ES2250290T3

ES2250290T3 - Formulaciones estables de fsh y variantes de fsh.

Info

Publication number: ES2250290T3
Application number: ES01130213T
Authority: ES
Inventors: James Arthur Hoffmann; Jirong Lu
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1998-07-23
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2019-07-16
Also published as: BR9912243A; DE69928296D1; EP1188444A1; DE69904262T2; JP4719357B2; IL140984A0; DE69928296T2; JP2002521342A; AU4998099A; ATE228850T1; ES2183486T3; NO20010326D0; PE20000939A1; HK1026615A1; KR20010083126A; CA2335340C; CN1309567A; NO20010326L; DK0974359T4; EP0974359B1

Abstract

Una formulación que comprende FSH o una variante de FSH, que contiene una subunidad alfa y beta, y un conservante seleccionado entre fenol, m-cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso.

Description

Formulaciones estables de FSH y variantes de FSH.

Esta invención se refiere a nuevas formulaciones, artículos de fabricación y uso de preparaciones de hormona folículo-estimulante (FSH) o variantes de la hormona folículo-estimulante (variantes de FSH) conocidas en la técnica. La invención también se refiere a soluciones y formulaciones ventajosas, multiuso y estables y productos farmacéuticos de los cuales no han existido previamente para uso terapéutico. Estas formulaciones y productos son particularmente útiles en regímenes terapéuticos para aumentar los niveles en suero de FSH o variantes de FSH durante un periodo de tratamiento. Por tanto, entre otras, la invención satisface la necesidad de soluciones estables y conservadas adecuadas, formulaciones y productos que comprenden FSH o variantes de FSH y el uso de estas formulaciones y productos en el tratamiento de infertilidad.

FSH está indicada para uso en infertilidad. A los pacientes se les administra diariamente o dos veces al día inyecciones intramusculares ("IM") o subcutáneas ("SC") de una dosificación ajustada a la respuesta, habitualmente que varía de 75 a 300 IU/día. La semivida corta de FSH hace necesario que a los pacientes se les de inyecciones de una vez o dos veces al día, prolongándose a varios días, dependiendo de su respuesta de ovario o testicular. Una formulación más estable de FSH o una variante FSH proporcionaría mejoras para su uso en terapia.

Aunque FSH no se ha administrado previamente por modos aprobados de administración distintos de IM o SC, se espera administrar otras proteínas terapéuticas durante una cantidad prolongada de días. Serían útiles diversos procedimientos de suministro, incluyendo inyecciones regulares SC o IM durante un periodo de tiempo, parches transdérmicos, implantes, bombas osmóticas, microbombas, cartuchos, sistemas de suministro pulmonar, y similares, por ejemplo, para facilitar la aceptación del paciente, para reducir la incomodidad, o para facilitar la administración. Estos regímenes de tratamiento prolongados generalmente requieren soluciones estables o conservantes en la formación.

Los conservantes, en un aspecto, evitan o minimizan la contaminación microbiana nociva en la formulación. Convencionalmente, a menudo se añaden agentes terapéuticos no proteicos, agentes conservantes antimicrobianos, tales como clorohexidina, fenol, alcohol bencílico, m-cresol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido benzoico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal y diversas mezclas de los mismos, a una formulación líquida para asegurar la esterilidad durante la semivida y/o el régimen de uso múltiple (Akers, MJ, Pharm. Technol. 8, 36-46, 1984; Gennnaro, AR., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª edición., Mack, Easton, PA., 1278-1280, 1985). Estos conservantes como una clase, sin embargo, tienden a ser perjudiciales para la estabilidad de proteínas. Por ejemplo, un conservante muy eficaz, m-cresol, se ha informado de que generalmente se combina y desnaturaliza proteínas (Development of Pharmaceutical Parenteral Dosage Forms, Bontempo, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, pp. 118-119, 1977). También presenta dificultad particular con la estabilidad de la solución de hormonas, tales como hormona del crecimiento humana (Maa YF y Hsu C, International Journal of Pharmaceutics, 140, pp. 155-168, 1996).

FSH es un miembro de la familia de hormonas heterodiméricas, glicoproteicas que incluyen la hormona estimuladora de la tiroides (TSH), gonadotropina coriónica (CG), y hormona luteinizante (LH) (Pierce JG y Parsons TF, Annu. Rev. Biochem., 50, 465-495, 1981; Baenziger y Green, Biochem. Biophys. Acta., 947, 287-306, 1988). Los miembros de esta familia son heterodímeros, mantenidos generalmente juntos por interacciones no covalentes entre las dos subunidades diferentes. El heterodímero FSH humano (hFSH) consta de (i) una subunidad alfa de 92 aminoácidos madura, que también es común a los otros miembros de la familia humana (es decir, gonadotropina coriónica ("CG"), y hormona luteinizante ("LH") y hormona estimuladora de la tiroides ("TSH")); y (ii) una subunidad beta de 111 aminoácidos madura que es única para FSH (Shome y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39:187-205 (1974); Shome, y col., J. Prot. Chem, 7:325-339, 1988). Las subunidades alfa y beta se unen de manera no covalente y, por tanto, la unión se cree que es más susceptible a agentes desestabilizantes de proteínas.

Las secuencias de aminoácidos alfa y beta de FSH humana nativa y de otros mamíferos y ciertas variantes de estas secuencias son bien conocidas en la técnica anterior a 1982 y se ha conseguido la clonación y expresión de FSH humana activa y de otros mamíferos en células de mamífero antes de 1985. La subunidad alfa de gonadotropina común (o FSH alfa) se secuenció de la proteína purificada (Bellisario y col., J. Biol. Chem. 248:6796 (1973); Morgan y col., J. Biol. Chem. 250:5247 (1975)) y después se clonó y se expresó (Fiddes y col., Nature 281:351 (1979); Nature 286:684 (1981); J. Molec. Appl. Genet. 1:3-18 (1981)). La subunidad beta de FSH se secuenció de la proteína purificada (Shome y col., J. Clin Endocrinol. Metab. 39:187 (1974); Saxena y col., J. Biol. Chem. 251:993 (1976)); (Sairam y col., Biochem. J. 197:541 (1981); Fujiki y col., Biochem Biophys. Acta 624:428 (1980)). Integrated Genetics informó de la expresión recombinante de una CG humana (Biotechnology Newswatch (página. 3, 20 de junio de 1983); Chemical and Engineering News 61:41 (21 de noviembre de 1983); Genetic Technology News 3:9 (12 de diciembre de 1983)) y una forma activa (Biotechnology Newswatch, 16 de enero de 1984)), y también informaron de la clonación exitosa de FSH (Genetic Engineering Newsletter 4:4 (10 de agosto de 1984)) y FSH recombinante producida en células de mamífero en forma activa (DNA 4:76 (publicado el 16 de enero de 1985)). Amgen también informó de la expresión de una LH bovina activa en células CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7280 (noviembre de 1985)).

Hay evidencias sustanciales en la bibliografía que indican que las hormonas proteicas heterodiméricas pueden disociarse en condiciones fisiológicas o ácidas (Ryan, R.J., y col., Recent Progr. Hormone Res. 26:105-137; 1970, Strickland, TW y Puett, D, J. Biol. Chem., 257:2954-2960; 1982, Reichert LE y Ramsey RB, J. Biol. Chem., 250:3034-3040; 1975). Los dímeros intactos son esenciales para la actividad biológica y vitales para la secreción de FSH (Baenziger JU y Green ED, Biochem. Biophys. Acta, 947:287-306, 1988; Corless, y col., J. Cell Biol., 104:1173-1181, 1987). Los intentos de contrarrestar la inestabilidad de FSH incluyen aquellos en los que se produce una molécula de cadena única, incorporando dos subunidades en una molécula estable, y aquellos en los que se crean enlaces disulfuro adicionales para estabilizar la interacción entre las dos subunidades (Sughara T., y col., J. Biol. Chem., 271:10445-10448, 1996; Heikoop J.C., y col., Nature Biotech, 15:658-62, 1997).

Donaldson, Patente de Estados Unidos Nº 5.162.306, se refiere a composiciones veterinarias que comprenden FSH y LH. Estas composiciones han demostrado ser estables en timol (5-metil-2(1-metiletil)fenol). Donaldson informa de que el timol es un conservante en la lista de conservantes de la U.S.P. XXI que no dañará las hormonas glicoproteicas (Patente de Estados Unidos Nº 5.162.306) en la formulación SUPER-OV descrita.

FSH derivada de orina de mujeres posmenopáusicas (hMG, comercializado como Menotropin o Humagon^{TM} por Organon y como urofolitropina o Metrodin^{TM} por Serono) se ha usado en forma inyectable durante 30 años para el desarrollo de folículos múltiples en pacientes ovuladores que participan en programas de Tecnología de Reproducción Asistida (ART) y para la inducción de ovulación en pacientes infértiles no ovuladores. (Fauser BCJM y Van Heusden AM, Endocrine Rev., 18, 71-106, 1997). Más recientemente, ha llegado a estar disponible FSH humana recombinante obtenida de células CHO (rhFSH) (Keene J.L., y col., J. Biol. Chem., 264:4769-4752, 1989; Loumaye E., y col., Human Reprod. Update, 1:188-1999, 1995; Olijve W., y col., Mol. Hum. Reprod., 2:361-369, 1996).

FSH terapéutica (hMG o rhFSH) actualmente se suministra en forma liofilizada en ampollas de 75 IU/vial y 150 IU/vial con una semivida de uno y medio a dos años cuando se almacena a 2-25ºC. Las inyecciones diarias con dosis de inicio de 75 IU o 150 IU se recomiendan durante hasta diez días para alcanzar concentraciones de estado estacionario de hFSH que son 1,5-2,5 veces superiores que después de una administración de dosis única. Este régimen de dosificación produce concentraciones necesarias para eficacia terapéutica, ya que FSH funciona a través de un mecanismo de umbral (Schoemaker J., y col., Ann. NY. Acad. Sci. 687:296-299, 1993). Dependiendo de la respuesta del paciente, pueden usarse hasta tres ciclos de tratamiento con dosis en aumento de FSH. El paciente o el compañero necesitan reconstituir un nuevo vial de material liofilizado con diluyente y administrarlo inmediatamente después de la reconstitución (Prospecto N1700101A, Publicado en febrero de 1996, para Fertinex^{TM} (urofolitropina para inyección purificada) para inyección subcutánea, por Serono Laboratories, Inc., Randolph, MA) en una base diaria. Se desecha cualquier material sin usar.

Por consiguiente, permanece una necesidad en la técnica de aumentar la aceptación del paciente mediante el desarrollo de formulaciones estables y formulaciones conservadas de FSH o proteínas variantes de FSH, y artículos de fabricación relacionados. Estas preparaciones estables son especialmente necesarias cuando se necesitan o se aconsejan tratamientos prolongados, tales como tratamientos de fertilidad con FSH. También hay una necesidad de proporcionar un producto de FSH o variante de FSH que pueda usarse o aprobarse para administración multiuso durante un periodo de veinticuatro horas o más. La invención también proporciona nuevas soluciones y formulaciones estables y soluciones y formulaciones conservadas de FSH y variantes de FSH y los artículos de fabricación relacionados que también pueden usarse y aprobarse para su uso durante un periodo de veinticuatro horas o más.

Esta invención proporciona nuevas formulaciones de FSH o variantes de FSH, su preparación, y su uso farmacéutico o veterinario en el tratamiento de trastornos de fertilidad y artículos de fabricación relacionados.

En un aspecto, la invención proporciona soluciones y formulaciones conservadas que comprenden FSH o una variante de FSH y un conservante seleccionado entre el grupo constituido por al menos un fenol, m-cresol, clorocresol, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, y derivados o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Opcionalmente, las soluciones y formulaciones conservadas contienen un tampón seleccionado y una sal.

En otro aspecto, la invención proporciona el tratamiento de infertilidad por el uso de una formulación conservada de FSH o una variante de FSH en solución que contiene al menos un conservante seleccionado entre el grupo constituido por un fenol, un m-cresol, un clorocresol, un alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, al menos un derivado de los mismos, o mezclas de los mismos.

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para preparar al menos una formulación multi-dosis de FSH o una variante de FSH, que comprende mezclar FSH y al menos un conservante seleccionado entre el grupo constituido por fenol, m-cresol, clorocresol, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, derivados de los mismos, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso.

Esta invención también proporciona un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano que comprende material de envasado y un vial que comprende una solución de FSH o una variante de FSH y un conservante, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse durante un periodo de veinticuatro horas o más para su uso. La invención comprende adicionalmente un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano, que comprende material de envasado, un primer vial que comprende FSH o una variante de FSH liofilizada, y un segundo vial que comprende un conservante, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que enseña al paciente a reconstituir la FSH o una variante de FSH en la solución conservante para formar una solución que puede mantenerse durante un periodo de veinticuatro horas o más para su uso en condiciones como se describen adicionalmente en este documento.

La invención comprende adicionalmente un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano, que comprende material de envasado, un primer vial que comprende FSH o una variante de FSH liofilizada, y un segundo vial que comprende un conservante, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que enseña al paciente a reconstituir la FSH o una variante de FSH en la solución conservante para formar una solución que puede mantenerse durante un periodo de veinticuatro horas o más para su uso en condiciones como se describen adicionalmente en este documento.

La presente invención, en un aspecto, proporciona soluciones y formulaciones de FSH o una variante de FSH recombinante y/o purificada o aislada, artículos de fabricación y su uso para el tratamiento, y productos farmacéuticos que son inesperadamente estables y/o son adecuados para uso prolongado o múltiple.

