むβ−ＣＴＰ１１２プライマー：５' -
ＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧ
ＧＧＣＴＧ- ３' （配列番号：１２）とＭ１３順鎖プラ
イマー：５'-ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ-
３' （配列番号：１１）を用いてＰＣＲを行う以外は、
実施例１と同様の方法を用いてα／β−ＣＴＰ１１２を
作製した。
【００５７】ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片はＸhoＩとＳ
alＩで切断し、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏに挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１２と命名
した。ｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１２の塩基配列を解析
し、所定の変異が導入されたことを確認した。実施例２
と同様にして変異型ｅＣＧを発現させ、ラジオイムノア
ッセイによって生産物を定量した。また、常法に従い得
られた変異型ｅＣＧに糖鎖が結合していることを確認し
た。
alＩで切断し、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏに挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１２と命名
した。ｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１２の塩基配列を解析
し、所定の変異が導入されたことを確認した。実施例２
と同様にして変異型ｅＣＧを発現させ、ラジオイムノア
ッセイによって生産物を定量した。また、常法に従い得
られた変異型ｅＣＧに糖鎖が結合していることを確認し
た。
【００５８】２．α／β−ＣＴＰ１１８の作製 Ｏ−結合型糖鎖を含むβ−サブユニットのアミノ酸番号
１１８番目以降のＣ末端ペプチド（β−ＣＴＰ）を欠失
させるために、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏを鋳型として、Ｓ
alＩサイトを含むβ−ＣＴＰ１１８プライマー：５' -
ＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣ
ＴＴＡＧＡ- ３' （配列番号：１３）とＭ１３順鎖プラ
イマー：５'-ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ-
３' （配列番号：１１）を用いてＰＣＲを行う以外は、
実施例１と同様の方法を用いてα／β−ＣＴＰ１１８を
作製した。
１１８番目以降のＣ末端ペプチド（β−ＣＴＰ）を欠失
させるために、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏを鋳型として、Ｓ
alＩサイトを含むβ−ＣＴＰ１１８プライマー：５' -
ＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣ
ＴＴＡＧＡ- ３' （配列番号：１３）とＭ１３順鎖プラ
イマー：５'-ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ-
３' （配列番号：１１）を用いてＰＣＲを行う以外は、
実施例１と同様の方法を用いてα／β−ＣＴＰ１１８を
作製した。
【００５９】ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片はＸhoＩとＳ
alＩで切断し、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏに挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１８と命名
した。ｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１８の塩基配列を解析
し、所定の変異が導入されたことを確認した。実施例２
と同様にして変異型ｅＣＧを発現させ、ラジオイムノア
ッセイによって生産物を定量した。また、常法に従い得
られた変異型ｅＣＧに糖鎖が結合していることを確認し
た。
alＩで切断し、ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏに挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１８と命名
した。ｐＵＣｅＣＧβ−ＣＴＰ１１８の塩基配列を解析
し、所定の変異が導入されたことを確認した。実施例２
と同様にして変異型ｅＣＧを発現させ、ラジオイムノア
ッセイによって生産物を定量した。また、常法に従い得
られた変異型ｅＣＧに糖鎖が結合していることを確認し
た。
【００６０】３．変異型ｅＣＧの生物学的活性 実施例３の方法に従い、変異型ｅＣＧであるα／β−Ｃ
ＴＰ１１２およびα／β−ＣＴＰ１１８のＦＳＨ活性お
よびＬＨ活性を測定し、野生型の組換えｅＣＧと比較し
て表２に示した。
ＴＰ１１２およびα／β−ＣＴＰ１１８のＦＳＨ活性お
よびＬＨ活性を測定し、野生型の組換えｅＣＧと比較し
て表２に示した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
【発明の効果】ｅＣＧを構成するαおよびβ−サブユニ
ットのうち、β−サブユニットのＣ末端ペプチド配列を
遺伝子工学的に除去することにより、ＦＳＨ活性を選択
的に増強した新規な性腺刺激ホルモンを作製した。これ
により、ＦＳＨ活性を大幅に向上させることができるだ
けでなく、卵胞膿腫の原因と考えられるＬＨ活性を相対
的に低く抑えた医薬品を提供することが可能となり、従
って、ヒトおよび動物を対象とするより安全で適用範囲
の広い排卵誘発剤・卵巣疾患治療剤を提供することが可
能となった。
ットのうち、β−サブユニットのＣ末端ペプチド配列を
遺伝子工学的に除去することにより、ＦＳＨ活性を選択
的に増強した新規な性腺刺激ホルモンを作製した。これ
により、ＦＳＨ活性を大幅に向上させることができるだ
けでなく、卵胞膿腫の原因と考えられるＬＨ活性を相対
的に低く抑えた医薬品を提供することが可能となり、従
って、ヒトおよび動物を対象とするより安全で適用範囲
の広い排卵誘発剤・卵巣疾患治療剤を提供することが可
能となった。
【００６３】
