DE69825395T2

DE69825395T2 - Medikament, behandlungsmethode, prophylaktikum und prophylaxe gegen immunologische erkrankungen von hunden und katzen

Info

Publication number: DE69825395T2
Application number: DE1998625395
Authority: DE
Inventors: Fumiyoshi Nagoya-shi OKANO; Masahiro Kamakura-shi SATOH; Katsushige Nishikasugai-gun YAMADA
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2018-05-08
Also published as: AU739107B2; EP0919241A1; CA2265505C; EP0919241B1; EP0919241A4; CA2265505A1; AU7234398A; US6231850B1; WO1998051327A1; US6562334B1; DE69825395D1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Mittel und ein präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen, umfassend canines Interleukin 12 (nachstehend mit CaIL12 abgekürzt) mit der Primärstruktur seines Proteins, die sich von der caninen genetischen Information ableitet, und einem Verfahren zur Behandlung einer Immunkrankheit und ein präventives Verfahren für Hunde und Katzen, wobei das Mittel oder das präventive Mittel verwendet werden.
Technischer Hintergrund
Interleukin 12 ist ein Heterodimer, das aus einem Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kD (nachstehend mit P40 abgekürzt) und einem Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 35 kD (nachstehend mit P35 abgekürzt) besteht, es ist ein Cytokin mit einer Bioaktivität, um natürliche Killerzellen und Typ 1 T-Helferzellen (Referenzen 1 und 2) zu aktivieren, und wird mit IL12 abgekürzt.
Über IL12 wurde in der Literatur (Referenzen 3, 4 und 5) von überraschenden Behandlungseffekten bei Experimenten in Mausmodellen gegen Tumore, infektiöse Erkrankungen, Allergien und der Gleichen und besonders über seine starke Aktivität die zellvermittelte Immunantwort zu fördern berichtet und klinische Versuche mit IL12 als ein Mittel gegen humanen Krebs und humane infektiöse Erkrankungen wurden bereits begonnen.
Hunde sind bekannt dafür, dass sie unter verschiedenen Krebsarten wie Brustdrüsentumoren, verschiedenen Dermatitisarten wie einer allergischen Dermatitis, verschiedenen viralen Erkrankungen wie einer Parvovirusinfektion, Staupeninfektionserkrankungen und der Gleichen leiden. Diese Erkrankungen nehmen immer einen hohen Rang in Statistiken von Hundeerkrankungen ein. Es sind jedoch wenige Mittel und präventive Mittel derzeit erhältlich, die gegen diese Hundeerkrankungen wirksam sind. Zum Beispiel kommen die meisten Hunde, die unter Krebserkrankungen leiden, ins Krankenhaus nachdem ihre Tumore gewachsen sind, und selbst wenn die Tumore mittels einer Operation entfernt werden sterben sie bald nach der Operation auf Grund der Metastasen. Auch Hauterkrankungen, die oft bei Hunden beobachtet werden, können in den meisten Fällen nicht geheilt werden auch wenn wiederholt über lange Zeiträume Steroide als eine Behandlung verabreicht werden. Als eine Konsequenz sind schnell und kontinuierlich wirkende Mittel gefragt. Es wird erwartet, dass neue Einsatzmöglichkeiten gegen diese Hundeerkrankungen versucht werden, die jetzt ohne irgendein wirksames und präventives Mittel verbleiben. Dasselbe gilt für Katzenerkrankungen.
In dem Artikel von Virgil E. C. J. Schijns in Immunogenetics, Band 45, Nr. 6 (1997), S. 462–463 wird von der molekularen Klonierung des Katzen-Interleukin-12 berichtet.
Offenbarung der Erfindung
In diesem Fall machte der Erfinder Untersuchungen, um CaIL12-cDNA zu klonieren, um es für eine Massenherstellung zu verwenden und um eine Präparation bereitzustellen, die CaIL12 als ein Mittel oder präventives Mittel für Hunde enthält, die unter Immunerkrankungen leiden, und war erfolgreich bei der Klonierung von cDNAs, die für das P40 und P35 des CaIL12 von der caninen cDNA kodierten, und sie waren darüber hinaus bei der Herstellung von Zellen erfolgreich, die im Stande waren CaIL12 herzustellen, wobei zwei Expressionsplasmide verwendet wurden, die diese cDNAs entsprechend verbinden, und sie waren bei der Herstellung eines rekombinanten Baculovirus erfolgreich, welcher beide der Gene enthielt. Folglich hat der Erfinder ein Verfahren für eine einfache Massenherstellung von CaIL12 etabliert und herausgefunden, dass wenn eine Präparation, die CaIL12 enthält, an Hunde verabreicht wird, die an Erkrankungen leiden, welche mit konventionellen therapeutischen Verfahren schwierig zu behandeln sind, oder wenn Lymphozyten, die aus dem peripheren Blut eines kranken Hundes isoliert wurden, in vitro durch eine Präparation stimuliert wurden, die CaIL12 enthielt, und in den Körper des Hundes wieder zurückgeführt wurden, die Erkrankung überraschend außergewöhnlich verbessert werden kann. Folglich wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt. Überraschenderweise ist auch herausgefunden worden, dass die Präparation, die CaIL12 enthält, auch gegen feline Erkrankungen ein außergewöhnliches Mittel darstellt und eine außergewöhnliche präventive Wirkung zeigt.
Die Essenz der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:

(1) Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen, umfassend canines Interleukin 12 von einem Heterodimer, gebildet von einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der SEQ ID NO: 2 oder der SEQ ID NO: 14 umfasst, und eine Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der SEQ ID NO: 4 oder der SEQ ID NO: 16 umfasst.
(2) Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen, das oben unter (1) genannt ist, worin die Immunerkrankung ein Tumor, eine Dermatitis, eine infektiöse Erkrankung oder eine allergische Krankheit ist.
(3) Verwendung eines Mittels und/oder präventiven Mittels gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen, das oben unter (1) oder (2) genannt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Immunerkrankungen in Hunden und Katzen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Medikament injeziert wird.
(4) rekombinanter Baculovirus, der sowohl eine DNA-Sequenz, die identisch ist mit der Sequenz Nr: 1 oder der Sequenz Nr: 13 umfasst, als auch eine DNA-Sequenz enthält, die identisch ist mit der Sequenz Nr: 3 oder der Sequenz Nr: 15.
(5) Verfahren zur Herstellung von caninem Interleukin 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Insektenzelle oder Larve mit dem rekombinantem Baculovirus, der oben unter (4) genannt ist, infiziert wird und das canine Interleukin 12 genommen wird.

Beste Ausführungsformen der Erfindung
Es können Plasmide, zum Beispiel wie unten beschrieben, hergestellt werden, auf welchen DNAs für die zwei Untereinheiten des CaIL12-Proteins der vorliegenden Erfindung kodieren. Es können zwei Gene, die entsprechend für die zwei Untereinheiten kodieren, die eine CaIL12-Aktivität zeigen, mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (nachstehend abgekürzt mit PCR für Englisch: polymerase chain reaction) von cDNAs, die nach der Extraktion von Poly(A)-RNA aus caninen Zellen synthetisiert wurden, unter Verwendung von Primern kloniert werden, die auf den Gensequenzen basieren, welche jeweils für die zwei Untereinheiten von bovinem oder humanem IL12 kodieren. Ebenso kann durch ein anderes Verfahren die Gesamtlänge der CaIL12-P40- cDNA und CaIL12-P35-cDNA mittels Plaquehybridisierung einer Phagenbibliothek kloniert werden, die mit zwei cDNA-Fragmenten, welche über PCR erhalten wurden von einer synthetisierten cDNA-Rekombinanten hergestellt wurde.
