DE69904262T3

DE69904262T3 - Benzylalkohol enthaltene FSH und FSH-Varianten Formulierungen

Info

Publication number: DE69904262T3
Application number: DE69904262T
Authority: DE
Inventors: James Arthur Greenwood Hoffmann; Jirong Indianapolis Lu
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2009-08-13
Anticipated expiration: 2019-07-17
Also published as: MY135913A; CA2335340A1; DK0974359T3; AU4998099A; NZ508874A; ATE308990T1; JP2002521342A; WO2000004913A1; EP0974359B1; EP1188444A1; DE69928296T2; DK0974359T4; ES2250290T3; ID28747A; HK1026615A1; IL140984A0; PE20000939A1; AR020618A1; ES2183486T3; ATE228850T1

Description

Die Erfindung betrifft neue Formulierungen, Serienartikel und Verwendungen von Präparationen des Follikel-stimulierenden Hormons (FSH) oder von in der Technik bekannten Varianten des Follikel-stimulierenden Hormons (FSH Varianten). Die Erfindung liefert auch vorteilhafte, mehrfach anwendbare und stabile Lösungen und Formulierungen und pharmazeutische Produkte, die vorher für eine therapeutische Verwendung nicht existiert haben. Diese Formulierungen und Produkte sind besonders bei Therapieplänen zur Erhöhung der Serumspiegel an FSH oder FSH Varianten über einen Behandlungszeitraum brauchbar. Daher erfüllt die Erfindung unter anderem den Bedarf für bequeme, stabile und konservierte Lösungen, Formulierungen und Produkte, die FSH oder FSH Varianten enthalten und die Verwendung dieser Formulierungen und Produkte bei der Behandlung der Unfruchtbarkeit.
FSH ist für eine Verwendung bei der Unfruchtbarkeit indiziert Den Patienten werden täglich oder zweimal täglich intramuskulär ("IM") oder subkutan ("SC") Injektionen mit einer an die Reaktion angepaßten Dosierung verabreicht, die gewöhnlich von 75-300 IE/Tag reicht Die kurze Halbwertszeit von FSH macht es erforderlich, daß den Patienten ein- oder zweimal täglich Injektionen über mehrere Tage in Abhängigkeit ihrer Reaktion der Ovarien oder Testikel verabreicht werden. Eine stabilere Formulierung von FSH oder einer FSH Variante würde Verbessrungen für die Therapie bereitstellen.
Obwohl FSH vorher nicht durch andere. Verabreichungsarten als IM oder SC verabreicht wurde, müssen andere Proteine über mehrere Tage verabreicht werden. Verschiedene Abgabeverfahren, einschließlich normaler SC oder IM Injektionen über einen Zeitraum, Transdermalpflaster, Implantate, osmotische Pumpen, Mikropumpen, Kartuschen, Lungenabgabesysteme und dergleichen waren brauchbar, um beispielsweise die Compliance des Patienten zu verbessern, die Unannehmlichkeiten zu verringern oder die Verabreichung zu vereinfachen. Diese verlängerten Behandlungspläne erfordern im allgemeinen stabile Lösungen oder Konservierungsstoffe in der Formulierung.
Konservierungsstoffe würden als ein Aspekt die schädliche mikrobielle Kontamination in der Formulierung verhindern oder minimieren. Für herkömmliche nicht-proteinartige Therapeutika werden oft antimikrobielle Konservierungsmittel, wie Chlorhexidin, Phenol, Benzylalkohol, m-Cresol, o-Cresol, p-Cresol, Chlorcresol, Phenylquecksilbernitrat, Thimerosal, Benzoesäure, Alkylparaben (Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und dergleichen), Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Natriumdehydroacetat und Thimerosal und verschiedene Gemische hiervon zu einer flüssigen Formulierung gegeben, um die Sterilität während der Haltbarkeitsperiode und/oder den Mehrfachverabreichungen sicherzustellen (M. J. Akers, Pharm. Technol. 8, 36–46, 1984, A. R. Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, Mack, P. A. Easton, 1278–1280, 1985). Diese Konservierungsstoffe tendieren jedoch als Klasse dazu für die Stabilität der Proteine schädlich zu sein. Beispielsweise wurde von einem sehr wirkungsvollen Konservierungsmittel, nämlich m-Cresol berichtet, daß es sich allgemein mit Proteinen zusammenlagert und diese denaturiert (Development of Pharmaceutical Parenteral Dosage Forms, Bontempo, Herausgeber, Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Seiten 118–119, 1977). Es bereitet besondere Schwierigkeiten bei der Lösungsstabilität von Hormonen, wie dem humanen Wachstumshormon (Y. F. Maa und C. Hsu, International Journal of Pharmaceutics, 140, Seiten 155–168, 1996).
FSH ist ein Vertreter der Heterodimer-Glycoproteinhormonfamilie, die Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), Choriongonadotropin (CG) und luteinisierendes Hormon (LH) umfaßt (J. G. Pierce und T. F. Parsons, Anni. Rev. Biochem., 50, 465–495, 1981, Baenziger und Green, Biochem. Biophys. Acta., 947, 287–306, 1988). Die Vertreter dieser Familie sind Heterodimere, die durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den zwei unter schiedlichen Untereinheiten zusammengehalten werden. Das humane FSH Heterodimer (hFSH) besteht aus (i) einer reifen 92 Aminosäuren langen α-Untereinheit, die auch den anderen humanen Familienvertretern gemein ist (das heißt Choriongonadotropin ("CG"), luteinisierendes Hormon ("LH") und Schilddrüsen-stimulierendes Hormon ("TSH")) und (ii) einer reifen 111 Aminosäuren langen β-Untereinheit, die für FSH einzigartig ist (Shome et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39: 187–205 (1974), Shome et al., J. Prot. Chem., 7: 325–339, 1988). Die α- und β-Untereinheiten binden nicht kovalent und daher sollte die Bindung empfindlicher gegen Protein-destabilisierende Mittel sein.
Die nativen FSH α- und β-Aminosäuresequenzen vom Menschen und anderen Säugern und bestimmte Varianten dieser Sequenzen sind in der Technik seit 1982 bekannt und die Klonierung und Expression des aktiven FSH vom Menschen und anderen Säugern wurde seit 1985 in Säugerzellen erreicht. Die gemeinsame Gonadotropin-α-Untereinheit (oder FSH-α-Untereinheit) wurde aus gereinigtem Protein sequenziert (Bellisario et al., J. Biol. Chem. 248: 6796 (1973), Morgan et al., J. Biol. Chem. 250: 5247 (1975)) und später kloniert und exprimiert (Fiddes et al., Nature 281: 351 (1979), Nature 286: 684 (1981), J. Molec. Appl. Genet. 1: 3–18 (1981)). Die FSH-β-Untereinheit wurde aus gereinigtem Protein sequenziert (Shome et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39: 187 (1974), Saxena et al., J. Biol. Chem. 251: 993 (1976)), (Sairam et al., Biochem. J. 197: 541 (1981), Fujiki et al., Biochem. Biophys. Acta 624: 428 (1980)). Integrated Genetics berichtete die rekombinante Expression von humanem CG (Biotechnology Newswatch (Seite 3, 20. Juni 1983), Chemical and Engineering News 61: 41 (21. November 1983), Genetic Technology News 3: 9 (12. Dezember 1983)) und in aktiver Form (Biotechnology Newswatch, 16. Januar 1984)) und sie berichteten auch die erfolgreiche Klonierung von FSH (Genetic Engineering Newsletter 4: 4 (10. August 1984)) und rekombinantes FSH, das in Säugerzellen in aktiver Form hergestellt wird (DNA 4: 76 (veröffentlicht am 16. Januar 1985)). Amgen berichtete auch die Expression eines aktiven LH vom Rind in CHO Zellen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7280 (Nov. 1985)).
Es besteht eine substantielle Evidenz in der Literatur, die zeigt, daß heterodimere Proteinhormone unter physiologischen oder sauren Bedingungen dissoziieren können (R. J. Ryan et al., Recent Progr. Hormone Res. 26: 105–137, 1970, T. W. Strickland und D. Puett, J. Biol. Chem., 257: 2954–2960, 1982, L. E. Reichert und R. B. Ramsey, J. Biol. Chem. 250: 3034–3040, 1975). Intakte Dimere sind für die biologische Aktivität essentiell und wesentlich für die Sekretion von FSH (J. U. Baenziger und E. D. Green, Biochem. Biophys. Acta, 947: 287–306, 1988, Corless et al., J. Cell. Biol., 104: 1173–1181, 1987). Versuche der Instabilität von FSH entgegenzuwirken umfassen die, worin ein einkettiges Molekül hergestellt wird, das zwei Untereinheiten in einem stabilen Molekül zusammenfaßt und auch jene, worin zusätzliche Disulfidbrücken erzeugt wurden, um die Wechselwirkung zwischen den zwei Untereinheiten zu stabilisieren (T. Sughara et al., J. Biol. Chem., 271: 10445–10448, 1996, J. C. Heikoop et al., Nature Biotech, 15: 658–662, 1997).
Donaldson beschreibt in US 5 162 306 A tiermedizinische Zusammensetzungen, die FSH und LH enthalten. Diese Zusammensetzungen sind in Thymol (5-Methyl-2-(1-methylethyl)phenol) stabil. Donaldson berichtet, daß Thymol ein Konservierungsstoff in der Liste an Konservierungsstoffen in der USP XXI ist, der Glycoproteinhormone ( US 5 162 306 A ) in der beschriebenen SUPER-OV Formulierung nicht schädigt.
Aus dem Urin stammendes FSH von postmenopausalen Frauen (hMG, vermarktet als Menotropin oder Humagon^® von Organon und als Urofollitropin oder Metrodin^® von Serono) wurde seit über 30 Jahren zur Entwicklung von mehrfachen Follikeln in ovulatorischen Patienten als Injektionslösung verwendet, die in Assisted Reproductive Technology Programmen (ART) teilgenommen haben und zur Induktion der Ovulation in anovulato risch unfruchtbaren Patienten. (B. C. J. M. Fauser und A. M. Van Heusden, Endocrine Rev., 18, 71–106, 1997). Kürzlich wurde von CHO Zellen stammendes rekombinantes humanes FSH (rhFSH) verfügbar (J. L. Keene et al., J. Biol, Chem., 264: 4769–4752, 1989, E. Loumaye et al., Human Reprod. Update, 1: 188–1999, 1995, W. Olijve et al., Mol. Hum. Reprod., 2: 361–369, 1996).
Therapeutisches FSH (entweder hMG oder rhFSH) wird derzeit in einer lyophilisierten Form in Ampullen von 75 IE/Gläschen und 150 IE/Gläschen mit einer Haltbarkeit von 1,5 bis 2 Jahren bei einer Lagerung bei 2–25°C bereitgestellt. Tägliche Injektionen mit Startdosierungen von 75 IE oder 150 IE werden für bis zu 10 Tage empfohlen, um stabile Konzentrationen an hFSH zu erreichen, die 1,5–2,5 fach höher sind, als die nach einer Einzeldosisverabreichung. Der Dosierungsplan ergibt Konzentrationen, die für die therapeutische Wirksamkeit notwendig sind, da FSH durch einen Schwellenwertmechanismus wirkt (J. Schoemaker et al., Ann. NY. Acad. Sci. 687: 296–299, 1993). In Abhängigkeit der Reaktion des Patienten können bis zu 3 Behandlungszyklen mit steigenden FSH Dosen verwendet werden. Der Patient oder der Partner muß täglich ein neues Gläschen mit lyophilisiertem Material mit Verdünnungsmittel ansetzen und es unmittelbar nach dem Ansetzen verabreichen (Verpackungsbeilage N1700101A vom Februar 1996 für Fertinex^® (Urofollitropin zur Injektion, gereinigt) zur subkutanen Injektion von Serono Laboratories, Inc., Randolph, MA). Das nicht verwendete Material wird verworfen.
Demnach verbleibt ein Bedarf in der Technik, die Patientenkompliance über die Entwicklung von stabilen Formulierungen und konservierten Formulierungen von FSH oder FSH Proteinvarianten und zugehörigen Serienartikeln zu verbessern. Diese stabilen Präparationen werden insbesondere benötigt, wo ausgedehnte Behandlungen erforderlich oder angeraten sind, wie Fertilitätsbehandlungen mit FSH. Es besteht auch ein Bedarf zur Bereitstellung von Produkten mit FSH oder FSH Varianten, die für eine Mehrfachverwendung über einen Zeitraum von 24 Stunden oder mehr verwendet und genehmigt werden. Die Erfindung liefert auch neue stabile Lösungen und Formulierungen mit FSH und FSH Varianten und die zugehörigen Serienartikel, die zur Verwendung über einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden geeignet und genehmigt sind.
Die Erfindung liefert neue Formulierungen von FSH oder FSH Varianten, ihre Herstellung und ihre pharmazeutische oder tiermedizinische Verwendung bei der Behandlung von Fertilitätsstörungen und zugehörige Serienartikel.
In einem Aspekt liefert die Erfindung konservierte Lösungen und Formulierungen, die FSH oder eine FSH Variante und den Konservierungsstoff Benzylalkohol in einem wäßriger Verdünnungsmittel enthalten. Die Lösungen und Formulierungen haben einen pH zwischen 6,8 und 9 und sind mehrfach anwendbare Formulierungen in einem einzelnen Gläschen mit einer Lösung für eine therapeutische Verwendung. Wahlweise enthalten die konservierten Lösungen und Formulierungen einen ausgewählten Puffer und ein Salz.
Die Erfindung liefert auch einen Serienartikel zur humanen pharmazeutischen Verwendung, die Verpackungsmaterial und ein einzelnes Gläschen mit einer Lösung umfaßt, das eine Lösung an FSH und FSH Variante und Benzylalkohol als Konservierungsmittel enthält, wobei das Verpackungsmaterial eine Aufschrift aufweist, die anzeigt, daß die Lösung für einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger aufbewahrt werden kann. Die Lösung hat einen pH zwischen 6,8 und 9 und ist eine mehrfach anwendbare Formulierung für eine therapeutische Verwendung.
Diese Lösungen und Formulierungen von FSH oder der FSH Variante, Serienartikel, Verwendungen und Behandlungen mittels FSH oder einer FSH Variante mit verbesserten oder geeigneteren Eigenschaften oder einer verbesserten Stabilität sind zur Behandlung der Unfruchtbarkeit bei Frauen und/oder Männern brauchbar. Diese Formulierungen und Serienartikel sind zusätzlich zur Verwendung als Injektionsmittel und alternative Abgabesysteme geeignet, wie unter anderem nasal, pulmonal, transmukosal, transdermal, oral, subkutan, intramuskulär oder parenteral mit verzögerter Freisetzung der flüssigen Formulierung. Die bereitgestellten Lösungen und Formulierungen mit FSH oder einer FSH Variante können auch eine erhöhte in vivo Wirksamkeit im Vergleich zu im Handel erhältlichen Produkten alleine oder in Kombination mit zumindest einem zusätzlichen Gonadotropin aufweisen, indem sie den Verlust der Aktivität oder Stabilität verhindern oder verringern oder indem sie alle Aspekte der Wirksamkeit oder Annehmlichkeit der Verabreichung verbessern, beispielsweise durch zumindest eines aus Art, Häufigkeit, Dosierung, Komfort, Anwendungsvereinfachung, biologische Aktivität in vitro oder in vivo und dergleichen.
Alle hierin zitierten Veröffentlichungen oder Patente zeigen den Stand der Technik zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung oder der Anmeldedaten der hierin zitierten Patentanmeldungen.
Follicel-stimulierendes Hormon "FSH", ob rekombinant hergestellt oder isoliert, und Varianten des Follikel-stimulierenden Hormons "FSH Varianten" sind, wie sie hierin definiert sind, in der Technik gut bekannt. FSH bezieht sich, wie es hierin verwendet wird, auf das als reifes Vollängenprotein gebildete FSH, das unter anderem humanes FSH oder "hFSH" umfaßt, ob rekombinant hergestellt oder aus Humanquellen isoliert (siehe B. Shome et al., J. Prot. Chem., 7: 325–339, 1988, B. B. Saxena und P. Rathnam, J. Biol. Chem., 251: 993–1005, 1976, Watkins et al., DNA, 6: 205–212, 1987, B. Shome und A. F. Parlow, J. Clin. Endocrinol. Metab, 39 (1): 203–205, 1974 und Beck et al., DNA, 4: 76, 1985, US 5 405 945 A und US 5 639 640 A ). Die Proteinsequenz der humanen FSH-α-Untereinheit wird in SEQ ID Nr. 5 angegeben und die Proteinsequenz der humanen FSH-β-Untereinheit wird in SEQ ID Nr. 6 angegeben. Darüberhinaus sind verschiedene FSH Varianten bekannt oder von der Technik verstanden (siehe Shome, J. Clin. Endocrin. Metab. 39: 187 (1974), Saxena, J. Biol. Chem. 251 (4): 993–1005 (1976), Sairam et al., Biochem. J. 197: 541 (1981), zusätzlich siehe Closset Eur. J. Biochem. 86: 115–120, Fujiki, J. Biol. Chem. 253: 5363–5368 (1978), Sairam, Biochem. J. 197: 541–552 (1981). FSH-β-Untereinheiten des Stands der Technik umfassen die Saxena Sequenz wie auch eine Gruppe an Sequenzen, die in Sairams Diskussion impliziert sind, nämlich (a) evulotionstechnisch konsiervierte Aminosäuren und (b) gut bekannte und beschriebene Sequenzierfehler. Ferner erkennt der Fachmann, daß die Substitution einer vorher identifizierten Aminosäure durch (i) eine chemisch ähnliche Aminosäure oder (ii) eine evolutionstechnisch konservierte Aminosäure keinen nennenswerten Effekt auf die biologische Aktivität eines so modifizierten FSH Herterodimers hat, das sich aus einer hFSH-β-Untereinheit zusammensetzt.
Insbesondere definiert der Kommentar von Sairam über die Saxena hFSH Sequenz wie auch seine Diskussion der zwischen funktionellen FSH Molekülen identifizierten Aminosäuresubstitutionen eine Gruppe an FSH-β-Kettensequenzen im Stand der Technik. Genauer gesagt identifiziert die Veröffentlichung von Sairam 1981 konservierte Aminosäuresequenzen, die sich auf die Veröffentlichungen von Saxena et al., Shome et al., Closset et al., und Fujiki et al. beziehen, siehe Sairam, Biochem. J. 197: 541–551 (1981). Der Stand der Technik (1) zeigt eine Bevorzugung für die FSH-β-Kettensequenz von Saxena gegenüber der von Shome, (2) adressiert das Problem der carboxyterminalen Heterogenität, (3) erwähnt, daß Teile des Moleküls, die durch Unterschiede zwischen den Spezies betroffen sind, für die Aktivität des Hormons nicht essentiell sind und (4) hebt den Leitfaden hervor, der aus den Homologien zwischen den Spezies und zwischen den β-Ketten der drei humanen Glycoproteinhormone FSH, LH und TSH abgeleitet wird.
Die C-terminale Heterogenität wird für alle veröffentlichten Sequenzen berichtet, außer für die von FSH-s vom Schwein, worin Glutaminsäure der einzige C-terminale Rest ist. Für die Position 27 ordnet Saxena dieser Position einen Tryptophanrest zu, der auch durch die evolutorische Konservierung unterstützt wird, die für ein Tryptophan an der Position 24 für FSH-B unter allen Arten des Stands der Technik gezeigt wird. Für die Positionen 44 und 46 zeigt Saxena, daß an Position 44 der Rest Arginin statt Lysin sein sollte und an Position 46 Lysin statt Arginin. Die Sequenzen vom Schwein, Pferd und Huhn reflektieren auch einen evolutorischen Druck, das Arginin an der Position 44 zu konservieren. Die Variationen an den drei Positionen 21, 22 und 44 umfassen strukturell konservative oder evolutionstechnisch konservierte ("homologe") Substitutionen, die jeweils eine Bioaktivität aufweisen.