配列番号：１ 配列の長さ：１２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ 起源： ・生物名：ウマ（Ｅｑｕｉｄｅａ） ・組織の種類：胎盤 直接の起源： ・ライブラリー名：ｃＤＮＡ ・クローン名：ＣＨＯ−Ｋ１（ｐＡＢｅＣＧα／β） 配列の特徴： ・特徴を表す記号：sig peptide ・存在位置：-24..-1 ・特徴を決定した方法：Ｅ Met Asp Tyr Tyr Arg Lys His Ala Ala Val Ile Leu Ala Thr Leu Ser -24 -20 -15 -10 Val Phe Leu His Ile Leu His Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr -5 1 5 Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys 10 15 20 Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala 25 30 35 40 Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Arg Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn 45 50 55 Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val 60 65 70 Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu Glu Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys 75 80 85 Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile 90 95
【００６４】配列番号：２ 配列の長さ：１６９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：記載せず トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ 起源： ・生物名：ウマ（Ｅｑｕｉｄｅａ） ・組織の種類：胎盤 直接の起源： ・ライブラリー名：ｃＤＮＡ ・クローン名：ＣＨＯ−Ｋ１（ｐＡＢｅＣＧα／β） 配列の特徴： ・特徴を表す記号：sig peptide ・存在位置：-20..-1 ・特徴を決定した方法：Ｅ Met Glu Thr Leu Gln Gly Leu Leu Leu Trp Met Leu Leu Ser Val Gly -20 -15 -10 -5 Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile 1 5 10 Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Ile Cys Ile Thr 15 20 25 Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val 30 35 40 Met Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ile Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg 45 50 55 60 Glu Leu Arg Phe Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val 65 70 75 Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro 80 85 90 Cys Gln Ile Lys Thr Thr Asp Cys Gly Val Phe Arg Asp Gln Pro Leu 95 100 105 Ala Cys Ala Pro Gln Ala Ser Ser Ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gln 110 115 120 Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser 125 130 135 140 Ser His Pro Leu Pro Ile Lys Thr Ser 145 149
【００６５】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGAGMGCYA TGGATTRCTA C 21
【００６６】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACTTGGTGA AACCTTTAAA T 21
【００６７】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCACCGAGGA TGGAGACGCT CCAG 24
【００６８】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTAGTTCAAG AAGTCTTTAT TGG 23
【００６９】配列番号：７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTACTCGAGC CACCATGGAT TACTACAGA 29
【００７０】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【００７１】配列番号：９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGCTCGAGC CACCATGGAG ACGCTCCAG 29
【００７２】配列番号：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGTCGACTTT CAGGCCTGGG GGGCACAGGC 30
【００７３】配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTTTCCCAG TCACGAC 17
【００７４】配列番号：１２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGTCGACTTT CAGGCACAGG CCAAGGGCTG 30
【００７５】配列番号：１３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGTCGACTTT CAGGATGGGG GATCCTTAGA 30
【図１】αおよびβサブユニット遺伝子のサブクローニ
ングによるｐＵＣｅＣＧα１およびｐＵＣｅＣＧβ１の
構築を示す図である。
ングによるｐＵＣｅＣＧα１およびｐＵＣｅＣＧβ１の
構築を示す図である。
【図２】各サブユニット遺伝子の５’末端へのＸｈｏＩ
サイトの導入によるｐＵＣｅＣＧαＸｈｏおよびｐＵＣ
ｅＣＧβＸｈｏの構築を示す図である。
サイトの導入によるｐＵＣｅＣＧαＸｈｏおよびｐＵＣ
ｅＣＧβＸｈｏの構築を示す図である。
【図３】ｐＵＣｅＣＧβＸｈｏからのｐＵＣｅＣＧβ−
ＣＴＰの作製を示す図である。
ＣＴＰの作製を示す図である。
【図４】ｐＡＢ２ｅＣＧαの構築を示す図である。
【図５】ｐＡＢＷＮからのｐＡＢ３ｅＣＧβとｐＡＢｅ
ＣＧβ−ＣＴＰの作製を示す図である。
ＣＧβ−ＣＴＰの作製を示す図である。
【図６】発現転移ベクターｐＡＢｅＣＧα／βの構築を
示す図である。
示す図である。
【図７】変異発現ベクターｐＡＢｅＣＧα／β−ＣＴＰ
の構築を示す図である。
の構築を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 ｅＣＧのα及びβ−サブユニットから構
成され、βサブユニットがＣ末端ペプチド配列を除去し
た変異型βサブユニットであることを特徴とする、実質