Um RNA aus einem caninen Organ oder caninen Zellen, zum Beispiel canine Monocyten oder Lymphocyten, die mit einem Mitogen, etc. stimuliert wurden, zu erhalten, können die üblichen Verfahren verwendet werden, wie die Isolierung von Polysomen oder die Verwendung einer Rohrzucker-Dichtegradientenzentrifugation oder Elektrophorese. Die RNA kann aus dem besagten caninen Organ oder den besagten Zellen durch jedes angemessene Verfahren extrahiert werden, ausgewählt aus dem Guanidinthiocyanatcäsiumchloridverfahren, um eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation nach einer Guanidinthiocyanatbehandlung (Referenz 3) durchzuführen, einer Phenolextraktion nach einer Behandlung mit einem oberflächenaktiven Stoff in der Anwesenheit eines Ribonukleseinhibitors unter Verwendung eines Vanadiumkompositen (Referenz 4), dem Guanidinthiocyanat-heißem Phenol-Verfahren, dem Guanidinthiocyanat-Guanidin-Salzsäure-Verfahren, dem Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren, der Präzipitation von RNA durch die Behandlung mit Lithiumchlorid nach einer Behandlung mit Guanidinthiocyanat, etc.
Aus einem caninen Organ oder caninen Monocyten oder Lymphocyten, die mit einem Mitogen, etc., stimuliert wurden, wird die mRNA durch irgendein gewöhnliches Verfahren wie dem Lithiumchlorid-Urea-Verfahren, dem Guanidinisocyanatverfahren oder dem Oligo-dT-Cellulosesäulenverfahren, etc. isoliert und von der erhaltenen mRNA eine cDNA durch irgendein gewöhnliches Verfahren synthetisiert wie dem Verfahren von Gubler et al (Referenz 5) oder H. Okayama et al (Referenz 6), etc. Für die Synthetisierung einer cDNA von der erhaltenen mRNA wird im Wesentlichen eine reverse Transkriptase wie die des Vogel-Myeloblastosevirus (AMV für Englisch: avian myeloblastosis virus) verwendet, wenn nötig in Kombination mit einer DNA-Polymerase, etc. verwendet, wobei ein Primer verwendet wird. Es ist jedoch angenehm einen vertriebenen Synthetisierungs- oder Klonierungskit zu verwenden.
Wenn die PCR mit cDNAs als Vorlagen unter Verwendung eines Primers durchgeführt wird, der auf einer humanen, Maus- oder Rinderbasissequenz basiert, können cDNAs, die für die P40- und die P35-Untereinheit kodieren, welche eine CaIL12-Aktivität aufweisen, kloniert werden. In einem weiteren Verfahren werden die synthetisierten cDNAs in λ-Phagenvektoren ligiert und in vitro zur Verpackung mit einem λ-Phagenmantelprotein vermischt, etc. Mit den hergestellten Phagenpartikel werden Escherichia coli infiziert, der als ein Wirt dient. In diesem Fall werden die Escherichia coli, die mit einem λ-Phagen infiziert sind, bakteriolysiert und individuelle Klone werden als Plaques gesammelt. Die Plaques werden auf einen Nitrozellulosefilter transferiert, etc. und durch die Hybridisierung unter Verwendung der radiomarkierten Gene als Sonde, die mittels PCR erhalten wurde, konnte die Gesamtlängen-CaIL12 P40- und -CaIL12 P35-cDNA kloniert werden.
Als ein Wirt kann ein Prokaryot oder Eukaryot verwendet werden. Die Prokaryoten, die hier verwendet werden können, schließen Bakterien, insbesondere Escherichia coli und Bacillus wie Bacillus subtilis ein. Die Eukaryoten, die hier verwendet werden können, schließen eukaryotische Mikroben wie Hefen, zum Beispiel Saccharomyces wie Saccharomyces cerevisiae, Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda-Zellen, Trichoplusiani-Zellen und Bombyx mori-Zellen und tierische Zellen wie humane Zellen, simiane Zellen und Mauszellen ein. In der vorliegenden Erfindung können auch die Organismen selbst, zum Beispiel Insekten wie Trichoplusiani, verwendet werden.
Die Expressionsvektoren, die hier verwendet werden können, schießen Plasmide, Phagen, Phagemide, Viren (Baculovirus) (Insekten), Vaccinia (tierische Zellen), etc. ein. Der Promotor in dem Expressionsvektor wird abhängig von den Wirtszellen ausgewählt. Zum Beispiel schließen Promotoren für Bakterien den lac-Promotor, den trp-Promotor, etc. und Promotoren für Hefen schließen den adh1-Promotor, den pqk-Promotor, etc. ein. Die Promotoren für Insektenzellen schließen den Baculovirus Polyhedrinpromotor, den p10-Promotor, etc. ein. Promotoren für tierische Zellen schließen den frühen (early) oder späten (late) Promotor des Simian Virus 40, etc. ein. Die Promotoren, die verwendet werden können, sind jedoch nicht auf die oben genannten beschränkt.
Die Transformation eines Wirts mit einem Expressionsvektor kann durch irgendeines der konventionellen Verfahren durchgeführt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, und diese Verfahren sind zum Beispiel in den Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons erklärt. Die Kultivierung der Transformanten kann auch entsprechend der konventionellen Verfahren durchgeführt werden.
Das hergestellte CaIL12 hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 70 bis 80 kD, wenn es unter nicht-reduzierenden Bedingungen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt wird.
Die 70~80 kD-Bande in dem SDS-PAGE produziert unter reduzierenden Bedingungen zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kD und etwa 35 kD.
CaIL12 ist, wie in dem unten genannten Beispiel 2 gezeigt, hauptsächlich durch die Fähigkeit in vitro canines Interferon γ (nachstehend mit IFNγ abgekürzt) in caninen Leukozyten zu induzieren und die Wirkung gekennzeichnet, die Proliferation von caninen Lymphocyten, die mit verschiedenen Mitogenen wie Phytohämagglutinin (nachstehend mit PHA abgekürzt) stimuliert werden, zu fördern. Es hat auch eine Aktivität NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen zu aktivieren, ihre Zielzellen zu töten, zum Beispiel die Zelllinie, die von einem Tumor oder von Fibroblasten, infiziert mit einem Virus, stammt.
Das Verfahren zur Isolation und Aufreinigung von CaIL12, das mit einer rekombinanten DNA-Technik hergestellt wurde, ist nicht beschränkt. Es kann ein konventionelles Aufreinigungsverfahren für Proteine verwendet werden. Zum Beispiel kann, beruhend auf der Aktivität canines INFγ zu induzieren, die Aufreinigung und Isolation durchgeführt werden, indem eine Chromatography, wobei ein Ionenaustauscherträger, Farbträger, Gelfiltrationsträger, Silicagelträger, Chelatträger und der Gleichen verwendet wird, mit einer Entsalzung und Konzentration durch Ultrazentrifugation, Gelfiltration, Dialyse, Aussalzung und der Gleichen kombiniert wird.
Das Mittel und präventive Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen der vorliegenden Erfindung zeigt einen überraschend außergewöhnlichen Behandlungs- und präventiven Effekt gegen verschiedene Immunerkrankungen von Hunden und Katzen, wie Erkrankungen, bei denen die immunologische Kompetenz abnimmt, wie Tumore, Dermatitis, allergische und infektiöse Erkrankungen, und Erkrankungen, die eine partielle Immunreaktion aufweisen, die hauptsächlich auf einer flüssig-humoralen Antwort als auf einer zellulären Immunantwort beruht, verglichen mit konventionellen Mitteln, Prophylaktikas, Behandlungsverfahren und präventiven Verfahren gegen diese caninen Erkrankungen.
In der vorliegenden Erfindung schließen die Tumore von Hunden und Katzen einen Brustdrüsentumor, eosinophiles Granulom, Epidermoid, Ekphyma, Lipom, Othämatom, pulmonales Ödem, dermalen kauleszenten weichen Tumor, Analtumor, etc. ein. Die Dermatitis von Hunden und Katzen schließt eine externe Entzündung des Gehörgangs, Dermatitis, Ekzem, Dermatomykose, Pyodermie, allergische Dermatitis, Urtikation, traumatische Dermatitis und Alopezie ein. Die infektiösen Erkrankungen von Hunden und Katzen schließen eine Infektion mit dem caninen Parvovirus, eine Staupeninfektionserkrankung, felines AIDS und feline Leukämie etc. ein. Die allgerischen Erkrankungen schließen canine und felline Pollinose ein.