Estas soluciones y formulaciones de FSH o variante de FSH, artículos de fabricación, uso y tratamiento usando una FSH o una variante de FSH, con propiedades o estabilidad mejoradas o más adecuadas, son útiles para el tratamiento de infertilidad en mujeres y/u hombres. Estas formulaciones, artículos de fabricación, son adicionalmente adecuados para su uso en sistemas de suministro inyectables y alternativos, por ejemplo, aunque sin limitación, formulación de liberación sostenida nasal, pulmonar, transmucosa, transdérmica, oral, subcutánea, intramuscular o parenteral, en polvo, o líquida. Las soluciones y formulaciones de FSH o una variante de FSH proporcionadas también pueden tener un aumento en la potencia in vivo en comparación con productos comerciales conocidos, solas o en combinación con al menos una gonadotropina adicional, evitando o reduciendo la perdida de actividad o estabilidad, o mejorando cualquier aspecto de la eficacia o conveniencia de la administración, por ejemplo, por al menos uno de modo, frecuencia, dosificación, comodidad, facilidad de uso, actividad biológica in vitro o in vivo, y similares.

Se citan las siguientes menciones: Ausubel, y col., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1987-1999); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, y col., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, N.Y. (1994-1999); Colligan y col., eds., Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, N.Y. (1993-1999).

La hormona folículo-estimulante "FSH", esté producida de manera recombinante o aislada, y las variantes de la hormona folículo-estimulante "variantes de FSH" como se definen en este documento son bien conocidas en la técnica. FSH como se usa en este documento se refiere a la FSH producida como una proteína madura de longitud completa que incluye, aunque sin limitación, FSH humana o "hFSH", esté producida de manera recombinante o aislada de fuentes humanas (véase, Shome B, y col., J. Prot. Chem., 7:325-339, 1988; Saxena B.B. y Rathnam P., J. Biol. Chem., 251:993-1005, 1976; Watkins, y col., DNA, 6:205-212, 1987; Shome B. y Parlow A.F., J. Clin. Endocrinol. Metab., 39 (1):203-205, 1974; y Beck, y col., DNA, 4:76, 1985; documento de Estados Unidos Nº 5.405.945, y documento de Estados Unidos Nº 5.639.640). La secuencia proteica de la subunidad alfa de FSH humana se proporciona en SEC ID Nº 5, y la secuencia proteica de la subunidad beta de FSH humana se da en SEC ID Nº 6. Además, se conocen diversas variantes de FSH o se entienden a partir de la técnica (véase, Shome, J. Clin. Endocrin. Metab 39:187 (1974); Saxena, J. Biol Chem 251 (4):993-1005 (1976); 1978; Sairam y col., Biochem J 197:541 (1981); adicionalmente véase Closset Eur. J. Biochem. 86:115-120; Fujiki, J. Biol. Chem 253:5363-5368 (1978); Sairam, Biochem. J. 197:541-552 (1981). Las subunidades beta de FSH de la técnica anterior incluirían la secuencia de Saxena así como un género de secuencias implicado en el análisis de Sairam de (a) aminoácidos evolutivamente conservados y (b) errores bien conocidos y caracterizados en secuenciación. Además, los especialistas en la técnica reconocen que la sustitución de un aminoácido identificado en la técnica anterior con (i) un aminoácido químicamente similar o (ii) un aminoácido evolutivamente conservado no tendría efecto apreciable sobre la actividad biológica de un heterodímero FSH compuesto de una subunidad beta de hFSH, modificada de este modo.

En particular, el comentario de Sairam sobre la secuencia de hFSH de Saxena, así como su análisis de las sustituciones de aminoácidos identificadas entre moléculas FSH funcionales, define un género de secuencias de la cadena beta de FSH en la técnica anterior. Más específicamente, la publicación de Sairam en 1981 identifica secuencias de aminoácidos conservadas que se refieren a publicaciones por Saxena y col., Shome y col., Closset y col., y Fujiki y col. Sairam, Biochem J 197:541, 551 (1981). La técnica anterior (1) hace evidente una preferencia por la secuencia de la cadena beta de FSH de Saxena sobre la de Shome; (2) trata el asunto de heterogenicidad carboxi-terminal; (3) establece que partes de la molécula afectadas por diferencias entre especies no son esenciales para la actividad de la hormona y (4) destaca la directriz sacada de las homologías entre especies y entre las cadenas beta de las tres hormonas glicoproteicas humanas, FSH, LH y TSH.

Se informa de la heterogenicidad C-terminal para todas las secuencias publicadas excepto para la de FSH-s porcina, en la que el ácido glutámico era el único resto C-terminal. Para la posición 27, Saxena asignó un resto de triptófano a esta posición encontrando también soporte en la conservación evolutiva demostrada por un triptófano en la posición 24 para FSH-B, entre todas las especies de la técnica anterior. Para las posiciones 44 y 46, Saxena demuestra que, en la posición 44, el resto debe ser arginina en lugar de lisina y, en la posición 46, lisina en lugar de arginina. Las secuencias porcina, equina y ovina, también reflejaron una presión evolutiva para conservar la arginina en la posición 44. Las variaciones en tres posiciones, 21, 22 y 44, implican unas sustituciones estructuralmente conservativas o evolutivamente conservadas ("homólogas"), cada una de las cuales tiene bioactividad.

Cada una de las referencias de Sairam, Shome, y Closset describen restos de isoleucina, serina en las posiciones 21-22, mientras que Saxena describe leucina, treonina y Fujiki describe isoleucina, treonina en estas posiciones. Cada una de estas descripciones no es sólo una sustitución evolutivamente conservativa, sino también una sustitución estructuralmente conservativa. La variación en la posición 41 entre el ácido aspártico descrito por Sairam, Shome, Closset y Fujiki y la asparagina descrita por Saxena, Closset y Sairam implica dos restos evolutivamente conservados, cada uno de los cuales proporciona bioactividad. Estas descripciones de sustituciones conservativas y sustituciones evolutivamente conservadas guían al especialista en la técnica a distinguir las variantes de la cadena beta de FSH, en el género de cadena hFSH-B.

Las variantes de FSH mencionadas en este documento son las deleciones carboxi-terminales de la subunidad beta que son más cortas que la proteína madura de longitud completa de SEC ID Nº 6. Las deleciones carboxi-terminales de la subunidad beta humana se proporcionan en SEC ID Nº 11, 12, y 13. Se entiende que las variantes carboxi-terminales de la cadena beta forman dímeros con una subunidad alfa conocida para formar un heterodímero variante de FSH. Adicionalmente, se conocen varias especies de FSH, incluyendo, aunque sin limitación, FSH porcina (SEC ID Nº 7 y 8), FSH de caballo (SEC ID Nº 3 y 4), FSH bovina (SEC ID Nº 1 y 2), FSH de oveja (SEC ID Nº 9 y 10), y las citadas en Combarnous Y., Endocrine Reviews, 13(4), 670-691, 1992. En la misma, se entiende que un especialista en la técnica sería capaz de fabricar y preparar otras variantes carboxi-terminales a partir de la especie dada como se proporciona adicionalmente en este documento.

Los heterodímeros de FSH o heterodímeros de variante de FSH pueden producirse por cualquier procedimiento adecuado, tal como de manera recombinante, por aislamiento o purificación a partir de fuentes naturales como puede ser el caso, o por síntesis química, o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes de heterodímeros de FSH y heterodímeros de variante de FSH que comprenden una subunidad alfa y una subunidad beta incluyen, aunque sin limitación:

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El uso del término "recombinante" se refiere a preparaciones recombinantes de FSH o variantes de FSH a través del uso de tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, Boine y col., Seminars in Reproductive Endocrinology 10, 45-50, 1992, y como se proporciona adicionalmente en líneas generales y se ejemplifica en este documento). Las secuencias para clones genómicos y de ADNc son conocidas para las subunidades alfa y beta de varias especies (Fiddes, J.C., y col., J of Mol. and Applied Genetics, 1:3-18(1981); Esch F.S., y col. DNA 5:363-369 (1986); Watkins P.C., y col., DNA 6:205-212 (1987); Hirai T., y col., J. Mol. Endrocrinol. 5:147-158 (1990); Maurer, R.A., y col., Mol. Endocrinol. 1:717-723 (1987); Guzman K., y col., DNA Cell Biol. 10:593-601 (1991); Kumar TR, y col., Gene. 12 de diciembre de 1995;166(2):335-6; Kumar TR, y col., Gene. 12 de diciembre de 1995;166(2):333-4. Varias de las secuencias de ADN para las subunidades alfa y beta se proporcionan como SEC ID: 14-20. Además, la transfección de células eucariotas con las secuencias de ADN que codifican una subunidad alfa y beta, se proporcionen en un vector o en dos vectores con cada subunidad teniendo un promotor separado, son capaces de proporcionar dímeros intactos, o por otros procedimientos entendidos en la técnica.

La FSH o una variante de FSH usada de acuerdo con la presente invención puede producirse no sólo por medios recombinantes, incluyendo a partir de células de mamífero o preparaciones transgénicas, sino que también pueden purificarse de otras fuentes biológicas, tales como a partir de orina. Las metodologías aceptables incluyen las descritas en Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69, 1997; Keene, y col., J. Biol. Chem., 264:4769-4775, 1989; Cerpa-Poljak, y col., Endocrinology, 132:351-356, 1993; Dias, et al., J. Biol. Chem., 269:25289-25294, 1994; Flack, y col., J. Biol. Chem., 269:14015-14020, 1994; y Valove, y col., Endocrinology, 135:2657-2661, 1994, y la Patente de Estados Unidos 3.119.740.

"Sustancialmente puro", usado como referencia a un péptido o proteína, significa separación de otras moléculas celulares y no celulares, incluyendo otras moléculas proteicas. Una separación sustancialmente pura sería aproximadamente al menos un 85% de pureza, preferiblemente aproximadamente al menos un 95% de pureza. Una proteína "sustancialmente pura" puede prepararse por una diversidad de técnicas, bien conocidas por el especialista en la técnica, incluyendo, por ejemplo, cromatografía líquida a alta presión (HPLC) y como se entiende adicionalmente en la técnica o se demuestra en este documento.

El término "administrar" o "administración" significa introducir una formulación de la presente invención en el cuerpo de un paciente en necesidad de la misma para tratar una enfermedad o afección.

El término "paciente" significa un mamífero que se trata para una enfermedad o afección. Los pacientes son de, aunque sin limitación, el siguiente origen, humano, ovino, porcino, equino, bovino, de conejo y similares.

El término "alquilparebeno" se refiere a un alquil C_{1}-C_{6} parabeno fisiológicamente tolerado útil como agente microbiano. Los ejemplos no limitantes incluyen al menos un metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, y butilparabeno.

El término "diluyente acuoso" se refiere a un disolvente líquido que contiene agua. Los sistemas disolvente acuosos pueden estar compuestos únicamente de agua, o pueden estar compuestos de agua más uno o más disolventes miscibles, y pueden contener solutos disueltos tales como azúcares u otros excipientes. Los disolventes miscibles usados más habitualmente son los alcoholes orgánicos de cadena corta, tales como metanol, etanol, propanol, cetonas de cadena corta, tales como acetona, y polialcoholes, tales como glicerol.

Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que se tolera fisiológicamente y confiere una tonicidad adecuada a una formulación para evitar un flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Los compuestos, tales como glicerina, se usan habitualmente para dichos propósitos a concentraciones conocidas. Otros agentes de isotonicidad adecuados incluyen, aunque sin limitación, aminoácidos o proteínas (por ejemplo, metionina o albúmina), sales (por ejemplo, cloruro sódico), y azúcares (por ejemplo, dextrosa, sacarosa y lactosa), y/o muchos otros bien conocidos en la técnica.

El término "conservante" se refiere a un compuesto o composiciones añadidos a una formulación para funcionar como agente antimicrobiano, antifúngico, antimicoplásmico, antiviral, antipriones y/o antibacteriano. Una formulación conservada que contiene FSH o una variante de FSH de la presente invención preferiblemente satisface una directriz reglamentaria o reguladora para la eficacia conservante para ser un producto multiuso disponible en el mercado. Los conservantes adecuados incluyen al menos uno de un cloruro de benzalconio, un cloruro de bencetonio, un fenol, un m-cresol, un alquilparebeno (metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno), deshidroacetato sódico, un clorocresol, un timerosal, y cualquier mezcla de los mismos de uno o más conservantes. Véase, por ejemplo, Wallhauser, K., Develop. Biol. Standard. 24, pp. 9-28 (Basel, S. Krager, 1974).

El término "tampón fosfato" se refiere a excipientes que contienen un ión fosfato. Generalmente los tampones fosfato se preparan a partir de ácido fosfórico, o sal de ácido fosfórico, incluyendo, aunque sin limitación, sales de sodio y potasio. Se conocen varias sales de ácido fosfórico en la técnica, tales como sales monobásicas, dibásicas y tribásicas de sodio y potasio del ácido. Las sales de ácido fosfórico son bien conocidas por encontrarse como hidratos de la sal existente. Los tampones fosfato pueden cubrir un amplio intervalo de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, e intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y un intervalo más preferido de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Preferiblemente las formulaciones de la presente invención tienen pH entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,8, incluyendo aproximadamente pH 7,0, pH 7,2 y 7,4. Los iones preferidos son los iones sodio o potasio, encontrados por separado o juntos en la solución, como por ejemplo se encuentra la solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los tampones de solución salina con fosfato son bien conocidos en la técnica, tales como solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Las concentraciones salinas en solución total pueden variar entre aproximadamente 5 mM, 9,5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, y 500 mM. Preferiblemente, la concentración iónica está por encima de 10 mM, o por encima de 50 mM, o por encima de 100 mM.

El término "vial" se refiere ampliamente a una reserva adecuada para retener la FSH y diluyente en un estado estéril contenido. Los ejemplos de un vial usado en este documento incluye ampollas, cartuchos, envases blíster, u otra reserva adecuada para suministro de la FSH al paciente mediante bomba (incluyendo osmótica), catéter, parche transdér-
mico, cartucho, suministro pulmonar, transmucosa, o parenteral. Los viales adecuados para envasar productos para ad-
ministración parenteral, pulmonar, transmucosa, o transdérmica son bien conocidos y están reconocidos en la técnica.

