KR20150035681A - 지속형 인간 성장 호르몬 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제, 구체적으로는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 동결 건조 제제 및 액상 제제, 상기 동결 건조 제제의 제조 방법, 상기 동결 건조 제제를 재구축하는 방법 및 상기 동결 건조 제제 및 재구축 용액을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

지속형 인간 성장 호르몬 제제{A formulation of long-acting human growth hormone conjugate}
본 발명은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제, 구체적으로는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 동결 건조 제제 및 액상 제제, 상기 동결 건조 제제의 제조 방법, 상기 동결 건조 제제를 재구축하는 방법 및 상기 동결 건조 제제 및 재구축 용액을 포함하는 키트에 관한 것이다.
인간 성장 호르몬(human growth hormone, hGH, 하기 "hGH"로 인용됨)은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 22,000의 폴리펩타이드 호르몬으로서 주로 소아의 뇌하수체성 왜소증 치료에 사용되고 있다. 종래에는 사람의 뇌하수체에서 추출한 hGH이 사용되었으나 그 양이 제한되어 치료를 받을 수 있는 사람이 극히 제한되었다. 또한 뇌하수체에서 추출한 hGH를 사용한 환자 중의 일부에서 치명적 신경계 질환인 크루즈펠트-야콥(Creutzfeldt-Jacob) 질병이 발생된 예가 보고되어 이러한 뇌하수체에서 추출한 hGH의 사용은 중단되었다. 최근에는 유전 공학 기술이 발전함에 따라서 대장균, 효모 등에서 hGH의 생산에 성공하였으며, 이러한 유전 공학 방법으로 생산된 재조합 hGH 제제들은 독성 및 임상 시험을 거쳐 1985년 이후에 여러 국가에서 허가를 획득하여 시판되고 있다.
hGH와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다.
최근에 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 대한민국 등록특허 제10-0567902호(생체 내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체), 및 대한민국 등록특허 제10-0725315호(면역글로불린단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법)에 개시되었다. 상기의 방법으로 생리활성 폴리펩타이드로서 hGH를 적용시켜 지속형 hGH 결합체를 제조할 수 있는데, 지속형 hGH 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 특히, 지속형 hGH 결합체는 폴리펩타이드 상의 hGH에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 폴리펩타이드 상의 hGH에 비해 제제로서 안정화하는데 매우 어려움이 있다.
동결 건조(Freeze-drying, lyophilization)는 특정 단백질 제제에서 수분을 제거하여 단백질을 보존하는 방법으로 사용되고 있다. 이러한 동결 건조는 수용액이나 다량의 수분을 함유한 재료를 동결시키고, 감압함으로써 얼음을 승화시켜 수분을 제거하여 건조물을 수득하는 방법이다. 이러한 동결-건조 과정에서 단백질의 안정성을 유지 또는 증가시키거나, 저장 기간 내에 동결 건조된 물질을 안정화시키기 위하여, 부형제를 포함하는 전-동결 건조 제제(pre-lyophilized formulation)를 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 동결 건조 제제의 조성은, 보존하려고 하는 단백질의 종류에 따라 그 특성의 차이로 인해, 한 단백질에 적용되는 제제의 조성이 다른 단백질에 대한 제제에는 적용되지 않는 경우가 빈번하다. 구체적으로, 상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해, 저장 및 동결 건조 과정, 재구축 시 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 안정성 증대 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 및 동결 건조, 재구축 시 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 적합한 비율, 농도 및 종류가 다양하다. 안정화제들을 병용할 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 동결 건조 공정 또는 저장 기간 동안 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 단백질을 안정화하기 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다.