Das Mittel und präventive Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen kann auch andere beliebige Ingredienzien zusätzlich zu CaIL12 enthalten. Die Ingredienzien, die zu diesen Arzneimitteln zugegeben werden, werden hauptsächlich in Bezug auf den Verabreichungsweg des Arzneimittels bestimmt. Wenn das Arzneimittel als ein Feststoff verwendet wird kann ein Füllstoff wie Lactose, ein Bindemittel wie Carboxylmethylcellulose oder Gelatine, ein Farbmittel und ein Beschichtungsmittel/Überzug, etc. verwendet werden und eine solche Formulierung ist für die orale Verabreichung geeignet. Darüber hinaus können weiße Vaseline, Cellulosederivate, oberflächenaktive Stoffe, Polyethylenglycol, Silikon oder Olivenöl, etc. als ein Feststoff oder Aktivator zugeben werden, um eine Creme, eine Emulsion oder Lotion, etc. für die Anwendung als ein externes Arzneimittel auf einen erkrankten Teil herzustellen. Ferner kann das Arzneimittel, wenn es als eine Flüssigkeit verabreicht wird, ein physiologisch zulässiges Lösungsmittel, einen Emulgator und Stabilisator wie es gewöhnlich praktiziert wird enthalten. Das Lösungsmittel kann Wasser oder eine isotonische physiologische Salzlösung wie PBS sein und der Emulgator kann ein oberflächenaktiver Stoff auf Polyoxyethylenbasis, ein oberflächenaktiver Stoff auf Fettsäurebasis oder Silikon sein. Der Stabilisator kann canines Serumalbumin, ein Polyol wie Gelatine oder ein Saccharid wie Sorbitol oder Trehalose, etc. sein. Das Verfahren zur Verabreichung des Mittels und präventiven Mittels der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt, es wird aber erwartet, dass eine Injektion den höchsten Behandlungseffekt erzielt. Das Injektionsverfahren ist nicht auf eine intravenöse, intramuskuläre, hypodermale, intraperitoneale oder intrapleurale Injektion limitiert. Die Dosis wird in Bezug auf die Größe des Feststoffs, das Verabreichungsverfahren, die betreffende Erkrankung, das Symptom, etc. bestimmt und es kann eine Menge verabreicht werden, die ausreicht einen Behandlungs- und präventiven Effekt zu manifestieren. Zum Beispiel kann die Verabreichung von CaIL12 von 0,1 pg bis 100 μg/kg pro Tag einen ausreichenden Effekt bereitstellen.
Im Falle einer adoptiven Immuntherapie kann ein ausreichender Effekt erhalten werden, wenn Lymphocyten, die aus 1 bis 100 ml caninem oder felinem Blut isoliert wurden, für 12 Stunden bis 6 Tage mit 0,001 pg bis 1 μg CaIL12 stimuliert und in den den Körper zurückgeführt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unten mit Bezug auf Beispiele konkreter beschrieben, sie ist aber dadurch oder darauf nicht beschränkt.
Beispiel 1
Klonierung der CaIL12 P40- und P35-Gene
(1) Herstellung von caniner cDNA
Es wurden unter Verwendung von ISOGEN (hergestellt von Nippon Gene) Gesamt-RNAs aus einer caninen Leber extrahiert, Monocyten aus caninem perphärem Blut mit LPS (50 μg/ml) für 48 Stunden stimuliert und Lymphocyten, die aus einer caninen Milz stammen, für 7 Stunden mit dem Avian Newcastle Disease Virus behandelt (10⁷ pfu/ml). Jede der erhaltenen RNAs wurde in 10 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5) (nachstehend mit TE abgekürzt) gelöst, der 1 mM EDTA enthielt, und die Lösung für 5 Minuten auf 70°C erhitzt. Dann wurde dieselbe Menge TE, die 1 M LiCl enthielt, zugegeben. Die RNA-Lösung wurde auf eine Oligo-dT-Cellulosesäule aufgetragen, die mit TE äqulibriert worden war, das 0,5 M LiCl enthielt, und mit demselben Puffer gewaschen. Ferner wurde sie mit TE gewaschen, das 0,3 M LiCl enthielt, und die absorbierte Poly(A)-RNA mit 2 mM EDTA (pH 7,0), das 0,01% SDS enthielt, eluiert. Die Poly(A)-RNA, welche auf diese Weise erhalten wurde, wurde verwendet, um eine einzelsträngige cDNA zu synthetisieren. Das heisst, es wurden 5 μg der Poly(A)-RNA und 0,5 μg eines Oligo-dT-Primers (12–18 mer) in ein sterilisiertes 0,5 ml Microfugetube gegeben und Diethylpyrocarbonat-behandeltes, sterilisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 12 μl zu ergeben. Die Mischung wurde für 10 min bei 70°C inkubiert und für 1 Minute in Eis eingetaucht. Zu der Mischung wurden 200 mM Tris-Salzsäure (pH 8,4), 2 μl 500 mM KCl-Lösung, 2 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl von jedem 10 mM dNTP und 2 μl 0,1 M DTT zugegeben und die Mischung für 5 Minuten bei 42°C inkubiert. Dann wurde 1 μl von einer 200-Unit SuperScript II RT, hergestellt von GibcoBRL, zugegeben und die Mischung für die cDNA-Synthesereaktion für 50 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde ferner für 15 Mintuten bei 70°C inkubiert und nachdem die Reaktion beendet war, wurde die Reaktionslösung für 5 Minuten auf Eis gegeben. Zu der Reaktionslösung wurde 1 μl E. coli RNaseH (2 Units/ml) zugegeben und die Mischung für 20 Minuten bei 37°C inkubiert.
(2) Herstellung einer caninen cDNA-Phagenbibliothek
Es wird jeweils 1 μg von jeder der oben (1) erhaltenen Poly(A)-RNA verwendet um eine doppelsträngige cDNA zu synthetisieren, wobei ein Oligo-dT-Primer des TimeSaver cDNA-Synthese-Kits, hergestellt von Pharmacia, entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet wurde, und ferner wurde ein EcoRI/NotI-Adaptor ligiert. Diese und das cDNA-Rapid-Cloning-Modul λgt10, hergestellt von Amasham, wurden entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet, um einen rekombinanten λgt10-Vektor herzustellen und außerdem wurde ein In-Vitro-Packaging-Modul, hergestellt von Amasham, entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet, um einen rekombinanten Phagen zu produzieren.
(3) Klonierung der CaIL12-P40-cDNA
Es wurden die folgenden zwei Primer:
5'-ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTT-3' (Sequenz Nummer 5) und 5'-CTAACTGCAGGGCACAGATGCCCA-3'(Sequenz Nummer 6) mittels eines DNA-Synthesizers basierend auf den Basensequenzen des humanen IL12-P40 synthetisiert (Referenz 1). Von denen in (1) oben aus einer caninen Leber erhaltenen cDNAs und dem LPS-stimulierten caninen periphären Blut wurden jeweils 2 μl in verschiedene 0,5 ml Microfugetubes gegeben und die jeweiligen Reagenzien zugegeben, um 20 pmol von jedem der Primer, 20 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 8,0), 1,5 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 100 μm/ml Gelatine, 50 μM von jedem dNTP und 4-Units Taq-DNA-Polymerase zu enthalten und um ein Gesamtvolumen von 100 μl in jedem Tube zu erhalten. Die Reaktion wurde in einem DNA-Thermal-Cycler, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus, 35 Amplifikationscyclen unterworfen. Das Amplifikationscyclusprofil war eine Denaturation bei 94°C für 1 Minute, ein Primerannealing bei 55°C für 2 Minuten und eine Primerextension bei 72°C für 3 Minuten. Das PCR-Produkt wurde mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und ein etwa 990 bp langes DNA-Fragment entsprechend einem konventionellen Verfahren hergestellt (Referenz 7).
Das DNA-Fragment wurde in einen T-Vektor, der von Invitrogen hergestellt wurde, unter Verwendung eines DNA-Ligationsskits Ver. 1, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. ligiert. Dieser wurde verwendet um E. coli entsprechend einem konventionellem Verfahren zu transformieren und aus dem erhaltenen Transformant wurde eine Plasmid-DNA entsprechend einem konventionellem Verfahren hergestellt. Es wurde mittels PCR unter denselben Bedingungen wie zuvor erwähnt bestätigt, dass das Plasmid ein PCR-Fragment inseriert hatte, und es wurde die Basensequenz der P40-Untereinheit-cDNA der zwei Untereinheiten, von denen angenommen wird, dass sie eine CaIL12-Aktivität aufweisen, mittels des Dyedeoxyverfahrens (Referenz 9) bestimmt, wobei das Genesis 2000 DNA Analysesystem (hergestellt von Du Pont) verwendet wurde. Die Sequenz ist als Sequenz Nummer 1 angegeben.