El término "estabilidad" se refiere a la estabilidad física, química y conformacional de formulaciones de FSH de la presente invención. La inestabilidad de una formulación proteica puede estar provocada por degradación química o agregación de las moléculas proteicas para formar polímeros de mayor orden, por disociación de los heterodímeros en monómeros, desglicosilación, modificación de glicosilación o cualquier otra modificación estructural que reduce al menos una actividad biológica de un polipéptido FSH incluido en la presente invención.

Una solución o formulación "estable", que es preferiblemente un tampón fosfato con solución salina o una sal elegida, es una en la que el grado de degradación, modificación, agregación, perdida de actividad biológica y similares, de proteínas en la misma, está aceptablemente controlado y no aumenta inaceptablemente con el tiempo. La estabilidad puede evaluarse por procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo medida de dispersión de la luz de una muestra, atenuación aparente de la luz (absorbancia, o densidad óptica), tamaño (por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño), actividad biológica y/o propiedades in vitro o in vivo por calorimetría de exploración diferencial (DSC). Otros procedimientos para evaluar la estabilidad son bien conocidos en la técnica y también pueden usarse de acuerdo con la presente invención.

El termino "tratamiento" se refiere a la administración, seguimiento, manejo y/o cuidado de un paciente para el que es deseable la administración de FSH para el propósito de estimulación de los folículos o testículos o cualquier otra respuesta fisiológica regulada por FSH. Por tanto, el tratamiento puede incluir, aunque sin limitación, la administración de FSH para la inducción o mejora del desarrollo de espermas o folicular o para la inducción de ovulación. Además, los tratamientos para restaurar la espermatogénesis normal se contemplan en hombres.

Una "sal" es una sal fisiológicamente aceptable de FSH. Dichas sales se forman entre uno cualquiera o más de los grupos cargados en la proteína y uno cualquiera o más cationes o aniones fisiológicamente aceptables, no tóxicos. Las sales orgánicas e inorgánicas incluyen, por ejemplo, las preparadas a partir de ácidos tales como ácido clorhídrico, sulfúrico, sulfónico, tartárico, fumárico, bromhídrico, glicólico, cítrico, maleico, fosfórico, succínico, acético, nítrico, benzoico, ascórbico, p-toluenosulfónico, bencenosulfónico, naftalenosulfónico, propiónico, carbónico, y similares, o por ejemplo, amonio, sodio, potasio, calcio, o magnesio. Las sales adicionales y adecuadas son conocidas en la técnica y se incluyen en este documento.

El termino "tampón" o "tampón fisiológicamente aceptable" se refiere a un compuesto que se sabe que es seguro para el uso farmacéutico o veterinario en formulaciones y que tiene el efecto de mantener o controlar el pH de la formulación en el intervalo de pH deseado para la formulación. Los tampones aceptables para controlar el pH de un pH moderadamente ácido a un pH moderadamente básico incluyen, aunque sin limitación, compuestos tales como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS, e histidina. "TRIS" se refiere a 2-amino2-hidroximetil-1,3-propanodiol, y a cualquier sal farmacológicamente aceptable del mismo. Los tampones preferidos son tampones fosfato con solución salina o una sal aceptable. Otros tampones que son fisiológicamente aceptables, y que son adecuados para controlar el pH en el nivel deseado son conocidos por los especialistas en la técnica y se incluyen en este documento.

Puede explorarse una biblioteca de ADNc o genómica usando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido o ácido nucleico conocido para obtener un clon que codifica una secuencia de FSH conocida. Pueden usarse sondas par hibridar con ADN genómico o secuencias de ADNc para aislar secuencias de ADN homólogo en el mismo o diferentes organismos. Los especialistas en la técnica apreciarán que pueden emplearse diversos grados de rigurosidad de hibridación en el ensayo; y el medio de hibridación o lavado puede ser riguroso. Según las condiciones de hibridación llegan a ser más rigurosas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y la diana para que suceda la formación de dúplex. El grado de rigurosidad puede controlarse por la temperatura, fuerza iónica, pH y las presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida. Por ejemplo, la rigurosidad de hibridación se varía oportunamente cambiando la polaridad de la solución reactiva a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida en el intervalo de 0% a 50%. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) necesario para una unión detectable variará de acuerdo con la rigurosidad del medio de hibridación y/o el medio de lavado. El grado de complementariedad será óptimamente del 100%; sin embargo, debe entenderse que variaciones minoritarias en la secuencia de las sondas y cebadores puede compensarse por la reducción de la rigurosidad del medio de hibridación y/o lavado.

Los procedimientos de amplificación de ARN o ADN son bien conocidos en la técnica y pueden usarse de acuerdo con la presente invención sin experimentación excesiva, en base al análisis y directriz presentados en este documento. Los procedimientos de amplificación selectiva por PCR permiten el diseño de segmentos más pequeños de secuencias de ácido nucleico, tales como los que codificarían una cadena beta variante de FSH definida. Dichas técnicas de amplificación permiten añadir señales de terminación, sitios de restricción y similares adecuados a la secuencia amplificada.

Los procedimientos conocidos de amplificación de ADN o ARN incluyen, aunque sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y procedimientos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, de Mullis, y col.; 4.795.699 y 4.921.794 de Tabor, y col; 5.142.033 de Innis; 5.122.464 de Wilson, y col.; 5.091.310 de Innis; 5.066.584 de Gyllensten, y col; 4.889.818 de Gelfand, y col; 4.994.370 de Silver, y col; 4.766.067 de Biswas; 4.656.134 de Ringold) y amplificación mediada por ARN que usa ARN antisentido para la secuencia diana como molde para síntesis de ADN de doble hélice (Patente de Estados Unidos Nº 5.130.238 de Malek, y col, con el nombre comercial NASBA), Ausubel, supra; Colligan, supra, Sambrook, supra.

Por ejemplo, puede usarse tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleótidos y secuencias de ADN relacionadas directamente del ADN genómico o bibliotecas de ADNc. La PCR y otros procedimientos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas a expresar como, por ejemplo, para obtener una cualquiera de las FSH o variantes de FSH proporcionadas, para fabricar ácidos nucleicos para usar como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciación de ácidos nucleicos, o para otros propósitos. Los ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a los especialistas en la técnica a través de los procedimientos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, supra, así como Mullis, y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202 (1987); e Innis, y col., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los kits disponibles en el mercado para amplificación por PCR genómico son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el kit Advantage-Gc Genomic PCR (Clontech). Puede usarse la proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de PCR largos.

Los ácidos nucleicos necesarios para expresar una cualquiera de las FSH o variantes de FSH dadas también pueden prepararse por síntesis química directa por procedimientos tales como el procedimiento de fosfotriéster de Narang, y col., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); el procedimiento de fosfodiéster de Brown, y col., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); el procedimiento de dietilfosforamidita de Beaucage, y col., Tetra. Letts. 22:1859-1862 (1981); el procedimiento de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862 (1981), por ejemplo, usando un sintetizador automático, por ejemplo, como se describe en Needham-VanDevanter, y col., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984); y el procedimiento en soporte sólido de la Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de hélice única, que puede convertirse en ADN de doble hélice por hibridación con una secuencia complementaria, o por polimerización con una ADN polimerasa usando la hélice única como molde. Un especialista en la técnica reconocerá que aunque la síntesis química de ADN está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas por el ligamiento de secuencias más cortas.

Como se sabe en la técnica, se pueden usar casetes de expresión recombinante para expresar ácidos nucleicos codificantes conocidos para una FSH o variante de FSH conocida. Una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómica que codifica una subunidad de longitud completa puede usarse para construir un casete de expresión recombinante que puede introducirse en una célula huésped deseada. Sin embargo, se aprecia en la técnica que para obtener heterodímeros funcionales deben expresarse ambas unidades, sea a partir de un plásmido o introducidas en plásmidos separados. Un casete de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido unido de manera operativa a secuencias reguladoras del inicio de la trascripción que dirigirán la trascripción del polinucleótido en la célula huésped pretendida para cada subunidad. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica para expresar FSH (por ejemplo, FSH humana recombinante (rhFSH) obtenida de células CHO;(Kreene J.L., y col., J. Biol. Chem., 264:4769-4752, 1989; Loumaye E., y col., Human Reprod. Update, 1:188-1999, 1995; Olijve W., y col., Mol. Hum. Reprod., 2:361-369, 1996).

Pueden emplearse promotores tanto heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos que codifican subunidades de FSH o una variante de FSH. Las metodologías de producción general por técnicas recombinantes son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo., Sambrook, y col., 1989; Ausubel, y col., 1987-1989.

Los polinucleótidos codificados para las subunidades alfa y beta para FSH o una variante de FSH pueden unirse a un vector que contiene un marcador de selección para la propagación en un huésped. Generalmente, un vector plasmídico (o vectores si las subunidades alfa y beta están contenidas en vectores de expresión separados), se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector o vectores es un virus, puede empaquetarse in vitro usando una línea celular de empaquetado apropiada y después transducirse en células huésped.

El inserto de ADN para cada subunidad debe estar unido de manera operativa a un promotor apropiado, tal como los promotores temprano y tardío de SV40 y promotores de LTR retrovirales, por nombrar unos pocos. Otros promotores adecuados se conocerán por los especialistas en la técnica. Las construcciones de expresión contendrán adicionalmente sitios para el inicio de la trascripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirán preferiblemente un codón de inicio de la traducción en el comienzo y uno de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente al final del ARNm a traducir.

El vector o vectores de expresión preferiblemente incluirán al menos un marcador de selección. Dichos marcadores incluyen, por ejemplo, dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo celular eucariota, y genes de resistencia tetraciclina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, aunque sin limitación, células fúngicas tales como células de levadura; células de insecto, tales como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células animales o de mamífero tales como, aunque sin limitación, células CHO, COS, AV-12, HEPG2, NIH3T3 y de melanoma de Bowes; y células vegetales, siendo preferidas las células CHO. Los medios de cultivo apropiados y condiciones para las células huésped descritas anteriormente son conocidos en la técnica. Los vectores eucariotas preferidos incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para los especialistas en la técnica.

La introducción de una construcción de vector, o vectores, en una célula huésped puede realizarse por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, supra, Capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, Capítulos 1, 9, 13, 15, 16.

Se espera que las subunidades de FSH o una variante de FSH puedan expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puedan incluir no sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede añadirse al extremo N-terminal de un polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación, o durante manejo posterior y almacenamiento. Además, pueden añadirse restos peptídicos a un polipéptido para facilitar la purificación. Dichas regiones se espera que puedan retirarse antes de la preparación final de la FSH o una variante de FSH deseada. Dichos procedimientos se describen en líneas generales en muchos manuales de laboratorio convencionales tales como Sambrook, supra, Capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, Capítulos 16, 17 y 18.

Usando secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en este documento o conocidas en la técnica, se pueden expresar las subunidades alfa y beta de FSH o una variante de FSH en una célula eucariota diseñada de manera recombinante, tal como células de mamífero. Se espera que los especialistas en la técnica sean entendidos en los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene dos subunidades. No se hará ningún intento de describir en detalle los diversos procedimientos conocidos para la expresión de proteínas en eucariotas.

En breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifican una FSH o una variante de FSH conocida, típicamente se conseguirán uniendo de manera operativa por separado el ADN o ADNc de la subunidad alfa y la subunidad beta a un promotor (que es constitutivo o inducible), seguido de incorporación en un vector o vectores de expresión. Como alternativa, insertando el ADN, el vector proporcionará un promotor adecuado. El vector o vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en células eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de la trascripción y traducción, secuencias de inicio y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica una proteína de la presente invención. Para obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contienen, como mínimo, un promotor fuerte para dirigir la trascripción, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la trascripción/traducción. Un especialista en la técnica reconocería que pueden hacerse modificaciones sin disminuir su actividad biológica. Pueden hacerse algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de las moléculas diana en el genoma. Dichas modificaciones son bien conocidas para los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, proporcionar sitios de restricción o codones de terminación o secuencias de purificación oportunamente colocados.

Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden expresarse en una célula huésped excitándolos (por manipulación) en una célula huésped que contiene ADN endógeno que codifica las subunidades alfa y beta deseadas. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746, y 5.733.761.

Se conocen una diversidad de sistemas de expresión eucariotas tales como células de mamífero, por los especialistas en la técnica. Como se explica brevemente a continuación, un ácido nucleico que codifica la subunidad alfa y beta de una FSH o una variante de FSH conocida puede expresarse en estos sistemas eucariotas.

La síntesis de proteínas heterólogas en levaduras es bien conocida. F. Sherman, y col., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es un trabajo bien reconocido que describe los diversos procedimientos disponibles para producir la proteína en levaduras. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucariotas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Son conocidos vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia en la técnica y están disponibles de distribuidores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores adecuados habitualmente tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo 3-fosfogliceratoquinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Las secuencias que codifican las subunidades alfa y beta de FSH o una variante de FSH también pueden ligarse a diversos vectores de expresión para su uso en la transfección de cultivos celulares de, por ejemplo, origen de mamífero, insecto o vegetal. Ejemplos ilustrativos de cultivos celulares útiles para producción de los péptidos son células de mamífero. Los sistemas de células de mamífero a menudo estarán en forma de monocapas de células aunque también pueden usarse suspensiones de células de mamífero. Se han desarrollado varias líneas de células huésped adecuadas capaces de expresar proteínas intactas en la técnica, e incluyen las líneas celulares HEK293, BHK21, y CHO, siendo preferidas las líneas celulares CHO, tales como CHO K1 de Lonza. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, preferiblemente el promotor de CMV, un promotor tk de HSV, un promotor EF1 alfa, el promotor tardío o temprano de SV40, o pgk (promotor de fosfoglicerato quinasa), un potenciador (Queen, y col., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de procesamiento de la información, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli A del antígeno T grande de SV40), y secuencias de terminación de la trascripción. Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente invención están disponibles, por ejemplo, de la American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7ª edición, 1992). Las células huésped preferidas incluyen células CHO, tales como CHO-K1 y los vectores preferidos incluyen vectores GS, cada uno disponible, por ejemplo, de Lonza Biologies PLC (Slough, Berkshire, Inglaterra, UK).