제제 개발에 있어, 생체 내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 hGH 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 인간 성장 호르몬과 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다. 또한, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역은 각각 물리화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역을 동시에 안정화하여야 한다. 그러나, 상기에서 설명한 바와 같이, 상이한 펩타이드 또는 단백질들은 그들의 물리 화학적 차이점으로 인해, 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있고, 각각의 펩타이드 또는 단백질에 적합한 안정화제들을 병용하는 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있다. 따라서, 지속형 hGH 결합체의 경우 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역을 동시에 안정화할 수 있는 안정화제의 조성을 찾는 것에 많은 어려움이 따른다. 또한, 동결 건조 제제의 경우 재구축 시, 단백질의 안정성 및 활성을 유지하기 위해 다양한 방법으로 동결 건조 및 재구축 방법 역시 조절되어야 할 필요가 있으며, 이러한 방법은 제제의 조성 및 단백질의 종류에 따라 달라질 수 있다.
또한, 동결 건조제제에서 고농도 단백질을 포함하는 경우에는, 이의 농도로 인하여 동결 건조 과정 중에 단백질이 응집되는 경향이 있을 뿐 아니라, 다루기에도 어려운 점이 있다. 따라서, 기존에는 고농도의 단백질을 동결 건조시키고, 이를 재구축함으로써 수득하는 것이 아니라 저농도의 단백질을 포함하는 제제를 동결 건조시키고, 이를 재구축하는 경우 작은 부피로 재구축함으로써 고농도의 단백질을 수득하곤 하였다. 다만, 이와 같이 작은 부피로 재구축하게 되는 경우, 이에 포함되어 있던 단백질뿐만 아니라, 다른 구성성분들도 농축되며 고장성(hypertonic)이 되어 체내 투여에 바로 적용하기에는 적합하지 않을 수 있어, 고농도의 단백질 자체를 동결 건조시킬 수 있는 제제의 개발이 요구되어 왔다.
최근에는 환자의 편의성을 높인 반복 사용 가능한 단백질 및 펩타이드 제형이 개발되고 있다. 하지만 이 다회 사용 제형은, 반복 투여 후 버리기 전까지 미생물의 오염을 방지하기 위하여 반드시 보존제가 포함되어야 한다. 보존제가 포함된 다회 사용 제형은 단회 사용 제형에 비해 몇 가지 장점이 있다. 예를 들어, 단회 사용 제형의 경우 투여량의 차이에 따라 낭비되는 약물의 양이 많은데, 다회 사용 제형의 경우 버려지는 제품의 양을 줄일 수 있다. 게다가 일정 기간 동안 미생물의 성장의 걱정 없이 여러 번 사용 할 수 있으며, 하나의 용기로 제공할 수 있어 포장을 최소화할 수 있어 경제적이다. 하지만, 보존제의 사용이 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 보존제를 사용하는 경우 가장 많이 알려진 문제는 침전 형성이다. 단백질 침전은 약물의 효과를 감소시키고 체내 투여시 예기치 않은 면역반응을 초래할 수 있다. 따라서 보존제의 미생물 방지력을 유지하면서 단백질의 안정성에 문제가 되지 않는 농도 및 보존제의 선택이 중요하다.
일반적으로 용액 상태의 제제는 주사기 형태로 개발되며, 이때 가장 보편적으로 프리필드 시린지(prefilled syringe)가 사용되고 이를 더 편리하게 도와주는 자동 주사기(auto injector)도 많이 사용되고 있다. 그 외 카트리지(cartridge)를 장착하여 주사 양을 환자에 맞게 조절해서 자동으로 주사해 주는 펜주사기(pen injector)는 성장호르몬과 인슐린 등에 주로 사용되고 있다. 그러나 이런 주사 도구들은 용액 상태의 제형을 편리하게 투여할 수 있지만 안정성이 낮아 동결 건조 해야 하는 제품에는 사용될 수 없다.
