CN106061468B - 包含TNFR和Fc区的融合蛋白的液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含TNFR‑Fc融合蛋白和稳定剂的液体制剂，其中该融合蛋白包含TNFR(肿瘤坏死因子受体)或其片段和免疫球蛋白Fc区，并且该稳定剂包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸，缓冲溶液，和含有氯化钠(NaCl)和蔗糖的等渗剂，及该液体制剂的制备方法。本发明的液体制剂提供了出色的储存稳定性，因为TNFR‑Fc融合蛋白(依那西普)的长期储存是可能的并且不需要特定的储存条件。由于本发明的液体制剂显示出出色的储存稳定性，即使制剂是简单的，其比其它稳定剂或冻干的制剂更为经济，并且因此该制剂可有效地用于使用TNFR‑Fc融合蛋白(依那西普)有益的治疗中。

Description

包含TNFR和Fc区的融合蛋白的液体制剂
技术领域
本发明涉及一种液体制剂，其包含TNFR-Fc融合蛋白和稳定剂，其中该融合蛋白包含TNFR(肿瘤坏死因子受体)或其片段和免疫球蛋白Fc区，并且该稳定剂包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸，缓冲溶液，和含有氯化钠(NaCl)和蔗糖的等渗剂，及该液体制剂的制备方法。
背景技术
通常，蛋白质药物的化学和物理变性可易于由不利的温度、剪切力、振动、冻融、UV暴露、过度pH变化、有机溶剂、微生物污染等导致。化学变性包括二聚体解离、氧化、脱酰胺、异构化和聚合，其受到组成蛋白质的氨基酸以及含有该蛋白质的溶剂的条件(盐、pH和温度)的影响。物理变性包括失去三级结构、单体的共价/非共价聚集和粘附，其受到由含蛋白质的周围环境如溶剂而带电的蛋白质表面上的疏水性贴片、复杂蛋白质结构如电荷分布、和热稳定性的影响。
包括抗体的蛋白质的物理或化学变性使得其生理活性丧失。由于变性是不可逆的过程，一旦变性，蛋白质可能无法恢复其天然性质，导师其治疗功效的降低。还已经提出以下现象，如单体的聚集产生免疫应答。因此，已经对不含聚集体的含有生理有效量的蛋白质的制剂进行了许多研究(Ishikawa等，Biol.Pharm.Bull.,33(8):1413-1417,2010)。
存在许多方法可用于防止液体制剂中的蛋白质变性。在一些蛋白质药物中，通过冻干来解决稳定性问题。然而，冻干问题导致了与冷冻和干燥相关的应激，如形成冰晶体、pH变化、和高溶质浓度，并且这些应激可导致蛋白质变性。另外，由于在生产期间冻干过程需要大容量的冻干机，在大规模生产期间产生了高生产成本。在使用前将冻干的产物溶解在无菌水性基质中也带来了不便。
作为解决这些限制的替代，向液体制剂中加入稳定剂用于改善蛋白质稳定性。已知表面活性剂、血清白蛋白、多糖、氨基酸、聚合物、盐等用作蛋白质药物中的稳定剂(Wang,Int.J.Pharm.,185:129-188,1999；Wang等，J.Pharm.Sci.,96(1):1-26,2007)。
为了制备药物的稳定制剂，然而，考虑各活性成分的物理化学性质，应使用合适的稳定剂。当组合使用稳定剂时，它们之间的竞争和不良作用可能产生不希望的影响。另外，蛋白质的浓度应该在适于稳定的范围内，并且具体地，用于制备高浓度的蛋白质药物，需要许多的努力和谨慎以在溶液中稳定化蛋白质(Shire等，J.Pharm.Sci.,93(6):1390-1402,2004)。
同时，依那西普是一种生物调节剂，其功能是作为TNF-α的竞争性抑制剂，结合细胞表面TNF-α受体，以抑制TNF-α介导的免疫应答。依那西普是分子量为150kDa的大分子，并且是通过二硫键连接的2种融合蛋白的同源二聚体，各融合蛋白由与人免疫球蛋白G亚类1的Fc区偶联的人可溶p75TNF(肿瘤坏死因子)受体组成(Goldenberg,ClinicalTherapeutics,21(1):75-87,1999；Moreland等，Ann.Intern.Med.,130(6):478-486,1999)。
在2002年由安进公司(Amgen)以Enbrel的商品名销售。依那西普是用于治疗类风湿性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎的TNF-α抑制剂，并且处于用于治疗脉管炎、阿尔茨海默病和克罗恩氏病的临床试验中。
针对TNFR-Fc融合蛋白质如依那西普的制剂稳定化技术旨在开发一种用于最小化可发生在生产、储存和运输期间的蛋白质变性、并且使其活性维持与常规蛋白质药物相同的一长段时间的液体制剂，但是难以开发令人满意的液体制剂。因此，存在对开发一种能够稳定地保持TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的活性持续一长段时间并且在稳定化TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)中比已知制剂，包括美国专利号7,648,702中公开的精氨酸更有效的新液体制剂的迫切需求。
发明内容
技术问题
因此，本发明的发明人已经对开发用于制备能够稳定地保持依那西普的活性的液体制剂的方法作出了许多努力。本发明提供了一种包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸的稳定剂，其对溶液中依那西普的稳定化有显著的效果，甚至当以比包含单个氨基酸或混合氨基酸的已知稳定剂所用的浓度低的浓度使用时，仍完成本发明。
技术方案
本发明的目标是提供一种稳定液体制剂，其包含TNFR-Fc融合蛋白和稳定剂，其中TNFR-Fc融合蛋白是包含TNFR(肿瘤坏死因子受体)或其片段和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，并且该稳定剂包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸，缓冲溶液，和等渗剂，优选含有氯化钠(NaCl)和蔗糖。
本发明的另一个目标是提供液体制剂的制备方法。
有益效果
本发明的液体制剂提供了出色的储存稳定性，因为TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的长期储存是可能的并且不需要特定的储存条件。由于本发明的液体制剂显示出出色的储存稳定性，即使制剂是简单的，其比其它稳定化或冻干的制剂更为经济，并且因此该制剂可有效地用于使用TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的治疗中。
附图说明