Es wurde ein 990 bp DNA-Fragment, das diese Sequenz enthielt, mit ³²P unter Verwendung des Random Primer DNA-Markierungskits, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., verwendet um eine Sonde herzustellen. Die rekombinante Phagenbibliothek, die aus der oben (2) erhaltenen caninen Leber-cDNA hergestellt wurde, bildete auf E. coli NM514 einen Plaque und wurde auf Hybond-N⁺, hergestellt von Amersham, entsprechend einem konventionellem Verfahren, transferiert. Das Hybond-N⁺ wurde bei 65°C für 2 Stunden in 5 × SSPE (0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 5 mM EDTA, pH 7,4), 5 × Denhault's-Lösung (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% bovinem Serumalbumin) 0,1% SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA inkubiert und mit 1 × 10⁶ cpm/ml der markierten Sonde, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, hybridisiert. Nach einer Übernachtinkubation bei 65°C wurde das Hybond-N⁺ für 15 Minuten 3 mal in 0,2 × SSC (30 mM NaCL, 3 mM Natriumcitrat), 0,1% SDS gewaschen und zu einer Fuji Imaging Platte, hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd., für 12 Stunden exponiert, welche mittels des Bioimaging Analyzers, hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd., analysiert wurde. Die Plaques mit einem positiven Signal wurden entsprechend einem konventionellem Verfahren nochmals gescreent. Als eine Ergebnis des dreimaligen Screenens wurde ein rekombinanter Phage mit einem positiven Signal erhalten. Aus dem rekombinanten Phagen wurde die Phagen-DNA entsprechend einem konventionellem Verfahren extrahiert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten. Durch eine Gelelektrophorese auf einem 1% Agarosegel wurde ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 1,5 kb erhalten und in pUC118 BAP-behandelte DNA (EcoRI/BAP) ligiert, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., wobei ein DNA-Ligationskits Ver. 2, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd, verwendet wurde. Unter Verwendung dieses wurde eine Plasmid-DNA entsprechend einem konventionellem Verfahren hergestellt und die Basensequenz des erhaltenen DNA-Fragments unter Verwendung eines Fluoreszenz-DNA-Sequenzierers (DNA Sequenzer 373S, hergestellt von Perkin-Elmer) und des Dye Termination Cycle Sequencing Kits, hergestellt von Perkin-Elmer, entsprechend den Angaben des Herstellers bestimmt. Von der Sequenz ist die die Sequenz, die für die CaIL12-P40-cDNA kodiert als Sequenz Nummer 13 gezeigt.
(4) Klonierung der CaIL12-P35-cDNA
Es wurden die folgenden zwei Primer:
5'-AGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTCGCTACCCTG-3' (Sequenz Nummer 7) und
5'-CTAGGAAGAACTCAGATAGCTCATCATTCTGTCGATGGT-3' (Sequenz Nummer 8) mittels eines DNA-Synthesizers basierend auf den Basensequenzen des humanen IL12-P35 (Referenz 1) und des bovinen IL12-P35 synthetisiert. Es wurde ein etwa 670 pb langes DNA-Fragement wie oben unter (3) beschrieben erhalten, wobei die cDNA, die oben unter (1) aus den Lymphocyten erhalten wurde, welche aus einer caninen Milz, behandelt mit dem Avian Newcastle Disease Virus, stammen, als eine Vorlage verwendet wurde, in den T-Vektor inseriert wurde und die Basensequenz der P35-Untereinheit-cDNA der zwei Untereinheiten, von denen angenommen wird, dass sie eine CaIL12-Aktivität aufweisen, bestimmt. Die Sequenz ist als Sequenz Nummer 3 gezeigt. Darüber hinaus wurde ein etwa 670 bp langes DNA-Fragement, das diese Sequenz enthielt, verwendet, um eine radiomarkierte Sonde herzustellen. Die rekombinante Phagenbibliothek, hergestellt von der cDNA, die aus den Lymphocyten, welche aus einer caninen Milz stammen, behandelt mit dem Avian Newcastle Disease Virus oben unter (2) erhalten wurde, wurde wie oben unter (3) beschrieben mit der markierten Sonde hybridisiert und das Hybrid gescreent. Von einem rekombinantem Phagen mit einem positiven Signal, der als ein Ergebnis erhalten wurde, wurde die DNA extrahiert, mit dem Restriktionsenzym NotI geschnitten, mittels Gelelektrophorese auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und ein etwa 1,2 kb DNA-Fragment erhalten. Es wurde in die NotI-Stelle von pBluescriptII, hergestellt von STRATAGENE, entsprechend einem konventionellem Verfahren ligiert. Dies wurde verwendet um eine Plasmid-DNA herzustellen und die Basensequenz des erhaltenen DNA-Fragments wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-DNA-Sequenzierers bestimmt. Von der Sequenz ist die Sequenz, die für die CaIL12-P35-cDNA kodiert, als Sequenz Nummer 15 gezeigt.
Beispiel 2
Herstellung von CaIL12
(1) Herstellung eines CaIL12-Expressionvektors
Der Expressionsvektor pCDL-SRα296 (Referenz 9) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und die Enden mit einer alkalischen Phosphatase, die aus einem Bakterium stammt, dephosphoryliert. Durch eine Gelelektrophorese des verdauten und dephosphorylierten Vektors auf einem 1% Agarosegel wurde ein etwa 3,6 kb DNA-Fragment entsprechend einem konventionellem Verfahren hergestellt. Auf der anderen Seite wurde wie das CaIL12-P40-Fragment ein etwa 990 pb langes DNA-Fragment hergestellt, indem die folgenden zwei Primer mit der angehängten EcoRI-Schnittregion hergestellt wurden:
5'-GGGGAATTCATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGG-3' (Sequenz Nummer 9) und
5'-CCCGAATTCCTAACTGCAGGGCACAGATGCCCAGTCGCT-3'(Sequenz Nummer 10),
eine PCR mit 30 Cyclen durchgeführt wird, wobei die P40-Untereinheit DNA der zwei Untereinheiten, von denen angenommen wird, dass sie eine CaIL12-Aktivität aufweisen, die, inseriert in den T-Vektor, hergestellt in Beispiel 1 (2), als eine Vorlage verwendet wird, die DNA bei 94°C für 1 Minute denaturiert wird, die Primer bei 55°C für 2 Minuten annealed werden und die Primerextension bei 72°C für 3 Minuten erfolgt, eine Ethanolpräzipitation, ein Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI und eine Gelelektrophorese auf einem 1% Agarosegel durchgeführt wird. Darüber hinaus wurde ein etwa 990 pb langes DNA-Fragment hergestellt, indem die folgenden zwei Primer mit der angehängten EcoRI-Schnittregion hergestellt wurden:
5'-GGGGAATTCATGCATCCTCAGCAGTTGGTCATCTCCTGG-3' (Sequenz Nummer 17) und
5'-CCCGAATTCCTAACTGCAGGACACAGATGCCCAGTCGCT-3' (Sequenz Nummer 18)
eine PCR unter Verwendung der CaIL12-P40-cDNA, welche in pUC118, hergestellt in Beispiel 1 (2), inseriert wurde, als eine Vorlage durchgeführt wird und mit EcoRI geschnitten wird. Die jeweils erhaltenen CaIL12-P40-cDNA-Fragmente wurden mit dem pCDL-SRα296, der wie oben beschrieben hergestellt wurde, unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase verbunden. Dieses wurde verwendet, um E. coli zu transformieren und aus den erhaltenen Transformanten eine Plasmid-DNA herzustellen, um FO CaIL12 P40 und FO CaIL12 P40FL zu erhalten, die CaIL12 P40 exprimieren.