的にＦＳＨ活性を増強した新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項２】 αサブユニットが配列表の配列番号１記
載のアミノ酸番号１〜９６のアミノ酸配列を有すること
を特徴とする請求項１記載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項３】 βサブユニットが野生型のアミノ酸配列
のうち、Ｃ末端ペプチドを除去した配列を有することを
特徴とする請求項１記載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項４】 βサブユニットが配列表の配列番号：２
の配列のＣ末端の３９個以下のアミノ酸残基が除去され
たアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は
３に記載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項５】 変異型βサブユニットが配列表の配列番
号２記載のアミノ酸番号１のアミノ酸から１１０ないし
１１９のいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を有す
ることを特徴とする請求項１，３，４のいずれか１項記
載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項６】 変異型βサブユニットが配列表の配列番
号２記載のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配
列を有することを特徴とする請求項１又は３〜５のいず
れか１項に記載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項７】 変異型βサブユニットが配列表の配列番
号：２のアミノ酸番号１から１１１のアミノ酸配列を有
することを特徴とする請求項１又は３〜５のいずれか１
項に記載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項８】 変異型βサブユニットが配列表の配列番
号：２のアミノ酸番号１から１１７のアミノ酸配列を有
することを特徴とする、請求項１又は３〜５のいずれか
１項に記載の新規な性腺刺激ホルモン。 - 【請求項９】 請求項１又は３〜８のいずれか１項に記
載の変異型ｅＣＧβサブユニットをコードするＤＮＡ。 - 【請求項１０】 αサブユニット及びβサブユニットの
ヘテロダイマーからなる請求項１〜８のいずれか１項記
載の変異型ｅＣＧの製造法であって、βサブユニットが
請求項１又は３〜８のいずれか１項に記載のアミノ酸配
列を有し、上記各サブユニットをコードするＤＮＡを含
んで成る同一または別々の発現ベクターで真核細胞宿主
を形質転換し、該組換え細胞を該性腺刺激ホルモンが発
現する条件で培養し、発現したホルモンを採取すること
を特徴とする、糖鎖が結合しかつ生物学的活性を有する
新規な変異型性腺刺激ホルモンの製造法。 - 【請求項１１】 αサブユニットをコードするＤＮＡが
配列表の配列番号１記載の分泌に必要なリーダー配列を
含むアミノ酸番号−２４〜９６のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡであることを特徴とする請求項１０記載の新
規な変異型性腺刺激ホルモンの製造法。 - 【請求項１２】 βサブユニットをコードするＤＮＡが
配列表の配列番号２記載の分泌に必要なアミノ酸番号−
２０〜−１のリーダー配列を含む請求項３〜８のいずれ
か１項に記載の変異型βサブユニットのアミノ酸配列を
コードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１０記
載の新規な変異型性腺刺激ホルモンの製造法。 - 【請求項１３】 発現ベクターがαサブユニットをコー
ドする請求項１１記載のＤＮＡとβサブユニットをコー
ドする請求項１２記載のＤＮＡを同時に組み込んでなる
自律複製可能な発現ベクターであることを特徴とする請
求項１０記載の新規な変異型性腺刺激ホルモンの製造
法。 - 【請求項１４】 宿主がほ乳動物由来の培養可能な細胞
であることを特徴とする請求項１０記載の新規な変異型
性腺刺激ホルモンの製造法。 - 【請求項１５】 前記ほ乳動物由来の培養可能な細胞が
チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項１０記載
の新規な変異型性腺刺激ホルモンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8212197A JPH1036399A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 新規な性腺刺激ホルモン及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8212197A JPH1036399A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 新規な性腺刺激ホルモン及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1036399A true JPH1036399A (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=16618536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8212197A Pending JPH1036399A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 新規な性腺刺激ホルモン及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1036399A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114957442A (zh) * | 2022-04-05 | 2022-08-30 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种具有促进大菱鲆卵巢发育功能的重组蛋白 |
-
1996
- 1996-07-24 JP JP8212197A patent/JPH1036399A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114957442A (zh) * | 2022-04-05 | 2022-08-30 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种具有促进大菱鲆卵巢发育功能的重组蛋白 |
| CN114957442B (zh) * | 2022-04-05 | 2023-07-14 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种具有促进大菱鲆卵巢发育功能的重组蛋白 |
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