图1显示p75sTNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2显示了在4℃(图2a)和25℃(图2b)下实施例3所述的对照和制剂1、2、3的差示扫描量热法(DSC)照片。4℃(2a)和25℃(2b)下含精氨酸和组氨酸(制剂1)或者脯氨酸和组氨酸(制剂2和3)的依那西普制剂在储存温度下6个月时间点时的DSC热谱图。
最佳实施方式
在实现上述目标的一个方面中，本发明提供一种液体制剂，其包含TNFR-Fc融合蛋白和稳定剂，其中该融合蛋白包含TNFR(肿瘤坏死因子受体)或其片段和免疫球蛋白Fc区，并且该稳定剂包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸，缓冲溶液，和等渗剂，优选含有氯化钠(NaCl)和蔗糖。
包含TNFR或其片段以及免疫球蛋白Fc区的融合蛋白可以是依那西普(重组p75sTNFR-Fc融合蛋白)，具体地，由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。此外，该融合蛋白可以是通过在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中的氨基酸取代、删除或插入来制备的突变融合蛋白，或显示与依那西普相似的活性的肽类似物。本发明的液体制剂是稳定化的液体制剂或稳定的液体制剂，其包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸或其药学上可接受的盐，从而减少TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的副产物的形成并且稳定地使其活性维持一长段时间。
本文所用术语“包含TNFR和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白”是指通过肿瘤坏死因子受体(TNFR)或其片段和免疫球蛋白Fc区的融合制备的重组蛋白质，并且具体地，免疫球蛋白Fc区可源自IgG1的免疫球蛋白Fc区。优选地，所述融合蛋白可以是依那西普，并且由SEQID NO.1的氨基酸序列表示。
本文所用的术语“依那西普(重组p75sTNFR:Fc融合蛋白)”是指通过二硫键连接的2个融合蛋白的同源二聚体形式，各融合蛋白由与人免疫球蛋白G(IgG1)亚类1的Fc区偶联的人可溶75千道尔顿(p75)TNF受体组成。
更具体地，依那西普是由3个二硫键连接的2个融合蛋白的同源二聚体形式，各融合蛋白由连接至人IgG1的Fc部分的人可溶p75 TNF受体的胞外配体-结合部分组成。依那西普的Fc组分含CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但不含IgG1的CH1结构域。依那西普具有约150kDa的分子量。该依那西普现在可以商品名
Figure BDA0001003689760000041
(加利福尼亚州千橡的安进公司(Amgen Inc.,Thousand Oaks,CA.))销售，并且具有CAS编号185243-69-0。
本发明中包含TNFR或其片段和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，尤其是依那西普，可通过在细胞表达系统中的重组DNA技术产生，但不限于此。
本发明的依那西普是生物调节剂，其功能为TNF-α的竞争性抑制剂，结合细胞表面TNF-α受体，以抑制TNF-α介导的免疫应答，并且用于治疗类风湿性关节炎、银屑病和强直性脊柱炎，并且处于用于治疗脉管炎、阿尔茨海默病和克罗恩氏病的临床试验中。
在本发明的液体制剂可以药学上有效的量包括本发明的包含TNFR或其片段以及免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，尤其是依那西普，，并可且以1至100mg/mL，优选20至55mg/mL，并且更优选30至55mg/mL的量包括。
本文所用术语“稳定化的液体制剂”或“稳定的液体制剂”是指在溶液中储存期间，保留治疗活性成分，即本发明的融合蛋白，尤其是依那西普的物理和化学相同性和完整性的制剂。可通过本领域广泛知晓的蛋白质稳定性试验来对本发明的融合蛋白，尤其是依那西普的稳定性进行分析测量。可在预定温度下持续预定的时间测量稳定性。对于快速试验，该制剂可在较高或“升高”的温度下储存，例如，40℃保持2周至1个月或更长时间，其间测量其时间依赖的稳定性。
本文所用的术语“稳定剂”是指与制剂中的生物分子和/或一般药物赋形剂相互作用以改善其稳定性的具体化学化合物或组合物。稳定剂一般保护蛋白质免受导致蛋白质聚集的空气/溶解界面诱导的应激和溶液/表面-诱导的应激。在本发明中，稳定剂是减少储存期间本发明的融合蛋白，尤其是依那西普的副产物形成以使其活性维持一长段时间的组分。优选地，稳定剂包括选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸。
本发明的氨基酸可同时包括L-氨基酸和D-氨基酸。
作为本发明的稳定剂，不仅氨基酸本身如脯氨酸和组氨酸，同时其类似物、溶剂合物、水合物、立体异构体和药学上可接受的盐也在本发明的范围内，只要它们显示出基本相同的效果。
本文所用术语“副产物”是指制剂中降低或减少治疗活性成分TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的比率的不希望的产物。一般的副产物包括从通过去酰胺或水解的TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的变性产生的“低分子量产物”，如寡聚体和聚集体的“高分子量产物”，或其混合物。
本文所用术语“高分子量产物”包括由变性随后聚集的TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)片段(例如，由于去酰胺或水解的多肽降解所产生)或其混合物。一般而言，高分子量产物是具有比治疗性单体TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)大的分子量的复合物，并且可具有超过约150kDa的分子量。
本文所用术语“低分子量产物”包括例如由去酰胺或水解产生的治疗性多肽，即，TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)片段。一般而言，低分子量产物是具有比治疗性单体TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)小的分子量的复合物，并且可具有低于约150kDa的分子量。