Los vectores apropiados para expresar la subunidad alfa y beta de FSH o una variante de FSH en células de insecto se obtienen habitualmente del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insecto adecuadas incluyen líneas celulares de larvas de mosquito, gusanos de seda, gusanos cogolleros, polillas y Drosophila tales como la línea celular de Schneider (véase, Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-365 (1987).

Como con levaduras, cuando se emplean células huésped de animales superiores o vegetales, típicamente se incorporan secuencias de poliadenilación o terminación de la trascripción en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovina. También pueden incluirse secuencias para un corte y empalme preciso del trascrito. Un ejemplo de una secuencia de corte y empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, y col., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Adicionalmente, pueden incorporarse secuencias génicas para controlar la replicación en la célula huésped, en el vector, tales como las encontradas en vectores tipo virus del papiloma bovino. M. Saveria-Campo, Bovine Papilloma Virus DNA, a Eucaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol. II, a Practical Approach, D. M. Glover, Ed., IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-238 (1985).

FSH o una variante de FSH, una vez expresada, puede aislarse de las células aplicando técnicas de aislamiento de proteínas convencionales a los lisados. El control de los procedimientos de purificación puede conseguirse usando técnicas de transferencia de Western o radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo convencionales.

FSH o una variante de FSH, que contiene una subunidad alfa y beta, puede recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía por exclusión de tamaño, y cromatografía con lectina. Preferiblemente, se emplean cromatografía líquida de alta resolución ("HPCL"), cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de afinidad, cromatografía por exclusión de tamaño, o combinaciones de las mismas, para la purificación. FSH y variantes de FSH que tienen una subunidad alfa y beta incluyen productos purificados de manera natural, productos de procedimientos químicos sintéticos, e incluyen productos producidos por técnicas recombinantes de un huésped eucariota, incluyendo, por ejemplo, células de levadura, vegetales superiores, insecto y mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Las moléculas FSH o variantes de FSH están glicosiladas como sucedería en huéspedes eucariotas. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de los proce-
dimientos mediados por el huésped. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook, supra, Capítulos 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.

FSH o una variante de FSH conocida en la técnica incluye, aunque sin limitación, las secuencias proteicas enumeradas en la parte de identificación de secuencias de la memoria descriptiva de la cual se identifican adicionalmente a continuación:

SEC ID Nº: 1;	subunidad alfa bovina	-	96 aminoácidos
SEC ID Nº: 2;	subunidad beta bovina	-	111 aminoácidos
SEC ID Nº: 3;	subunidad alfa equina	-	96 aminoácidos
SEC ID Nº: 4;	subunidad beta equina	-	111 aminoácidos
SEC ID Nº: 5;	subunidad alfa humana	-	92 aminoácidos
SEC ID Nº: 6;	subunidad beta humana	-	111 aminoácidos
SEC ID Nº: 7;	subunidad alfa porcina	-	96 aminoácidos
SEC ID Nº: 8;	subunidad beta porcina	-	111 aminoácidos
SEC ID Nº: 9;	subunidad alfa ovina	-	96 aminoácidos
SEC ID Nº: 10;	subunidad beta ovina	-	111 aminoácidos
SEC ID Nº: 11;	variante beta humana	-	108 aminoácidos
SEC ID Nº: 12;	variante beta humana	-	109 aminoácidos
SEC ID Nº: 13;	variante beta humana	-	110 aminoácidos

La secuencia de nucleótidos de FSH o una variante de FSH, incluye, aunque sin limitación, las secuencias de nucleótidos que codifican una subunidad alfa o beta enumerada en la parte de identificación de secuencias de la memoria descriptiva de cual que se identifican adicionalmente a continuación:

SEC ID Nº: 14;	ADNc alfa humano	-	276 nucleótidos
	(codifica 92 aminoácidos)
SEC ID Nº: 15;	ADNc variante beta h.	-	324 nucleótidos
	(codifica 108 aminoácidos)
SEC ID Nº: 16;	ADNc variante beta h.	-	327 nucleótidos
	(codifica 109 aminoácidos)
SEC ID Nº: 17;	ADNc variante beta h.	-	330 nucleótidos
	(codifica 110 aminoácidos)
SEC ID Nº: 18;	ADNc beta h.	-	333 nucleótidos
	(codifica 111 aminoácidos)
SEC ID Nº: 19;	ADNc alfa humano	-	276 nucleótidos
	(codifica 92 aminoácidos)
SEC ID Nº: 20;	ADNc variante beta h.	-	324 nucleótidos
	(codifica 108 aminoácidos)

El ADN de la SEC ID Nº: 19 y 20 se diseña y construye a partir de oligonucleótidos ligados. Las diferencias entre la SEC ID Nº: 19 y la SEC ID Nº: 14 son tales que no cambia la secuencia de aminoácidos codificada de la proteína de la subunidad alfa. De forma similar, las diferencias entre la SEC ID Nº: 20 y la SEC ID Nº: 15 son tales que no cambia la secuencia de aminoácidos codificada de la proteína de la subunidad variante beta.

Los aminoácidos que constituyen las proteínas y polipéptidos de la presente invención a menudo están abreviados. Las denominaciones de aminoácidos pueden indicarse nombrando a los aminoácidos por su código de una sola letra, su código de tres letras, su nombre, o uno o más codones trinucleotídicos como es bien conocido en la técnica (véase, Alberts, B., y col., Molecular Biology of The Cell, Tercera Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994):

Código de una sola letra	Código de tres letras	Nombre	Codón (codones) de tres nucleótidos
A	Ala	Alanina	GCA, GCC, GCG, GCU
C	Cys	Cisteína	UGC, UGU
D	Asp	Ácido aspártico	GAC, GAU
E	Glu	Ácido glutámico	GAA, GAG
F	Phe	Fenilalanina	UUC, UUU
G	Gly	Glicina	GGA, GGC, GGG, GGU
H	His	Histidina	CAC, CAU
I	Ile	Isoleucina	AUA, AUC, AUU
K	Lys	Lisina	AAA, AAG
L	Leu	Leucina	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	Met	Metionina	AUG
N	Asn	Asparagina	AAC, AAU
P	Pro	Prolina	CCA, CCC, CCG, CCU
Q	Gin	Glutamina	CAA, CAG
R	Arg	Arginina	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU

(Continuación)

Código de una sola letra	Código de tres letras	nombre	Codón (codones) de tres nucleótidos
S	Ser	Serina	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	Thr	Treonina	ACA, ACC, ACG, ACU
V	Val	Valina	GUA, GUC, GUG, GUU
W	Trp	Triptófano	UGG
Y	Tyr	Tirosina	UAC, UAU

Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona formulaciones estables que contienen un conservante así como formulaciones conservadas multiuso adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que comprenden FSH o una variante de FSH en una formulación farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante seleccionado entre el grupo constituido por al menos un fenol, m-cresol, clorocresol, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso.

Como se ha indicado anteriormente, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un material de envasado y un vial que comprende una solución de FSH o una variante de FSH con los tampones y conservantes prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse durante un periodo de veinticuatro horas o más. La invención también comprende un artículo de fabricación, que comprende un material de envasado, un primer vial que comprende FSH o una variante de FSH liofilizada, y un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de conservante prescrito, en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que enseña al paciente a reconstituir la FSH o una variante de FSH en un diluyente acuoso para formar una solución que pueda mantenerse durante un periodo de veinticuatro horas o más.

La FSH o una variante de FSH usada de acuerdo con la presente invención puede producirse por medios recombinantes, incluyendo a partir de células de mamífero o preparaciones transgénicas, o puede purificarse a partir de otras fuentes biológicas, tales como a partir de orina. Las metodologías aceptables incluyen las descritas en Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69, 1997; Keene, y col., J. Biol. Chem., 264:4769-4775, 1989; Cerpa-Poljak, y col., Endocrinology, 132:351-356, 1993; Dias, y col., J. Biol. Chem., 269:25289-25294, 1994; Flack, y col., J. Biol. Chem., 269:14015-14020, 1994; y Valove, y col., Endocrinology, 135:2657-2661, 1994, y la Patente de Estados Unidos Nº 3.119.740.

El procedimiento por medio del cual se proporcionan las proteínas para las formulaciones de esta invención no es particularmente importante. Preferiblemente, FSH es un heterodímero que comprende una subunidad alfa y una subunidad beta, respectivamente, como se proporcionan en la SEC ID Nº 5 y 6, o un heterodímero de variante de FSH que comprende una subunidad alfa y una subunidad beta, respectivamente, como se proporcionan en la SEC ID Nº: 5 y 11; 5 y 12; 5 y 13. Las especies de FSH o de variante de FSH adecuadas en la presente invención incluyen, aunque sin limitación, al menos una secuencia de subunidad alfa conocida y al menos una subunidad beta conocida (véase la lista de secuencias para las subunidades alfa y beta conocidas y como se conocen de otra forma en la técnica).

Los ejemplos no limitantes de FSH o de una variante de FSH incluyen, aunque sin limitación:

4

5

6

El intervalo de hormona proteica en el producto de la presente invención incluye cantidades que producen tras la reconstitución, si están en un sistema húmedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1,0 \mug/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aunque son posibles concentraciones menores y mayores y dependen del vehículo de suministro pretendido, por ejemplo, las formulaciones en solución diferirán de los parches transdérmicos, y de los procedimientos pulmonar, transmucoso, o de bomba osmótica o microbomba. Las concentraciones de hormonas preferiblemente son de 5,0 \mug/ml a 2 mg/ml, y más preferiblemente de aproximadamente 5,0 \mug/ml, o 10 \mug/ml, o de 50 \mug/ml a aproximadamente 200 \mug/ml.

El diluyente acuoso además comprende un conservante farmacéuticamente aceptable. Los conservantes incluyen los seleccionados entre el grupo constituido por fenol, m-cresol, clorocresol, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el conservante es meta-cresol, fenol, clorocresol, o una mezcla de los mismos, siendo el más preferido el m-cresol. La concentración de conservante usada en la formulación es una concentración suficiente para producir un efecto antimicrobiano. Dichas concentraciones dependen del conservante seleccionado y de determinan fácilmente por el especialista en la técnica. Por ejemplo, el m-cresol o fenol (solos o en combinación) generalmente están a una concentración de aproximadamente 23 mM a aproximadamente 35 mM. Sorprendentemente, los conservantes usados en las formulaciones reivindicadas en el momento actual no afectan de manera adversa a la actividad biológica de FSH o una variante de FSH y permiten una administración multiuso.

Al diluyente se le pueden añadir opcional y preferiblemente otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, tampones, antioxidantes, potenciadores del conservante. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa comúnmente a concentraciones conocidas. La concentración de glicerina generalmente es de aproximadamente 16 mg/ml. Preferiblemente se añade un tampón fisiológicamente tolerado para proporcionar un mejor control del pH. Las formulaciones pueden cubrir un amplio intervalo de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, e intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y un intervalo más preferido de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. Preferiblemente, las formulaciones de la presente invención tienen un valor de pH entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,8. Los tampones preferidos incluyen tampones fosfato, más preferiblemente fosfato sódico, particularmente solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Opcionalmente se les pueden añadir a las formulaciones o composiciones otros aditivos, tales como solubilizantes farmacéuticamente aceptable tales como Tween 20 (monolaurato de polioxietilen (20) sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxietilen (20) sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxietilen (20) sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 20 u 80 o poloxámero 184 o 188, polioles Pluronic®, otros copolímeros de bloque, y quelantes tales como EDTA y EGTA para reducir la agregación. Estos aditivos son particularmente útiles si se usa una bomba o recipiente de plástico para administrar la formulación. La presencia de tensioactivos farmacéuticamente aceptables mitiga la tendencia de la proteína a agregarse. Las formulaciones reivindicadas en el presente documento son sorprendentemente estables. Antes de la presente invención, se creía que la preparación de formulaciones multiuso conservadas de FSH era imposible debido a la inestabilidad. Los solicitantes han descubierto que las formulaciones reivindicadas pueden almacenarse de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente 40ºC y conservan la actividad biológica de la proteína durante periodos de tiempo prolongados, que exceden de 2 meses y como se demuestra adicionalmente.

Las formulaciones de la presente invención pueden prepararse por un procedimiento que comprende mezclar FSH o una variante de FSH y un conservante seleccionado entre el grupo constituido por fenol, m-cresol, clorocresol, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla de FSH o una variante de FSH y un conservante en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos de disolución y mezcla convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad medida de FSH o una variante de FSH en solución tamponada, se combina con el conservante deseado en una solución tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el conservante a las concentraciones deseadas. Un especialista en la técnica reconocería variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos convencionales, la temperatura y pH a los que se prepara la formulación son factores que pueden optimizarse para la concentración y medios de administración usados.

Las formulaciones reivindicadas pueden proporcionarse a pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de FSH o una variante de FSH liofilizada que se reconstituye con un segundo vial que contiene un conservante y/o excipientes, preferiblemente un tampón fosfato y/o solución salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. El vial de solución individual o el vial doble que requiere la reconstitución pueden reutilizarse múltiples veces y pueden ser suficientes para uno solo o múltiples ciclos de tratamiento del paciente y, de esta manera, proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que el disponible actualmente.