Jede der Literaturstellen von Sairam, Shome und Closset beschreiben die Reste Isoleucin und Serin an den Postionen 21–22, während Saxena Leucin und Threonin beschreibt und Fujiki Isoleucin und Threonin an diesen Positionen beschreibt. Jede der Beschreibungen ist nicht nur eine evolutionstechnisch konservative Substitution, sondern auch eine strukturell konservative Substitution. Die Variation an Position 41 zwischen der jeweils von Sairam, Shome, Closset und Fujiki beschriebenen Asparaginsäure und dem von Saxena, Closset und Sairam beschriebenen Asparagin umfaßt zwei evolutionstechnisch konservierte Reste, die jeweils eine Bioaktivität zeigen. Diese Beschreibungen der konservativen Substitutionen und evolutionstechnisch konservierten Substitutionen leiten den Fachmann an, FSH-β-Kettenvarianten innerhalb der Gruppe der hFSH-B-Ketten zu unterscheiden.
Die hierin beschriebenen FSH Varianten sind die carboxyterminalen Deletionen der β-Untereinheit, die kürzer sind als das reife Vollängenprotein der SEQ ID Nr. 6. Die carboxyterminalen Deletionen der humanen β-Untereinheit werden in den SEQ ID Nr. 11, 12 und 13 bereitgestellt Es ist verständlich, daß die carboxyterminalen Varianten der β-Kette Dimere mit einer bekannten α-Untereinheit unter Bildung eines Heterodimers einer FSH-Variante bilden. Zusätzlich sind mehrere Arten an FSH bekannt, einschließlich unter anderem Schweine-FSH (SEQ ID Nr. 7 und 8), Pferde-FSH (SEQ ID Nr. 3 und 4), Rinder-FSH (SEQ ID Nr. 1 und 2), Schaf-FSH (SEQ ID Nr. 9 und 10) und die, die in Y. Combarnous, Endocrine Reviews, 13 (4), 670–691, 1992 zitiert sind. Dadurch ist verständlich, daß der Fachmann in der Lage ist, andere carboxyterminale Varianten von der gegebenen Spezies zu entwerfen und herzustellen, wie dies hierin weiter bereitgestellt wird.
Es können FSH Heterodimere oder Heterodimere der FSH-Varianten durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, wie rekombinant, durch Isolierung oder Reinigung aus natürlichen Quellen, wie es der Fall sein kann, oder durch chemische Synthese oder durch jede Kombination hiervon. Nicht beschränkende Beispiele für FSH Heterodimere oder Heterodimere von FSH-Varianten, die eine α-Untereinheit und eine β-Untereinheit umfassen, sind unter anderem folgende:
Die Verwendung des Ausdrucks "rekombinant" bezieht sich auf rekombinante Präparationen von FSH oder FSH Varianten durch die Verwendung der rekombinanten DNA Technologie (beispielsweise Boine et al., Seminars in Reproductive Endocronology 10, 45–50, 1992 und wie dies ferner hierin bereitgestellt und beispielhaft dargestellt ist). Die Sequenzen für genomische und cDNA Klone sind für die α- und β-Untereinheiten von mehreren Spezies bekannt (J. C. Fiddes et al., J. of Mol. and Applied Genetics, 1: 3–18 (1981), F. S. Esch et al., DNA 5: 363–369 (1986), P. C. Watkins et al., DNA 6: 205–212 (1987), T. Hirai et al., J. Mol. Endocrinol. 5: 147–158 (1990), R. A. Maurer et al., Mol. Endocrinol. 1: 717–723 (1987), K. Guzman et al., DNA Cell Biol. 10: 593–601 (1991), T. R. Kumar et al., Gene, 12. Dezember 1995, 166 (2): 335–336, F. R. Kumar et al., Gene 12. Dezember 1995, 166 (2): 333–334. Es werden mehrere DNA Sequenzen für die α- und β-Untereinheiten als SEQ ID Nr. 14–20 bereitgestellt. Darüberhinaus sind die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit DNA Sequenzen, die für eine α- und β-Untereinheit kodieren, ob sie auf einem Vektor oder auf zwei Vektoren bereitgestellt werden, wobei jede Unter einheit einen separaten Promotor aufweist, oder andere in der Technik bekannte Verfahren zur Bereitstellung von intakten Dimeren fähig.
Das FSH oder die FSH Variante, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann nicht nur durch rekombinante Mittel hergestellt werden, einschließlich aus Säuerzellen oder transgenen Präparationen, sondern kann auch aus anderen biologischen Quellen gereinigt werden, wie aus Urin. Annehmbare Verfahren umfassen die, welche beschrieben sind in K. Hakola Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59–69, 1997, Keene et al., 3. Biol. Chem., 264: 4769–4775, 1989, Cerpa-Poljak et al., Endocrinology, 132: 351–356, 1993, Dias et al., J. Biol. Chem. 269: 25289–25294, 1994, Flack et al., J. Biol. Chem. 269: 14015–14020, 1994 und Valove et al., Endocrinology 135: 2657–2661, 1994 und US 3 119 740 A .
"Im wesentlichen rein" meint in Bezug auf ein Peptid oder Protein die Abtrennung von anderen zellulären und nicht-zellulären Molekülen, einschließlich anderer Proteinmoleküle. Eine im wesentlichen reine Präparation ist etwa zu mindestens 85% rein, vorzugsweise zumindest etwa 95% rein. Ein "im wesentlichen reines" Protein kann durch eine Vielzahl an Techniken hergestellt werden, die dem Fachman bekannt sind, einschließlich beispielsweise Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) und wie dies ferner in der Technik bekannt oder hierin beschrieben ist.
Der Ausdruck "verabreichen" oder "Verabreichung" meint die Einbringung einer Formulierung der vorliegenden Erfindung in den Körper eines bedürftigen Patienten, der einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands bedarf.
Der Ausdruck "Patient" meint einen Säuger, der wegen einer Erkrankung oder eines Zustands behandelt wird. Patienten können unter anderem Menschen, Hühner, Schweine, Pferde, Rinder, Kaninchen und dergleichen sein.
Der Ausdruck "Alkylparaben" bezieht sich auf ein physiologisch toleriertes C₁-C₅ Alkylparaben, das als antimikrobielles Mittel brauchbar ist. Nicht beschränkende Beispiele umfassen zumindest eines Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben und Butylparaben.
Der Ausdruck "wäßriges Verdünnungsmittel" bezieht sich auf ein flüssiges Lösemittel, das Wasser enthält. Wäßrige Lösemittelsysteme können nur aus Wasser bestehen oder können aus Wasser und einem oder mehreren mischbaren Lösemitteln bestehen und können gelöste Solute enthalten, wie Zucker oder andere Hilfsstoffe. Die herkömmlicher verwendeten mischbaren Lösemittel sind die kurzkettigen organischen Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Propanol, kurzkettige Ketone, wie Aceton, und Polyalkohole, wie Glycerin.
Ein "Isotonizitätsmittel" ist eine Verbindung, die physiologisch toleriert wird und einer Formulierung eine geeignete Tonizität verleiht, um den Nettofluß von Wasser über die Zellmembranen zu verhindern, die mit der Formulierung in Kontakt sind. Verbindungen wie Glycerin werden herkömmlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet. Andere geeignete Isotonizitätsmittel umfassen unter anderem Aminosäuren oder Proteine (beispielsweise Methionin oder Albumin), Salze (beispielsweise Natriumchlorid) und Zucker (beispielsweise Dextrose, Saccharose und Lactose).
Der Ausdruck "Konservierungsstoff" bezieht sich auf eine Verbindung oder auf Zusammensetzungen, die zu einer Formulierung gegeben werden, um als Mittel gegen Mikroben, Pilze, Mycoplasmen, Viren, Prionen und/oder Bakterien zu wirken. Eine konservierte FSH oder eine FSH Variante enthaltende Formulierung der vorliegenden Erfindung erfüllt vorzugsweise standardisierte oder regulatorische Richtlinien für die Konservierungswirkung, um ein kommerziell wertvolles Mehrfachverwendungprodukt zu sein. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Konservierungsmittel ist Benzylalkohol.
Der Ausdruck "Phosphatpuffer" bezieht sich auf Hilfsstoffe, die ein Phosphation enthalten. Im allgemeinen werden Phosphatpuffer aus der Phosphorsäure oder einem Salz der Phosphorsäure hergestellt, einschließlich unter anderem Kalium- und Natriumsalzen. Es sind mehrere Salze der Phosphorsäure in der Technik bekannt, wie monobasische, dibasische und tribasische Kalium- und Natriumsalze der Säure. Salze der Phosphorsäure treten bekanntermaßen auch als Hydrate des jeweiligen Salzes auf. Phosphatpuffer können einen weiten Bereich an pH Werten abdecken von pH 6,8 bis pH 9 und einen bevorzugten Bereich von etwa 8,0. Vorzugsweise haben die Formulierungen der vorliegenden Erfindung einen pH zwischen 6,8 und etwa 7,8 einschließlich etwa pH 7,0, pH 7,2 und 7,4. Bevorzugte Ionen sind die Natrium- und Kaliumionen, die einzeln oder zusammen in der Lösung vorkommen, wie es beispielsweise bei der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) der Fall ist. Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen sind in der Technik gut bekannt, wie Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Die Salzkonzentration in der gesamten Lösung kann zwischen etwa 5 mM, 9,5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM und 500 mM liegen. Vorzugsweise ist die Ionenkonzentration über 10 mM oder über 50 mM oder über 100 mM.
Der Ausdruck "Gläschen" bezieht sich breit auf ein Gefäß, das zur Erhaltung des FSH und des Verdünnungsmittels in einem geschlossenen, sterilen Zustand geeignet ist. Beispiele eines Gläschens, wie es hierin verwendet wird, sind Ampullen, Kartuschen, Blisterpackungen oder ein anderes Reservoir, das zur Abgabe des FSH an den Patienten über eine Pumpe (einschließlich osmotisch), einem Katheter, einem Transdermalpflaster, einer Kartusche, über die Lunge, über die Mukosa oder durch eine parenterale Verabreichung geeignet ist. Gläschen, die zur Verpakkung der Produkte für die parenterale, pulmonale, transmukosale oder transdermale Verabreichung geeignet sind, sind in der Technik gut bekannt.
Der Ausdruck "Stabilität" bezieht sich auf die physikalische, chemische und Konformationsstabilität von FSH Formulierungen der vorliegenden Erfindung. Die Instabilität einer Proteinformulierung kann durch einen chemischen Abbau oder eine Aggregation der Proteinmoleküle unter Bildung von Polymeren höherer Ordnung verursacht werden durch Dissoziation der Heterodimere in Monomere, Deglycosylierung, Modifikation der Glycosylierung oder jede andere Strukturmodifikation, die zumindest eine biologische Aktivität eines von der vorliegenden Erfindung umfaßten FSH Polypeptids verringert.
Eine "stabile" Lösung oder Formulierung ist eine, worin das Ausmaß an Abbau, Modifizierung, Aggregation, Verlust an biologischer Aktivität und dergleichen des Proteins hierin annehmbar kontrolliert ist und mit der Zeit nicht unannehmbar zunimmt. Die Stabilität kann durch in der Technik gut bekannte Verfahren untersucht werden, einschließlich der Messung der Lichtsstreuung, Zurückhaltung von Licht (Absorption oder optische Dichte); der Größe (beispielsweise durch Größenausschlußchromatographie), der biologischen Aktivität in vitro oder in vivo und/oder den Eigenschaften durch Differentialscanningkalorimetrie (DSC) der Probe. Andere Methoden zur Untersuchung der Stabilität sind in der Technik gut bekannt und können auch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Ausdruck "behandeln" bezieht sich auf die Verabreichung, Nachverfolgung, Versorgung und/oder Pflege eines Patienten, für den eine FSH Verabreichung zum Zweck der Stimulierung des Follikels oder Testikels oder jede andere physiologische durch FSH regulierte Reaktion erwünscht ist. Die Behandlung kann daher unter anderem die Verabreichung von FSH zur Induktion oder Verbesserung von Sperma oder der follikulären Entwicklung oder zur Ovulationsinduktion umfassen. Zusätzlich werden Behandlungen zur Wiederherstellung der normalen Spermatogenese bei Männern umfaßt.
Ein "Salz" ist ein physiologisch annehmbares Salz von FSH. Solche Salze werden zwischen einer oder mehreren der geladenen Gruppen im Protein und einem oder mehreren physiologisch annehmbaren, nicht toxischen Kationen oder Anionen gebildet. Organische und anorganische Salze umfassen beispielsweise die, welche aus Säuren gebildet werden, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Glycolsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Propionsäure, Kohlensäure und dergleichen oder beispielsweise Ammonium, Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium.
Der Ausdruck "Puffer" oder "physiologisch annehmbarer Puffer" bezieht sich auf eine Verbindung die bekanntermaßen zur pharmazeutischen oder tiermedizinischen Verwendung in Formulierungen sicher ist und die die Wirkung der Aufrechterhaltung oder Kontrolle des pH Werts der Formulierung in dem für die Formulierung gewünschten pH Bereich hat. Annehmbare Puffer zur Kontrolle des pH Werts bei einem moderat sauren pH bis zu einem moderat basischen pH umfassen unter anderem Verbindungen, wie Phosphat, Acetat, Citrat, Arginin, TRIS und Histidin. "TRIS" bezieht sich auf 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und auf jedes pharmazeutisch annehmbare Salz hiervon. Bevorzugte Puffer sind Phosphatpuffer mit Kochsalzlösung oder ein annehmbares Salz hiervon.
Eine cDNA Bank oder genomische Bank kann mittels einer Sonde auf der Grundlage der Sequenz eines Polynukleotids oder einer bekannten Nukleinsäure gescreent werden, um einen Klon zu erhalten, der eine bekannte FSH Seuquenz kodiert. Die Sonden können zur Hybridisierung mit genomischen cDNA Sequenzen zur Isolierung von homologen DNA Sequenzen im gleichen oder einem unterschiedlichen Organismus verwendet werden. Der Fachmann erkennt, daß unterschiedliche Ausmaße an Stringenz der Hybridisierung im Test verwendet werden können und entweder die Hybridisierung oder das Waschmedium stringent sein können. Wenn die Bedingungen für die Hybridisierung stringenter werden muß ein größeres Ausmaß an Komplementarität zwischen der Sonde und dem Ziel vorhanden sein, damit eine Doppelstrangbildung auftritt. Das Ausmaß der Stringenz kann durch Temperatur, Ionenstärke, pH und dem Vorkommen eines teilweise denaturierenden Lösemittels kontrolliert werden, wie Formamid. Beispielsweise variiert die Stringenz der Hybridisierung bequemerweise durch die Veränderung der Polarität der Reaktionslösung beispielsweise durch die Veränderung der Formamidkonzentration im Bereich von 0% bis 50%. Das Ausmaß an Komplementarität (Sequenzidentität), das für eine detektierbare Bindung erforderlich ist, variiert gemäß de Stringenz des Hybridisierungsmediums und/oder Waschmediums. Das Ausmaß an Komplementarität ist optimalerweise 100%, jedoch sollte verstanden werden, daß geringe Sequenzvariationen in den Sonden und Primern durch die Verringerung der Stringenz des Hybridisierungsmediums und/oder Waschmediums kompensiert werden können.
Verfahren zur Amplifizierung der DNA oder DNA sind in der Technik gut bekannt und können gemäß der vorliegenden Erfindung ohne unmäßige Experimente auf der Grundlage der hierin bereitgestellten Beschreibung und Anleitung verwendet werden. Verfahren zur selektiven Amplifizierung durch PCR erlauben den Entwurf von kleineren Segmenten an Nukleinsäuresequenzen, wie solchen, die eine definierte FSH Variante der β-Kette kodieren wurden. Solche Amplifizierungstechniken erlauben die Anfügung von bequemen Terminationssignalen, Restriktionsstellen und dergleichen zur amplifizierten Sequenz.
Bekannte Verfahren der DNA oder RNA Amplifizierung umfassen unter anderem die Polymerasekettenreaktion (PCR) und verwandte Amplifizierungsprozesse (siehe beispielsweise US 4 683 195 A , US 4 683 202 A , US 4 800 159 A , US 4 965 188 A von Mullis et al., US 4 795 699 A und US 4 921 794 A von Tabor et al., US 5 142 033 A von Innis, US 5 122 464 A von Wilson et al., US 5 091 310 A von Innis, US 5 066 584 A von Gyllensten et al., US 4 889 818 A von Gelfand et al. US 4 994 370 A von Silver et al., US 4 766 067 A von Biswas, US 4 656 134 A von Ringold) und RNA-vermittelte Amplifikation, die eine Antisense-RNA zur Zielsequenz als Matrize für die doppelsträngige DNA Synthese verwendet ( US 5 130 238 A von Malek et al., mit dem Handelsnamen NASBA), Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Colligan, siehe obige Literaturstelle und Sambrook, siehe obige Literaturstelle.
Beispielsweise kann die Polymerasekettenreaktionstechnologie (PCR) zur Amplifizierung der Polynukleotidsequenzen und der verwandten DNA Sequenzen direkt aus den genomischen DNA oder cDNA Banken verwendet werden. Die PCR und andere in vitro Amplifzierungsmethoden sind beispielsweise auch brauchbar zur Klonierung von Nukleinsäuresequenzen, die für zu exprimierende Proteine kodieren, um beispielsweise eine der bereitgestellten FSH oder FSH Varianten zu erhalten, um Nukleinsäuren zur Verwendung als Sonden zur Detektion des Vorkommens gewünschter mRNA in Proben herzustellen, zur Nukleinsäuresequenzierung oder für andere Zwecke. Beispiele für Techniken, die zur Anleitung von Fachleuten bei in vitro Amplifikationsverfahren ausreichen, finden sich in Berger, Sambrook und Ausubel, siehe obige Literaturstelle, wie auch Mullis et al., US 4 683 202 A (1987) und Innis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Herausgeber, Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Im Handel erhältliche Kits für die genomische PCR Amplifizierung sind in der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Das T4 Gen 32 Protein (Boehringer Mannheim) kann zur Verbesserung der Ausbeute an langen PCR Produkten verwendet werden.