本发明的液体制剂包括选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸作为稳定剂。可加入其它氨基酸例如谷氨酸来稳定化制剂。优选地，该液体制剂仅包含脯氨酸或组氨酸，或者同时包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸。在组合中，还可包括脯氨酸或组氨酸的药学上可接受的盐，或修饰的脯氨酸和组氨酸，或其药学上可接受的盐。优选地，该液体直接包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物。
在本发明中，稳定剂中，脯氨酸浓度的范围可以是1至10mM，优选1至9mM，更优选3至9mM，甚至更优选3至6mM，并且组氨酸浓度的范围可以是0.01至5mM，优选0.01至0.1mM，更优选0.03至0.1mM，甚至更优选0.03至0.09mM，甚至更优选0.06至0.09mM，或者甚至更优选约0.09mM。具体地，在包括脯氨酸和组氨酸作为稳定剂的混合物中，脯氨酸浓度的范围可以是1至10mM，优选1至9mM，更优选3至9mM，甚至更优选3至6mM，并且组氨酸浓度的范围可以是0.01至5mM，优选0.01至0.1mM，更优选0.03至0.1mM，甚至更优选0.03至0.09mM，甚至更优选0.06至0.09mM，或者甚至更优选约0.09mM。加入其它氨基酸，如谷氨酸的范围可以是1至20mM，优选5至15mM，更优选10至15mM。当与脯氨酸和组氨酸的混合物合并时，谷氨酸的浓度范围可以是1至20mM，优选5至15mM，更优选10至15mM。
在本发明的一个具体实施方式中，在TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)的稳定化的液体制剂的制备中，通过改变氨基酸组成和等渗剂的条件来制备液体制剂以开发一种液体制剂，其具有与已知的液体制剂，包括精氨酸，如依那西普的稳定化的液体制剂(美国专利号7,648,702)相比的优势，并且检验了它们的稳定化效果。
结果，发现包括选自脯氨酸和组氨酸的一个或多个氨基酸的制剂显示出通过防止其在高温下储存期间变性来稳定化依那西普的显著效果(表1的制剂4和制剂5、制剂7和制剂8，表4的制剂2和制剂3，表7的制剂2-4和制剂6-7)。具体地，包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸的混合物的制剂(表1的制剂5和制剂8，表4的制剂2和制剂3，表7的制剂2-4和制剂6-7)显示出比对照制剂更出色的稳定化效果。
即，本发明率先证明一种包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸的稳定剂显示出对溶液中依那西普的稳定化有显著的效果，甚至当以比使用单个氨基酸或混合氨基酸的已知稳定剂所用的浓度(10mM或更多)低的浓度(6.1mM)使用时亦是如此。
本发明的液体制剂还可包含在蛋白质药物或抗体药物的液体制剂中一般含有的任何材料，只要其不降低通过加入包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸的稳定剂来改善TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)稳定性的功能。
本文所用术语“缓冲溶液”是指改善制剂的等渗性和化学稳定性，并且功能是维持生理上合适的pH的组分。缓冲剂防止液体制剂的快速pH变化以保持溶液的pH用于使TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)稳定化。缓冲溶液的优选示例包括柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐、组氨酸或Tris等的水溶液，但不限于此。在具体实施方式中，缓冲剂是水性柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液。缓冲剂可以单独使用，或者两种或更多种混合使用。
本发明的液体制剂的pH可以是约5-7.5或约5.8-6.8。具体地，制剂的pH是约6.0-6.6。如果需要，可通过本领域已知的技术来调节pH。缓冲溶液可以0.1至100mM，优选1至50mM，并且更优选10至35mM的浓度存在。优选地，在本发明的水性缓冲溶液中使用注射用水。
本文所用术语“等渗剂”是指功能是部分维持制剂的等渗性和蛋白质和水平，和部分维持制剂中治疗活性多肽的水平、比例或部分的组分。等渗剂保持与血浆相同的渗透压，并且可静脉内注射到对象中而不改变对象血浆的渗透压。在本发明的一个实施方式中，渗透压适于本发明的制剂的静脉内注射。通常，等渗剂还用作填充剂。如此，等渗剂可使蛋白质克服多种应激，如冷冻和剪切。
等渗剂用于维持体内合适的渗透压，当向体内给予溶液中的TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)时。等渗剂的示例可包括常用的氯化钠、氯化钾、硼酸钠、甘露醇、甘油、丙二醇、乙二醇、麦芽糖、蔗糖、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、葡萄糖等，但不限于此。这些等渗剂可以单独使用，或者两种或更多种混合使用。在本发明中，等渗剂可以是包含氯化钠和蔗糖的那些。本发明的等渗剂使得溶液维持250至350mOsm的渗透压，并且其可包含优选1至1000mM氯化钠和/或0.01至3％蔗糖，更优选50至250mM氯化钠和/或0.01至1.5％蔗糖，并且甚至更优选105至150mM氯化钠和/或0.01至1.5％蔗糖。当在本发明的制剂中使用氯化钠和蔗糖时，氯化钠浓度可以是1至1000mM，优选50至250mM，更优选100至150mM，甚至更优选105至150mM，甚至更优选115至140mM，甚至更优选115至130mM，并且制剂中蔗糖的量可以是总制剂的0.01至3重量％，优选0.01至1.5重量％，更优选0.1至1.0重量％，甚至更优选制剂中蔗糖的量选自0.1重量％、0.5重量％、和1.0重量％。
在本发明的一个具体实施方式中，氯化钠和蔗糖用作本发明的液体制剂中的等渗剂，并且制备包含115mM氯化钠和1.0％蔗糖的制剂(表1的制剂1至制剂5)或包含115mM氯化钠和0.5％蔗糖的制剂(表7的制剂1至制剂4)和包含140mM氯化钠和0.1％蔗糖的制剂(表1的制剂6至制剂8)或包含130mM氯化钠和0.1％蔗糖的制剂(表7的制剂5至制剂7)并且其稳定化效果与对照制剂(100mM氯化钠，1.0％蔗糖)的稳定化效果比较。