Darüber hinaus wurde pCDL-SRα296 mit dem Restriktionsenzym PstI geschnitten, dephosphoryliert und eine Gelelektrophorese durchgeführt, um ein etwa 3,6 kb DNA-Fragment herzustellen. Wie bei dem CaIL12-P35-DNA-Fragment wurde ein etwa 670 pb langes DNA-Fragment erhalten, indem die folgenden zwei Primer mit der anghängten PstI-Schnittregion hergestellt wurden:
5'-GGGCTGCAGATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTC-3' (Sequenz Nummer 11) und
5'-GGGCTGCAGCTAGGAAGAACTCAGATAGCTCATCATTCT-3' (Sequenz Nummer 12)
eine PCR mit 30 Cyclen bei 94°C für 1 Minute, bei 55°C für 2 Minuten und bei 72°C für 3 Minuten erfolgt, wobei die P35-Untereinheit DNA der zwei Untereinheiten, von denen angenommen wird, dass sie eine CaIL12-Aktivität aufweisen, inseriert in den T-Vektor, hergestellt in Beispiel 1 (3), als eine Vorlage verwendet wird, eine Ethanolpräzipitation, ein Verdau mit dem Restriktionsenzym PstI und eine Gelelektrophorese auf einem 1% Agarosegel durchgeführt wird. Darüber hinaus wurde ein etwa 670 pb langes DNA-Fragment hergestellt, indem die folgenden zwei Primer mit der angehängten PstI-Schnittregion hergestellt wurden:
5'-GGGCTGCAGATGTGCCCGCCGCGCGGCCTCCTCCTTGTG-3' (Sequenz Nummer 19) und
5'-GGGCTGCAGTTAGGAAGAATTCAGATAACTCATCATTCT-3' (Sequenz Nummer 20)
eine PCR unter Verwendung der CaIL12-P35-cDNA, welche in pUC118, hergestellt in Beispiel 1 (2), inseriert wurde, als eine Vorlage durchgeführt wird und indem mit PstI geschnitten wird. Die jeweilig erhaltenen CaIL12-P35-cDNA-Fragmente wurden mit dem pCDL-SRα296, der durch den Verdau mit PstI hergestellt wurde, unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase verbunden, um E. coli zu transformieren, und eine Plasmid-DNA wie oben beschrieben herzustellen, um FO CaIL12 P35 und FO CaIL12 P35FL zu erhalten, die CaIL12 P35 exprimieren.
Die Basensequenz der CaIL12-P40-DNA und der CaIL12-P35-DNA in diesen vier hergestellten Expressionsplasmiden wurde bestätigt.
(2) Herstellung von CaIL12 durch COS-1-Zellen
Es wurden jeweils 5 Mikrogramm von FO CaIL12 P40 und FO CaIL12 P35, erhalten oben unter (1), zu 4 ml ERDF-Medium (hergestellt von Kyokuto Seiyaku K. K.) zugegeben, das 50 mM Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,5), 400 μg/ml DEAE-Dextran (hergestellt von Pharmacia) und 100 μM Chloroquin (hergestellt von Sigma) enthielt. Auf der anderen Seite wurden die COS-1-Zellen (ATCC CRL-1650), welche in 10% fötalem Rinderserum (hergestellt von Gibco, nachstehend mit FBS abgekürzt für Englisch: fetal bovine serum) unter Verwendung eines Kulturgefäßes mit 10 cm Durchmesser kultiviert, bis das Wachstum 50% konfluent war kultiviert, einmal mit PBS gewaschen und 4 ml der oben erhaltenen DNA-Mischung zugegeben. Die Mischung wurde in 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Vier Stunden später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 20 ml ERDF-Medium bei 37°C in einer humidifizierten CO₂-Atmosphäre für 4 Tage kultiviert, um einen kultivierten Überstand zu erhalten, der das produzierte CaIL12 enthielt.
(3) Herstellung eines rekombinanten Baculovirus, der im Stande ist CaIL12 herzustellen
Mit den von den Restriktionsenzymen XbaI und SmaI geschnitten Regionen downstream von dem Promotor des Baculovirus-Transfervektors pAcAB3 (hergestellt von Pharmingen) wurden die p40- beziehungsweise die p35-Untereinheit-cDNAs entsprechend einem konventionellem Verfahren verbunden, um einen rekombinanten Transfervektor zu erhalten. Darüber hinaus wurde ein rekombinanter Baculovirus unter Verwendung des Baculovirus Transfection Kits von Pharmingen entsprechend dem beiliegenden Handbuch hergestellt.
(4) Herstellung von CaIL12 mittels Insektenzellen
Mit dem oben unter (3) erhaltenen rekombinanten Baculovirus wurden Sf21-Zellen (abgeleitet von Spondoptera fragcruda, erhalten von Pharmingen) infiziert, die in einer 75 cm²-Flasche in BaculoGold^TM proteinfreiem Insektenmedium, hergestellt von Pharmingen, plattenkultiviert wurden, und die infizierten Zellen wurden für 4 Tage kultiviert, um einen kultivierten Überstand zu erhalten, der das produzierte CaIL12 enthielt.
(5) Aktivitätsmessung von CaIL12
Die Aktivitäten des oben unter (2) und (4) hergestellten CaIL12 wurde wie unten beschrieben gemessen. Um die Aktivität zu testen, canines INFγ in caninen Lymphocyten zu induzieren, wurde die antivirale Aktivität und die Aktivität die Klasse-II-MHC-Expression von caninen Zellen zu intensivieren gemessen.
Es wurden aus einer caninen Milz Lymphocyten isoliert und in 10% FBS-ERDF mit einer Zelldichte von 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Es wurden 2,5 ml davon und 250U humanes IL2 (hergestellt von Genzyme) zu einem 6 cm Kulturgefäß zugegeben, und 2,5 ml des oben unter (2) erhaltenen kultivierten Überstands und 250U humanes IL2 (hergestellt von Genzyme) dazu zugegeben. Die Mischung wurde in 5% CO₂ bei 37° für 2 Tage kultiviert und die antivirale Aktivität des kultivierten Überstands entsprechend dem CPE-Verfahren aus Referenz 10 gemessen, wobei ein Vesicular Stomatitis Virus als ein Virus und MDCK (ATCC CCL-34) als sensitive Zellen verwendet wurden. Als ein Ergebnis wurde die antivirale Aktivität von mehr als 2 × 10⁵ Verdünnungsunits/ml bestätigt. Die antivirale Aktivität des oben unter (4) erhaltenen kultivierten Überstands wurde ebenfalls in Übereinstimmung mit demselben, oben erwähnten Verfahren bestimmt, um eine antivirale Aktivität von mehr als 10⁷ Verdünnungsunits/ml zu finden. Auf der anderen Seite zeigte ein Zellkulturüberstand, der durch die Transfektion von 10 μg pCDL-SRα296 in COS-1-Zellen wie oben unter (2) als eine Kontrolle erhalten wurde, und eine für 3 Tage kultivierte Sf21-Zelle nicht die Fähigkeit die antivirale Aktivität zu induzieren.
Es wurde der Zellstamm FCBR1, abgeleitet von einem caninen Brustdrüsentumorgewebe, welcher den Klasse-II-MHC exprimiert, verwendet, um die Klasse-II-MHC-Expression-intensivierende Aktivität von jeder der oben genannten Kulturen zu messen. In ein 6 cm Kulturgefäß wurden 10⁵ FCBR1-Zellen angesetzt und 5 ml von jeder der oben genannten Kulturen dazugegeben und über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und in einem 1,5 ml Micofugetube zentrifugiert. Dazu wurden 10 μl eines Ratten anti-caniner-Klasse-II-MHC monoklonalen Antikörpers (hergestellt von Stratagene) zugegeben und des Weiteren wurde die Mischung in 50 μl 10% FBS-ERDF suspendiert. Die Suspension wurde für 1 Stunde auf Eis inkubiert. Sie wurde mit PBS gewaschen, in 5 μl FITC-markierten Kaninchen anti-Ratten monoklonalen Antikörper (hergestellt von Serotec) und 50 μl 10% FBS-ERDF suspendiert und die Suspension wurde für 1 Stunde auf Eis inkubiert. Sie wurde mit PBS gewaschen und mittels einem FACScan, hergestellt von Becton Dickinson K. K., analysiert. Als ein Ergebnis erhöhte das von COS-1 und Sf21 produzierte CaIL12 die Expression des Klasse-II-MHC auf FCBR1 um etwa 20% beziehungsweise 60%. Demnach wurde herausgefunden, dass CaIL12 eine Aktivität besitzt auf canine Lymphocyten zu wirken, um canines IFNγ zu induzieren.