Nukleinsäuren, die zur Expression jeder gegebenen FSH oder FSH Variante erforderlich sind, können durch direkte chemische Synthese durch Verfahren hergestellt werden, wie dem Phosphotriesterverfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90–99 (1979), das Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109–151 (1979), das Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., Tetra. Letts. 22: 1859–1862 (1981), das Festphasenphosphoramidittriesterverfahren, das von Beaucage und Caruthers, Tetra: Letts. 22 (20): 1859–1862 (1981) beschrieben ist, beispielsweise mittels eines automatisierten Synthesegeräts, wie dies in Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 (1984) beschrieben ist und dem Festphasenverfahren von US 4 458 066 A . Die chemische Synthese bildet im allgemeinen ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das durch DNA Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch die Polymerisation mit einer DNA Polymerase unter Verwendung des Einzelstrangs als Matrize in eine doppelsträngige DNA umgewandelt werden kann. Der Fachmann erkennt, daß die chemische Sequenz auf etwa 100 Basen beschränkt ist und längere Sequenzen durch die Ligation von kürzeren Sequenzen erhalten werden können.
Wie in der Technik bekannt, kann man rekombinante Expressionskassetten zur Expression von bekannten Nukleinsäuren für FSH oder eine bekannte FSH Variante verwenden. Eine Nukleinsäuresequenz, beispielsweise eine cDNA oder eine genomische Sequenz, die für eine Vollängenuntereinheit kodiert, kann zur Konstruktion einer rekombinanten Expressionskassette verwendet werden, die in eine gewünschte Wirtszelle eingeführt werden kann. Jedoch ist es in der Technik erwünscht, beide Untereinheiten zu exprimieren, um funktionsfähige Heterodimere zu erhalten, sei es von einem Plasmid oder von getrennt eingeführten Plasmiden. Eine rekombinante Expressionskassette umfaßt typischerweise ein Polynukleotid, das operativ an die Regulationssequenzen der transkriptionellen Initiation gebunden ist, die die Transkription des Polynukleotids in der gewünschten Wirtszelle für jede Untereinheit steuert. Solche Verfahren sind in der Technik zur Expression von FSH gut bekannt (beispielsweise CHO cell-derived recombinant human FSH (rhFSH), (J. L. Keene et al., J. Biol. Chem., 264: 4769- derived recombinant human FSH (rhFSH), (J. L. Keene et al., J. Biol. Chem., 264: 4769–4752, 1989, E. Loumaye et al., Human Reprod. Update, 1: 188–1999, 1995, W. Olijve et al., Mol. Hum. Reprod., 2: 361–369, 1996).
Beide heterologen und nicht-heterologen (das heißt endogenen) Promotoren können zur Expressionssteuerung der Nukleinsäuren verwendet werden, die für Untereinheiten von FSH oder FSH Varianten kodieren. Allgemeine Herstellverfahren durch rekombinante Techniken sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Ausubel et al., 1987–1989.
Für die α- und β-Untereinheiten von FSH oder einer FSH Variante kodierende Polynukleotide können an einen Vektor gebunden werden, der einen Selektionsmarker zur Vermehrung im Wirt enthält. Im allgemeinen wird ein Plasmidvektor (oder Vektoren, falls die α- und β-Untereinheiten auf getrennten Expressionsvektoren enthalten sind) in einem Niederschlag, wie einem Calciumphosphatniederschlag oder in einem Komplex mit einem geladenen Lipid eingeführt. Falls der Vektor ein Virus ist, kann dies in vitro mittels einer geeigneten Verpackungszellinie verpackt und dann in geeignete Wirtszellen transduziert werden.
Das DNA Insert für jede Untereinheit sollte operativ an einen geeigneten Promotor gebunden sein, wie den frühen und späten SV40 Promotoren und Promotoren der retroviralen LTRs, um einige zu nennen. Andere geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Die Expressionskontrukte enthalten ferner Stellen für die Transkriptionsinitiation, Termination und in der transkribierten Region eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation. Der kodierende Teil der durch die Konstrukte exprimierten reifen Transkripte umfaßt vorzugsweise ein Translationsinitiationscodon am Beginn und ein Terminationscodon (beispielsweise UAA, UGA oder UAG) in geeignter Position am Ende der zu translatierenden mRNA.
Die Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise zumindest einen Selektionsmarker. Solche Marker umfassen beispielsweise Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für eine eukaryontische Zellkultur und Gene für eine Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz zur Kultivierung in E. coli und anderen Bakterien. Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte umfassen unter anderem Pilzzellen, wie Hefezellen, Insektenzellen, wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 Zellen, Tier- oder Säugerzellen, wie unter anderem CHO, COS, AV-12, HEPG2, NIH3T3 und Bowes Melanomzellen und Pflanzenzellen, wobei CHO Zellen bevorzugt sind. Geeignete Kulkturmedien und Bedingungen für die oben beschriebenen Wirtszellen sind in der Technik bekannt. Bevorzugte eukaryontische Vektoren sind unter anderen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, die von Stratagene erhältlich sind, und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, die von Pharmacia erhältlich sind. Andere geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt.
Die Einführung eines Vektorkonstrukts oder von Vektoren in eine Wirtszellen kann erreicht werden durch Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, kationische Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder andere Verfahren. Solche Verfahren sind in Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Sambrook, siehe spätere Literaturstelle, Kapitel 1–4 und 16–18, Ausubel et al., siehe obige Literaturstelle, Kapitel 1, 9, 13, 15 und 16.
Es wird vorweggenommen, daß Untereinheiten von FSH oder einer FSH Variante in einer modifizierten Form exprimiert werden können, wie einem Fusionsprotein und nicht nur Sekretionssignale enthalten können, sondern auch zusätzliche heterologe Funktionsregionen. Beispielsweise kann eine Region mit zusätzlichen Aminosäuren, insbesondere geladene Aminosäuren, an den N-Terminus eines Polypeptids angefügt werden, um die Stabilität und die Persistenz in der Wirtszelle, während der Reingung oder während der anschließenden Verarbeitung und Lagerung zu verbessern. Es können auch Peptidreste an das Polypeptid angefügt werden, um die Reinigung zu er leichtern. Es wird vorweggenommen, daß solche Regionen vor der schließlichen Präparation des gewünschten FSH oder der gewünschten FSH Variante entfernt werden können. Solche Verfahren sind allgemein beschrieben in verschiedenen Standardlaborhandbüchern, wie Sambrook, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 17.29–17.42 und 18.1–18.74, Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 16, 17 und 18.
Mittels der hierin bereitgestellten oder in der Technik bekannten Nukleinsäuresequenzen kann man die α- und β-Untereinheiten von FSH oder einer FSH Variante in einer rekombinant veränderten eukaryontischen Zelle, wie Säugerzellen, exprimieren. Es wird erwartet, daß der Fachmann die vielen Expressionssysteme kennt, die zur Expression einer Nukleinsäure geeignet sind, die für ein Protein kodiert, das zwei Untereinheiten enthält Es wird kein Versuch unternommen, die verschiedenen Verfahren zur Expression von Proteinen in Eukaryonten im Detail zu beschreiben.
Kurz zusammengefaßt wird die Expression von isolierten Nukleinsäuren, die für FSH oder eine FSH Variante kodieren, typischerweise erreicht durch die getrennte operative Verknüpfung der DNA oder cDNA für die α- oder β-Untereinheit an einen Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist), wonach ein Einbau in einen Expressionsvektor erfolgt. Alternativ dazu stellt der Vektor beim Einbau der DNA einen geeigneten Promotor bereit. Die Vektoren können zur Replikation und Integration in eukaryontische Wirtszellen geeignet sein. Typische Expresssionsvektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Initiationssequenzen und Promotoren, die zur Regulation der Expression der DNA brauchbar sind, die ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert. Um eine starke Expression eines klonierten Gens zu erhalten, ist es erwünscht, Expressionsvektoren zu konstruieren, die mindestens einen starken Promotor zur Transkriptionssteuerung, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptions-Translationsterminator enthalten. Der Fachmann erkennt, daß Modifizierungen ohne Zerstörung der biologischen Aktivität ausgeführt werden können. Einige Modifizierungen können ausgeführt werden, um die Klonierung, Expression oder den Einbau der Zielmoleküle in das Genom zu erleichtern. Solche Modifikationen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die Bereitstellung von bequem liegenden Restriktionsschnittstellen oder Terminationskodons oder Reinigungssequenzen.
Alternativ dazu können Nukleinsäuren in einer Wirtszelle durch das Anschalten (durch Manipulation) von endogener DNA in einer Wirtszelle exprimiert werden, die die gewünschten α- und β-Untereinheiten kodiert. Solche Verfahren sind in der Technik gut bekannt und beispielsweise beschrieben in US 5 580 734 A , US 5 641 670 A , US 5 733 746 A und US 5 733 761 A .
Dem Fachmann ist eine Vielzahl an eukaryontischen Expressionssystemen bekannt, wie Säugerzellen. Wie hierin kurz erläutert, kann eine Nukleinsäure, die für die α- und β-Untereinheit von FSH oder einer bekannten FSH Variante kodiert, in diesen eukaryontischen Systemen exprimiert werden.
Die Synthese von heterologen Proteinen in Hefe ist gut bekannt. F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ist eine gut bekannte Arbeit, die die verschiedenen Verfahren beschreibt, die zur Herstellung von Protein in der Hefe verfügbar sind. Zwei zur Herstellung von eukaryontischen Proteinen verbreitet verwendete Hefen sind Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Vektoren, Stämme und Protokolle für die Expression in Saccharomyces und Pichia sind in der Technik bekannt und von kommerziellen Herstellern erhältlich (beispielsweise Invitrogen). Geeignete Vektoren haben gewöhnlich Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder Alkoholoxidase, und einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen und dergleichen, wie dies gewünscht ist.
Die für die α- und β-Untereinheiten von FSH oder einer FSH Variante kodierenden Sequenzen können auch in verschiedene Expressionsvektoren zur Transfektion in Zellkulturen von beispielsweise Säuger-, Insektenoder Pflanzenursprung ligiert werden. Beispielsgemäß für Zellkulturen, die zur Herstellung der Peptide brauchbar sind, sind Säugerzellen. Säugerzellsysteme liegen oft in Form von Monoschichten von Zellen vor, obwohl Säugerzellsuspensionen auch verwendet werden können. Es wurden viele geeignete Wirtzellinien entwickelt, die intakte Proteine exprimieren und diese umfassen HEK293, BHK21 und CHO Zellinien, wobei die CHO Zellinien bevorzugt sind, wie CHO KI von Lonza. Die Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen umfassen, wie einen Replikatiosursprung, einen Promotor (beispielsweise vorzugsweise den CMV Promotor, einen HSV tk Promotor, EF1 α-Promotor, den späten oder frühen SV40 Promotor oder den pgk Promotor (Phosphoglyceratkinase), einen Enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) und Prozessierungsinformationsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen (beispielsweise eine Poly-A-Anfügungsstelle des großen T Ag von SV40) und Transkriptionsterminationssequenzen. Andere Tierzellen, die zur Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen brauchbar sind, sind beispielsweise erhältlich von American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7. Ausgabe 1992). Bevorzugte Wirtszellen umfassen CHO Zellen, wie CHO-K1 und bevorzugte Vektoren umfassen GS Vektoren, die jeweils erhältlich sind beispielsweise von Lonza Biologics PLC (Slough, Bekshire, England, UK).
Geeignete Vektoren für die Expression der α- und β-Untereinheit von FSH oder einer FSH Variante in Insektenzellen werden gewöhnlich vom SF9 Baculovius abgeleitet. Geeignete Insektenzellinien umfassen Zellinien von Moskitolarven, Seidenspinnerraupe, Heerwurm, Motte und Drosophilazellinien, wie eine Schneiderzellinie (siehe Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353–365 (1987).
Wie bei der Hefe werden bei der Verwendung von Wirtszellen höherer Tiere oder Pflanzen die Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminationssequenzen typischerweise in den Vektor eingearbeitet. Ein Beispiel für eine Terminatorsequenz ist die Polyadenylierungssequenz des Rinderwachstumshormongens. Die Sequenzen für die genaue Prozessierung des Transkripts können ebenfalls eingearbeitet werden. Ein Beispiel für eine Spleißsequenz ist das VP1 Intron von SV40 (Sprague et al., J. Virol. 45: 773–781 (1993)). Zusätzlich können Gensequenzen zur Kontrolle der Replikation in der Wirtszelle in den Vektor eingearbeitet werden, wie die, die in Vektoren vom Rinderpapillomavirus gefunden werden. M. Saveria-Campo, Bovine Papilloma Virus DNA, a Eukaryontic Cloning Vector in DNA Cloning Vol. II, a Practical Approach, D. M. Glover, Herausgeber, IRL Press, Arlington, VA, Seiten 213–238 (1985).
FSH oder eine FSH Variante kann nach der Expression aus den Zellen durch Anwendung von Standardproteinisolierungstechniken auf die Lysate isoliert werden. Die Überwachung des Reinigungsprozesses kann durch Westernblottechniken oder durch einen Radioimmuntest von anderen Standardimmuntesttechniken erreicht werden.
FSH oder eine FSH Variante, die eine α- und β-Untereinheit enthalten, können aus rekombinanten Zellkulturen durch gut bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylappatitchromatographie, Größenausschlußchromatographie und Lektinchromatographie. Vorzugsweise werden für die Reinigung Hochleistungsflüssigchromatographie ("HPLC"), Kationenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie oder Kombinationen hiervon verwendet. FSH und die FSH Varianten mit einer α- und einer β-Untereinheit umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und umfassen Produkte, die durch rekombinante Techniken aus einem eukaryontischen Wirt hergestellt werden, einschließlich beispielsweise Hefe, höhere Pflanzen, Insekten- und Säugerzellen. In Abhängigkeit des in einem rekombinanten Herstellverfahren verwendeten Wirts können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert sein oder auch nicht. Bevorzugte Moleküle von FSH oder FSH Varianten sind glykosyliert, wie sie in eukaryontischen Wirten vorkommen würden. Zusätzlich können die Polypeptide der Erfindung auch einen anfänglich modifizierten Methioninrest enthalten, der in manchen Fällen ein Ergebnis von durch den Wirt vermittelten Prozessen ist. Solche Methoden sind in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Sambrook, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 17.37–17.42, Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 10, 12, 13, 16, 18 und 20.
FSH oder eine in der Technik bekannte FSH Variante umfassen unter anderem die Proteinsequenzen, die im Sequenzidentifizierungsteil der Beschreibung aufgeführt sind, und werden im folgenden beschrieben:
SEQ ID Nr. 1: α-Untereinheit vom Rind – 96 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 2: β-Untereinheit vom Rind – 111 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 3: α-Untereinheit vom Pferd – 96 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 4: β-Untereinheit vom Pferd – 111 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 5: α-Untereinheit vom Menschen – 92 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 6: β-Untereinheit vom Menschen – 111 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 7: α-Untereinheit vom Schwein – 96 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 8: β-Untereinheit vom Schwein – 111 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 9: α-Untereinheit vom Huhn – 96 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 10: β-Untereinheit vom Huhn – 111 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 11: Humane β-Variante vom Menschen – 108 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 12: Humane β-Variante vom Menschen – 109 Aminosäuren
SEQ ID Nr. 13: Humane β-Variante vom Menschen – 110 Aminosäuren
Die Nukleotidsequenz von FSH oder einer FSH Variante, die unter anderem die Nukleotidsequenzen umfassen, die für die im Sequenzidentifizierungteil der Beschreibung aufgeführten α- oder β-Untereinheiten kodieren, sind im folgenden beschrieben:
SEQ ID Nr. 14: α-cDNA vom Menschen – 276 Nukleotide (kodiert für 92 Aminosäuren)
SEQ ID Nr. 15: cDNA einer human β-Variante – 324 Nukleotide (kodiert für 108 Aminosäuren)
SEQ ID Nr. 16: cDNA einer human β-Variante – 327 Nukleotide (kodiert für 109 Aminosäuren)
SEQ ID Nr. 17: cDNA einer human β-Variante – 330 Nukleotide (kodiert für 110 Aminosäuren)
SEQ ID Nr. 18: β-cDNA vom Menschen – 333 Nukleotide (kodiert für 111 Aminosäuren)
SEQ ID Nr. 19: α-cDNA vom Menschen – 276 Nukleotide (kodiert für 92 Aminosäuren)
SEQ ID Nr. 20: cDNA einer humanen β-Variante – 324 Nukleotide (kodiert für 108 Aminosäuren)
Die DNA der SEQ ID Nr. 19 und 20 wird aus ligierten Oligonukleotiden entworfen und konstruiert. Die Unterschiede zwischen SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 14 sind welche, die die kodierte Aminosäuresequenz des α-Untereinheitenproteins nicht verändern. Ähnlich sind die Unterschiede zwischen SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 15 welche, die die Aminosäuresequenz des β-Untereinheitvariantenproteins nicht verändern.