Los artículos de fabricación reivindicados en el presente documento son sorprendentemente útiles para la administración durante un periodo de veinticuatro horas o más. Antes de la presente invención, dichos productos sólo eran adecuados y estaban aprobados para el uso inmediato. Se ordenaba al paciente que desechara el material no usado, lo que conducía a residuos y gastos. Por consiguiente, los artículos de fabricación reivindicados en el presente documento ofrecen ventajas significativas para el paciente. Los solicitantes han descubierto que las formulaciones reivindicadas pueden almacenarse de forma segura a temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente 40ºC y conservan la actividad biológica de la proteína durante periodos de tiempo prolongados, que exceden de 2 meses permitiendo, por tanto una etiqueta que indique que la solución puede conservarse y/o usarse durante un periodo de 24, 36, 48, 72 ó 96 horas o más. Si se usa un diluyente conservado, esta etiqueta puede incluir el uso hasta uno, uno y medio y
dos años.

Las soluciones de FSH o una variante de FSH en la invención pueden preparase por un procedimiento que comprende mezclar FSH o una variante de FSH en un diluyente acuoso. La mezcla se realiza usando procedimientos de disolución y mezcla convencionales. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, una cantidad medida de FSH o una variante de FSH en agua o tampón, se combina en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y un conservante a las concentraciones deseadas. Un especialista en la técnica reconocería las variaciones de este procedimiento. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulación, son factores que pueden optimizarse para la concentración y medios de administración usados.

Los productos reivindicados pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de FSH o una variante de FSH liofilizada que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. El vial de solución individual o el vial doble que requiere la reconstitución, pueden reutilizarse múltiples veces y pueden ser suficientes para uno solo o múltiples ciclos de tratamiento del paciente y, por tanto, proporcionan un régimen de tratamiento más adecuado que el disponible actualmente.

Los productos reivindicados pueden proporcionarse indirectamente a los pacientes proporcionando a las farmacias, clínicas, u otras instituciones e instalaciones similares, soluciones transparentes o viales dobles que comprenden un vial de FSH o una variante de FSH liofilizada que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. En este caso, la solución transparente puede tener un tamaño de hasta un litro o incluso mayor, proporcionando un depósito grande desde el cual pueden recogerse partes más pequeñas de la solución de FSH o una variante de FSH una o múltiples veces para transferirse a viales más pequeños y proporcionarse por la farmacia o clínica a sus clientes y/o pacientes. El vial de diluyente en este caso puede tener un tamaño de hasta un litro o incluso mayor, proporcionando un depósito grande desde el cual pueden extraerse partes más pequeñas del diluyente múltiples veces para la reconstitución de FSH o una variante de FSH liofilizada. La solución transparente o la solución de FSH o una variante de FSH reconstituida proporcionada por la farmacia o clínica a sus clientes y pacientes, puede ser suficiente para uno solo o múltiples ciclos de tratamiento de pacientes y de esta forma proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que el disponible actualmente.

Los dispositivos reconocidos que comprenden estos sistemas de un solo vial incluyen los dispositivos de inyector de pluma para suministrar una solución tal como Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, y OptiPen®. Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de vial doble incluyen los sistemas de inyector de pluma para reconstituir un fármaco liofilizado en un cartucho para suministrar la solución reconstituida tal como HumatroPen®.

Los productos reivindicados en el presente documento incluyen material de envasado. El material de envasado proporciona, además de la información requerida por las agencias reguladoras, las condiciones en las que puede usarse el producto. El material de envasado de la presente invención proporciona instrucciones al paciente para reconstituir la FSH o una variante de FSH en el diluyente acuoso para formar una solución y usar la solución durante un periodo de veinticuatro horas o más para el producto de dos viales húmedo/seco. Para el producto de solución de un solo vial, la etiqueta indica que dicha solución puede usarse durante un periodo de veinticuatro horas o más. Los productos reivindicados en el presente documento son útiles para uso farmacéutico humano.

Las formulaciones estables o conservadas reivindicadas pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones transparentes o como viales dobles que comprenden un vial de FSH o una variante de FSH liofilizada que se reconstituye con un segundo vial que contienen un conservante o tampón y excipientes en un diluyente acuoso. Un vial de solución individual o un vial doble que requiere la reconstitución, puede reutilizarse múltiples veces y puede ser suficiente para uno solo o múltiples ciclos de tratamiento del paciente y, por tanto, proporciona un régimen de tratamiento más adecuado que el disponible actualmente.

La FSH o una variante de FSH en las formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas en este documento, pueden administrarse a un paciente de acuerdo con la presente invención mediante una diversidad de procedimientos de suministro que incluyen inyección SC o IM; administración transdérmica, pulmonar, transmucosa, por implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba, por vía oral, u otros medios apreciados por el especialista en la técnica, como es bien conocido en la técnica.

Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar adicionalmente la preparación de las formulaciones y composiciones de la invención. No debe considerarse que el alcance de la invención consta meramente de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Clonación y Expresión de FSH o una variante de FSH en Células de Mamífero

Un vector de expresión de mamíferos típico contiene al menos un elemento promotor, que media el inicio de la trascripción del ARNm, la secuencia codificante del polipéptido, y señales necesarias para la terminación de la trascripción y poliadenilación del trascrito. Sin embargo, como la FSH o variantes de FSH funcionales contienen tanto una subunidad alfa como una subunidad beta, se requieren medios para expresar las dos subunidades, expresando las dos subunidades a partir de un solo vector que contiene un elemento promotor para cada subunidad, o usando dos vectores: un primer vector que contenga un promotor para expresar la primera subunidad y un segundo vector que tenga un promotor para expresar la segunda subunidad.

Adicionalmente, cada vector de expresión de mamífero tiene elementos que pueden estar presentes en uno o más vectores e incluyen potenciadores, secuencias Kozak y secuencias de intervención flanqueadas por sitios donadores y aceptores para el corte y empalme del ARN.

Puede conseguirse una trascripción altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de Retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también pueden usarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humana). Los vectores de expresión adecuados para su uso para proporcionar subunidades de FSH o variantes de FSH incluyen, por ejemplo, vectores tales como pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, o pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL y PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) and pBC12MI (ATCC 67109). Las células huésped de mamífero que podrían usarse incluyen células humanas Hela 293, H9 y Jurkat, células de ratón NIH3T3 y C127, células Cos 1, Cos 7 y CV 1, células de codorniz QC1-3, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO).

Como alternativa, las secuencias de ADN deseadas para la subunidad alfa y beta pueden expresarse en líneas celulares estables que contienen las secuencias de ADN para expresar cada subunidad una vez integrada en uno o más cromosomas. La co-transfección con un marcador de selección tal como dhfr, gpt, neomicina, o higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas como se conoce en la técnica.

Las secuencias de ADN transfectadas para las subunidades también pueden amplificarse para expresar grandes cantidades del polipéptido codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que lleven varios cientos o incluso varios miles de copias de las secuencias de ADN de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy, y col., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, y col., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Usando estos marcadores, se hacen crecer las células de mamífero en medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el gen o genes amplificados integrados en un cromosoma. Para la producción de proteínas y polipéptidos a menudo se usan células de ovario de hámster chino (CHO) y células NSO.

Los vectores de expresión PC1 y PC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del Sarcoma de Rous (Cullen, y col., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) más un fragmento del potenciador de CMV (Boshart, y col., Cell 41:521-530 (1985)). Los múltiples sitios de clonación, por ejemplo, con los sitios de escisión de enzimas de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación de las secuencias de ADN de las subunidades alfa y beta de interés. Los vectores contienen además el intrón 3', la señal de poliadenilación y la señal de terminación del gen de la preproinsulina de rata.

Ejemplo 2 Clonación y Expresión en Células COS o CHO

Se obtiene un plásmido de expresión para FSH o una variante de FSH por clonación de un ADNc que codifica las subunidades de FSH o una variante de FSH en el vector de expresión pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que puede obtenerse en Invitrogen, Inc.). Como se ha mencionado previamente, se requiere la expresión de cada subunidad para producir un heterodímero funcional, por la introducción independiente de vectores separados en la célula huésped o por diseño de un solo vector para expresar las subunidades tanto alfa como beta.

El vector o vectores de expresión pcDNAI/amp contiene: (1) un origen de replicación de E. coli eficaz para la propagación en E. coli y otras células procariotas; (2) un gen de resistencia a ampicilina para la selección de células procariotas que contienen el plásmido; (3) un origen de replicación de SV40 para la propagación en células eucariotas; (4) un promotor de CMV, un poliengarce, un intrón de SV40; (5) varios codones que codifican un fragmento de hemaglutinina (es decir, una señal "HA" para facilitar la purificación) o una señal HIS (véase, por ejemplo, Ausubel, supra) seguido de un codón de terminación y una señal de poliadenilación dispuesta de tal manera que un ADNc pueda colocarse oportunamente bajo el control de la expresión del promotor de CMV y unirse de forma operativa al intrón de SV40 y la señal de poliadenilación por medio de sitios de restricción presentes en el poliengarce. La señal HA corresponde a un epítope derivado del polipéptido de hemaglutinina de la gripe descrito por by Wilson, y col., Cell 37:767-778 (1984). La fusión de la señal HA al polipéptido diana, la subunidad alfa o beta, permite detectar y recuperar fácilmente el polipéptido recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítope de HA. pcDNAIII contiene, además, el marcador de selección neomicina.

Por separado se clona un fragmento de ADN que codifica la subunidad alfa y beta de FSH o una variante de FSH en la región de poliengarce del vector de forma que la expresión del polipéptido recombinante esté dirigida por el promotor de CMV. La inserción en el vector opcionalmente se realiza con o sin el epítope de HA. La estrategia de construcción del plásmido es la siguiente. El ADNc de la FSH o una variante de FSH del clon depositado para cada subunidad, se amplifica usando cebadores que contienen sitios de restricción adecuados.

El fragmento de ADN amplificado por PCR para cada subunidad y el vector, pcDNAI/Amp, se digieren con una o más enzimas de restricción adecuadas y después cada subunidad se liga al vector digerido. Cada mezcla de ligamiento se utiliza para transformar la cepa SURE de E. coli (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), y el cultivo transformado se cultiva en placas con medios con ampicilina que después se incuban para permitir el crecimiento de colonias resistentes a ampicilina. Se aísla el ADN plasmídico para cada subunidad a partir de las colonias resistentes y se examina por análisis de restricción u otros medios para determinar la presencia del fragmento codificante de la FSH o una variante de FSH.

Para la expresión de FSH o una variante de FSH recombinante, se co-transfectan células COS con un vector de expresión para cada subunidad, como se ha descrito anteriormente, usando DEAE-DEXTRANO, como se describe, por ejemplo, en Sambrook, y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Las células se incuban en condiciones para la expresión de FSH o una variante de FSH, por cada vector.

Es de esperar que la expresión del polipéptido de fusión de FSH HA o variante de FSH HA se detecte por radiomarcaje e inmunoprecipitación, usando procedimientos descritos, por ejemplo, en Harlow, y col., Antibodies: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988). Para este fin, dos días después de la transfección, las células se marcan por incubación en medios que contienen 35S-cisteína durante 8 horas. Se recogen las células y los medios, y las células se lavan y se lisan con tampón RIPA que contiene detergente: NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, TRIS 50 mM, pH 7,5, como se describe por Wilson y col. citado anteriormente. Se precipitan las proteínas del lisado celular y de los medios de cultivo usando un anticuerpo monoclonal específico para HA. La proteína precipitada después se analiza por SDS-PAGE y se autorradiografía. En el lisado celular se ve un producto de expresión del tamaño esperado, que no se ve en los controles negativos.

Se usa el vector pC4 para la expresión de cada subunidad de FSH o una variante de FSH. Como alternativa, un especialista en la técnica sería capaz de adaptar pC4 para expresar las subunidades tanto alfa como beta a partir de un solo vector. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (Nº de acceso de la ATCC 37146). El plásmido contiene el gen de HFR de ratón bajo el control del promotor temprano de SV40. Las células de ovario de hámster chino u otras células que carecen de actividad dihidrofolato que se co-transfectan con plásmidos de subunidad alfa y beta pueden seleccionarse haciendo crecer las células en un medio de selección (MEM sin alfa, Life Technologies) suplementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes DHFR en células resistentes a metotrexato (MTX) se ha documento bien (véase, por ejemplo, F. W. Alt, y col., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin y C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M. J. Page y M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Las células que han crecido en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al fármaco por sobreproducción de la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificación del gen DHFR. Si se asocian secuencias de ADN al gen DHFR, normalmente se co-amplifica y sobre-expresa. En la técnica se sabe que esta estrategia puede usarse para desarrollar líneas celulares que lleven más de 1.000 copias del gen o genes amplificados. Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen líneas celulares que contienen las secuencias de ADN amplificadas e integradas en uno o más cromosomas de la célula huésped.

El plásmido pC4 contiene para la expresión de la subunidad alfa y beta, secuencias de ADN de interés detrás del promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR) del virus del Sarcoma de Rous (Cullen, y col., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) que contiene adicionalmente un fragmento aislado del potenciador del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) (Boshart, y col., Cell 41:521-530 (1985)). Cadena abajo del promotor se encuentran sitios de escisión por enzimas de restricción BamHI, Xbal, y Asp718 que permiten la integración de las secuencias de ADN. Detrás de estos sitios de clonación el plásmido contiene el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen de la preproinsulina de rata. También pueden usarse otros promotores de alta eficacia para la expresión, por ejemplo, el promotor de la b-actina humana, los promotores temprano o tardío de SV40 o las repeticiones terminales largas de otro retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI. Pueden usarse sistemas de expresión de genes Tet-Off y Tet-On de Clontech y sistemas similares para expresar la FSH y una variante de FSH, de una forma regulada, en células de mamífero (M. Gossen, y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para la poliadenilación del ARNm, también pueden usarse otras señales, por ejemplo, de genes de la hormona del crecimiento humana o de globina. También pueden seleccionarse líneas celulares estables que llevan las secuencias da ADN de la subunidad alfa y beta integradas en los cromosomas tras la co-transfección con un marcador de selección tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar más de un marcador de selección al principio, por ejemplo, G418 más metotrexato.