因此，与已知的依那西普制剂相比，发现使用通过不同浓度的蔗糖和氯化钠制备的等渗剂的本发明的制剂由于等渗剂中增加的氯化钠浓度和减少的蔗糖浓度而在依那西普稳定性中显示出改善。
本发明的液体制剂还可包含药学上可接受的赋形剂，并且赋形剂的示例包括糖和多元醇、表面活性剂、聚合物等。糖和多元醇的示例可包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨糖醇、甘油等，表面活性剂的示例可包括非离子型表面活性剂如聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆等，并且聚合物的示例可包括葡聚糖、聚乙二醇、羧甲基纤维素、透明质酸、环糊精等。
本发明的液体制剂还可包括防腐剂。防腐剂是指以抗微生物剂加入药物制剂的化学物。防腐剂的示例可包括苯扎氯铵、苄乙铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯-甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸等，但不限于此。这些防腐剂可以单独使用，或者两种或更多种混合使用。
本发明的液体制剂可以是包含药学上有效量的TNFR-Fc融合蛋白和稳定剂的稳定的液体制剂，其中TNFR-Fc融合蛋白(“依那西普”)由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示，并且稳定剂包括柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、氯化钠、蔗糖、以及脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物。具体地，本发明的液体制剂可以是包含30至55mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，10至35mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液，105至125mM NaCl，0.5至1.5％蔗糖，1至9mM脯氨酸和0.01至0.1mM组氨酸，pH 6.3的液体制剂；或包含30至55mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，和10至35mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液，120至150mM NaCl，0.01至0.5％蔗糖，1至9mM脯氨酸和0.01至0.1mM组氨酸，pH 6.3的液体制剂。
在本发明的具体实施方式中，提供了以下液体制剂。
-包含50mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液，115mM NaCl，0.5％蔗糖，6mM脯氨酸和0.09mM组氨酸，pH 6.3的液体制剂(表7的制剂3)。
-包含50mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液，130mM NaCl，0.1％蔗糖，6mM脯氨酸和0.09mM组氨酸，pH 6.3的液体制剂(表7的制剂7)。
-包含50mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液，100mM NaCl，1.0％蔗糖，10mM脯氨酸，5mM组氨酸，和10mM谷氨酸，pH 6.3的液体制剂(表1的制剂10)。
本发明的制剂可用于治疗其中依那西普在治疗上有效的疾病。依那西普是一种抑制TNF-α介导的免疫应答的生物调节剂，并且本发明的制剂可用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、脉管炎、阿尔茨海默病、或克罗恩氏病，但不限于此。
本发明的制剂可通过口服或胃肠外途径给予进入体内，即，皮下、肌内、腹膜内、胸骨内、透皮、和静脉内注射，但不限于此。
在另一个方面中，本发明提供了一种液体制剂的制备方法。
可通过一种方法来制备本发明的液体制剂，包括以下步骤：制备依那西普；并将上述步骤中制备的依那西普与包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸的稳定剂、缓冲溶液、和等渗剂(优选含有氯化钠(NaCl)和蔗糖)混合。在上述制备方法中，混合步骤可包括用含稳定剂的溶液交换其中制备依那西普的溶液。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的液体制剂的药物组合物用于预防或治疗其中TNFα活性有害的疾病。
该液体制剂与上述相同。
本文所用术语“其中TNFα活性有害的疾病”包括以下疾病和病症，其中患有该病症的对象中TNFα的存在已经显示或怀疑导致病症的病理生理学或者是导致病症恶化的因素。在本发明中，其中TNFα活性有害的疾病的示例可包括炎性疾病，如脓毒血症、自身免疫疾病，具体地，类风湿性关节炎、类风湿性脊柱炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏、多发性硬化、自身免疫糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、和肾病变综合征、感染性疾病、同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病(GVHD)、恶性肿瘤、肺部病症、肠道病症、心脏病症等，但不限于此。
可通过向对象给予本发明的组合物来预防或治疗其中TNFα活性有害的疾病。
本文所用术语“治疗”是指由于给予本发明的组合物而导致其中TNFα活性有害的疾病的症状改善或者其中TNFα活性有害的疾病的有益改变的任何作用，并且术语“预防”是指由于给予本发明的组合物而导致其中TNFα活性有害的疾病的发生受到抑制或延迟的任何作用。可向任何患有其中TNFα活性有害的疾病的哺乳动物应用预防或治疗，例如，人和灵长类以及牲畜如奶牛、猪、绵羊、马、狗、猫等，而不受限制，并且优选人。
本文所用术语“给药”是指通过某些合适的方法向患者导入预订量的物质。组合物的给药途径可以是任意合适的常规途径，只要其能够达到所需的组织。给药途径可以是腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内、或直肠途径，但不限于此。然而，由于肽在口服给药之后被消化，用于口服给药的组合物的活性成分应该优选经包被或配制以保护免于在胃内降解。优选地，可以可注射制剂的形式给药。另外，可在任何装置的辅助之下给予该组合物，该装置有助于将活性成分转移至目标细胞。