또한, 동결 건조 제품은 강화유리로 된 바이알에 동결 건조된 제제와 용해를 위한 용매로 각각 제조되며, 사용하기 전에 직접 섞어서 용해를 시킨 후 주사기에 충전하여 주사하는 제품의 형태가 일반적이다. 최근 환자 편의성을 고려하여 동결 건조 바이알 형태(예, 강화유리 바이알)에서 단회용 충전주사기 또는 반복사용이 가능한 충전주사기 형태로 변경 및 개선되는 추세이다. 이러한 동결 건조 제제 형태로는 독일 베터(Vetter) 사의 듀얼 챔버 카트리지(dual chamber cartridge) 등이 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체를 동결 건조 과정 중에 안정성을 유지시킬 수 있으면서, 바이러스 오염의 우려 없이 안정적으로 장기간 동안 보관할 수 있는 동결 건조 제제, 및 지속형 인간 성장 호르몬 결합체를 안정적으로 보관할 수 있는 액상 제제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제를 이용하는 경우, 지속형 hGH 결합체의 안정성 및 동결 건조 과정에서의 안정성을 증대시킴으로써 경제적이고 안정한 동결 건조 제제를 제공할 수 있으며, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10 내지 58.5mg/mL에서 안정성이 우수한 염화나트륨을 포함하지 않는 액상 제제를 제공할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 동결 건조 제제는 보관 및 운반 시 안정할 뿐만 아니라, 재구축하였을 때, 피하 주사 제제로 적합한 삼투압 및 안정성을 가지는 제형임을 확인하였다. 또한, 보존제를 포함하여도 안정성을 유지하여 다회용 제제로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 및 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 혼합한 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동결 건조 제제에 포함된, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물에 재구축 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 상기 동결 건조 제제를 재구축하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제를 포함하는, 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제이다.
하나의 구체적인 양태는, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 hGH 결합체, 및 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 혼합한 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제이다.
하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 완충용액은 아세트산염, 히스티딘 또는 시트르산염 완충용액인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 완충용액은 아세트산염 완충용액인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 아세트산염은 아세트산 나트륨이고, 시트르산염은 시트르산 나트륨인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 완충용액의 pH는 5.0 내지 6.0인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 당알코올은 만니톨 또는 소르비톨인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 당알코올은 수용액 전체 부피에 대하여 1%(w/v) 내지 10%(w/v)의 범위로 포함되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 당알코올은 2.5%(w/v) 내지 5%(w/v)의 범위로 포함되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 비이온성 계면활성제는 수용액 총 부피에 대하여 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v) 농도인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 알부민-비함유 수용액은 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 아미노산은 히스티딘 또는 글라이신인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 히스티딘의 농도는 1 내지 10mM인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 지속형 hGH 결합체는 10 내지 100mg/mL 농도인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 알부민-비함유 수용액은 추가로 등장화제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 등장화제는 염화나트륨인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제에서 상기 염화나트륨은 0 내지 200mM인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 동결 건조 제제의 용기는 바이알, 듀얼 챔버 카트리지 또는 듀얼 챔버 시린지 형태인 것을 특징으로 한다.
다른 구체적인 양태는, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제이다.
하나의 구체예로서, 상기 액상제제는 등장화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 완충용액은 시트르산염, 아세트산염 또는 히스티딘 완충용액인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 당알코올은 만니톨 또는 소르비톨인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 당알코올은 2%(w/v) 내지 4.5%(w/v)의 농도로 제제에 포함되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 당알코올은 4%(w/v)의 농도로 제제에 포함되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 완충용액의 pH는 5.0 내지 6.0인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 완충용액의 pH는 5.2인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 비이온성 계면활성제는 제제 총 부피에 대하여 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v) 농도인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 액상제제에서 상기 지속형 hGH 결합체는 5.0mg/mL 내지 60.0mg/mL의 농도로 제제에 포함되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 인간 성장 호르몬(hGH)은 천연형 hGH와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에서 상기 결합체는 인간 성장 호르몬 및 면역글로불린 Fc가 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 연결된 형태이거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 연결된 형태인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제에 포함되는 결합체의 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 상기 제제는 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료를 위한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 아세테이트 완충용액, 폴리소르베이트 80 및 만니톨을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제이다.
본 발명의 또 다른 양태는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 및 시트르산염 완충용액, 폴리소르베이트 80 및 만니톨을 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 함유하고, 상기 안정화제는 등장화제를 포함하지 않는 것이 특징인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제이다.
본 발명의 또 다른 양태는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조하는 단계를 포함하는, 상기 동결 건조 제제의 제조 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 동결 건조 제제에 포함된, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물에 재구축 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 상기 동결 건조 제제를 재구축하는 방법이다.