El plásmido pC4 se digiere con enzimas de restricción y después se desfosforila usando fosfatasa intestinal de ternero por procedimientos conocidos en la técnica. Después el vector de aísla a partir de un gel de agarosa al 1%.

La secuencia de ADN que codifica la FSH o una variante de FSH completa, para cada subunidad, se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. Los ejemplos no limitantes incluyen cebadores 5' y 3' que tienen nucleótidos correspondientes o complementarios a una parte de la secuencia codificante de cada subunidad para una FSH o una variante de FSH de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.

El fragmento o fragmentos amplificados se digieren con endonucleasas adecuadas y después se purifican de nuevo en un gen de agarosa al 1%. Después los fragmentos aislados para cada subunidad y el vector desfosforilado se ligan por separado con ADN ligasa de T4. Después se transforman células E. coli HB101 o XL-1 Blue por separado y se identifican las bacterias que contienen el fragmento (o fragmentos si el vector está adaptado para expresar subunidades tanto alfa como beta) insertado en el plásmido pC4, usando, por ejemplo, análisis con enzimas de restricción.

Para la transfección se usan células de ovario de hámster chino (CHO) que carecen de un gen DHFR activo. Se co-transfectan 5 \mug del plásmido o plásmidos de expresión pC4 con 0,5 \mug del plásmido pSV2-neo usando lipofectina. El plásmido pSV2neo contiene un marcador de selección dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en MEM sin alfa suplementado con 1 \mug/ml de G418. Después de 2 días, las células se tratan con tripsina y se siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) en MEM sin alfa suplementado con 10, 25, ó 50 ng/ml de metotrexato más 1 \mug/ml de G418. Después de aproximadamente 10-14 días, se tratan con tripsina los clones individuales y después se siembran en placas petri de 6 pocillos o en matraces de 10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Después, los clones que crecen a las mayores concentraciones de metotrexato se transfieren a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones incluso mayores de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100-200 mM. La expresión del producto deseado se analiza, por ejemplo, por SDS-PAGE y transferencia de Western o por análisis de HPLC en fase inversa.

Será evidente que la invención puede ponerse en práctica de otra manera que como se ha descrito particularmente en la descripción anterior y ejemplos.

En la técnica se conocen numerosas modificaciones y variaciones de las presentes metodologías para expresar proteínas recombinantes, incluyendo las descritas en Keene J.L., y col., J. Biol. Chem., 264:4769-4752, 1989; Loumaye E., y col., Human Reprod. Update, 1:188-1999, 1995; Olijve W., y col., Mol. Hum. Reprod., 2:361-369, 1996, así como otras técnicas recombinantes conocidas y usadas para otras gonadotropinas.

Ejemplo 3 Expresión en células AV12

Se usó un casete de expresión del vector pGTH para la expresión de la subunidad alfa en AV12. Varios artículos publicados describen el uso de células AV12-664 y/o AV12-RGT18 (véase, Grinnell, B.W. y col., Blood 76(12):2546-54,1990; Burck, P.J. y col., J. Biol. Chem. 265(9):5170-7, 1990; Parkinson, J.F. y col., J. of Biol. Chem. 265 (21):12602-10, 1990; Grinnell, B.W. y col., J. Biol. Chem 266(15):9778-85, 1991; Wery, J.P. y col., Nature 352(6330):79-82, 1991; Berg, D.T. y col., Biotechniques 14:972-9, 1993; Gerlitz, B. y col. Biochemical Journal 295 (1): 131-40, 1993; Kursar, J.D. y col. Molecular Pharmacology 46(2):227-34, 1994; Desai, M.A. y col. Molecular Pharmacology 48 (4):648-57, 1995; Obesity Research 3 Supl 4:4441S-4447S, 1995; Desai, M.A. y col. British Journal of Pharmacology 118(6):1558-64, 1996; Kumar, A. y col. Cancer Research 56(23):5397-402, 1996; Boggs, L.N. y col. J. of Neurochemistry 57(3):1324-7, 1996; Lucaites, V.L y col. Life Sciences 59(13):1081-95, 1996; Schoepp. D.D. y col. Neuropharmacology 35(12):1661-72, 1996; Kumar, A. y col. Cancer Research 57(15):3111-4, 1997; Urology 49(3):487-93, 1997; Wainscott, D.B. y col. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharacology 357(1):17-24, 1998; Wu, S. y col. Brain Research - Molecular Brain Research 53 (1-2):88-97, 1998. De manera similar, ciertas publicaciones han descrito el uso del plásmido pGTH (véase, Grinnell, y col. J. Biol. Chem. 266(15):9778-85, 1991) y el plásmido pGTD (véase, Biolchemical Journal 295 (Pt1): 131-40, 1993).

Brevemente, pGTH contiene secuencialmente varios elementos: el promotor temprano de SV40.ori, resistencia a higromicina de E. coli, el sitio de corte y empalme/sitio poli-A del antígeno "t" pequeño de SV40, el remanente de clonación de pBR322, el remanente de clonación del virus BK (cepa P2), un elemento poli-CA_{20}/GT_{20} (oligonucleótido sintético), potenciador del virus BK (cepa P2), el promotor tardío principal/líder tripartito sometido a corte y empalme de AD2, el sitio de inserción Bcl1 para la secuencia codificante de la subunidad alfa de FSH (incluyendo codón de parada), sitio de corte y empalme/sitio poli-A del antígeno "t" pequeño de SV40; y resistencia ampicilina/ori de pBR322.

Se generó la construcción plasmídica pGTH-alfa para expresar la secuencia de la subunidad alfa humana codificada (SEC ID: 5) clonando un fragmento de ADNc de FSH BclI de 362-pb en el único sitio BclI del vector (véase secuencia SEC ID: 19 ó 14). Se generó el ADN del fragmento de ADNc alfa de FSH por amplificación por PCR usando el plásmido lanzadera pLGD637 como molde (pLGD637 contiene una secuencia de ADNc alfa de FSH sintética/ensamblada a oligonucleótido). La integridad del inserto BclI se confirmó por secuenciación seguida de comparación con la base de datos GenPept (Número de Acceso 31869).

Se usó un casete de expresión del vector pGTD para expresar la secuencia de la subunidad beta de la variante FSH humana (SEC ID: 11). pGTD contiene varios elementos para la expresión en células AV12. pGTD contiene secuencialmente el remanente de clonación del virus BK (cepa P2), el elemento poli-CA_{20}/GT_{20}(oligonucleótido sintético), el potenciador del virus BK (cepa P2), el promotor tardío principal/líder tripartito sometido a corte y empalme de AD2, el sitio de inserción Bcl1 para la secuencia codificante de la subunidad beta de la variante FSH (incluyendo codón de parada), sitio de corte y empalme/sitio poli-A del antígeno "t" pequeño de SV40; el promotor temprano de SV40.ori, el ADNc de la dihidrofolato reductasa murina, el sitio de corte y empalme/sitio poli-A del antígeno "t" pequeño de SV40, y resistencia a ampicilina /ori de pBR322.

Se generó la construcción plasmídica pGTD-bCD3 clonando el fragmento de ADNc beta-Bcd3 de FSH BclI de 393-pb en el único sitio BclI del vector pGTD (véase SEC ID: 20 ó 15). Se generó el ADN del fragmento de ADNc beta-CD3 de FSH por amplificación por PCR, usando el plásmido lanzadera pLGD638 como molde (pLGD638 contiene una secuencia de ADNc de beta de FSH sintética/ensamblada a oligonucleótido). La integridad de la construcción se confirmó por secuenciación y se comparó con la secuencia de la subunidad beta humana depositada en la base de datos GenPept (Número de Acceso 476441).

Brevemente, los plásmidos pGTH-alfa y pGTD-bCD3 se linealizaron, re-purificaron, y después se co-transfectaron en células AV23-RGT18 adherentes. Después de la selección con medio que contenía metotrexato 0,25 \muM y 100 \mug/ml de higromicina-B, junto con 200 \mug/ml de G418 para mantener el genotipo transportador de glutamato de las células VA12-RGT18, se aislaron clones estables individuales manualmente o mediante clasificación de células asistidas por flujo. Los clones de producción más alta se identificaron por análisis de medio condicionado con un kit de Elisa de FSH comercial. Se adaptaron varios clones a suspensión libre de suero y se amplificaron adicionalmente para obtener cantidades aislables del heterodímero de la variante FSH.

Ejemplo 4 Expresión en células CHO-K1

Se desarrolló una línea celular CHO-K1 (LONZA Biologics plc.) para producir un heterodímero de la variante FSH compuesto de la subunidad alfa de SEC ID Nº 5 y la subunidad beta de SEC ID Nº 11.

El casete del vector de expresión contiene el ADN codificante para la subunidad alfa, SEC ID Nº 5, y el ADN codificante para la subunidad beta, SEC ID Nº 11 se controla por dos promotores diferentes: CMV para la subunidad beta y EF1 Alfa para la subunidad alfa. Cada secuencia de la subunidad alfa y beta usa la cola poliA de la Hormona de Crecimiento Bovina. Adicionalmente, el vector contiene el gen de la Glutamina Sintetasa, controlado por el Promotor Tardío de SV40 y que contiene la cola poliA de SV40, se usa como marcador de selección. Este vector se usó para transfectar las células CHO-K1.

La línea celular se hizo crecer en medios CD CHO de GibcoBRL en presión selectiva de L-metionina sulfoximina. Se usaron ensayos ELISA para identificar los pocillos principales que expresaban la variante de FSH. Se sometieron a procedimientos de clonación y amplificación varios pocillos principales. Estos experimentos condujeron a la línea celular clonal 2B6.1C3.25 que tiene títulos adecuados. Los estudios de expresión realizados en matraces de agitación a pequeña escala (20-60 ml) han demostrado que esta línea expresa la variante de FSH a 3 mg/l después de 7 a 8 días.

Ejemplo 5 Purificación de las variantes de FSH de células CHO o AV-12

La purificación del heterodímero de la variante FSH compuesto de una subunidad alfa de SEC ID Nº 5 y una subunidad beta de SEC ID Nº 11 puede conseguirse por varios procedimientos descritos y conocidos en la técnica a partir de cultivos monocapa o en suspensión de líneas celulares CHO-K1 o AV-12 u otras líneas de producción adecuadamente disponibles. Un procedimiento para aislar la variante de FSH descrita del medio que contiene cultivo es sometiendo el medio de cultivo a cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía por afinidad de colorante y cromatografía por filtración en gel para purificar la proteína. En el caso de cultivos en suspensión, que pueden contener detergentes, pueden ser necesarias etapas de purificación adicionales tales como una etapa de Q-Sepharose. Las etapas cromatográficas pueden añadirse adicionalmente a u optimizarse para pH, conductividad, composición del tampón y condiciones de procesamiento (dimensiones de la columna, caudales, etc.). La pureza y rendimiento analizarse por geles SDS-PAGE (tinción con Coomassie y transferencia de Western), ensayos ELISA, cromatografía de exclusión y concentración proteica por absorbancia en UV a 277 nm u otras técnicas conocidas.

La purificación y fraccionamiento cromatográfico puede conseguirse siguiendo los detalles adicionales para cada etapa de aislamiento dados a continuación. Para cultivos monocapa, el medio condicionado se concentra y se diafiltra antes de la aplicación a la columna de intercambio catiónico. La etapa discontinua de Q-Sepharose puede incluirse para cultivos en suspensión para retirar los detergentes que pueden estar presentes.

1. Concentración

Típicamente, si se usa Pluronic F68 del 0,02 al 0,04% para cultivos en suspensión de AV12, mientras que hay del 0,1 al 0,18% en los medios usados para cultivos en suspensión de CHO. El medio condicionado, aclarado por el grupo de cultivo celular usando centrifugación y filtración a través de una estopilla, se concentra usando un sistema de filtración en flujo tangencial Proflux (Proflux M12 de Millipore) con un cartucho espiral S3YM10 (Amicon Nº 540633). Dependiendo de la cantidad de Pluronic F68 que se usó, el medio se concentra de 4 a 10 veces de modo que hay Pluronic F68 del 0,2-0,4% en el medio concentrado. El volumen final de material después de la concentración es habitualmente 2-3 l comenzando con 8 litros para los cultivos de CHO-K1 y 24 l para AV12.

2. Separación con Q-Sepharose

Para cada litro de medio condicionado de inicio antes de la concentración, se añaden 50 ml de resina Fast Flow Q-Sepharose (Pharmacia 17-0510-01, preequilibrada con Tris 20 mM, pH 7,4) y suficiente NaCl para dar una conductividad final de 200 mM (\sim20 mS/cm) al medio concentrado y se agita suavemente durante una noche a 4ºC.

3. Diafiltración

Después de separación durante una noche del medio concentrado con resina Q-Sepharose, la resina se deja asentar, el sobrenadante se retira por decantación y se filtra usando un sistema CUNO con un filtro Zeta Plus 30-SP (Nº B0406-30SP de Sun Source Fauver) y una bomba Masterflex a un caudal de 170 ml/min. El medio después se concentra adicionalmente a aproximadamente 800 ml y se diafiltra usando 5-6 volúmenes de Tris 20 mM, pH 7,4 en el sistema Proflux. En este punto, la conductividad es \sim2 mS/cm. El pH se ajusta a 5,0 con HCl 1 N y la solución se filtra otra vez usando un filtro Zeta Plus 30-SP nuevo en el sistema CUNO y se carga inmediatamente en la columna de Intercambio Catiónico.

4. Cromatografía de Intercambio Catiónico (CEX)

Columna: Pharmacia SP-Sepharose Fast Flow (17-0729-01) se usa para compactar una columna de 50 ml para \sim100-200 mg de FSH (proteína total \sim500-600 mg). Los tampones son: A: fosfato sódico 20 mM, pH 5,0; y B: fosfato sódico 20 mM, pH 5,0, NaCl 1 M.