此外，可基于活性成分的类型，以及各种相关因素，如待治疗的疾病、给药途径、患者的年龄、性别和体重、疾病的严重性等来确定本发明的药物组合物。
此外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的运载体。本文所用的术语“药学上可接受的运载体”是指并不产生对生物体的明显刺激并且不会消除给予的化合物的生物活性和性质的运载体或稀释剂。对于口服给药，可使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料等。对于可注射给药，可组合使用缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。对于局部给药，可使用碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明的药物组合物可通过将其与上述药学上可接受的运载体混合来制备成多种制剂。例如，对于口服给药，可将药物组合物制备成片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、晶片等。可注射组合物可配制成足量的单位剂型或多剂型。其还可制备成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂型等。
本发明的液体制剂包括治疗有效量的TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)。例如，治疗有效量的依那西普(Enbrel)一般是25-100mg/周。
在另一个方面中，本发明提供了用于预防或治疗其中TNFα活性有害的疾病的方法，包括以下步骤：向患有其中TNFα活性有害的疾病的对象给予包含液体制剂的组合物。
由于包含本发明的液体制剂的组合物能够将高浓度的TNFR-Fc融合蛋白(依那西普)稳定地维持一长段时间，长期储存变得可能并且不需要特定的储存条件。因此，其可广泛用于预防或治疗其中TNFα活性有害的疾病。
本发明的一个实施方式是包含TNFR-Fc融合蛋白、一种或多种氨基酸、缓冲溶液和等渗剂的液体制剂，其中该融合蛋白包含TNFR(肿瘤坏死因子受体)或其片段和免疫球蛋白Fc区，并且该一种或多种氨基酸选自脯氨酸和组氨酸和谷氨酸。
第二实施方式是第一实施方式的液体制剂，其中融合蛋白是依那西普。
第三实施方式是第一实施方式的液体制剂，其中融合蛋白是SEQ ID NO.1的氨基酸序列。
第四实施方式是第一实施方式的液体制剂，其中融合蛋白是通过SEQ ID NO.1的氨基酸序列中的氨基酸取代、删除或插入制备的突变融合蛋白，或显示与依那西普的活性相似活性的肽类似物。
第五实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中等渗剂使得液体制剂保持280至350mOsm的渗透压。
第六个实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中等渗剂含有氯化钠(NaCl)和蔗糖。
第七个实施方式是本发明的第六实施方式的液体制剂，其中氯化钠的浓度是1至1000mM并且蔗糖的量占总组合物重量的0.01-3％。
第八个实施方式是本发明的第七实施方式的液体制剂，其中氯化钠的浓度是105至150mM并且蔗糖的量占总组合物重量的0.01-1.5％。
第九个实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中液体制剂中融合蛋白的浓度是20至55mg/mL。
第十个实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中缓冲溶液是柠檬酸盐-磷酸盐或磷酸盐缓冲溶液。
第十一个实施方式是第十个实施方式的液体制剂，其中缓冲溶液的浓度范围是10-35mM。
第十二个实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中液体制剂的pH范围是6.0至6.6。
第十三个实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中该制剂包含低于10mM浓度的脯氨酸或低于5mM浓度的组氨酸。
第十四个实施方式是前述实施方式中任一项的液体制剂，其中该制剂包含低于9mM浓度的脯氨酸或低于0.1mM浓度的组氨酸。
第十五个实施方式是第一至第十四个实施方式中任一项的液体制剂，其中该制剂包含脯氨酸和组氨酸的混合物。
第十六个实施方式是第十五个实施方式的液体制剂，其中脯氨酸的浓度是1mM至9mM并且组氨酸的浓度低于0.1mM。
第十七个实施方式是第十六个实施方式的液体制剂，其中脯氨酸的浓度是1mM至9mM并且组氨酸的浓度是0.01至0.09mM。
第十八个实施方式是第十七个实施方式的液体制剂，其中脯氨酸的浓度是6mM并且组氨酸的浓度是0.09mM。
第十九个实施方式是第一至第十三个实施方式中任一项的液体制剂，还包含浓度1mM至20mM的谷氨酸。
第二十个实施方式是第十九个实施方式的液体制剂，其中谷氨酸的浓度是10至15mM。
第二十一个实施方式是包含药学上有效量的TNFR-Fc融合蛋白、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、氯化钠、蔗糖、和包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物的液体制剂，其中TNFR-Fc融合蛋白是p75sTNFR-Fc融合蛋白。
第二十实施方式是第二十一实施方式的液体制剂，其中该液体制剂包含30至55mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，和10至35mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、105至120mM NaCl、0.5至1.5％蔗糖、1至9mM脯氨酸和0.01至0.1mM组氨酸，并且pH为6.3。
第二十三个实施方式是第二十二个实施方式的液体制剂，其中该液体制剂包含50mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白、25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、115mM NaCl、1％蔗糖、6mM脯氨酸、和0.09mM组氨酸，并且pH为6.3。
第二十四实施方式是第二十一实施方式的液体制剂，其中该液体制剂包含30至55mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，和10至35mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、120至120mM NaCl、0.01至0.5％蔗糖、1至9mM脯氨酸和0.01至0.1mM组氨酸，并且pH为6.3。