하나의 구체예로서, 상기 재구축 용액은 주사용수인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 재구축 용액은 추가로 보존제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 구체예로서, 상기 보존제는 벤질 알코올, m-크레졸 또는 페놀인 것을 특징으로 한다.
또 다른 구체예로서, 상기 방법으로 재구축된 제제는 지속형 hGH 결합체를 10 내지 100mg/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제를 포함하는, 키트이다.
본 발명에 따른 지속형 hGH 결합체의 제제는 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없고, hGH 폴리펩티드와 면역 글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비하여 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 hGH 결합체에 대해 안정성을 제공한다. 특히, 상기 동결 건조 제제는 동결 건조 과정뿐만 아니라, 재구축 후에도 우수한 안정성을 제공하며, 보존제를 포함하여도 안정하여 다 회 투여용 제제로서도 사용될 수 있다.
도 1은, 본 발명에 사용된 동결 건조의 온도 구배 과정을 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명에 사용된 동결 건조의 온도 구배 과정을 나타낸 것으로, 1차 건조를 두 구간으로 설정한 온도 구배 과정을 표시한 것이다.
도 3a는, 본 발명에 사용된 강화유리 바이알을 나타낸 것이다.
도 3b는 베터(Vetter) 사의 듀얼 챔버 카트리지(dual chamber cartridge)를 나타낸 것이다.
본 발명은 하나의 양태로서 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제를 제공한다.
본 발명에서 용어, "지속형 인간 성장 호르몬(human growth hormone, hGH) 결합체"는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 단백질로서, 천연형 인간 성장 호르몬에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 의미한다. 본 발명에서 용어, "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형 인간 성장 호르몬에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태를 의미한다.
상기 제제는 구체적으로, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제일 수 있다.
본 발명에서 용어, "지속형 hGH 결합체의 동결 건조 제제(lyophilized formulation)"는 지속형 hGH 결합체를 포함하는 동결 건조 제제를 의미한다. 이는, 지속형 hGH 결합체와, 이를 안정화시키기 위한 부형제 등의 물질을 함께 동결 건조시켜 고체 상태로 존재하는 물질을 포함하는 형태를 말한다. 본 발명에서 동결 건조 제제는 동결 건조 물질 자체를 포함하는 개념이다. 상기 동결 건조 물질은 동결 건조 케이크(lyophilized cake)로도 불릴 수 있다.
상기 동결 건조 제제는, 지속형 hGH 결합체를 안정화시키기 위한 부형제를 포함하는 예비-동결 건조 제제(pre-lyophilized formulation)와 지속형 hGH 결합체가 모두 포함된 예비 제형 형태에서, 수분을 승화시키는 동결 건조 과정을 거쳐 제조된다. 본 발명에서, 상기 지속형 hGH 결합체 동결 건조 제제는 치료학적 유효량의 지속형 hGH 결합체를 포함할 수 있으며, hGH은 치료학적 유효량으로 1회용 용기(single-use container) 또는 다회용 용기(multi-use container)에 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 동결 건조 제제는 바이알(예, 강화유리 바이알), 듀얼 챔버 카트리지 또는 듀얼 챔버 시린지 형태의 용기에 함유된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 동결 건조 제제는 지속형 hGH 결합체를 동결 건조 과정에서 안정화시킬 수 있는 조성을 가지며, 이를 보관한 후 재구축하는 경우에도 제제의 안정성을 유지시킬 수 있는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 동결 건조 제제는 10 mg/mL 내지 100 mg/mL의 고농도의 지속형 hGH 결합체를 포함하여도 안정성을 부여할 수 있는 효과를 가진다.