Es wurde die Aktivität gemessen, die Proliferation von caninen Lymphoblasten zu fördern. Es wurden aus caninem periphärem Blut Lymphocyten isoliert und in 10% FBS-ERDF mit einer Zellsichte von 10⁶ Zellen/ml suspendiert und davon 5 ml in ein 6 ml Kulturgefäß gegeben. Dazu wurde PHA mit einer Konzentration von 5 μg/ml zugegeben und die Mischung in 5% CO₂ bei 37°C für 3 Tage kultiviert, um die Lymphocyten blastogen zu machen. Die Lymphoblasten wurden in 10% FBS-ERDF mit einer Zelldichte von 10⁶ Zellen/ml suspendiert und in jedes Loch einer 96-Lochplatte 50 μl der Suspension gegeben. Dazu wurden 50 μl pro Loch des kultivierten Überstands, der oben unter (2) erhalten wurde, zugegeben. Sie wurden in 5% CO₂ bei 37°C für 3 Tage kultiviert und die Aktivität von CaIL12 die Proliferation von Lymphoblasten zu fördern gemäß dem MTT-Assay-Verfahren aus Referenz 11 gemessen. Das heißt es wurden 10 μl einer 5 mg/ml MTT (hergestellt von Sigma)-Lösung in jedes Loch zugegeben und die Mischung für weitere 6 Stunden kultiviert. Es wurden 150 μl einer 0,01 N Isopropanolhydrochloridlösung zugegeben und die Zellen mit Utraschall aufgebrochen. Es wurde die Absorbtion bei einer Wellenlänge von 595 nm mittels eines Micro-Plate Readers (Model 13550, hergestellt von BIO-RAD) gemessen. Als eine Ergebnis war die durchschnittliche Absorbtion der Kontrolle 0,69, während die durchschnittliche Absorbtion des CaIL12, hergestellt von COS-1, 1,52 war, was zeigt, dass die Aktivität die Proliferation von Lymphoblasten zu fördern um den Faktor 2 erhöht war.
Im Weiteren wurde der Antitumoreffekt von CaIL12 gegen canine Tumoren untersucht. Es wurden aus caninem periphären Blut Lymphocyten isoliert und in 10% FBS-ERDF mit einer Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert und davon wurden 5 ml in ein 6 cm Kulturgefäß gegeben. Dazu wurden 500U rekombinantes humanes IL2, hergestellt von Boehringer-Manheim K. K zugegeben, und die Mischung wurde in 5% CO₂ bei 37°C für 3 Tage kultivert. Auf der anderen Seite wurden die caninen Tumorzelllinien FCBR1 und A72 (ATCC CRL-1542) jeweils in 10% FBS-ERDF mit einer Zelldichte von 10⁵ Zellen/ml suspendiert und jeweils 50 μl der Suspensionen in ein Loch einer 96-Lochplatte zur Adhäsion an die Platte gegeben. Dazu wurden 50 μl canine Lymphocyten, stimuliert mit humanem IL2, zugegeben und im Weiteren 100 μl des kultivierten CaIL12 exprimierenden Überstands, der oben unter (2) erhalten wurde, oder 100 μl 10% FBS-ERDF als Kontrolle zugegeben und die Mischung in 5% CO₂ bei 37°C für 2 Tage kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurde der Überstand vollständig entfernt und ein MTT-Assay durchgeführt. Es wurde die Cytotoxizität mit der folgenden Formel berechnet: Cytotoxizität % = (1 – OD2/OD1) × 100wobei die OD1 die Absorbtion der Tumorzellen bei einer Wellenlänge von 595 nm ist, die nur in einem Medium kultiviert wurden, und die OD2 die Absorbtion der mit caninen Lymphocyten kultivierten Tumorzellen bei einer Wellenlänge von 595 nm ist, die mit caninen Lymphocyten kultiviert wurden.
Als ein Ergebnis im Fall von FCBR1 wies das CaIL12, hergestellt von COS-1, eine Cytotoxizität von 75% auf, während die Kontrolle eine Cytotoxizität von 34% zeigte. Im Fall von A72 wies das CaIL12 eine Cytotoxizität von 83% auf, während die Kontrolle eine Cytotoxizität von 22% zeigte. Demnach wurde herausgefunden, dass CaIL12 canine Lymphocyten aktiviert einen Antitumoreffekt gegen canine Tumorzellen zu exprimieren.
Beispiel 3
Aufreinigung von CaIL12
Es wurden 250 ml des Überstandes der kultiverten Zellen aus Beispiel 2 (4) auf eine Säule aufgetragen, die mit einem Sulfopropylträger gepackt war, und die Säule wurde mit einer ausreichenden Menge 20 mM Phosphorsäurepuffer gewaschen. Die absorbierten Fraktionen wurden durch die Elution mit 0,5~1 M NaCl erhalten, auf einen Blue-Sepharose-Träger appliziert, auf ähnliche Weise gewaschen und die Elution mit 1,1~2 M NaCl durchgeführt, um die Fraktionen zu erhalten. Die erhaltenen Fraktionen wurden mittels Dialyse entsalzt, um 5 ml einer aufgereinigten CaIL12-Fraktion zu erhalten. Entsprechend einer SDS-PAGE-Analyse war die Reinheit des CaIL12 in der Fraktion mehr als 90%.
Beispiel 4
Herstellung einer CaIL12-Präparation
Es wurden eine physiologische Salzlösung für Injektionen, eine niedermolekulare Gelatine für Injektionen (hergestellt von Nitta Gelatin K. K.) und Sorbitol zu der aufgereinigten CaIL12-Lösung, erhalten in Beispiel 3, zugegeben, um für die Gelatine eine Endkonzentration von 0,5% und für das Sorbitol eine Endkonzentration von 30% zu erhalten. Im Weiteren wurde die Mischung mit Posidyne (hergestellt von Pall K. K.) behandelt, um das Pyrogen zu entfernen, und 1 ml des Rests wurde jeweils in Glasfläschchen dispergiert, die bei trockener Hitze bei 250°C für 2 Stunden sterilisiert wurden. Anschließend wurde die Lösung steril gefriergetrocknet, um eine CaIL12-Präparation in Glasfläschchen zu erhalten, die jeweils 1 pg bis 5 μg CaIL12 enthielten. Die CaIL12-Präparation war bei Raumtemperatur stabil und löste sich gut in destilliertem Wasser oder einer physiologischen Salzlösung.
Beispiel 5
Beurteilung der medizinischen Wirkung der CaIL12-Präparation auf Zellebene
(1) Tumore
Um den Antitumoreffekt der CaIL12-Präparation zu sehen wurden tumortragende Mäuse hergestellt und in sie canine Lymphocyten injeziert, die mit der CaIL12-Präparation stimuliert worden waren, um die tumorreduzierende Wirkung zu untersuchen. Es wurden zehn 6 Wochen alte weibliche nackte Mäuse (BALB/C nu/nu) von Nippon Crea K. K. bezogen. Es wurden jeder Maus 10⁸ Zellen der caninen Brustdrüsentumorzellenline FCBR1 subcutan in den Rücken transplantiert und etwa einen Monat später konnten tumortragende Mäuse mit einem Tumor von 33 mm × 25 mm im Durchschnitt hergestellt werden. Auf der anderen Seite wurden, wenn die FCBR1 etabliert waren, 10⁸ Zellen tumorinfiltrierende Lymphocyten (nachstehend mit TILs abgekürzt), die entsprechend dem Verfahren von Whiteside et al (Referenz 14) isoliert worden waren, in 20 ml 10% FBS-ERDF suspendiert und 10 ng der CaIL12-Präparation, hergestellt in Beispiel 4, zugegeben. Die Mischung wurde in 5% CO₂ bei 37°C für 2 Tage kultiviert, um TILs zu erhalten, die mit der CaIL12-Präparation stimuliert waren. Im Weiteren wurden als eine Kontrolle 10⁸ Zellen der TILs, die unter ähnlichen Bedingungen kultiviert wurden, ohne die Zugabe der CaIL12-Präparation erhalten. Diese zwei TIL-Proben wurden in jeweils 5 tumortragende nackte Mäuse intravenös injeziert, wobei pro Maus 10⁷ Zellen injeziert wurden. Sieben Tage nach der Injektion wurde das Gewicht von jedem Tumor mittels Schublehren (Englisch: vernier calipers) gemessen, um den Unterschied zu dem Tumorgewicht, welches vor der Injektion jeder TILs gemessen wurde, zu untersuchen. Das Gewicht von jedem Tumor wurde mit der folgenden Formel berechnet: Tumorgewicht = (Länge × Breite2/2)
Als ein Ergebnis zeigten von fünf tumortragenden Mäusen, in welche die TILs injeziert worden waren, die mit der CaIL12-Präparation stimuliert worden waren, drei eine perfekte Regression des Tumors und zwei Mäuse hatten weniger als 0,2 des relativen Tumorgewichts verglichen mit dem Tumorgewicht vor der TILs-Injektion bezogen auf 1. Auf der anderen Seite nahm das Tumorgewicht in allen fünf tumortragenden Mäusen, in welche die Kontroll-TILs injeziert worden waren, zu und alle relativen Tumorgewichte waren mehr als 1,25. Mit diesen Ergebnissen wurde herausgefunden, dass die CaIL12-Präparation die TILs aktivierte, was die tumorreduzierende Wirkung ausdrückt.