Die Aminosäuren, die die Proteine und Polypeptide der vorliegenden Erfindung aufbauen, werden oft abgekürzt. Die Aminosäurebezeichnungen können durch die Angabe der Aminosäure im Einbuchstabencode, im Dreibuchstabencode, durch Angabe des Namens oder der Nukleotiddreiercodons bezeichnet werden, wie dies in der Technik ebenfalls verstanden wird (siehe B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3. Ausgabe, Garland Publishing, Inc. New York, 1994):

Einbuchstabencode	Dreibuchstabencode	Name	Nukleotiddreiercode
A	Ala	Alanin	GCA, GCC, GCG, GCU
C	Cys	Cystein	UGC, UGU
D	Asp	Asparaginsäure	GAC, GAU
E	Glu	Glutaminsäure	GAA, GAG
F	Phe	Phenylalanin	UUC, UUU
G	Gly	Glycin	GGA, GGC, GGG, GGU
H	His	Histidin	CAC, CAU
I	Ile	Isoleucin	AUA, AUC, AUU
K	Lys	Lysin	AAA, AAG
L	Leu	Leucin	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	Met	Methionin	AUG
N	Asn	Asparagin	AAC, AAU
P	Pro	Prolin	CCA, CCC, CCG, CCU
Q	Gln	Glutamin	CAA, CAG
R	Arg	Arginin	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S	Ser	Serin	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	Thr	Threonin	ACA, ACC, ACG, ACU
V	Val	Valin	GUA, GUC, GUG, GUU
W	Trp	Tryptophan	UGG
Y	Tyr	Tyrosin	UAC, UAU