또한, 상기 지속형 hGH 결합체 동결 건조 제제는 용기에 보관되다가 개체에 투여가 필요한 경우 등에 있어 재구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "재구축"이란, 고체 상태의 상기 동결 건조 물질을 액상화하여 hGH 결합체를 투여할 수 있게 하는 것을 의미한다. 이때, 본 발명의 동결 건조 제제에 포함되는 지속형 hGH 결합체의 농도는 재구축 시 1 mg/mL 내지 150 mg/mL, 바람직하게는 10 mg/mL 내지 120 mg/mL, 더욱 바람직하게는 10 mg/mL 내지 100 mg/mL이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재구축은 동결 건조 물질을 포함하는 바이알에 용해를 위한 용매를 섞어서 용해 시키는 방식으로 수행되거나, 또는 단회용 충전 주사기 또는 반복 사용이 가능한 충전 주사기 형태에서 동결 건조 물질에 용매를 가하여 용해 시키는 방식으로 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 지속형 인간 성장호르몬 결합체 동결 건조 제제는 기존의 액상 제제에 비해 hGH 결합체를 안정적으로 저장할 수 있는 장점이 있고, 유효 결합체의 농도를 조절 할 수 있는 특징을 가진다. 한편, 동결 건조 과정에서 예비 제형의 농도와 재구축 후 농도는 같거나 다를 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 본 발명의 동결 건조 제제는 지속형 hGH 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "알부민-비함유 수용액"은, 지속형 hGH 결합체가 안정하게 저장되고 동결 건조 과정 및 재구축 시 안정성을 유지할 수 있도록 하는 물질을 의미한다. 특히, 상기 알부민-비함유 수용액은 지속형 hGH 결합체 및 이를 안정화시키는 부형제를 포함하여, 동결 건조 과정 중 지속형 hGH 결합체의 안정성을 부여하고, 보관 안정성을 지닌 동결 건조 제제를 제조할 수 있게 하는 수용액을 의미한다. 상기 수용액은 완충용액, 당알코올, 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 또는 삼투압의 조정을 위해 등장화제를 추가할 수 있다. 지속형 hGH 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서뿐만 아니라, 지속형 hGH 결합체에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다. 또한, 상기 알부민-비함유 수용액은 본 발명에서 "예비 제형"과 혼용될 수 있다.
동결 건조 제제에 첨가되는 재구축 용액의 부피 조절에 따라, 지속형 hGH 결합체의 농도를 조절할 수 있으므로, 상기 알부민-비함유 수용액에서 지속형 hGH 결합체의 농도는 특별히 제한되는 것은 않는다. 그러나, 본 발명의 제제는 10mg/mL 내지 100mg/mL 이상의 고농도 지속형 hGH 결합체를 포함하는 알부민-비함유 수용액도 안정적으로 동결 건조할 수 있고, 제조된 동결 건조 제제를 3분 이내에 빠르게 용해시킬 수 있을 뿐만 아니라, 재구축한 용액의 지속형 hGH 결합체도 안정성을 유지시킬 수 있는 이점을 가진다.
또한, 상기 수용액은 인간 혈청 알부민을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
본 발명에서 용어, "완충용액"은 본 발명의 알부민-비함유 수용액에 포함되어 지속형 hGH 결합체가 안정해지도록 동결 건조 과정 또는 재구축 후 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 하는 용액을 의미한다. 상기 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소염), 시트르산염(예, 나트륨 시트레이트/시트르산), 아세테이트염(예, 나트륨 아세테이트/아세트산), 히스티딘을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 아세트산염 완충용액, 히스티딘 완충용액 또는 시트르산염 완충용액이며, 더욱 바람직하게는 아세트산염 완충용액, 또는 시트르산염 완충용액이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 완충용액을 구성하는 시트르산염 또는 아세트산염의 농도는 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM이고, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 6.0이며, 더욱더 바람직하게는 5.2 내지 6.0이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "당 알코올"은 본 발명의 동결 건조 제제에 포함되어 동결 건조 과정에서 지속형 hGH 결합체의 단백질을 보호하고, 재구축 후에도 안정성을 증대시키는 역할을 하는 수소화 탄수화물(hydrogenated carbohydrate)을 의미한다. 본 발명에 사용되는 당 알코올의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1% 내지 10%(w/v)이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 당 알코올의 농도는 구체적으로 2.5 내지 5%(w/v)일 수 있으며, 상기 당 알코올의 농도가 상기 범위인 경우, 예비 제형과 동일한 부피의 재구축 용액으로 재구축하였을 때, 등장액 범위의 삼투압을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 당 알코올은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 만니톨이 사용될 수 있다. 만니톨과 같은 당 알코올은 본 발명의 조성물에 포함되어, 삼투압 조절에 관여할 수 있다. 본 발명의 동결 건조제제를 재구축한 제제는 바람직하게는 등장성(isotonic)이나, 고장성 또는 저장성 제제 역시 본 발명에 적합하다.