第二十五个实施方式是第二十四个实施方式的液体制剂，其中该液体制剂包含50mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白、25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、130mM NaCl、0.1％蔗糖、6mM脯氨酸、和0.09mM组氨酸作为稳定剂，并且pH为6.3。
第二十六实施方式是第二十一实施方式的液体制剂，还包含谷氨酸，其中该液体制剂包含30至55mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白，和10至35mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、100至150mM NaCl、0.1至1.5％蔗糖、5至15mM谷氨酸盐、1至10mM脯氨酸和1至10mM组氨酸，并且pH为6.3。
第二十七个实施方式是第二十六个实施方式的液体制剂，其中该液体制剂包含50mg/mL的TNFR-Fc融合蛋白、25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、100mM NaCl、1％蔗糖、10mM谷氨酸盐、10mM脯氨酸、和5mM组氨酸，并且pH为6.3。
第二十八个实施方式是用于制备权利要求1-16中任一项的含TNFR-Fc融合蛋白的液体制剂的方法，包括：
a)制备TNFR-Fc融合蛋白；并且
b)将步骤a)中制备的TNFR-Fc融合蛋白与包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸的稳定剂、缓冲溶液、以及含氯化钠(NaCl)和蔗糖的等渗剂混合。
第二十九个实施方式是第二十八个实施方式的方法，其中，步骤b)中的混合包括i)制备包含稳定剂、缓冲溶液和等渗剂的溶液和ii)用步骤i)中的溶液交换步骤a)中制备TNFR-Fc融合蛋白的溶液。
发明实施方式
下文中，将参照实施例详细地描述本发明。然而，这些实施例仅仅用于示例性目的，并且本发明并不受到这些实施例的限制。
实施例1：依那西普液体制剂的制备
为了稳定化TNFR-Fc融合蛋白，依那西普(重组p75sTNFR:Fc融合蛋白)的液体制剂，氨基酸或氨基酸混合物用作稳定剂或者控制等渗剂来检验稳定化效果。即，通过使用脯氨酸或脯氨酸和组氨酸的混合物作为稳定剂或通过控制作为等渗剂的NaCl和蔗糖的浓度来制备液体制剂。
通过向25mM柠檬酸盐-磷酸盐水性缓冲溶液中加入一种或多种选自精氨酸、谷氨酸、脯氨酸和组氨酸的氨基酸，然后加入蔗糖和氯化钠(NaCl)作为等渗剂来制备本发明的液体制剂，具体地，制剂1至制剂10。之后，将各制剂的pH调整到6.3，并且使该制剂经过透析使得TNFR-fc融合蛋白(依那西普)的浓度变为50mg/mL，由此制备制剂1至制剂10。此外，制备对照液体制剂，在25mM磷酸盐缓冲溶液中包括25mM精氨酸、100mM氯化钠和1.0％蔗糖作为等渗剂，还包括50mg/mL依那西普，然后将pH调整到6.3。由此，制备对照制剂，其中依那西普的浓度是50mg/mL。
制备的液体制剂的组成如下。
表1
Figure BDA0001003689760000151
Figure BDA0001003689760000161
实施例2：依那西普液体制剂的稳定性测试
为了检验实施例1中制备的液体制剂的稳定性，各制剂在25℃和40℃的条件下储存1、2、3和8周，然后通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和疏水性相互作用高效液相色谱(HIC-HPLC)来测量依那西普的剩余量。
测量结果见下表2和3。
表2
Figure BDA0001003689760000171
表3
Figure BDA0001003689760000172
Figure BDA0001003689760000181
※N/A：不可获得
如显示25℃和40℃下的SE-HPLC和HIC-HPLC的分析结果的表2和3所确认，与通过在常规依那西普制剂的组合物中单独使用精氨酸作为稳定剂制备的对照制剂相比，使用脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物的制剂(制剂5，制剂8)显示改善依那西普溶液稳定性的效果。
这些结果证明包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物作为稳定剂的依那西普液体制剂防止依那西普变性以使其活性保持一长段时间，并且脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物可有效用作依那西普溶液的稳定性改善中的稳定剂。
此外，在通过改变常规依那西普制剂的组合物中等渗剂的蔗糖和氯化钠的组成制备的本发明的制剂之间检验依那西普稳定性。具与对照制剂相比，有较高浓度氯化钠和较低浓度蔗糖的制剂显示依那西普溶液改善的稳定性。
此外，与不含氨基酸稳定剂的液体制剂(制剂1和制剂6)相比，使用脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物作为稳定剂的液体制剂(制剂5和制剂8)显示改善依那西普溶液稳定性的效果。
因此，这些实验结果显示，可通过以下来改善依那西普溶液的稳定性：1)在等渗剂中增加NaCl浓度并降低蔗糖浓度和2)在依那西普液体制剂中使用脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物作为稳定剂。即，与常规依那西普液体制剂相比，通过1)或2)的条件，可有效地防止依那西普副产物的形成并且改善其稳定性，以使依那西普的药物功效稳定地保持一长段时间。
实施例3：长期储存期间具有氨基酸混合物的组成的依那西普液体制剂的稳定性 测试
已经通过实施例1和2的实验确认稳定性改善的包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸及其混合物的依那西普液体制剂经过持续6个月的长期储存条件下的稳定性测试。