Wie oben erwähnt liefert die Erfindung konservierte Lösungen und Formulierungen, die ein Konservierungsmittel enthalten, wie auch konservierte Mehrfachverwendungsformulierungen, die für eine pharmzeutische oder tiermedizinische Verwendung geeignet sind und FSH oder eine FSH Variante in einer pharamazeutisch annehmbaren Formulierung enthalten. Konservierte Formulierungen enthalten das Konservierungsmittel Benzylalkohol in einem wäßrigen Verdünnungsmittel.
Wie oben erwähnt, liefert die Erfindung einen Serienartikel, zur humanen pharmazeutischen Verwendung, der Verpackungsmaterial und ein Gläschen umfaßt, das eine Lösung an FSH oder einer FSH Variante mit den vorgeschriebenen Puffern und/oder Konservierungsmitteln wahlweise in einem wäßrigen Verdünnungsmittel enthält, wobei das Verpackungsmaterial eine Aufschrift aufweist, die anzeigt, daß die Lösung für einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger aufbewahrt werden kann.
Das FSH oder die FSH Variante, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch rekombinante Mittel hergestellt werden, einschließlich aus Saugerzellpräparationen oder transgenen Präparationen oder können aus anderen biologischen Quellen gereinigt werden, wie aus Harnquellen. Annehmbare Methodologien umfassen die, welche beschrieben sind in K. Hakola, Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59–69, 1997, Keene et al., J. Biol. Chem., 264: 4769–4775, 1989, Cerpa-Poljak et al., Endocrinology, 132: 351–356, 1993, Dias et al., J. Biol. Chem., 269: 25289–25294, 1994, Flack et al., J. Biol. Chem. 269: 14015–14020, 1994 und Valove et al., Endocrinology 135: 2657–2661, 1994 und US 3 119 740 A .
Das Verfahren, durch das die Proteine für die erfindungsgemäßen Formulierungen bereitgestellt werden ist nicht besonders relevant. Vorzugsweise ist FSH ein Heterodimer, das eine α-Untereinheit und eine β-Untereinheit umfaßt, wie sie jeweils in SEQ ID Nr. 5 und 6 angegeben sind, oder ein Heterodimer einer FSH Variante, das eine α-Untereinheit und eine β-Untereinheit umfaßt, wie sie in der SEQ ID 5 und 11, 5 und 12 und 5 und 13 angegeben sind. Geeignete Arten an FSH oder einer FSH Variante umfassen innerhalb der Erfindung unter anderem zumindest eine Sequenz für die α-Untereinheit und zumindest eine bekannte β-Untereinheit (siehe Sequenzliste für bekannte α- und β-Untereinheiten, wie sie andererweitig in der Technik bekannt sind).
Nicht-beschränkende Beispiele für FSH oder eine FSH Variante umfassen unter anderem:
Die Bandbreite an Proteinhormon im erfindungsgemäßen Produkt umfaßt Mengen, die nach der Rekonstitution in einem nassen/trockenen System Konzentrationen von etwa 1,0 μg/ml bis etwa 50 mg/ml aufweisen, obwohl geringere und höhere Konzentrationen funktionsfähig sind und vom beabsichtigten Abgabevehikel abhängen, wobei sich beispielsweise Lösungsformulierungen von Transdermalpflastern, pulmonalen, transmukosalen, osmotischen oder Mikropumpenverfahren unterscheiden. Die Hormonkonzentrationen betragen vorzugsweise etwa 5,0 μg/ml bis 2 mg/ml und am bevorzugtesten etwa 5,0 μg/ml oder 10 μg/ml oder 50 μg/ml bis etwa 200 μg/ml. Das wäßrige Verdünnungsmittel umfaßt ferner ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel, nämlich Benzylalkohol. Die Konzentration des Konservierungsmittels, die in der Formulierung verwendet wird, ist eine Konzentration, die ausreicht, um einen antimikrobiellen Effekt zu entwickeln und wird leicht durch den Fachmann bestimmt. Überraschenderweise schädigt das in den vorliegend beanspruchten Formulierungen nicht die biologische Aktivität von FSH oder einer FSH Variante und erlaubt die Mehrfachanwendung.
Andere Hilfsstoffe, beispielsweise Isotonizitätsmittel, Puffer, Antioxidationsmittel und Konservierungsverstärker können wahlweise und vorzugsweise zum Verdünnungsmittel gegeben werden. Ein Isotonizitätsmittel, wie Glycerin, wird herkömmlich in bekannten Konzentrationen verwendet. Die Glycerinkonzentration beträgt allgemein etwa 16 mg/ml. Ein physiologisch tolerierter Puffer wird vorzugsweise zugegeben, um eine verbesserte pH Kontrolle bereitzustellen. Die Formulierungen können einen weiten Bereich an pH Werten abdecken von pH 6,8 bis pH 9 und einen bevorzugten Bereich bis etwa 8,0. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Formulierungen einen pH zwischen etwa 6,8 und etwa 7,8 auf. Bevorzugte Puffer umfassen Phosphatpuffer, am bevorzugtesten Natriumphosphat, insbesondere phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
Andere Additive, wie pharmazeutisch annehmbare Löslichkeitsvermittler, wie Tween 20 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat), Tween 40 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonopalmitat), Tween 80 (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat), Pluronic F68 (Polyoxyethylen-Polyoxypropylenblockcopolymere) und PEG (Polyethylenglycol) oder nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, wie Polysorbat 20 oder 80 oder Poloxamer 184 oder 188, Pluronic^® Polyls oder andere Blockcopolymere und Chelatbildner, wie EDTA und EGTA können wahlweise zu den Formulierungen oder Zusammensetzungen gegeben werden, um die Aggregation zu verringern. Diese Zusätze sind besonders brauchbar, wenn eine Pumpe oder ein Plastikbehälter verwendet wird, um die Formulierung zu verabreichen. Das Vorkommen von pharmazeutisch annehmbaren oberflächenaktiven Mitteln verringert die Neigung des Proteins zu aggregieren. Die vorliegend beanspruchten Formulierungen sind überraschend stabil. Vor der vorliegenden Erfindung wurde die Herstellung von konservierten, Mehrfachverwendungsformulierungen von FSH aufgrund der Instabilität als unmöglich angesehen. Es wurde nun festgestellt, daß die beanspruchten Formulierungen sicher bei Temperaturen von 2 bis etwa 40°C gelagert werden können und die biologische Aktivität des Proteins für ausgedehnte Zeiträume behalten, die 2 Monate überschreiten, wie dies im weiteren gezeigt wird.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können durch ein Verfahren hergestellt werden, das das Mischen von FSH oder einer FSH Variante und Benzylalkohol in einem wäßrigen Verdünnungsmittel umfaßt. Das Mischen von FSH oder einer FSH Variante und eines Konservierungsmittels in einem wäßrigen Verdünnungsmittel wird mittels herkömmlicher Löse- und Mischverfahren ausgeführt. Um eine geeignete Formulierung herzustellen wird beispielsweise eine abgemessene Menge an FSH oder einer FSH Variante in gepufferter Lösung mit dem gewünschten Konservierungsmittel in gepufferter Lösung in Mengen vereinigt, die ausreichen, um das Protein und das Konservierungsmittel in den gewünschten Konzentrationen bereitzustellen. Variationen dieses Verfahrens sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind die Reihenfolge, in der die Komponenten zugegeben werden, ob zusätzliche Additive verwendet werden, die Temperatur und der pH, bei der die Formulierung hergestellt wird, alles Faktoren, die bezüglich der Konzentration und der Art der verwendeten Verabreichung optimiert werden.
Die beanspruchten Formulierungen können Patienten als klare Lösungen bereitgestellt werden. Das einzelne Gläschen mit einer Lösung kann mehrere Male verwendet werden und kann für einen einzigen oder mehrere Zyklen einer Patientenbehandlung ausreichen und daher einen bequemeren Verabreichungsplan bereitstellen, als dies derzeit verfügbar ist.
Die vorliegend beanspruchten Serienartikel sind für die Verabreichung über einen Zeitraum von 24 Stunden oder mehr überraschend brauchbar. Vor der vorliegenden Erfindung waren nur Produkte für eine unmittelbare Verwendung geeignet und zugelassen. Der Patient wurde angewiesen, nicht verbrauchtes Material zu verwerfen, was zu Abfall und Kosten führte. Demnach bieten die vorliegend beanspruchten Serienartikel dem Patienten signifikante Vorteile. Es wurde festgestellt, daß die beanspruchten Formulierungen sicher bei Temperaturen von etwa 2 bis etwa 40°C gelagert werden können und die biologische Aktivität des Proteins für ausgedehnte Zeiträume behalten, die 2 Monate übersteigen, wobei eine Verpackungsaufschrift verwendet werden kann, die anzeigt, daß die Lösung über einen Zeitraum von 24, 36, 48, 72 oder 96 Stunden oder mehr aufbewahrt und/oder verwendet werden kann. Falls ein konserviertes Verdünnungsmittel verwendet wird, kann eine solche Aufschrift 1, 1,5 und bis zu 2 Jahre ausweisen.
Die erfindungsgemäßen Lösungen an FSH oder einer FSH Variante können durch ein Verfahren hergestellt werden, das das Mischen von FSH oder einer FSH Variante in einem wäßrigen Verdünnungsmittel umfaßt. Das Mischen wird mittels herkömmlicher Lösungs- und Mischungsverfahren ausgeführt. Um ein geeignetes Verdünnungsmittel herzustellen wird beispielsweise eine abgemessene Menge an FSH oder einer FSH Variante in Wasser oder Puffer in Mengen kombiniert, die ausreichen, um das Protein und wahlweise ein Konservierungsmittel oder einen Puffer in den gewünschten Konzentrationen bereitzustellen. Die Variationen dieses Verfahrens sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind die Reihenfolge, in der die Komponenten zugegeben werden, ob zusätzliche Additive verwendet werden, die Temperatur und der pH, bei der die Formulierung hergestellt wird, alles Faktoren, die bezüglich der Konzentration und der Art der verwendeten Verabreichung optimiert werden.
Die beanspruchten Produkte können Patienten als klare Lösungen bereitgestellt werden. Das einzelne Gläschen mit einer Lösung kann mehrere Male verwendet werden und kann für einen einzigen oder mehrere Zyklen einer Patientenbehandlung ausreichen und daher einen bequemeren Verabreichungsplan bereitstellen, als dies derzeit verfügbar ist.
Die beanspruchten Produkte können indirekt Patienten bereitgestellt werden, indem man Apotheken, Kliniken und andere Institutionen und Einrichtungen klare Lösungen zur Verfügung stellt. Die klare Lösung kann in diesem Fall bis zu 1 Liter oder sogar mehr umfassen, was ein großes Reservoir darstellt, aus dem kleinere Portionen der Lösung an FSH oder der FSA Variante einmal oder mehrmals für einen Transfer in kleinere Gläschen entnommen werden können und durch die Apotheke oder die Klinik ihren Kunden und/oder Patienten bereitgestellt werden können. Die klare Lösung, die von der Apotheke oder der Klinik den Kunden und Patienten zur Verfügung gestellt wird, kann für einen oder mehrere Behandlungszyklen des Patienten ausreichen und so einen bequemeren Verabreichungsplan bereitstellen, als dies derzeit erhältlich ist.
Bekannte Vorrichtungen, die diese Einzelgläschensysteme umfassen, sind die Pen-Injektionsvorrichtungen zur Abgabe einer Lösung, wie Humaject^®, NovoPen^®, B-D^® Pen, AutoPen^® und OptiPen^®.
Die vorliegend beanspruchten Produkte umfassen ein Verpackungsmaterial. Das Verpackungsmaterial liefert zusätzlich zur Information, die durch die gesetzlichen Behörden erforderlich ist, die Bedingungen, unter denen das Produkt verwendet werden kann. Für das Lösungsprodukt in einem Gläschen zeigt die Aufschrift, daß die Lösung über einen Zeitraum von 24 Stunden oder mehr verwendet werden kann. Die vorliegend beanspruchten Produkte sind für die Verwendung als humanes pharmazeutisches Produkt brauchbar.
Die beanspruchten stabilen oder konservierten Formulierungen können den Patienten als klare Lösungen bereitgestellt werden. Das einzelne Gläschen mit einer Lösung kann mehrmals wiederverwendet werden und kann für einen oder mehrere Zyklen einer Patientenbehandlung ausreichen und so einen bequemeren Behandlungsplan liefern, als dies derzeit möglich ist.
FSH oder eine FSH Variante kann sowohl in den hierin beschriebenen stabilen oder konservierten Formulierungen als auch Lösungen an einen Patienten gemäß der vorliegenden "Erfindung auf eine Vielzahl an Verabreichungsarten verabreicht werden, wie unter anderem SC oder IM Injektionen, transdermal, pulmonal, transmukosal, durch Implantation, osmotische Pumpen, Kartuschen, Mikropumpen, oral oder andere Arten, die dem Fachmann und in der Technik bekannt sind.
Die folgenden Beispiele werden nur zur weiteren Erläuterung der Herstellung der Formulierungen und Zusammensetzungen der Erfindung bereitgestellt. Der Umfang der Erfindung soll nicht so aufgefaßt werden, daß er nur aus den folgenden Beispielen besteht.
Beispiel 1
Klonierung und Expression von FSH oder einer FSH Variante in Säugerzellen
Ein typischer Säugerexpressionsvektor enthält zumindest ein Promotorelement, das die Transkription von mRNA initiiert, die für das Polypeptid kodierende Sequenz und Signale enthält, die zur Termination der Transkription und der Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind. Da jedoch funktionsfähiges FSH oder FSH Varianten sowohl eine α- als auch eine β-Untereinheit umfassen, müssen beide Untereinheiten entweder durch die Expression beider Untereinheiten von einem Vektor, der ein Promotorelement für jede Untereinheit enthält, oder durch die Verwendung von zwei Vektoren exprimiert werden: Einem ersten Vektor, der einen Promotor zur Expression der ersten Untereinheit enthält und einen zweiten Vektor, der einen Promotor zur Expression der zweiten Untereinheit enthält.
Zusätzlich weist jeder Säugerexpressionsvektor Elemente auf, die auf einem oder mehreren Vektoren vorkommen können, einschließlich Enhancer, Kozak-Sequenzen und intervenierende Sequenzen, die durch Donor- und Akzeptorstellen für das RNA Spleißen flankiert sind.
Eine hocheffiziente Tanskription kann mit den frühen und späten Promotoren von SV40, den langen terminalen Wiederholungen (LTRS) von Retroviren, beispielsweise RSV, HTLVI, HIVI und dem frühen Promotor des Cytomegalievirus (CMV) erreicht werden. Jedoch können auch zelluläre Elemente verwendet werden (beispielsweise der humane Actinpromotor). Geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Bereitstellung von Untereinheiten für FSH oder FSH Varianten umfassen beispielsweise Vektoren, wie pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN oder pLNCX (Clontech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/–), pcDNA/Zeo (+/–) oder pcDNA3.1/Hygro (+/–) (Invitrogen), PSVL und PMSG (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) und pBC12MI (ATCC 67109). Säugerwirtszellen, die verwendet werden können, umfassen humane Hela 293, H9 und Jurkat Zellen, Maus NIH3T3 und C127 Zellen, COS 1, COS 7 und CV1, QC1-3 Wachtelzellen, Maus L Zellen und Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO).
Alternativ dazu können die gewünschten DNA Sequenzen für die α- und β-Untereinheit in stabilen Zellinien exprimiert werden, die die DNA Sequenzen zur Expression jeder Untereinheit enthalten, wenn diese in das Chromosom integriert wurden. Die Co-Transfektion mit einem Selektionsmarker, wie dhfr, gpt, Neomycin oder Hygromycin erlaubt die Identifizierung und Isolierung der transfizierten Zellen, wie dies in der Technik bekannt ist.
Die transfizierten DNA Sequenzen für die Untereinheiten können auch zur Expression von großen Mengen des kodierten Polypeptids amplifiziert werden. Der DHFR Marker (Dihydrofolatreduktase) ist zur Entwicklung von Zellinien brauchbar, die mehrere hundert oder sogar mehrere tausend Kopien der DNA Sequenzen von Interesse aufweisen. Ein weiterer brauchbarer Selektionsmarker ist das Enzym Glutaminsynthase (GS) (Murphy et al., Biochem. J. 227: 277–279 (1991), Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169–175 (1992)). Unter Verwendung dieser Marker werden die Säugerzellen in Selektivmedium angezogen und die Zellen mit der höchsten Resistenz werden ausgewählt. Diese Zellinien enthalten die amplifizierten Gene integriert im Chromosom. Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) und NSO Zellen werden oft zur Herstellung von Proteinen und Polypeptiden verwendet.
Die Expressionsvektoren pC1 und pC4 enthalten den starken Promotor (LTR) des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438–447 (1985)) plus einem Fragment des CMV-Enhancers (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Polylinker, beispielsweise mit den Restriktionsschnittstellen BamHI, XbaI und Asp718, erleichtern die Klonierung von DNA Sequenzen für die α- und β-Untereinheiten von Interesse. Die Vektoren enthalten zusätzlich das 3'-Intron, das Polyadenylierungs- und Terminationssignal des Präproinsulingens der Ratte.
Beispiel 2
Klonierung und Expression in COS und CHO Zellen
Ein Expressionsplasmid für FSH oder eine FSH Variante wird durch die Klonierung einer cDNA, die Untereinheiten für FSH oder eine FSH Variante kodiert, in den Expressionsvektor pcDNAI/Amp oder pcDNAIII hergestellt (der von Invitrogen, Inc. erhalten werden kann). Wie vorher erwähnt, erfordert jede Untereinheit eine Expression zur Bildung eines funktionsfähigen Heterodimers, entweder durch die unabhängige Einführung von zwei getrennten Vektoren in die Wirtszelle oder durch die Gestaltung eines einzelnen Vektors, der sowohl α- als auch β-Untereinheiten exprimiert.
Der Expressionsvektor pcDNAI/amp enthält: (1) Einen E. coli Replikationsursprung, der zur Vermehrung in E. coli und anderen prokaryontischen Zellen wirksam ist, (2) ein Ampicillinresistenzgen zur Selektion von Plasmid-enthaltenden prokaryontischen Zellen, (3) einen SV40 Replikationsursprung für eine Vermehrung in eukaryontischen Zellen, (4) einen CMV Promotor, einen Polylinker, ein SV40 Intron, (5) mehrere Codons, die für ein Hämagglutininfragments kodieren (das heißt einen "HA" Anhang zur Erleichterung der Reinigung) oder einen HIS Anhang (siehe beispielsweise Ausubel, siehe obige Literaturstelle) gefolgt von einem Terminationscodon und einem Polyadenylierungssignal, die so angeordnet sind, daß die cDNA bequem unter die Expressionskontrolle des CMV Promotors gestellt wird und operativ mit dem SV40 Intron und dem Polyadenylierungssignal durch die Restriktionsschnittstellen im Polylinker verbunden wird. Der HA Anhang entspricht einem Epitop, das vom Influenzahämagglutininpolypeptid abgeleitet ist, welches von Wilson et al., Cell 37: 767–778 (1984) beschrieben wird. Die Fusion des HA Anhangs mit dem Zielpolypeptid, entweder der α- oder der β-Untereinheit, erlaubt die leichte Detektion und Gewinnung des rekombinanten Polypeptids mit einem Antikörper, der das HA Epitop erkennt. pcDNAIII enthält zusätzlich den Neomycinselektionsmarker.
Ein DNA Fragment, das die α- und die β-Untereinheit von FSH oder einer FSH Variante kodiert, wird getrennt in die Polylinkerregion des Vektors kloniert, so daß die rekombinante Polypeptidexpression durch den CMV Promotor gesteuert wird. Die Insertion in den Vektor erfolgt wahlweise mit oder ohne des HA Epitops. Die Plasmidkonstruktionsstrategie ist wie folgt. Für FSH oder eine FSH Variante wird die cDNA des hinterlegten Klons für jede Untereinheit mittels Primer amplifiziert, die bequeme Restriktionsschnittstellen enthalten.