(2) Allergie
Um eine antiallergische Wirkung der CaIL12-Präparation zu sehen, wurden Lymphocyten, die aus Hunden stammen, welche an einer allergischen Erkrankung leiden, mit der CaIL12-Präparation stimuliert, um zu untersuchen, ob die Präparation die Expression der allergieverursachenden Faktoren wie IgE kontrollieren kann. Es wurde fünf Hunden, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie unter einer atopischen Dermatitis leiden, jeweils eine 10 ml Blutprobe entnommen. Aus den jeweiligen Proben wurden umgehend die Lymphocyten isoliert und zu jeden Lymphocyten jeweils 10 ng der CaIL12-Präparation in 10% FBS-ERDF in einem 10 cm Kulturgefäß zugegeben, mit einem polyklonalem anti-humanem CD3-Antikörper (hergestellt von Genzyme) immobilisiert, und für 3 Tage kultiviert. Als eine Kontrolle wurden canine Lymphocyten hergestellt, die unter ähnlichen Bedingungen ohne die Zugabe der CaIL12-Präparation kultiviert wurden. Nach Beendigung der Kultur wurden einige Lymphocyten aus jedem Kulturgefäß gesammelt und eine cDNA wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert. Die PCR wurde unter Verwendung von Primern, die spezifisch für das canine IgE und den caninen IgE-Rezeptor waren, durchgeführt, um die Expression der cDNAs zu untersuchen. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass die Expression der cDNAs in den caninen Lymphocyten, kultiviert mit der CaIL12-Präparation, in jeder Probe inhibiert war verglichen mit der Expression, die ohne die Zugabe des CaIL12 erreicht wurde. Mit diesen Ergebnissen wurde herausgefunden, dass die CaIL12-Präparation auf canine Lymphocyten wirkt, um die Expression von IgE und dem IgE-Rezeptor zu inhibieren, welches allergieverursachende Faktoren sind. Im Weiteren wurde gemäß dem Panning-Verfahren (Referenz 15) unter Verwendung eines polyklonalen anti-humanes CD4-Antikörpers (hergestellt von Genzyme) aus den Lymphocyten, die in jedem Kulturgefäß zurückgeblieben waren, CD4-positive Zellen erhalten, die hauptsächlich durch eine T-Helferzellpopulation gebildet wurden. Sie wurden verwendet, um eine cDNA zu synthetisieren, und die PCR wurde unter Verwendung von Primern, die spezifisch für das CaIL5- und CaIFNγ-Gen waren, durchgeführt, um die Expression der cDNAs zu untersuchen. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass die Expression der CaIL5-cDNA durch die Zugabe der CaIL12-Präparation in jedem Fall inhibiert wurde. Auf der anderen Seite wurde die Expression von CaIFNγ-cDNA durch die Zugabe der CaIL12-Präparation in jedem Fall intensiviert. IL5 wird von Typ 2 T-Helferzellen produziert, die eine humorale Immunantwort wie eine allergische Reaktion verursachen und auf der anderen Seite wird IFNγ von Typ 1 T-Helferzellen produziert, welche eine zelluläre Immunität verursachen und eine humorale Immunität inhibieren. Mit diesen Ergebnissen wurde vorgeschlagen, dass die CaIL12-Präparation die Typ 2 T-Helferzellen in caninen Lymphocyten inhibiert und die Typ 1 T-Helferzellen aktiviert. Mit diesen Ergebnissen wurde herausgefunden, dass die CaIL12-Präparation vielversprechend für die Behandlung von allergischen Erkrankungen in Hunden ist.
Beispiel 6
Toxizitätstest der CaIL12-Präparation für Hunde
Die Toxizität der CaIL12-Präparation wurde entsprechend dem folgenden Verfahren getestet. Als Testtiere wurden drei Beagle verwendet.
(1) Verabreichungsverfahren
Die Präparation wurde jeden zweiten Tag und 5 mal insgesamt verabreicht. Die Dosis wurde graduell erhöht (1 ng/kg Körpergewicht beim ersten mal, 5 ng/kg Körpergewicht, 25 ng/kg Körpergewicht, 250 ng/kg Körpergewicht und 1 μg/kg Körpergewicht beim fünften mal). Die Präparation wurde intravenös verabreicht.
(2) Beobachtungszeitraum, Beobachtungsgegenstände und Beobachtungszeitpunkte
Der Beobachtungszeitraum reichte von einer Woche vor dem Beginn der Verabreichung bis drei Wochen nach dem Verabreichungsbeginn. Die Beobachtungsgegenstände schlossen klinische Symptome (respiratorisches Muster, Vitalität, Appetit, Aktivität, sichtbare Schleimhäute, Speichel, Entleerungsaktivität, Somnolenz), Körpertemperatur, Herzfrequenz, Körpergewicht, eine hämatologische Untersuchung (Hämocytometrie (Leukocytenzahl, Hämatokrit, Thrombocytenzahl, Hämogram)), Elektrolyte (Na, K, Cl), eine biochemische Untersuchung (BUN, Crea., GOT, GPT, CPK, Glukose, TP, Alb, Glob, A/G), Urinbefunde, Kreislauforgane und automatische Nervensystembefunde (Englisch: automatic nervous System findings) ein. Das Körpergewicht wurde alle 7 Tage nach dem Datum der Verabreichung gemessen und die anderen Beobachtungsgegenstände wurden eine Woche vor Verabreichungsbeginn, unverzüglich vor Verabreichungsbeginn, 10 Minuten danach, 30 Minuten danach, 1 Stunde danach, 1,5 Stunden danach, 2 Stunden danach, 4 Stunden danach, 6 Stunden danach, 12 Stunden danach, 24 Stunden danach, 48 Stunden danach, 2 Wochen und 3 Wochen nach Beginn der Verabreichung gemessen.
Als eine Ergebnis der Tests entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren, zeigte die Verabreichung der CaIL12-Präparation keine Veränderungen, die ein Problem sind. So wurde geklärt, dass die CaIL12- Präparation wenigstens bis zur höchsten Dosierung von 1 μg/kg Körpergewicht für Hunde nicht toxisch ist.