具体地，向中加入含0.09mM组氨酸和3mM脯氨酸的氨基酸混合物或者0.09mM组氨酸和3mM精氨酸的混合物，并且也向其中加入1.0％或0.1％蔗糖和115mM或130mM氯化钠作为等渗剂。之后，将各制剂的pH调整到6.3，并且使该制剂经过透析使得TNFR-fc融合蛋白(依那西普)的浓度变为50mg/mL，由此制备制剂1至制剂3。此外，在还含有依那西普的25mM磷酸盐缓冲溶液中包括25mM精氨酸、100mM氯化钠和1.0％蔗糖作为等渗剂，然后将pH调整到6.3来制备对照液体制剂。由此，制备对照制剂，其中依那西普的浓度是50mg/mL。
制备的液体制剂的组成与下表4中相同。
表4
Figure BDA0001003689760000191
Figure BDA0001003689760000201
为了检验表4中制备的液体制剂的稳定性，各制剂在4℃、25℃和40℃的条件下储存1、3和6个月(在40℃下持续3个月)，并且然后通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和疏水性相互作用高效液相色谱(HIC-HPLC)来测量依那西普的剩余量。
测量结果见下表5和6。
表5
Figure BDA0001003689760000202
表6
Figure BDA0001003689760000203
Figure BDA0001003689760000211
同样，为了确定表4所述的制剂中依那西普的热稳定性，并且确定依那西普蛋白质解折叠的温度，通过差分扫描量热法(DSC)来测量依那西普的热分析图。图2显示了在4℃(图2A)和25℃(图2B)下6个月时间点处各制剂的DSC热分析图。
明显存在具有转变温度Tm1、Tm2和Tm3的3个热解折叠状态，这表示存在来自含有CH2(Tm2)、CH3(Tm3)结构域的依那西普的Fc组分的2个结构域，和胞外配体结合蛋白质，肿瘤坏死因子受体(TNFR；Tm1)(N.A.Kim等，Int.J.Pharm.,460(1-2),108-118,2014)。
如图2所示，与对照制剂和使用脯氨酸和组氨酸混合物的其它制剂相比，在25℃下使用精氨酸和组氨酸混合物的制剂1(图2B)显示出在4℃(图2A)和25℃(图2B)下储存之间Tm1和Tm2峰之间的谷消失。该结果显示了制剂1中依那西普的胞外配体结合结构域(TNFR)和Fc组件的CH2结构域的稳定性下降。
此外，如显示25℃和40℃下的SE-HPLC和HIC-HPLC的分析结果的表5和6所确认，与通过在常规依那西普制剂的组合物中单独使用精氨酸作为稳定剂制备的对照制剂相比，使用脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物的制剂(制剂2和3)显示改善依那西普溶液稳定性的效果。
这些结果证明，包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物作为稳定剂的依那西普液体制剂防止依那西普的变性以使其活性保持一长段时间。
实施例4：按照混合氨基酸的组成比例的依那西普液体制剂的稳定性测试
为了检验包含按照氨基酸混合物的组成比例的脯氨酸和组氨酸混合物的依那西普液体制剂的稳定性，在这些制剂被证明相比常规依那西普制剂(仅含精氨酸的单一制剂)具有改善的稳定性的实施例1-3中，检验了按照氨基酸混合物的组成比例的稳定化效果。即，通过以各种浓度混合脯氨酸和组氨酸作为稳定剂，并通过控制作为等渗剂的蔗糖和氯化钠的浓度来制备液体制剂。
具体地，向25mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液中加入0.09mM组氨酸和3mM至9mM脯氨酸的氨基酸混合物作为稳定剂，以及0.5％或0.1％蔗糖和115mM或130mM氯化钠作为等渗剂。之后，将各制剂的pH调整到6.3，并且使该制剂经过透析使得TNFR-fc融合蛋白(依那西普)的浓度变为50mg/mL，由此制备制剂1至制剂5。此外，在含有50mg/mL依那西普的25mM磷酸盐缓冲溶液中包括25mM精氨酸、100mM氯化钠和1.0％蔗糖作为等渗剂，然后将pH调整到6.3来制备对照液体制剂。由此，制备对照制剂，其中依那西普的浓度是50mg/mL。
制备的液体制剂的组成与下表7中相同。
表7
Figure BDA0001003689760000221
Figure BDA0001003689760000231
为了检验实施例7中制备的液体制剂的稳定性，各制剂在25℃和40℃的条件下储存2、4和8周，并且然后通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和疏水性相互作用高效液相色谱(HIC-HPLC)来测量依那西普的剩余量。
测量结果见下表8和9。
表8
Figure BDA0001003689760000232
Figure BDA0001003689760000241
表9
Figure BDA0001003689760000242
如显示25℃和40℃下的SE-HPLC和HIC-HPLC的分析结果的表8和9所确认，与通过在常规依那西普制剂的组合物中单独使用精氨酸作为稳定剂制备的对照制剂相比，使用脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物的制剂显示改善依那西普溶液稳定性的效果。
当检验到按照用作稳定剂的混合氨基酸的浓度比例改善稳定性的效果时，通过混合6mM脯氨酸和0.09mM组氨酸制备的制剂(制剂3)在包含脯氨酸和组氨酸的混合氨基酸的制剂(制剂2至制剂4)中显示最改善的稳定性，该制剂通过使用115mM氯化钠和0.5％蔗糖以及从3mM到9mM变化浓度的脯氨酸来制备。
这些结果证明，如上述脯氨酸和组氨酸的组成比例所示的包含6mM脯氨酸和0.09mM组氨酸的混合氨基酸作为稳定剂的依那西普液体制剂防止依那西普变性以使其活性保持一长段时间。
总之，本发明证明包含脯氨酸和组氨酸的混合氨基酸作为稳定剂的依那西普液体制剂防止变性以是其活性维持一长段时间，并且可通过使用由高浓度的氯化钠和低浓度的蔗糖组成的等渗剂来改善依那西普溶液的稳定性。
基于上述说明，本领域普通技术人员将理解本发明可以多种不同的具体形式实施而不改变其技术精神和必要特征。因此，应理解上述实施方式并非限制性的，而是在所有方面中是示例性的。由所附权利要求而非之前的说明书限定本发明的范围，并且因此权利要求往往包括落入权利要求边界的所有变化和修饰，或这类边界的等价形式。
Figure IDA0001003689830000011
Figure IDA0001003689830000021
Figure IDA0001003689830000031

Claims (24)