Das mittels PCR amplifizierte DNA Fragment für jede Untereinheit und der Vektor pcDNI/Amp werden mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und dann wird jede Untereinheit in den verdauten Vektor ligiert. Jedes Ligationsgemisch wird in den E. coli Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert und die transformierte Kultur wird auf Ampicillinmediumplatten plattiert, die dann inkubiert werden, um ein Wachstum von Ampicillin-resistenten Kolonien zu erlauben. Die Plasmid DNA für jede Untereinheit wird aus resistenten Kolonien isoliert und durch Restriktionsanalyse oder andere Mittel auf das Vorkommen eines für FSH oder eine FSH Variante kodierenden Fragments untersucht.
Zur Expression von rekombinantem FSH oder einer FSH Variante werden COS Zellen mit einem Expressionsvektor für jede wie oben beschriebene Untereinheit mittels DEAE-DEXTRAN co-transfiziert, wie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben ist. Die Zellen werden unter Bedingungen zur Expression von FSH oder einer FSH Variante durch jeden Vektor inkubiert.
Es wird erwartet, daß die Expression des Fusionsproteins von FSH HA oder FSH Variante HA durch radioaktive Markierung und Immunfällung mittels Verfahren detektiert wird, die beispielsweise beschrieben sind in Har low et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988). Hiernach werden die Zellen zwei Tage nach der Transfektion durch die Inkubation in Medium für 8 Stunden markiert, das 35S-Cystein enthält. Die Zellen und die Medien werden gewonnen und die Zellen werden gewaschen und mit Detergenz-enthaltendem RIPA Puffer, nämlich 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5 gewaschen, wie dies im obigen Zitat von Wilson et al. beschrieben ist. Die Proteine werden aus dem Zellysat und aus dem Kulturmedium mittels eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers ausgefällt. Das ausgefällte Protein wird dann durch SDS-PAGE Autoradiographie analysiert. Es wird ein Expressionsprodukt der erwarteten Größe im Zellysat beobachtet, das nicht in den Negativkontrollen beobachtet wird.
Der Vektor C4 wird zur Expression jeder Untereinheit von FSH oder einer FSH Variante verwendet. Alternativ dazu wäre der Fachmann in der Lage, pC4 so anzupassen, um sowohl α- als auch β-Untereinheiten von einem einzelnen Vektor zu exprimieren. Das Plasmid pC4 ist ein Derivat des Plasmids pSV2-dhfr (ATCC Hinterlegungsnummer 37146). Das Plasmid enthält das Maus-DHFR-Gen unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors. Ovarzellen vom Chinesischen Hamster, denen die Dihydrofolataktivität fehlt, die mit Plasmiden mit α- und β-Untereinheiten co-transfiziert werden, können durch das Wachsen der Zellen in einem Selektivmedium (α-minus MEM, Life Technologies) selektiert werden, das mit dem Chemotherapeutikum Methotrexat supplementiert ist. Die Amplifizierung der DHFR Gene in Zellen, die gegenüber Methotrexat (MTX) resistent sind, wurde gut beschrieben (siehe beispielsweise F. W. Alt et al., J. Biol. Chem. 253: 1357–1370 (1978), J. L. Hamlin und C. Ma, Biochem. et Biopbys. Acta 1097: 107–143 (1990) und M. J. Page und M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64–68 (1991)). Zellen, die in zunehmenden Konzentrationen an MTX angezogen werden, entwickeln eine Resistenz gegenüber dem Arzneimittel durch die Überproduktion des Zielenzyms DHFR als Ergebnis einer Amplifizierung des DHFR Gens. Falls DNA Sequenzen an das DHFR Gen gebunden werden, werden diese gewöhnlich co-amplifiziert und überexprimiert. Es ist in der Technik bekannt, daß dieser Ansatz zur Entwicklung von Zellinien verwendet werden kann, die mehr als 1000 Kopien des amplifizierten Gens tragen. Wenn anschließend Methotrexat abgesetzt wird, erhält man Zellinien, die die amplifizierten DNA Sequenzen integriert in ein oder mehrere Chromosomen der Wirtszelle enthalten.
Das Plasmid pC4 enthält zur Expression der α- und β-Untereinheit die DNA Sequenzen von Interesse hinter dem starken Promotor der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438–447 (1985)), der zusätzlich ein Fragment enthält, des aus dem Enhancer des unmittelbar frühen Gens des humanen Cytomegalievirus (CMV) isoliert wurde (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Stromabwärts des Promotors liegen BamHI, XbaI und Asp718 Restriktionsenzymschnittstellen, die die Integration der DNA Sequenzen erlauben. Hinter diesen Klonierungsstellen enthält das Plasmid das 3'-Intron und die Polyadenylierungsstelle des Präproinsulingens der Ratte. Andere hoch effiziente Promotoren können auch für die Expression verwendet werden, beispielsweise der Promotor von humanem b-Actin, die frühen und späten Promotoren von SV40 oder die langen terminalen Wiederholungen von anderen Retroviren, beispielsweise HIV und HTLVI. Die Tet-OFF und Tet-On Genexpressionssysteme von Clontech und ähnliche Systeme können zur Expression des FSH oder einer FSH Variante auf eine regulierte Weise in Säugerzellen verwendet werden (M. Gossen und H. Bujard, proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551 (1992)). Für die Polyadenylierung der mRNA können auch andere Signale verwendet werden, beispielsweise vom humanen Wachstumshormon oder von Globingen. Stabile Zellinien, die die DNA Sequenzen der α- und β-Untereinheit integriert in die Chromosomen enthalten, können auch nach einer Co-Transfektion mit einem Selektionsmarker selektiert werden, wie gpt, G418 oder Hygromycin. Es ist vorteilhaft, mehr als einen Selektionsmarker zu Beginn zu verwenden, beispielsweise G418 plus Methotrexat.
Das Plasmid pC4 wird mit den Restriktionsenzymen verdaut und dann mittels Phosphatase aus dem Kälberdarm durch in der Technik bekannte Verfahren dephosphoryliert. Der Vektor wird aus einem 1% Agarosegel isoliert.
Die DNA Sequenz, die das vollständige FSH oder die FSH Variante für jede Untereinheit kodiert, wird mittels PCR Oligonukleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen. Nichtbeschränkende Beispiele umfassen 5'- und 3'-Primer mit Nukleotiden, die einem Teil der kodierenden Sequenz jeder Untereinheit von FSH oder einer FSH Variante entsprechen oder hierzu komplementär sind.
Die amplifizierten Fragmente werden mit geeigneten Endonukleasen verdaut und dann erneut auf einem 1% Agarosegel gereinigt. Die isolierten Fragmente für jede Untereinheit und der dephosphorylierte Vektor werden dann getrennt mit T4 DNA Ligase ligiert. E. coli HB101 oder XL-1 Blue Zellen werden dann getrennt transformiert und es werden Bakterien identifiziert, die das Fragment (oder die Fragmente, falls der Vektor zur Expression sowohl der α- als auch der β-Untereinheit angelegt ist) in dem Plasmid pC4 inseriert enthalten, wobei beispielsweise eine Restriktionsanalyse verwendet wird.
Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO), denen ein aktives DHFR Gen fehlt, werden zur Transfektion verwendet. 5 μg des Expressionsplasmids pC4 wird mit 0,5 μg des Plasmids pSV2-neo mittels Lipofectin co-transfiziert. Das Plasmid pSV2neo enthält einen dominanten Selektionsmarker, nämlich das neo Gen von Tn5, das für ein Enzym kodiert, welches eine Resistenz gegenüber einer Gruppe von Antibiotika einschließlich G418 verleiht. Die Zellen werden in α-minus MEM angeimpft, das mit 1 μg/ml G418 supplementiert ist. Nach 2 Tagen werden die Zellen mit Trypsin behandelt und in Hybridomklonierungsplatten (Greiner, Germany) in α-minus MEM geimpft, das mit 10, 25 oder 50 ng/ml Methotrexat plus 1 μg/ml G418 supplementiert ist. Nach etwa 10–14 Tagen werden einzelne Klone mit Trypsin behandelt und dann in Petrischalen mit 6 Vertiefungen oder 10 ml Kolben unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen an Methothrexat geimpft (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klone, die bei den höchsten Methotrexatkonzentrationen wachsen, werden dann in neuePlatten mit 6 Vertiefungen überführt, die noch höhere Methotrexatkonzentrationen enthalten (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Das gleiche Verfahren wird wiederholt bis Klone erhalten werden, die bei Konzentrationen von 100–200 mM wachsen. Die Expression des gewünschten Produkts wird beispielsweise durch SDS-PAGE und Western Blot oder durch Umkehrphasen-HPLC Analyse analysiert.
Es ist verständlich, daß die Erfindung anders als dies in den vorhergeheneden Beschreibungen und Beispielen genau beschrieben ist, ausgeführt werden kann.
Es sind mehrere Modifikationen und Variationen der vorliegenden Methoden in der Technik bekannt, um rekombinante Proteine zu exprimieren, einschließlich derer, die beschrieben sind in J. L. Keene et al., J. Biol. Chem. 264: 4769–4752, 1989, E. Loumaye et al., Human Reprod. Update, 1: 188–1999, 1995, W. Olijve et al., Mol. Hum. Reprod., 2: 361–369, 1996 wie auch andere rekombinante Techniken, die für andere Gonadotropine bekannt sind und verwendet werden.
Beispiel 3
Expression in AV12 Zellen
Es wird der Expressionskassettenvektor pGTH zur Expression der α-Untereinheit in AV12 verwendet. Es beschreiben mehrere veröffentlichte Artikel die Verwendung von AV12-664 und/oder AV12-RGT18 Zellen (siehe B. W. Grinnell et al., Blood 76 (12): 2546–2554, 1990, P. J. Burck et al., J. Biol. Chem. 265 (9): 5170–5177, 1990, J. F. Parkinson et al., J. of Biol. Chem. 265 (21): 12606–12610, 1990, B. W. Grinell et. al., J. Biol. Chem. 266 (15): 9778–9785, 1991, J. P. Wery et al., Nature 352 (6330): 79–82, 1991, D. T. Berg et al., Biotechniques 14: 972–979, 1993, B. Gerlitz et al., Biochemical Journal 295 (1): 131–140, 1993, J. D. Kursar et al. Molecular Pharmacology 46 (2): 227–234, 1994, M. A. Desai et al. Molecular Pharmacology 48 (4): 648–657, 1995, Obesity Research 3 Suppl. 4: 4441S–4447S, 1995, M. A. Desai et al., British Journal of Pharmacology 118 (6): 1558–1564, 1996, A. Kumar et al. Cancer Research 56 (23): 5397–5402, 1996, L. N. Boggs et al., J. of Neurochemistry 57 (3): 1324–1327 (1996), V. L. Lucaites et al., Life Sciences 69 (13): 1081–1095, 1996, D. D. Schoepp et. al. Neuropharmacology 35 (12): 1661–1672, 1996, A. Kumar et al. Cancer Research 57 (15): 3111–3114, 1997, Urology 49 (3): 487–493, 1997, D. B. Wainscott et al. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology 357 (1): 17–24, 1998, S. Wu et al., Brain Research – Molecular Brain Research 53 (1–2): 88–97, 1998. Ähnlich wurde auch die Verwendung des Plasmids pGTH (siehe Grinell et al., J. Biol. Chem. 266 (15): 9778–9785, 1991) und des Plasmids pGTD (siehe Biochemical Journal 295 (Pt1): 131–140, 1993) beschrieben.
Kurz gesagt enthält pGTH aufeinanderfolgend mehrere Elemente: Den frühen SV40 Promotor, die Hygromycinresistenz von E. coli, die Prozessierungsstelle des kleinen "t" Antigens von SV40 und dessen Poly-A-Stelle, Klonierungsreste aus pBR322, Klonierungsreste aus dem BK Virus (Stamm P2), das Poly-CA₂₀/GT₂₀ Element (synthetisches Oligonukleotid), den Enhancer des BK Virus (Stamm P2), den späten Promotor von AD2/prozessierte dreiteilige Signalsequenz, die BclI Insertionsstelle für die die α-Untereinheit von FSH kodierende Sequenz (einschließlich des Stopcodons), die Prozessierungsstelle des kleinen "t" Antigens/dessen Poly-A-Stelle und die Ampicillinresistenz/den Replikationsursprung von pBR322.
Das Plasmidkonstrukt pGTH-α wird hergestellt, um die kodierte humane Sequenz der α-Untereinheit (SEQ ID Nr. 5) durch die Klonierung eines 362 bp langen BclI FSH cDNA Fragments in die BclI Einzelschnittstelle des Vektors zu exprimieren (siehe SEQ ID Nr. 19 oder 14). Das cDNA Fragment der FSH-α DNA wird durch die PCR Amplifuzierung mittels des Schaukelplasmids pLGD637 als Matrize erzeugt (pLGD637 enthält eine synthetische durch Oligonukleotide zusammengesetzte FSH-α cDNA Sequenz). Die Integrität des BclI Inserts wird durch die Sequenzierung gefolgt vom Vergleich mit der GenPept Datenbank bestätigt (Hinterlegungsnummer 31869).
Es wird der Expressionskassettenvektor pGTD verwendet, um die Sequenz der humanen β-Untereinheit der FSH-Variante (SEQ ID Nr. 11) zu exprimieren. pGTD enthält mehrere Elemente zur Expression in AV12 Zellen. pGTD enthält aufeinanderfolgend Klonierungsreste des BK Virus (Stamm P2), das Poly-CA₂₀/GT₂₀ Element (synthetisches Oligonukleotid), den Enhancer des BK Virus (Stamm P2), den späten hauptsächlichen Promotor/die prozessierte dreiteilige Signalsequenz von AD2, die BclI Insertionsstelle für die kodierende Sequenz der β-Untereinheit der FSH Variante (einschließlich des Stopcodons), die Prozessierungsstelle des kleinen "t" Antigens/Poly-A-Stelle von SV40, den frühen Promotor von SV40, die Dihydrofolatreduktase cDNA der Maus, die Prozessierungsstelle des kleinen "t" Antigens/Poly-A-Stelle von SV40 und die Ampicillinresistenz/den Replikationsursprung von pBR322.
Das Plasmidkonstrukt pGTD-bCD3 wird durch die Klonierung eines 393 bp langen BclI FSH-β-bCD3 cDNA Fragments in die BelI Einzelschnittstelle des pGTD Vektors hergestellt (siehe SEQ ID Nr. 20 oder 15). Die DNA des FSH-β-CD3 cDNA Fragments wird durch PCR Amplifikation mittels des Schaukelplasmids pLGD638 als Matrize hergestellt (pLGD638 enthält eine synthetische durch Oligonukleotide zusammengesetzte FSH-β cDNA Sequenz). Die Integrität des Konstrukts wird durch Sequenzierung bestätigt und mit der Sequenz der humanen β-Untereinheit verglichen, die in der GenPept Datenbank hinterlegt ist (Hinterlegungsnummer 476441).
Kurz gesagt werden die Plasmide pGTH-α und pGTD-bCD3 linearisiert, erneut gereinigt und dann in adhärente AV23-RGT18 Zellen co-transfiziert. Nach der Selektion mit Medium, das 0,25 μM Methotrexat und 100 μg/ml Hyromycin-B zusammen mit 200 μg/ml G418 zur Aufrechterhaltung des Glutamattransportergenotyps der AV12-RGT18 Zellen enthält, werden einzelne stabile Klone entweder manuell oder durch Durchflußzellsortierung isoliert. Die am besten produzierenden Klone werden durch die Analyse des konditionierten Mediums mit einem im Handel erhältlichen FSH Elisa Kit identifiziert. Es werden mehrere Klone an eine serumfreie Suspension angepaßt und weiter amplifiziert, um isolierbare Mengen des Heterodimers der FSH Variante zu erhalten.
Beispiel 4
Expression in CHO-K1 Zellen
Es wird eine CHO-K1 Zellinie (Lonza Biologics plc.) entwickelt, um ein Heterodimer einer FSH Variante herzustellen, das sich aus der β-Untereinheit der SEQ ID Nr. 5 und der β-Untereinheit der SEQ ID Nr. 11 zusammensetzt.
Die Expressionsvektorkassette enthält die kodierende DNA für die α-Untereinheit der SEQ ID Nr. 5 und die kodierende DNA für die β-Untereinheit der SEQ ID Nr. 11, die durch zwei unterschiedliche Promotoren kontrolliert werden: CMV für die β-Untereinheit und EF1 Alpha für die α-Untereinheit. Jede Sequenz für die α- und β-Untereinheit verwendet den Poly A Schwanz des Rinderwachstumshormons. Zusätzlich enthält der Vektor das Glutaminsynthetasegen, das durch den späten SV40 Promotor kontrolliert wird und den SV40 Poly-A-Schwanz enthält und als Selektionsmarker verwendet wird. Dieser Vektor wird zur Transfektion der CHO-K1 Zellen verwendet.
Die Zellinie wird in Gibco BRL's CD CHO Medium unter Selektionsdruck von L-Methioninsulfoximin angezogen. Es werden ELISA Tests verwendet, um Ausgangsvertiefungen zu identifizieren, die die FSH Variante exprimieren. Es werden mehrere Ausgangsvertiefungen Klonierungs- und Amplifizierungsverfahren unterzogen. Diese Experimente führen zu der klonierten Zellinie 2B6.1 C3.25, die geeignete Titer aufweist: Expressionsstudien, die in Schüttelkolben in kleinem Maßstab (20–60 ml) ausgeführt werden, haben gezeigt, daß diese Linie die FSH Variante mit 30 mg/l nach 7 bis 8 Tagen exprimiert.
Beispiel 5
Reinigung der FSH Varianten aus CHO oder AV-12 Zellen
Die Reinigung des Heterodimers der FSH Variante, die sich aus einer α-Untereinheit der SEQ ID Nr. 5 und einer β-Untereinheit der SEQ ID Nr. 11 zusammensetzt, kann durch mehrere Verfahren, die in der Technik bekannt sind und beschrieben werden, aus einlagigen Kulturen oder Suspensionskulturen von entweder CHO-K1 oder AV12 Zellinien oder anderen geeignet verfügbaren Produktionslinien erreicht werden. Ein Verfahren zur Isolierung der beschriebenen FSH Variante aus dem die Kultur enthaltendem Medium ist es, die Kultur einer Kationenaustauschchromatographie, einer Farbstoffaffinitätschromatographie und einer Gelfiltrationschromatographie zu unterziehen, um das Protein zu reinigen. Im Fall der Suspensionskulturen, die Detergenzien enthalten können, können zusätzliche Reinigungsschritte erforderlich sein, wie ein Q-Sepharoseschritt. Die chromatographischen Schritte können weiter angefügt werden oder bezüglich pH, Leitfähigkeit, Pufferzusammensetzung und Laufbedingungen optimiert werden (Säulengrößen, Flußraten, usw.) Die Reinheit und die Ausbeute kann durch SDS-PAGE Gele (sowohl Coomassie Färbung als auch Western Blot), ELISA Tests, Ausschlußchromatographie und Proteinkonzentrierung durch die UV Absorption bei 277 nm oder andere bekannte Techniken analysiert werden.
Die Reinigung und chromatographische Fraktionierung kann durch Befolgen der weiteren Details für jeden unten angegebenen Schritt erreicht werden. Für Einschichtkulturen wird das konditionierte Medium vor der Auftragung auf die Kationenaustauschersäule konzentriert und diafiltriert. Der Q-Sepharoseschritt kann für Suspensionskulturen verwendet werden, um Detergenzien zu entfernen, die vorkommen können.
1. Konzentrierung
Typischerweise werden 0,02 bis 0,04% Pluronic F68 für AV12 Suspensionskulturen verwendet, während 0,1 bis 0,18% im Medium für CHO Suspensionskulturen verwendet werden. Das konditionierte Medium wird durch die Zellkulturgruppe mittels Zentrifugation und Filtration durch ein Käsetuch geklärt wird, wird mittels eines Tangentialflußfiltrationssystems ProFlux (ProFlux M12 von Millipore) mit einem S3YM10 Spiralkartuschensystem konzentriert (Amicon Nr. 540633). In Abhängigkeit der Menge an Pluronic F68, die verwendet wird, wird das Medium vier- bis zehnfach konzentriert, so daß 0,2–0,4% Pluronic F68 im konzentrierten Medium vorhanden sind. Das schließliche Volumen des Materials nach der Konzentrierung beträgt gewöhnlich 2–3 Liter ausgehend von 8 Liter für CHO-K1 und 24 Liter für AV12 Kulturen.
2. Rühransatz mit O-Sepharose
Für jeden Liter konditioniertem Ausgangsmedium vor der Konzentrierung werden 50 ml Fast Flow Q-Sepharoseharz (Pharmacia 17-0510-01, voräquilibriert mit 20 mM Tris pH 7,4) und ausreichend NaCl unter Bildung einer schließlichen Leitfähigkeit von 200 mM (~20 mS/cm) zum konzentrierten Medium gegeben und sanft bei 4°C über Nacht gerührt.
3. Diafiltration
Nach dem Übernachtansatz des konzentrierten Mediums mit Q-Sepharoseharz kann sich das Harz absetzen, der Überstand wird abdekantiert und mittels eines CUNO Systems mit einem Zeta Plus 30-SP Filter (Nr. B0406-30SP von Sun Source Fauver) und einer Masterflexpumpe bei einer Flußrate von 170 ml/min filtriert. Das Medium wird dann weiter auf etwa 800 ml konzentriert und mittels 5–6 Volumina an 20 mM Tris pH 7,4 im Profluxsystem diafiltriert. An diesem Punkt beträgt die Leitfähigkeit ~2 mS/cm. Der pH wird mit 1 N HCl eingestellt und die Lösung wird erneut mittels eines frischen Zeta Plus 30-SP Filters im CUNO System filtriert und sofort auf die Kationenaustauschersäure aufgetragen.
4. Kationenaustauschchromatographie (CEX)