La muestra que ajusta a pH 5,0, se aclara por filtración y se carga inmediatamente en la columna y se procesa a 5 ml/min con 4 volúmenes de columna antes de iniciar un gradiente de 0% a 50% de B sobre 15 volúmenes de columna. Se recogen fracciones de 3 minutos (15 ml). Las fracciones se recogen en 400 ml de Tris 1 M, pH 8,0.

Se usan geles SDS PAGE teñidos con Coomassie para elegir la fracciones que contienen FSH a combinar (típicamente el tamaño de la combinación es 200 a 250 ml para una columna de 50 ml). Esta combinación se dializa frente a Tris 20 mM, pH 7,4 durante una noche a 4ºC para disminuir la conductividad a <3 mS/cm.

5. Cromatografía por Afinidad de Colorante (DAC)

Columna: se usa Mimetic Blue Dye 1 A6XL, 0090-0500 de Prometic Bioscienciences Inc. en una columna de 50 ml para \sim40 mg de FSH. Los tampones son: A: fosfato 25 mM, pH 6,5 (la conductividad es 4,5 a 5 mS/cm); B: fosfato 25 mM, KCL 150 mM, pH 6,5; C: fosfato 25 mM, KCl 1M, pH 8,0.

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Después de la diálisis de la combinación CEX, el pH se ajusta a 6,5, y se carga en la columna de DAC 3 ml por minuto. Se aplica un gradiente del 100% de A al 50% de A; 50% de B para 4 volúmenes de columna, después se eluye con tampón C al 100% para 5 volúmenes de columna, recogiendo fracciones de 3 minutos (9 ml).

Se usan geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie para elegir las fracciones que contienen FSH a combinar. Típicamente, el tamaño de la combinación es 90 a 100 ml para una columna de 50 ml. La combinación se concentra a 4 ml usando dispositivos de centrífuga Millipore Ultrafree (UFV2BCC40, 5000 MWCO, girado a 2000 rpm) y se carga en una columna de filtración en gel.

6. Filtración en Gel

Columna: se usa una columna BioPilot Superdex 75 Prep Grade 35/600 para 50 a 100 mg de FSH. Los tampones: 1x PBS (fabricado de GIBCO 10x PBS, Nº 70011) más NaCl 100 mM. La composición final del tampón es fosfato potásico monobásico 1 mM, fosfato sódico dibásico 3 mM, cloruro sódico 253 mM, pH 7,4.

La columna se carga con 4 ml de FSH de la etapa DAC en 1x PBS como se ha descrito anteriormente a un caudal: 3 ml/min recogiendo fracciones de un minuto (3 ml).

La pureza de FSH después de esta etapa es habitualmente >95% por geles teñidos con Coomassie y plata.

Ejemplo 6 Efecto de conservantes en la Estabilidad Física de FSH

Como los conservantes tienden a desnaturalizar o desestabilizar la proteína o inducir agregación (Brange, J. y Langkjar, L., Acta Pharm. Nord, 4, 149-158, 1992; Maa YF y Hsu C, International Journal of Pharmaceutics, 140, 155-168, 1996), la estabilidad física de uFSH (uFSH - Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) en presencia de diferentes conservantes se examinó usando la técnica de dispersión de luz dinámica. Todas las medidas se obtuvieron con un sistema que constaba de un láser de argón Lexel 95 (488 nm), un goniómetro Brookhaven Instruments modelo BI-200SM, y un autocorrelacionador BI9000AT. Los parámetros de los datos constan de: recuento de fotones iniciales ajustados a 100.000 cuentas/segundo, duración de 30 segundos, valor de limite en polvo de 31, y un ángulo de dispersión de 90º.

Los conservantes se añadieron a una solución de 1,5 ml de 1 mg/ml hormona folículo estimulante de orina (uFSH - Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) que se había dializado frente a 1 x PBS durante una noche a pH 7,4. La concentración del conservante se seleccionó para que fuera la concentración generalmente conocida para proporcionar actividad antimicrobiana adecuada. En una campana de flujo laminar, esta muestra se filtro a través de un filtro Anotop-Plus de 0,1 \mum (10 mm) en un tubo de ensayo LSD de 12 mm. La muestra se colocó en el portador DLS que se había equilibrado a 37ºC. La función de autocorrelación se determinó cada 15 minutos durante 24 horas y se analizó para producir el parámetro hidrodinámico. Esta medida demostró que más del 99% de las moléculas proteicas tenían un diámetro medio de aproximadamente 5,7 nm. Una pequeña población (<1%) tuvo un diámetro medio de aproximadamente 200 nm. La presencia de los conservantes no cambió la distribución de tamaño de las moléculas apreciablemente después de 24 horas a 37ºC. Los datos representativos a las 24 horas después se analizaron usando el programa NNLS (Cuadrados Lineales No Negativos) como se muestra en la Tabla I. Más del 99% de las moléculas estaban en partículas con un diámetro medio de aproximadamente 5,7 nm. Usando una ecuación empírica que relaciona los radios hidrodinámicos determinados por cristalografía con el peso molecular (Squire, P.G. y Himmel, M.E., en Arch. Bioch. Biophys., 196, pp 165- 177, 1979) esta tamaño de partícula DLS medio corresponde a aproximadamente 36.000 dalton, que es consistente con el peso molecular del heterodímero uFSH. La población pequeña restante de partículas (<1%) tuvo un diámetro medio de aproximadamente 200 nm. Estos datos muestran, en la Tabla VI, que los conservantes estudiados no agregaron significativamente uFSH en las condiciones ensayadas.

TABLA VI Distribución de tamaño uFSH en formulaciones que contienen diferentes conservantes

Conservante	Concentración de	Partículas pequeñas	Partículas grandes
	conservante (mg/ml)	(\sim 5,7 nm)	(\sim 200 nm)
Ninguno	0	>99%	<1%
m-cresol	3,5	>99%	<1%
Fenol	3,5	>99%	<1%
Alcohol bencílico	10	>99%	<1%
Metilparabeno	1	>99%	<1%
Clorocresol	2	>99%	<1%

Ejemplo 7 Estudios de Desnaturalización Térmica en Formulaciones de uFSH

Se controló la transición de desplegamiento térmico para uFSH (uFSH - Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) como función de las condiciones de disolvente por calorimetría de exploración diferencial (DSC). Los experimentos se realizaron en un Microcalorímetro VP-DSC (MicroCal inc., Northempton, MA; Plotink, V.V., y col., Anal. Biochem., 250:237-244, 1997) usando un software VPViewer para la adquisición de datos y un software Origin DSC para el análisis de datos. La célula demuestra coincidente y la célula de referencia tenían forma de piruleta, fabricados de tantalio, con un volumen de trabajo de 0,5 ml. Se dializaron muestras de aproximadamente 1 mg/ml de uFSH frente a tampón apropiado durante una noche y se determinó la concentración de la proteína en la muestra por espectroscopia en UV. Las proteínas después se diluyeron a 4,4 - 0,5 mg/ml para los experimentos DSC. El dializado se usó como solución de referencia. La muestra y las soluciones de referencia se desgasificaron durante 5 minutos antes de cargarlas en las células con una aguja de 2,5 ml a través de un embudo de llenado. La presión se mantuvo a aproximadamente 206,79 kPa (30 psi) con el tapón de presión. Para todas las medidas en este estudio, el instrumento se procesó durante una noche con tampones tanto en la célula de referencia como en la célula de muestra para establecer la historia térmica antes de procesar la muestra. Los datos se analizaron con el software Origin DSC usando un modelo doble estático (Sturtevant, J.M., Annu. Rev. Phys. Chem., 38:463-488, 1987). El punto medio de la temperatura de transición (T_{m}) a condiciones de solución diferentes se resumen en la Tabla VII. La proteína experimenta una transición muy cooperativa con una T_{m} de 77,3ºC en tampón PBS a pH 7,4. La desnaturalización térmica es irreversible en la escala de tiempo de las medidas como se muestra por la ausencia de transición en la segunda exploración inmediatamente después de la primera exploración. Sin embargo, las subunidades disociadas permanecen como monómeros en solución y estos monómeros después pueden reasociarse para formar dímeros biológicamente activos en el transcurso de los días (datos no mostrados). Los efectos de la adición de conservantes, m-cresol, fenol, alcohol bencílico, metilparabeno y clorocresol a las concentraciones especificadas a continuación muestran sólo efectos marginales en la T_{m} como se demuestra en la Tabla VII.

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TABLA VII Efecto de pH, sal, y conservantes en T_{m} de uFSH en solución controlada por DSC

Condiciones de solución	T_{m} (ºC)
PB (fosfato 9,5 Mm)
pH 5,7	72,4
pH 6,6	74,3
pH 7,6	74,8
pH 8,6	75,3
NaCl 100 mM, pH 7,6	76,1

PBS a pH 7,4	77,3
3,5 mg/ml de m-cresol	75,3
3,5 mg/ml de fenol	75,0
10 mg/ml de alcohol bencílico	73,5
1 mg/ml de metilparabeno	76,1
2 mg/ml de clorocresol	74,6

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Ejemplo 8 Estabilidad de uFSH como función del pH

La estabilidad de uFSH (uFSH -Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) en PBS se determinó para diversos pH. El porcentaje de heterodímeros como función del pH se controló por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en la Tabla VIII.

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TABLA VIII Porcentaje de heterodímeros como función del pH controlado por SEC

pH	Porcentaje de dímero
7,0	95,0
6,5	95,0
6,0	95,0
5,5	95,0
5,0	95,0
4,5	95,0
4,0	95,0
3,5	95,0
3,25	87,7
3,0	62,3
2,5	17,6
2,0	5,0

Ejemplo 9 Estabilidad de Formulaciones Conservadas y No Conservadas de uFSH

Se preparó una solución de uFSH (uFSH - Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) en PBS (de Dulbecco, GIBCO) y se diluyó adicionalmente con PBS a una concentración de aproximadamente 50 \mug/ml. La concentración de proteínas se determinó en un Espectrofotómetro de Serie con Diodo Hewlett Packard Modelo 8452A.

Se añadió una parte de la solución de uFSH a un vaso de precipitación que contenía una muestra pre-pesada de m-cresol para dar una concentración final de m-cresol de aproximadamente 3,16 mg/ml. Las alícuotas de 1 ml de la solución conservada y no conservada se colocaron en tubos de centrífuga de plástico y se incubaron hasta 238 días aproximadamente a 22ºC, 37ºC y 45ºC. En diversos momentos, se inyectaron las alícuotas en una columna Superdex-75 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada y procesada a temperatura ambiente a 0,5 ml/min en PBS. El eluyente se controló a 214 nm. El porcentaje del heterodímero se calculó a partir de la proporción del área del pico del dímero dividido por el área total del pico del dímero y picos de monómero, como se muestra en la Tabla III. Después de 64 días, aproximadamente un 79% de las moléculas uFSH en solución con m-cresol permanecen como dímero intacto a 37ºC y más del 52% permanecen como dímero a 45ºC. Sorprendentemente, después de 63 días a temperatura ambiente, hay una disociación mínima de heterodímero uFSH tanto en soluciones no conservadas como conservadas. Es singular que a 23ºC, 37ºC y 45ºC hay una disociación general y relativamente baja de heterodímero de uFSH tanto en soluciones no conservadas como conservadas en los días 4, 8, 16, 21, 28, 29, 43, 63, 64, 126, 127, 237
y 238.

TABLA IX Porcentaje de Dímero en soluciones de uFSH Conservadas y No conservadas

	PBS	PBS + m-cresol
Días	23ºC	37ºC	45ºC	23ºC	37ºC	45ºC
0	96,0	96,0	96,0	93,8	93,8	93,8
4	-	93,0	91,7	-	91,8	85,6
8	94,3	92,7	89,5	93,6	88,9	80,0
16	94,1	91,1	84,3	92,5	87,0	73,8
21	94,0	91,0	83,1	-	-	-
22	-	-	-	92,3	84,7	68,8
28	92,8	89,8	-	92,7	83,7	-
29	-	-	79,9	-	-	65,3
43	93,3	89,5	75,9	91,6	81,5	59,2
63	92,9	-	-	92,6	-	-
64	-	88,2	68,6	-	78,9	52,5
126	91,5	85,5	-	89,6	71,2	-
127	-	-	58,2	-	-	43,8
237	92,3	83,1	-	91	62,0	-
238	-	-	57,9	-	-	39,2

Ejemplo 10 Medidas de Bioactividad de Muestras de uFSH

Se transfectaron células HEK 293 transfectadas de manera estable con un vector informador de b-lactamasa sensible a AMPc (BLAM) (Zlokarnik, y col., 1998, Science 279: 84-88) con un vector de expresión del receptor de FSH humano que codifica un marcador de selección de higromicina y se incubaron en higromicina durante 3 semanas. Las células supervivientes se trataron con 10 \mug/ml de FSH (Sigma) durante 5 horas y la población de células activadas con FSH que mostraban la intensidad más alta de fluorescencia azul se identificaron y se aislaron por FACS. Esta población policlonal se expandió, se trató con 10 \mug/ml de FSH durante 5 horas, y se seleccionó por FACS en clones celulares individuales. Se analizaron dos líneas celulares clonales por el ensayo en placa de microtitulación BLAM y mostraron un aumento de 6 a 8 veces en proporción azul/verde. La línea celular FSH-R con el aumento de más veces en expresión BLAM se eligió como la línea celular a usar en los ensayos de FSH posteriores.