Beispiel 7
Behandlung und Prävention von Hundeerkrankungen mit der CaIL12-Präparation
Es wurde zwölf Hunden mit Tumoren an der Epidermis die CaIL12-Präparation lokal und intravenös injeziert. Jeder Hund hatte eine Vielzahl von Tumoren mit unterschiedlicher Größe. Von den zwölf Hunden wurde acht das CaIL12 mit 10 ng–1 μg pro Tumor lokal alle 3 bis 4 Tage und 10 mal insgesamt in die Tumore injeziert. Als ein Ergebnis verschwanden 90% der Tumore vollständig, die mit CaIL12 injeziert wurden, und alle verbleibenden Tumore wurden auf weniger als die Hälfte reduziert. Vier Hunde hatten Tumore mit mehr als 100 cm³, welche in die inneren Organe des Körpers wie Lunge, Leber und Niere metastasiert hatten. Bei drei Hunden wurden die Tumore auf der Epidermis durch eine chirurgische Operation abgetragen und den Hunden unmittelbar intravenös die CaIL12-Präparation mit 10 ng/kg injeziert. Anschließend wurden ihnen jeden Tag für 7 Tage eine Dosis von 500 ng/kg injeziert. Als ein Ergebnis verschwanden alle Tumore, die in die inneren Organe metastasiert hatten, und es wurde seit dem für 6 Monate kein Wiederauftreten beobachtet.
Es wurde sieben Hunden, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie an einer atopischen Dermatits leiden, intravenös die CaIL12-Präparation injeziert. Bei diesen Hunden wurden klinische Symptome wie ein Erythem, Ekzem, Alopezie, etc. auf der Haut beobachtet und es wurde viel IgE im Blut nachgewiesen. In ihren Leukocytenfraktionen waren die jeweiligen mRNAs von IL4, IL5, IL10 und IL13 hoch exprimiert. Den Hunden wurde die CaIL12-Präparation intravenös mit einer Dosis von jedesmal 0,1 bis 100 ng/kg alle 3 Tage und 3 bis 5 mal insgesamt injeziert und die klinischen Symptome wurden schnell durch eine einmalige Injektion verbessert und waren nach 3 bis 5 maliger Injektion perfekt kuriert.
Im Weiteren wurde drei Hunden, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie an einer Pollinose leiden, intravenös die CaIL12-Präparation injeziert. Durch die Verabreichung einer einmaligen Dosis von 0,1 bis 10 pg/kg wurden klinische Symptome wie Niesen und Aufziehen der Nase schnell verbessert.
Beispiel 8
Behandlung von caninen Erkrankungen durch eine adoptive Immuntherapie unter Verwendung der CaIL12-Präparation
Es wurden von fünf Hunden und zwei Katzen, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie Tumore an der Epidermis haben, und drei Hunden, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie an einer atopische Dermatits leiden, jeweils eine 25 ml Blutprobe entnommen. Von jeder der Proben wurden die Lymphocyten isoliert und 50U humanes IL2 (hergestellt von Genzyme) und 100 ng der CaIL12-Präparation in 10% FBS-ERDF in ein 10 cm Kulturgefäß gegeben, immobilsiert mit einem polyklonalen anti-humanen CD3-Antikörper (hergestellt von Genzyme). Die Mischungen wurden für 4 Tage kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Lymphocyten gesammelt und intravenös in die jeweiligen Hunde und Katzen injeziert. Als eine Ergebnis wurden alle drei Hunde, die unter einer atopischen Dermatits litten, perfekt kuriert und die Hunde und Katzen mit den Tumoren wiesen eine Tendenz zur Tumorreduktion auf. Dieselbe Operation wurde jede Woche und 3 bis 5 mal insgesamt wiederholt und alle Tumore waren perfekt zurückentwickelt.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung kann ein Mittel, ein präventives Mittel, ein Behandlungsverfahren und ein präventives Verfahren bereitstellen, dass exzellent gegen Tumore, Dermatitis, infektiöse Erkrankungen und allergische Erkrankungen von Hunden und Katzen ist.
Referenzen

1. Wolf et al.: J. Immunol. 146, 3074–3081 (1991).
2. Shoenhaut et al.: J. Immunol. 148, 3433–3440 (1992).
3. Nastala et al.: J. Immunol. 153, 1697–1706 (1994).
4. Gazzinelli et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 6115–6119 (1993).
5. Gazzinelli et al.: J. Exp. Med: 180, 2199–2208 (1994).
6. Chirgwin et al.: Biochemistry 18, 5294 (1979).
7. Berger et al.: Biochemistry 18, 5143 (1979).
8. Gubler et al.: Gene 25, 236–269 (1983).
9. Okayama et al.: Mol. Cell. Biol., 2, 161, (1982) & 3, 280, (1983).
10. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Loboratory. New York. 1982.
11. Prober et al.: Science 238, 336–341 (1987).
12. Takebe et al.: Mol. Cell. Biol. 8, 446–472 (1988).
13. F. L. Grabam et al.: Virology 54, 536 (1973).
14. Wheteside et al.: J. Immunol. Methods 90, 221–223 (1986).
15. Seed et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365–3369 (1986).

Sequenzliste

Claims

Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen, umfassend canines Interleukin 12 eines Heterodimers, gebildet von einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 2 oder der Sequenz Nummer: 14 umfasst, und einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 4 oder der Sequenz Nummer: 16 umfasst.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach Anspruch 1, worin die Immunerkrankung ein Tumor, eine Dermatitis, eine infektiöse Erkrankung oder eine Allergose ist.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach Anspruch 2, worin der Tumor ein Brustdrüsentumor, eosinophiles Granulom, Epidermoid, Ekphyma, Lipom, Othämatom, pulmonales Ödem, dermaler kauleszenter weicher Tumor oder Analtumor ist.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach Anspruch 2, worin die Dermatitis eine externe Entzündung des Gehörgangs, eine Dermatitis, Ekzem, Dermatomykose, Pyodermie, allergische Dermatitis, Urtikation, traumatische Dermatitis oder Alopezie ist.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach Anspruch 2, worin die infektiöse Erkrankung eine Infektion mit dem caninen Parvovirus, eine Staupeninfektionserkrankung, felines AIDS oder feline Leukämie ist.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach Anspruch 2, worin die allergische Erkrankung eine Pollinose ist.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das canine Interleukin 12 eines Heterodimers, gebildet von einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 2 oder der Sequenz Nummer: 14 umfasst, und einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 4 oder der Sequenz Nummer: 16 umfasst, durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird.
Mittel und/oder präventives Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das canine Interleukin 12 eines Heterodimers, gebildet von einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 2 oder der Sequenz Nummer: 14 umfasst, und einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 4 oder der Sequenz Nummer: 16 umfasst, unter Verwendung einer tierischen Zelle, die gleichzeitig mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 1 oder der Sequenz Nummer: 13 umfasst, und einer DNA-Sequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 3 oder der Sequenz Nummer: 15 umfasst, oder unter Verwendung einer Insektenzelle oder -larve hergestellt wird, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert wird, der sowohl eine DNA-Sequenz, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 1 oder der Sequenz Nummer: 13 umfasst, und eine DNA-Sequenz enthält, die identisch ist mit oder einen Teil der Sequenz Nummer: 3 oder der Sequenz Nummer: 15 umfasst.
Verwendung eines Mittels und/oder präventiven Mittels gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Immunerkrankungen in Hunden und Katzen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Medikament in einen Hund oder einen Katze injeziert wird.
Verwendung eines Mittels und/oder präventiven Mittels gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Immunerkrankungen in Hunden und Katzen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Injektion eine intravenöse Injektion, eine subkutane Injektion oder eine lokale Injektion ist.
Verwendung eines Mittels und/oder präventiven Mittels gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Immunerkrankungen in Hunden und Katzen nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Injektionsdosis pro Injektion 0,1 pg/kg (Körpergewicht) bis 100 μg/kg (Körpergewicht) ist.
Verwendung von Lymphozyten, isoliert aus caninem oder felinem periphärem Blut und stimuliert mit einem Mittel und/oder präventiven Mittel gegen Immunerkrankungen für Hunde und Katzen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von Immunerkrankungen in Hunden und Katzen, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Medikament in den Hunde- oder Katzenkörper zurückgeführt wird.
Rekombinanter Baculovirus, umfassend sowohl eine DNA-Sequenz, die identisch mit der Sequenz Nummer: 1 oder der Sequenz Nummer: 13 ist, und eine DNA-Sequenz, die identisch mit der Sequenz Nummer: 3 oder der Sequenz Nummer: 15 ist.
Verfahren zur Herstellung von caninem Interleukin 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Insektenzelle oder -larve mit dem rekombinanten Baculovirus nach Anspruch 13 infiziert wird und das canine Interleukin 12 entnommen wird.