Säule: Pharmacia SP-Sepharose Fast Flow (17-0729-01) wird zum Packen einer 50 ml Säule für ~100–200 mg FSH (Gesamtprotein ~500–600 mg) verwendet. Die Puffer sind: A: 20 mM Natriumphosphat, pH 5,0 und B: 20 mM Natriumphosphat pH 5,0, 1M NaCl

Die Probe wird auf pH 5,0 eingestellt, durch Filtration geklärt und sofort auf die Säule aufgetragen und mit 5 ml/min mit 4 Säulenvolumina gefahren, bevor man einen Gradient von 0% bis 50% B über 15 Säulenvolumina startet. Man sammelt alle 3 Minuten eine Fraktion (15 ml). Die Fraktionen werden in 400 ml an 1 M Tris pH 8,0 gesammelt.
Es werden Coomassie-gefärbte SDS-PAGE Gele verwendet, um FSH-enthaltende Fraktionen auszuwählen, die vereinigt werden (typischerweise beträgt die Poolgröße 200 bis 250 ml für eine 50 ml Säule). Dieser Pool wird gegen 20 mM Tris pH 7,4 über Nacht bei 4°C dialysiert, um die Leitfähigkeit auf < 3 mS/cm zu drücken.
5. Farbstoffaffinitätschromatographie (DAC)

Säule: Mimetic Blue Dye 1 A6XL, 0090-0500 von Prometic Biosciences Inc. wird in einer 50 ml Säule für ~40 mg FSH verwendet. Die Puffer sind: A: 25 mM Phosphat, pH 6,5 (Leitfähigkeit beträgt 4,5 bis 5 mS/cm), B: 25 mM Phosphat, 150 mM KCl, pH 6,5, C: 25 mM Phosphat, 1 M KCl, pH 8,0.

Nach der Dialyse des CEX Pools wird der pH auf 6,5 eingestellt und mit 3 ml/min auf die DAC Säule aufgetragen. Es wird ein Gradient von 100% A bis 50% A und 50% B für 4 Säulenvolumina angewendet und dann wird mit 100% Puffer C für 5 Säulenvolumina eluiert, wobei Fraktionen für 3 min (9 ml) gesammelt werden.
Coomassie-gefärbte SDS-PAGE Gele werden zur Auswahl von FSH-enthaltenden Fraktionen verwendet, die vereinigt werden. Typischerweise beträgt die Poolgröße 90 bis 100 ml für eine 100 ml Säule. Der Pool wird mittels Millipore Ultrafree Zentrifugenvorrichtungen auf 4 ml konzentriert (UFV2BCC40, 5000 MWCO, zentrifugiert bei 2000 Upm) und auf eine Gelfiltrationssäule aufgetragen.
6. Gelfiltration

Säule: Bio Pilot Superdex 75 Prep Grade 35/600 Säule wird für 50 bis 100 mg an FSH verwendet. Puffer sind: 1 × PBS (hergestellt aus GIBCO 10 × PBS, Nr. 70011) plus 100 mM NaCl. Die schließliche Zusammensetzung des Puffers ist 1 mM monobasisches Kaliumphosphat, 3 mM dibasisches Natriumphosphat und 253 mM Natriumchlorid, pH 7,4.

Die Säule wird mit 4 ml FSH aus dem DAC Schritt in 1 × PBS wie oben beschrieben mit einer Flußrate von 3 ml/mm aufgetragen, wobei für 1 Minute (3 ml) Fraktionen gesammelt werden.
Die Reinheit des FSH nach diesem Schritt beträgt gewöhnlich > 95% durch Gele, die mit Coomassie und Silber gefärbt werden.
Beispiel 6
Wirkung von Konservierungsstoffen auf die physikalische Stabilität von FSH
Da Konservierungsmittel zur Denaturierung oder Destabilisierung von Protein tendieren oder eine Aggregation induzieren (J. Brange und L. Langkjar, Acta Pharm. Nord, 4, 149–158, 1992, Y. F. Maa und C. Hsu, International Journal of Pharmaceutics, 140, 155–168, 1996) wird die physikalische Stabilität von uFSH (uFSH – Vitro Diagnostics-Human Urofollitropin) in Gegenwart von unterschiedlichen Konservierungsmitteln mittels einer dynamischen Lichtstreuungstechnik untersucht. Alle Messungen erhält man mit einem System, das aus einem Lexel 95 Argonlaser (488 nm), einem Brookhaven Instruments Modell BI-200 SM Goniometer und einem BI9000AT Autokorrelator besteht. Die Datenparameter bestehen aus anfänglichen Photonenzählungen, die auf 100 000 Zählungen/sec eingestellt werden, die 30 Sekunden dauern, einem Trübungsgrenzwert von 31 und einem 90° Lichtstreuungswinkel.

Die Konservierungsstoffe werden zu einer 1,5 ml Lösung aus 1 mg/ml Follikelstimulierungshormon aus dem Urin (uFSH – Vitro Diagnositics-Human Urofollitropin) gegeben, das gegen 1 × PBS über Nacht bei pH 7,4 dialysiert wurde. Die Konzentration des Konservierungsstoffs wird so ausgewählt daß sie die Konzentration ist, die bekanntermaßen eine angemessene antimikrobielle Aktivität bereitstellen kann. In einer Impfbank wird diese Probe durch ein 0,1 um Anotop-Plus Filter (10 mm) in ein 12 mm DLS Teströhrchen filtriert. Die Probe wird in den DLS Halter gegeben, der auf 37°C äquilibriert wurde. Die Autokorrelationsfunktion wird alle 15 Minuten für 24 Stunden bestimmt und analysiert, um den hydrodynamischen Parameter zu ergeben. Diese Messung zeigt, daß mehr als 99% der Proteinmoleküle einen Durchmesser van etwa 5,7 nm aufweisen. Ein kleiner Teil (< 1%) hat einen mittleren Durchmesser von etwa 200 nm. Das Vorkommen der Konservierungsstoffe verändert die Größenverteilung des Moleküls nach 24 Stunden bei 37°C nicht wesentlich. Die repräsentativen Daten nach 24 Stunden werden dann mit einem NNLS Programm (Non Negative Linear Squares) analysiert, wie dies in Tabelle I gezeigt ist Mehr als 99% der Moleküle liegen in Partikeln mit einem mittleren Durchmesser von etwa 5,7 nm vor. Mittels einer empirischen Gleichung; die einen Bezug zwischen dem kristallographisch ermittelten hydrodynamischen Radius und dem Molekulargewicht herstellt (P. G. Squire und M. E. Himmel in Arch. Bioch. Biophys. 196, Seiten 165–177, 1979) entpricht diese mittlere DLS Partikelgroße etwa 36 000 Daltons, was mit dem Molekulargewicht des uFSH Heterodimers übereinstimmt. Die verbleibende kleine Population an Partikeln (< 1%) hat einen mittleren Durchmesser von etwa 200 nm. Diese Daten zeigen in Tabelle VI, daß die untersuchten Konservierungsstoffe das uFSH unter den getesteten Bedingungen nicht signifikant aggregieren. Tabelle VI Größenverteilung von uFSH in Formulierungen, die unterschiedliche Konservierungsstoffe enthalten

Konservierungsstoff	Konservierungsmittelkonzentration (mg/ml)	Kleine Partikel (–5,7 nm)	Große Partikel (200 nm)
Keiner	0	> 99%	< 1%
m-Cresol	3,5	> 99%	< 1%
Phenol	3,5	> 99%	< 1%
Benzylalkohol	10	> 99%	< 1%
Methylparaben	1	> 99%	< 1%
Chlorcresol	2	> 99%	< 1%

Beispiel 7
Thermische Denaturierungsuntersuchungen mit uFSH Formulierungen

Der thermische Entfaltungsübergang für uFSH (uFSH – Vitro Diagnostics – Human Urofollitropin) wird als Funktion von Lösemittelbedingungen durch Differentialscanningcalorimetrie (DSC) verfolgt. Die Experimente werden auf einem VP-DSC Mikrokalorimeter (MicroCal Inc., Northampton, MA, V. V. Plotnik et al., Anal. Biochem., 250: 237–244, 1997) mittels einer VPViewer Software für eine Datenaufnahme und einer Origin DSC Software zur Datenanalyse ausgeführt. Die übereinstimmende Probenzelle und Referenzzelle haben eine Lutschbonbonform mit einem Arbeitsvolumen von 0,5 ml, die aus Tantal gefertigt sind. Etwa 1 mg/ml uFSH Proben werden gegen einen geeigneten Puffer über Nacht dialysiert und die Proteinkonzentration in der Probe wird mittels UV Spektroskopie bestimmt. Die Proteine werden dann für die DSC Experimente auf 0,4–0,5 mg/ml verdünnt. Das Dialysat wird als Referenzlösung verwendet. Die Proben- und Referenzlösungen werden für 5 Minuten entgast, bevor sie in die Zellen mit einer 2,5 ml Nadel durch einen Füllkanal eingefülllt werden. Der Druck wird auf etwa 30 psi mit einem Druckdeckel gehalten. Für alle Messungen in dieser Studie wird das Gerät über Nacht sowohl in der Proben- als auch in der Referenzzelle mit Puffern gefahren, um die thermische Entwicklung vor den Probenläufen zu ermitteln. Die Daten werden mit Origin DSC Software mittels eines Zweizustandsmodells analysiert (J. M. Sturtevant, Annu. Rev. Phys. Chem., 38: 463–488, 1987). Der Mittelpunkt der Übergangstemperatur (T_m) wird bei verschiedenen Lösungsbedingungen in Tabelle VII zusammengefaßt. Das Protein macht einen sehr kooperativen Übergang mit einem T_m von 77,3°C in PBS Puffer bei pH 7,4 durch. Die thermische Denaturierung ist in der Zeitspanne der Messungen unumkehrbar, wie dies durch das Fehlen des Übergangs im zweiten Lauf unmittelbar nach dem ersten gezeigt wird. Jedoch bleiben die dissoziierten Untereinheiten als Monomere in Lösung und diese Monomere können im Verlauf von Tagen unter Bildung des aktiven Dimers reassoziieren (Daten nicht gezeigt). Die Wirkungen der Zugabe der Konservierungsstoffe m-Cresol, Phenol, Benzylalkohol, Methylparaben und Chlorcresol mit den unten angegebenen Konzentrationen zeigen auf den T_m nur einen gerungen Effekt, wie dies in der Tabelle VII gezeigt ist. Tabelle VII Wirkungen von pH, Salz und Konservierungsstoffen auf den T_m von uFSH in Lösung, wie dies durch DSC verfolgt wird

Lösungsbedingungen	T_m (°C)
PB (9,5 mM Phosphat)
pH 5,7	72,4
pH 6,6	74,3
pH 7,6	74,8
pH 8,6	75,3
100 mM NaCl, pH 7,6	76,1

PBS mit pH 7,4	77,3
3,5 mg/ml m-Cresol	75,3
3,5 mg/ml Phenol	75,0
10 mg/ml Benzylalkohol	73,5
1 mg/ml Methylparaben	76,1
2 mg/ml Chlorcresol	74,6

Beispiel 8
Stabilität von uFSH als Funktion des pH
Die Stabilität von uFSH (uFSH – Vitro Dagnostics – Human Urofollitropin) wird in PBS für verschiedene pH Werte bestimmt. Die Prozente an Heterodimer werden als Funktion des pH durch Größenausschlußchromatographie (SEC) in Tabelle VIII verfolgt. Tabelle VIII Prozente an Heterodimer als Funktion des pH, wie dies durch SEC verfolgt wird

pH Prozente an Dimer

7,0 95,0

6,5 95,0

6,0 95,0

5,5 95,0

5,0 95,0

4,5 95,0

4,0 95,0

3,5 95,0

3,25 87,7

3,0 62,3

2,5 17,6

2,0 5,0
Referenzbeispiel 9
Stabilität der konservierten und nicht-konservierten uFSH Formulierungen
Eine Lösung aus uFSH (uFSH – Vitro Diagnostics – Human Urofollitropin) wird in PBS (Dulbeccos GIB-CO) hergestellt und mit PBS weiter auf eine Konzentration von etwa 50 μg/ml verdünnt. Die Proteinkonzentration wird auf einem Hewlett Packard Modell 8452A Diodenarrayspectrophotometer bestimmt.