La línea celular del receptor de FSH que alberga el informador BLAM sensible a AMPc se sembró en 100 \mul de Medio de Crecimiento (DMEM número de catálogo 11965-092, FBS al 10%, 500 \mug/ml de Gentamicina) a 20.000 células/pocillo en una placa de cultivo tisular de paredes negras de 96 pocillos revestida con poli-D-lisina, y se incubaron durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. El medio de crecimiento se reemplazó por 100 \mul de Medio de Ensayo (DMEM número de catálogo 11965-092, FBS al 0,5%, 500 \mug/ml de Gentamicina) y la placa se incubó durante una noche a 37ºC y CO_{2} al 5%. El Medio de Ensayo se retiró y después se añadieron 100 \mul de Medio de Ensayo que contenía la concentración indicada de la FSH a cada pocillo y la placa se incubó durante 5 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%. Después se añadieron 20 \mul del sustrato BLAM de carga, compuesto de 6 \mul de CCF2-AM 1 mM en DMSO, 6 \mul de Ácido Plurónico (100 \mug/ml en ácido acético al 0,1% DMSO) en 1 ml de PEG- 400 al 2% y ESS al 10% (Aurora Biosciences) a cada pocillo. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, la proporción de intensidades de fluorescencia azul (excitación a 395 nm/emisión a 460 nm) a verde (excitación a 395 nm/emisión a 530 nm) se determinó con un Cytofluor (Perseptives Biosystems, lector de placa multipocillo serie 4000). Las veces de aumento en la proporción azul/verde como resultado de la presencia de FSH se calculó dividiendo cada proporción por la proporción azul/verde de la muestra de control.

Se preparó una solución de FSH de orina (uFSH - Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) a 40 \mug/ml en PBS (Muestra A) como en el Ejemplo 9. Una parte de esta solución se calentó a 90ºC durante 10 minutos para disociar más del 99% del heterodímero en los dos monómeros (como se muestra por el análisis SEC) y se usó en este ensayo (Muestra B) como control negativo. Otra parte de la solución de FSH se modificó para incluir aproximadamente 3,5 mg/ml de m-cresol (Muestra C). La bioactividad de estas tres muestras de ensayo se evaluó en el ensayo FSH-R 293-Cre-BLAM en dos placas separadas. La media de análisis triplicados en cada placa se muestra en la Tabla X. Estos datos demuestran que el ensayo se realiza de manera muy reproducible. También demuestran que el heterodímero disociado perdía bioactividad (Muestra B) y que la FSH en la formulación que contenía el m-cresol (Muestra C) mantenía toda la bioactividad.

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TABLA X Aumento en veces de Azul/Verde en el ensayo de bioactividad del receptor de FSH

Concentración	Muestra	Muestra	Muestra	Muestra	Muestra	Muestra
de la muestra	A	A	B	B	C	C
de ensayo (nM)	Placa 1	Placa 2	Placa 1	Placa 2	Placa 1	Placa 2
0 (control)	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
0,003	1,68	1,67	1,07	1,06	1,22	1,22
0,01	1,91	1,86	1,06	1,06	1,58	1,62
0,03	3,00	2,89	1,06	1,06	2,72	3,21
0,1	4,00	4,09	1,18	1,18	3,86	3,85
0,3	4,53	4,47	1,24	1,24	4,61	4,63
1	4,88	4,71	1,68	1,69	4,81	4,77
3	4,60	4,64	2,61	2,58	4,83	4,92

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Ejemplo 11 Medidas de bioactividad de Muestras de uFSH Conservadas y No Conservadas

Se determinaron medidas de bioactividad de FSH de orina (uFSH - Vitro Diagnostics - Urofolitropina Humana) en el ensayo de bioactividad in vitro como se describe en el Ejemplo 10. El ensayo in vitro es el resultado de dos muestras de uFSH en PBS a 23ºC, PBS con y sin m-cresol a 23ºC después de 11 meses en comparación con un control en la Tabla XI. Los datos indican que las muestras de uFSH conservadas y no conservadas retienen la actividad biológica completa después de 11 meses en este ensayo.

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TABLA XI Bioactividad in vitro de solución de uFSH conservada y no conservada después de 11 meses a 23ºC

Muestra	Potencia relativa
uFSH de control (50 \mug/ml, PBS, reciente)	1,0
uFSH (50 \mug/ml, PBS, 23ºC durante 11 meses)	1,27
uFSH (50 \mug/ml, PBS, 3,15 mg/ml m-cresol, 23ºC durante 11 meses	0,86

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Ejemplo 12 Compatibilidad en cartucho de una Variante de rFSH Conservada y No conservada

Para ensayar la compatibilidad de una variante de rFSH formulada (subunidad alfa SEC ID Nº 5; subunidad beta SEC ID Nº 11) con cartuchos, se prepararon soluciones de 4ml de las muestras enumeradas en la Tabla 12 a partir de las soluciones madre enumeradas a continuación:

1,85 mg/ml de variante de rFSH en PBS

1,73 mg/ml de variante de rFSH en PB

20 mg/ml de m-cresol en PBS

20 mg/ml de m-cresol en PB

Glicerol al 20% en PB

1 x PBS

Después de mezclar, se pipetearon 1,7 ml de cada solución en cartuchos individuales con espacio entre cabezas mínimo permitido. Se cargaron dos cartuchos para cada muestra. Los tapones se sellaron en los cartuchos. Los cartuchos después se incubaron a 30ºC durante 20 días. Después de la carga, lo que quedaba de las muestras se incubó a 40ºC para servir como muestras de control.

Se midió la actividad in vitro de estas muestras después de 20 días de incubación a 30ºC, usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 11. La actividad de estas muestras se comparó con las muestras de control correspondientes en el tiempo puntual cero. Como se muestra en la Tabla XII a continuación, la muestra de rFSH a 50 \mug/ml en PBS y la muestra a 200 \mug/ml en PBS y 3,15 mg/ml de m-cresol son estables en los cartuchos (cartucho 1 y cartucho 4). Estas muestras permanecen completamente activas después de 20 días de incubación a 30ºC. Sin embargo, las muestras en tampón fosfato sin NaCl fueron menos potentes en estas condiciones. La actividad de muestras de rFSH en tampón fosfato y glicerol al 1,6% disminuye en comparación con la del control (cartucho 2 y cartucho 3)

TABLA XII Actividad in vitro de muestras conservadas y no conservadas incubadas a 30ºC durante 20 días en cartuchos

Muestra	Condiciones de muestra	Potencia relativa
Cartucho 1	200 \mug/ml de variante de rFSH,	1,06
	3,15 mg/ml de m-cresol, PBS, pH 7,4
Cartucho 2	200 \mug/ml de variante de rFSH,	0,81
	glicerol al 1,6%, PB, pH 7,4
Cartucho 3	50 \mug/ml de variante de rFSH,	0,60
	glicerol al 1,6%, 3,15 mg/ml de m-cresol, PB, pH 7,4
Cartucho 4	50 \mug/ml de variante de rFSH,	1,10
	PBS, pH 7,4

Como se demuestra por estos ejemplos, siguiendo los procedimientos y técnicas de escritos se puede generar una composición y formulaciones sorprendentemente estables de FSH o una variante de FSH. Estas composiciones y formulaciones dan como resultado el desarrollo de los artículos de fabricación reivindicados en este momento. Desde aproximadamente 1970, los tribunales han mantenido que la información impresa de un artículo de fabricación no retira el artículo del campo de la patentabilidad hasta que el artículo y la invención como conjunto satisfagan las otras necesidades del estatuto, tal como novedad y no evidencia. Como los productos de FSH o una variante de FSH analizados en la técnica anterior analizan expresamente que dichas soluciones son adecuadas sólo para uso inmediato y después del uso los contenidos deben desecharse, a diferencia del producto reivindicado en este momento adecuado para su uso 24 horas o más, el articulo de fabricación encarna una nueva y no evidente invención que es distinta y diferente de la técnica anterior.

Los principios, realizaciones preferidas, y modos de funcionamiento de la presente invención se han descrito en la memoria descriptiva anterior. La invención que se pretende proteger en este documento, sin embargo, no debe entenderse como limitada a las formas particulares descritas, ya que se deben mostrar ilustrativas en lugar de restrictivas.

Ejemplo 13 Estabilidad de Formulación de Muestras de Variantes de FSH Conservadas y No Conservadas

Se diluyó una solución madre de una variante de FSH recombinante (subunidad alfa SEC ID: 5; subunidad beta SEC ID Nº:11) a aproximadamente 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS, de Dulbecco, GIBCO) a 50 \mug/ml ó 25 \mug/ml con PBS o PBS que contiene m-cresol para dar una concentración final de m-cresol de 3,15 mg/ml. De manera similar, se fabricó otro conjunto de muestras usando 10 mg/ml de alcohol bencílico como conservante. Se incubaron alícuotas de 1 ml de la solución conservada y no conservada a 4, 22, 37ºC durante hasta tres meses en tubos eppendorf de plástico. En diferentes momentos, se inyectaron las alícuotas en una columna de filtración en gel Superdex 75 (Pharmacia) equilibrada con PBS y procesada a temperatura ambiente con un caudal de 0,07 ml/min y el tiempo de procesamiento de 35 minutos. La detección se controló por absorbancia en UV a 214 nm en el tiempo. Las áreas de los picos se integraron, y el porcentaje del heterodímero se calculó como una proporción del área del pico del heterodímero sobre el área total de los picos de dímero y monómero.

Como se muestra en la tabla XIII, hay disociación mínima del heterodímero en diversas condiciones de solución después de tres meses de incubación a temperatura ambiente o por debajo. Más del 50% del heterodímero permanece intacto después de tres meses de incubación a 37ºC. La estabilidad del heterodímero es más alta con solución más concentrada.

TABLA XIII Estabilidad de heterodímero de una variante de rFSH controlada por SE-HPLC

Muestra	% de Dímero
	1 mes	3 meses
	4ºC	22ºC	37ºC	4ºC	22ºC	37ºC
20 \mug/ml en PBS	100	100	88,9	100	100	77,3
20 mg/ml en PBS 3,15	100	100	86,2	100	100	64,6
mg/ml de m-cresol
20 \mug/ml 10 en PBS	100	100	89,1	100	100	57,1
mg/ml de alcohol bencílico
50 \mug/ml en PBS	100	100	100	100	100	81,1
50 \mug/ml 3,15 en PBS	100	100	90	100	100	75,7
mg/ml de m-cresol
50 \mug/ml en PBS 10	100	100	87	100	100	61,0
mg/ml de alcohol bencílico

Claims

1. Una formulación que comprende FSH o una variante de FSH, que contiene una subunidad alfa y beta, y un conservante seleccionado entre fenol, m-cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso.

2. Una formulación de la reivindicación 1, en la que la concentración de FSH o una variante de FSH es de 5,0 \mug/ml a 2 \mug/ml.

3. Una formulación de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende adicionalmente un agente de isotonicidad.

4. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un tampón fisiológicamente aceptable.

5. Una formulación que comprende FSH o una variante de FSH liofilizada en un primer vial, y un segundo vial que contiene un conservante seleccionado entre fenol, m-cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso.

6. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha FSH o una variante de FSH y el conservante están en solución.

7. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha FSH es al menos un compuesto seleccionado entre:

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7

8

80

9

8. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el conservante es fenol, m-cresol, clorocresol, o una mezcla de los mismos.

9. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el conservante es m-cresol o fenol, o una mezcla de los mismos, a una concentración de 23 mM a 35 mM.

10. Un procedimiento para preparar una formulación de solución conservada de FSH o una variante de FSH, que contiene una subunidad alfa y beta, que comprende mezclar dicha FSH o una variante de FSH y un conservante seleccionado entre fenol, m-cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de los mismos, en un diluyente acuoso.

11. Un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano, que comprende material de envasado y un vial que comprende una solución de FSH o una variante de FSH, que contiene una subunidad alfa y beta, y una solución conservante, en la que dicho conservante se selecciona entre fenol, m- cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de los mismos, y en la que dicho material de envasado comprende una etiqueta que indica que dicha solución puede mantenerse durante un período de 24 horas o más.

12. El artículo de fabricación de la reivindicación 11, en el que dicho vial es un recipiente de vidrio que tiene un tapón para administración multiuso.

13. El artículo de fabricación de la reivindicación 11, en el que dicho vial es un envase blíster, capaz de ser pinchado y usado en administración pulmonar.

14. El artículo de fabricación de la reivindicación 11, en el que dicho vial es un dispositivo de inyector de pluma.

15. Un artículo de fabricación, que comprende material de envasado, un primer vial que comprende FSH o una variante de FSH liofilizada, que contiene una subunidad alfa y beta, y un segundo vial que comprende una solución conservante, en la que dicho conservante se selecciona entre fenol, m-cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de los mismos, y en el que dicho material de envasado comprende una etiqueta que enseña al paciente a reconstituir dicha FSH o una variante de FSH liofilizada en la solución conservante para su uso durante un período de 24 horas o más.

16. El artículo de fabricación de la reivindicación 15, en el que dicho primer vial y dicho segundo vial están incorporados en un dispositivo de inyector de pluma.

17. El artículo de fabricación de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el conservante es fenol, m-cresol, clorocresol, o una mezcla de los mismos.

18. El artículo de fabricación de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el conservante es m-cresol o fenol, o una mezcla de los mismos, a una concentración de 23 mM a 35 mM.

19. Una formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en el tratamiento de infertilidad en un paciente en necesidad del mismo.

20. Una solución multiuso conservada de FSH o una variante de FSH, que contiene una subunidad alfa y beta y un conservante, en la que dicho conservante se selecciona entre fenol, m-cresol, clorocresol, un parabeno seleccionado entre metil, etil, propil o butilparabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de los mismos, para su uso en el tratamiento de infertilidad en un paciente en necesidad del mismo, siendo adecuada dicha solución para la administración durante un periodo de 24 horas o más.

21. La solución multiuso conservada de la reivindicación 20, en la que el conservante es fenol, m-cresol, clorocresol, o una mezcla de los mismos.

22. La solución multiuso conservada de la reivindicación 20, en la que el conservante es m-cresol o fenol, o una mezcla de los mismos, a una concentración de 23 mM a 35 mM.

23. Uso de una formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infertilidad en un paciente en necesidad del mismo.