1.一种包含TNFR-Fc融合蛋白、脯氨酸与组氨酸的混合物、缓冲溶液和等渗剂的液体制剂，其中所述融合蛋白包含TNFR（肿瘤坏死因子受体）或其片段和免疫球蛋白Fc区，所述制剂包含1mM至低于10mM浓度的脯氨酸和0.01mM至低于5mM浓度的组氨酸；所述融合蛋白选自：依那西普、具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的融合蛋白、通过SEQ ID NO. 1的氨基酸序列中的氨基酸取代、删除或插入所制备的突变融合蛋白、或显示与依那西普的活性相似活性的肽类似物。
2.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述等渗剂使得所述液体制剂保持280至350 mOsm的渗透压。
3.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述等渗剂含有氯化钠（NaCl）和蔗糖。
4.如权利要求3所述的液体制剂，其特征在于，氯化钠的浓度是1至1000 mM并且蔗糖的量占总组合物重量的0.01至3%。
5.如权利要求4所述的液体制剂，其特征在于，氯化钠的浓度是105 mM至150 mM并且蔗糖的量占总组合物重量的0.01至1.5%。
6.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂中融合蛋白的浓度范围是20至55 mg/mL。
7.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述缓冲溶液是柠檬酸盐-磷酸盐或磷酸盐缓冲溶液。
8.如权利要求7所述的液体制剂，其特征在于，所述缓冲溶液的浓度范围是10至35 mM。
9.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH范围是6.0至6.6。
10.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述制剂包含低于9 mM浓度的脯氨酸和低于0.1 mM浓度的组氨酸。
11.如权利要求10所述的液体制剂，其特征在于，脯氨酸的浓度是1 mM至9 mM并且组氨酸的浓度低于0.1 mM。
12.如权利要求11所述的液体制剂，其特征在于，脯氨酸的浓度是1 mM至9 mM并且组氨酸的浓度是0.01至0.09 mM。
13.如权利要求12所述的液体制剂，其特征在于，脯氨酸的浓度是6 mM并且组氨酸的浓度是0.09 mM。
14.如权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂还包含1 mM至20 mM浓度的谷氨酸。
15.如权利要求14所述的液体制剂，其特征在于，谷氨酸的浓度是10至15 mM。
16.一种包含药学上有效量的TNFR-Fc融合蛋白、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、氯化钠、蔗糖、和包含脯氨酸和组氨酸的氨基酸混合物的液体制剂，其中所述TNFR-Fc融合蛋白是p75 sTNFR-Fc融合蛋白。
17.如权利要求16所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含30至55 mg/mL的所述TNFR-Fc融合蛋白，和10至35 mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、105至120 mM NaCl、0.5至1.5%蔗糖、1至9 mM脯氨酸和0.01至0.1 mM组氨酸，并且pH为6.3。
18.如权利要求17所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含50 mg/mL的所述TNFR-Fc融合蛋白、25 mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、115 mM NaCl、1%蔗糖、6 mM脯氨酸、和0.09 mM组氨酸，并且pH为6.3。
19.如权利要求16所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含30至55 mg/mL的所述TNFR-Fc融合蛋白，和10至35 mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲溶液、120至150 mM NaCl、0.01至0.5%蔗糖、1至9 mM脯氨酸和0.01至0.1 mM组氨酸，并且pH为6.3。
20.如权利要求19所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含50 mg/mL的所述TNFR-Fc融合蛋白、25 mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、130 mM NaCl、0.1%蔗糖、6 mM脯氨酸、和0.09 mM组氨酸作为稳定剂，并且pH为6.3。
21.如权利要求16所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂还包含谷氨酸，其中所述液体制剂包含30至55 mg/mL的所述TNFR-Fc融合蛋白，和10至35 mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、100至150 mM NaCl、0.1至1.5%蔗糖、5至15 mM谷氨酸盐、1至10 mM脯氨酸和1至10 mM组氨酸，并且pH为6.3。
22.如权利要求21所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂包含50 mg/mL的所述TNFR-Fc融合蛋白、25 mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、100 mM NaCl、1%蔗糖、10 mM谷氨酸盐、10 mM脯氨酸、和5 mM组氨酸，并且pH为6.3。
23.一种用于制备权利要求1-22中任一项所述的含TNFR-Fc融合蛋白的液体制剂的方法，包括：
a）制备所述TNFR-Fc融合蛋白；并且
b）将步骤a）中制备的TNFR-Fc融合蛋白与包含选自脯氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸的稳定剂、缓冲溶液、以及含氯化钠（NaCl）和蔗糖的等渗剂混合。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，步骤b）中的混合包括i）制备包含稳定剂、缓冲溶液和等渗剂的溶液和ii）用步骤i）中的溶液交换步骤a）中在其中制备TNFR-Fc融合蛋白的溶液。
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