Eine Portion der uFSH Lösung wird zu einem Becher gegeben, der eine vorab gewogene Menge an m-Cresol enthält, um eine m-Cresolendkonzentration von etwa 3,16 mg/ml zu erhalten. 1 ml umfassende Aliquots der konservierten und nicht-konservierten Lösung werden in Plastikzentrifugenröhrchen gegeben und für bis zu 238 Tage bei etwa 22°C, 37°C und 45°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Aliquots auf die Superdex-75 HR 10/30n Säule (Pharmacia) injiziert, die bei Raumtemperatur in PBS äquilibriert wurde und mit 0,5 ml/min gefahren wird. Das Elutionsmittel wird bei 214 nm verfolgt. Der Prozentsatz des Heterodimers wird aus dem Verhältnis der Fläche des Dimerpeaks dividiert durch die gesamte Fläche der Dimer- und Monomerpeaks berechnet, wie dies in Tabelle III gezeigt ist. Nach 64 Tagen verbleiben etwa 79% der uFSH Moleküle in Lösung mit m-Cresol bei 37°C als intaktes Dimer und mehr als 52% verbleiben bei 45°C als Dimer. Überraschenderweise findet nach 63 Tagen bei Raumtemperatur nur eine minimale Dissoziation des uFSH Heterodimers sowohl in den konservierten als auch in den nicht-konservierten Lösungen statt. Es ist bemerkenswert, daß bei 23°C, 37°C und 45°C sowohl in nicht-konservierten als auch in konservierten Lösungen im allgemeinen eine relativ geringe Dissoziation des uFSH Heterodimers an den Tagen 4, 8, 16, 21, 28, 29, 43, 63, 64, 126, 127, 237 und 238 stattfindet. Tabelle IX Prozent an Dimer in konservierten und nicht-konservierten uFSH Lösungen

	PBS			PBS + m-Cresol
Tage	23°C	37°C	45°C	23°C	37°C	45°C
0	96,0	96,0	96,0	93,8	93,8	93,8
4	-	93,0	91,7	-	91,8	85,6
8	94,3	92,7	89,5	93,6	88,9	80,0
16	94,1	91,1	84,3	92,5	87,0	73,8
21	94,0	91,0	83,1	-	-	-
22	-	-	-	92,3	84,7	68,8
28	92,8	89,8	-	92,7	83,7	-
29	-	-	79,9	-	-	65,3
43	93,3	89,5	75,9	91,6	81,5	59,2
63	92,9	-	-	92,6	-	-
64	-	88,2	68,6	-	78,9	52,5
126	91,5	85,5	-	89,6	71,2	-
127	-	-	58,2	-	-	43,8
237	92,3	83,1	-	91	62,0	-
238	-	-	57,9	-	-	39,2

Referenzbeispiel 10
Bioaktivitätsmessungen von uFSH Proben
HEK 293 Zellen, die stabil mit einem cAMP sensitiven β-Lactamasereportervektor (BLAM) transfiziert sind (Zlokarnik et al., 1998, Science 279: 84–88) werden mit einem humanen FSH Rezeptorexpressionsvektor transfiziert, der einen Hygromycinselektionsmarker kodiert, und für 3 Wochen in Hygromycin inkubiert. Die überlebenden Zellen werden mit 10 μg/ml FSH (Sigma) für 5 Stunden behandelt und die Population der FSH aktivierten Zellen mit der höchsten Intensität an blauer Fluoreszenz werden durch FACS identifiziert und isoliert. Diese polyklonale Population wird vermehrt, mit 10 μg/ml FSH für 5 Stunden behandelt und mittels FACS in einzelne Zellklone sortiert. Zwei klonale Zellinien werden durch den BLAM Mikrotiterplattentest analysiert und zeigen eine sechs- bis achtfache Erhöhung des Blau/Grün-Verhältnisses. Die FSH-R Zellinie mit der größten Erhöhung der BLAM Expression wird als die Zellinie ausgewählt, die in den anschließenden FSH Tests verwendet wird.
Die FSH Rezeptorzellinie, die den cAMP sensitiven BLAM Reporter enthält, wird in 100 μl Wachstumsmedium (DMEM Katalognummer 11965-092, 10% FBS, 500 μg/ml Gentamicin) mit 20 000 Zellen/Vertiefung in eine mit Poly-D-Lysin beschichtete schwarzwandige Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen geimpft und bei 37°C über Nacht unter 5% CO₂ inkubiert. Das Wachstumsmedium wird durch 100 μl Testmedium (DMEM Katalognummer 11965-092, 0,5% FBS, 500 μg/ml Gentamicin) ersetzt und die Platte wird über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Das Testmedium wird ersetzt und 100 μl Testmedium, worin die angegebene Konzentration an FSH enthalten ist, wird dann zu jeder Vertiefung gegeben und die Platte wird für 5 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. 20 μl BLAM Substrat, das sich aus 6 μl 1 mM CCF2-AM in DMSO, 6 μl Pluronsäure (100 μg/ml in 0,1% Essigsäure DMSO) in 1 ml 2% PEG-400 und 10% ESS (Aurora Biosciences) wird dann zu jeder Vertiefung gegeben. Nach einer Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wird das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von Blau (395 nm Anregung/460 nm Emission) zu Grün (395 nm Anregung/530 nm Emission) mit einem Cytofluorgerät bestimmt (Perseptives Biosystems, Series 4000 Mikrotiterplattenlesegerät). Die Zunahme des Blau/Grun-Verhältnisses, das aus der Gegenwart von FSH resultiert, wird durch die Division jedes Verhältnisses durch das Blau/Grün-Verhältnis der Kontrollprobe berechnet.

Eine Lösung von FSH aus dem Urin (uFSH – Vitro Diagnostics – Human Urofollitropin) wird wie in Beispiel 9 mit 50 μg/ml in PBS hergestellt (Probe A). Ein Teil dieser Lösung wird für 10 Minuten auf 90°C erhitzt, um mehr als 99% des Heterodimers in die zwei Monomere zu dissoziieren (wie dies durch SEC Analyse gezeigt wird) und wird in diesem Test als Negativkontrolle (Probe B) verwendet. Ein weiterer Teil der FSH Lösung wird modifiziert, um etwa 3,15 mg/ml m-Cresol zu enthalten (Probe C). Die Bioaktivität dieser drei Testproben wird im FSH-R 293-Cre-BLAM Test auf zwei getrennten Platten evaluiert. Der Mittelwert der Dreifachanalysen auf jeder Platte wird in Tabelle X gezeigt. Diese Daten zeigen, daß der Test sehr reproduzierbar ausgeführt wurde. Es wird auch gezeigt, daß das dissoziierte Heterodimer die Bioaktivität verloren hat (Probe B) und daß das FSH in der Formulierung, die das m-Cresol enthält (Probe C), die volle Bioaktivität behält: Tabelle X Faktor der Blau/Grün Zunahme im FSH Rezeptorbioaktivitätstest

Testprobenkonzentration (nM)	Probe A Platte 1	Probe A Platte 2	Probe B Platte 1	Probe 13 Platte 2	Probe C Platte 1	Probe C Platte 2
0 (Kontrolle)	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
0,003	1,68	1,67	1,07	1,06	1,22	1,22
0,01	1,91	1,86	1,06	1,06	1,58	1,62
0,03	3,00	2,89	1,06	1,06	2,72	3,21
0,1	4,00	4,09	1,18	1,18	3,86	3,85
0,3	4,53	4,47	1,24	1,24	4,61	4,63
1	4,88	4,71	1,68	1,69	4,81	4,77
3	4,60	4,64	2,61	2,58	4,83	4,92

Referenzbeispiel 11
Bioaktivitätsmessungen von konservierten und nicht-konservierten uFSH Proben
Bioaktivitätsmessungen von Proben mit FSH aus dem Urin (uFSH – Vitro Diagnostics – Human Urofollitropin) werden im in vitro Bioaktivitätstest bestimmt, wie dies in Beispiel 10 beschrieben ist. Der in vitro Test führt zu zwei uFSH Proben in PBS bei 23°C, wobei das PBS mit und ohne m-Cresol bei 23°C nach 11 Monaten mit einer Kontrolle in Tabelle XI verglichen wird. Die Daten zeigen, daß konservierte und nicht-konservierte uFSH Proben in diesem Test die volle biologische Aktivität nach 11 Monaten behalten. Tabelle XI In vitro Bioaktivität von konservierter und nicht-konservierter uFSH Lösung nach 11 Monaten bei 23°C

Probe Relative Stärke

uFSH Kontrolle (50 μg/ml, PBS, frisch) 1,0

uFSH (50 μg/ml, PBS, 23°C für 11 Monate) 1,27

uFSH (50 μg/ml, PBS, 3,15 mg/ml m-Cresol, 23°C für 11 Monate) 0,86
Referenzbeispiel 12
Kartuschenkompatibilität einer konservierten und nicht-konservierten rFSH Variante
Um die Kompatibilität von formulierten rFSH Variante (α-Untereinheit SEQ ID Nr. 5, β-Untereinheit SEQ ID Nr. 11) mit Kartuschen zu testen, werden 4 ml umfassende Lösungen der wie in Tabelle 12 aufgeführten Proben am den unten angegebenen Stammlösungen hergestellt:
1,85 mg/ml rFSH Variante in PBS
1,73 mg/ml rFSH Variante in PB
20 mg/ml m-Cresol in PBS
20% Glycerin in PB
1 × PBS
Nach dem Mischen werden 1,7 ml jeder Lösung in zwei getrennte Kartuschen mit einem minimal zugelassenem Kopfraum pipettiert. Zwei Kartuschen werden für jede Probe gefüllt. Die Kappen werden auf den Kartuschen verschlossen. Die Kartuschen werden dann für 20 Tage bei 30°C inkubiert. Nach dem Füllen wird der Rest der Proben bei 40°C inkubiert, um als Kontrollproben zu dienen.

Die in vitro Aktivität der Proben wird nach 20 Tagen bei einer Inkubation bei 30°C mittels des in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Aktivität dieser Proben wird mit den entsprechenden Kontrollproben zum Zeitpunkt Null verglichen. Wie in der folgenden Tabelle XII gezeigt, sind die rFSH Probe bei 50 μg/ml in PBS und die Probe bei 200 μg/ml in PBS und 3,15 mg/ml m-Cresol in den Kartuschen stabil (Kartusche 1 und Kartusche 4). Diese Proben bleiben nach 20 Tagen Inkubation bei 30°C voll aktiv. Jedoch sind die Proben in Phosphatpuffer ohne NaCl unter diesen Bedingungen weniger wirksam. Die Aktivität der rFSH Proben in Phosphatpuffer und 1,6% Glycerin nimmt im Vergleich zu der der Kontrolle ab (Kartusche 2 und Kartusche 3). Tabelle XII In vitro Aktivität der konservierten und nicht-konservierten Proben, die bei 30°C für 20 Tage in Kartuschen inku biert wurden

Probe	Probenbedingungen	Relative Stärke
Kartusche 1	200 μg/ml rFSH Variante, 3,15 mg/ml m-Cresol, PBS, pH 7,4	1,06
Kartusche 2	200 μg/ml rFSH Variante, 1,6% Glycerin, PB, pH 7,4	0,81
Kartusche 3	50 μg/ml rFSH Variante, 1,6% Glycerin, 3,15 mg/ml m-Cresol, PB, pH 7,4	0,60
Kartusche 4	50 μg/ml rFSH Variante, PBS, pH 7,4	1,10

Wie es durch diese Beispiele gezeigt wird, kann man durch Befolgen der beschriebenen Verfahren und Techniken überraschend stabile Zusamensetzungen und Formulierungen von FSH oder einer FSH Variante herstellen. Diese Zusammensetzungen und Formulierungen führen zur Entwicklung der vorliegend beanspruchten Serienartikel.
Die Prinzipien, bevorzugten Ausführungsformen und Durchführungsarten der vorliegenden Erfindung wurden in der vorangehenden Beschreibung beschrieben. Die Erfindung, die hierin geschützt werden soll, soll jedoch nicht durch die im einzelnen beschriebenen Formen beschränkt werden, da sie als erläuternd und nicht als beschränkend gesehen werden sollen. Variationen und Veränderungen können durch den Fachmann vorgenommen werden, ohne sich vom Schutzumfang der Erfindung zu entfernen.
Beispiel 13
Formulierungsstabilität von Proben mit konservierten und nicht-konservierten FSH Varianten
Es wird eine Stammlösung der rekombinanten FSH Variante (α-Untereinheit SEQ ID Nr. 5, β-Untereinheit SEQ ID Nr. 11) mit etwa 1 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Dulbecco's, GIBCO) auf 50 μg/ml oder 20 μg/ml entweder mit PBS oder PBS, das m-Cresol enthält, unter Bildung einer m-Cresolendkonzentration von 3,15 mg/ml verdünnt. Ähnlich wird ein weiterer Satz an Proben mittels 10 mg/ml Benzylalkohol als Konservierungsstoff hergestellt. 1 ml umfassende Aliquots der konservierten und nicht konservierten Lösung werden bei 4°C, 22°C und 37°C für bis zu 3 Monate in Plastikeppendorfröhrchen inkubiert. Es werden zu verschiedenen Zeiten Aliquots auf eine Superdex 75 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) aufgespritzt, die mit PBS äquilibriert ist und bei Umgebungstemperatur mit einer Flußrate von 0,07 ml/min und einer Laufzeit von 35 Minuten gefahren wird. Die Detektion wird durch eine UV Absorption bei 214 nm über die Zeit verfolgt. Die Peakflächen werden integriert und der Prozentsatz an Heterodimer wird als Verhältnis der Fläche des Heterodimerpeaks über die Gesamtfläche der Peaks des Dimers und der Monomere berechnet.

Wie es in Tabelle XIII gezeigt ist, findet eine minimale Dissoziation des Heterodimers unter verschiedenen Lösungenbedingungen nach einer Inkubation von 3 Monaten bei Raumtemperatur oder darunter statt. Es bleiben mehr als 50% des Heterodimers nach einer Inkubation für 3 Monate bei 37°C intakt. Die Stabilität des Heterodimers ist mit der konzentrierteren Lösung höher. Tabelle XIII Heterodimerstabilität der rFSH Variante, die durch SE-HPLC verfolgt wird

Probe	%Dimer
	1 Monat				3 Monate
	4°C	22°C	37°C	4°C	22°C	37°C
20 μg/ml in PBS	100	100	88,9	100	100	77,3
20 μg/ml in PBS, 3,15 mg/ml m-Cresol	100	100	86,2	100	100	64,6
20 μg/ml in PBS, 10 mg/ml Benzylalkohol	100	100	89,1	100	100	57,1
50 μg/ml in PBS	100	100	100	100	100	81,1
50 μg/ml in PBS, 3,15 mg/ml m-Cresol	100	100	90	100	100	75,7
50 μg/ml in PBS, 10 mg/ml Benzylalkohol	100	100	87	100	100	61,0

Claims

Formulierung, die FSH oder eine FSH Variante umfaßt, welche eine alpha- oder beta-Untereinheit enthält, und ein Konservierungsstoff, welcher Benzylalkohol in einem wäßrigen Verdünnungsmittel ist, wobei die Formulierung einen pH-Wert zwischen 6,8 und 9 hat und eine mehrfach anwendbare Formulierung in einem einzelnen Gläschen mit einer Lösung für therapeutische Verwendung ist.
Formulierung nach Anspruch 1, worin das FSH oder die FSH Variante zumindest eine Verbindung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin das FSH oder die FSH Variante humanes FSH ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das FSH oder die FSH Variante durch die Verwendung von rekombinanter DNA Technologie hergestellt wird.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das FSH oder die FSH Variante in einer Konzentration von 5,0 μg/ml bis 200 μg/ml vorhanden ist.
Formulierung nach Anspruch 5, worin das FSH oder die FSH Variante in einer Konzentration von 50 μg/ml bis 200 μg/ml vorhanden ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die ferner einen physiologisch annehmbaren Puffer enthält
Formulierung nach Anspruch 7, worin der Puffer ein Phosphatpuffer mit Kochsalzlösung oder einem annehmbaren Salz ist.
Serienartikel, der ein einzelnes Gläschen mit einer Lösung, das eine Lösung an FSH oder einer FSH Variante, welche eine alpha- oder beta-Untereinheit enthält, einen Konservierungsstoff, welcher Benzylalkohol ist, und ein wäßriges Verdünnungsmittel umfaßt und ein Verpackungsmaterial, das eine Aufschrift aufweist, die anzeigt, daß die Lösung für einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger aufbewahrt werden kann, wobei die Lösung einen pH-Wert zwischen 6,8 und 9 hat und eine mehrfach anwendbare Formulierung für therapeutische Verwendung ist.
Serienartikel nach Anspruch 9, worin das FSH oder die FSH Variante zumindest eine Verbindung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus
Serienartikel nach einem der Ansprüche 9 bis 10, worin das FSH oder die FSH Variante humanes FSH ist.
Serienartikel nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das FSH oder die FSH Variante durch die Verwendung von rekombinanter DNA Technologie hergestellt wird.
Serienartikel nach einem der Ansprüche 4 bis 12, worin das FSH oder die FSH Variante in einer Konzentration von 5,0 μg/ml bis 200 μg/ml vorhanden ist.
Serienartikel nach Anspruch 13, worin das FSH oder die FSH Variante in einer Konzentration von 50 μg/ml bis 200 μg/ml vorhanden ist.
Serienartikel nach einem der Ansprüche 9 bis 14, der ferner einen physiologisch annehmbaren Puffer enthält.
Serienartikel nach Anspruch 15, worin der Puffer ein Phosphatpuffer mit Kochsalzlösung oder einem annehmbaren Salz ist.
Serienartikel nach einem der Ansprüche 9 bis 16, worin die Lösung für einen Zeitraum von 96 Stunden oder langer aufbewahrt oder verwendet werden kann.
Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Unfruchtbarkeit bei Frauen und/oder Männern.
Verwendung einer FSH Lösung mit Benzylalkohol als Konservierungsstoff zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Unfruchtbarkeit, wobei die Lösung eine mehrfach anwendbare Formulierung in einem einzelnen Gläschen mit einer Lösung ist, die für die Verabreichung über einen Zeitraum von 96 Stunden oder mehr geeignet ist und einen pH-Wert zwischen 6,8 und etwa 9 hat.