본 발명에서 용어, "비이온성 계면활성제"는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 재구축 후에 소수성 표면에 단백질이 흡착되거나 응집되는 것을 방지하여 주는 물질을 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제 및 폴록사머계 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들이 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 80이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 비이온 계면활성제를 제제에 고농도로 사용하는 것은 적절하지 못할 수 있는데, 고농도의 비이온 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵울 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 동결 건조 제형에는 상기 비이온 계면활성제가 바람직하게는 0.1%(w/v) 이하의 저농도, 더욱 바람직하게는 0.001% 내지 0.1%(w/v), 더욱더 바람직하게는 0.001% 내지 0.05%(w/v)로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 알부민-비함유 수용액은 추가로 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 대표적인 아미노산으로서 히스티딘을 추가로 포함하는 경우, 용해속도를 개선시킬 수 있으며, 재구축시 거품 생성 없이 재구축할 수 있음을 확인하였다.
지속형 hGH 결합체의 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스, 푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오즈, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 바람직한 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 아미노산의 예로는, 히스티딘 또는 글라이신이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 여기서 상기 히스티딘 등은 수용액 내에 1 내지 10mM의 농도로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 알부민-비함유 수용액은 추가로 삼투압 조절을 위하여 등장화제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "등장화제"는 지속형 hGH 결합체를 재구축 한 후 체내에 투여할 때 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 할 수 있는 물질을 의미한다. 또한, 상기 등장화제는 지속형 hGH 결합체를 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낼 수 있다. 이러한 등장화제의 대표적인 예로는 수용성 무기염을 들 수 있으며, 바람직한 예로는 염화나트륨을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 염화나트륨의 농도는 바람직하게는 0mM 내지 200mM이나, 이에 제한되지는 않으며, 제제에 포함된 성분들은 종류 및 양에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.
이와 같은 알부민-비함유 수용액은 1/2배, 1/4배, 또는 그 이상으로 희석된 형태로 동결 건조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는, 알부민-비함유 수용액을 1/2배, 1/4배로 희석하여 동결 건조하는 경우, 용해시간을 단축할 수 있음을 확인하였다(시험예 1-(5)).
이와 같은 동결 건조된 혼합물을 포함하는 본 발명의 동결 건조 제제는 용해 시간이 우수한 이점을 지닌다. 구체적으로, 동결 건조 물질에 있어서 중요한 특성 중 하나는 용해시간인데, 이는 용해 시간이 길어질수록 더욱더 농축된 용액에 단백질이 오래 노출되게 되면서, 제품 품질이 악화되기 때문이며, 또한, 완전히 용해되지 않은 제품은 개체에 투여할 수 없으므로, 짧은 용해시간은 환자 및 의사 모두에게 편리함을 제공할 수 있다. 그러나, 단백질의 농도가 증가할수록 이러한 용해 시간 역시 증가하게 된다. 따라서, 용해 시간을 감소시키기 위한 조성을 개발하는 것 역시 고농도의 동결 건조된 제제의 제조에 있어 중요한 문제가 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 10mg/mL 이상의 고농도의 지속형 hGH 결합체를 포함하는 본 발명의 동결 건조 제제의 경우에도, 최소 10초, 최대 3분 이내에 용해되는 결과를 나타내었다.
또한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 동결 건조된 제품에 있어서 원하는 복용량(dosage)은 표적 단백질을 원하는 농도로 동결 건조하고, 이를 다시 예비-제제의 부피로 재구성하여 얻을 수 있다. 또한, 예비-제제를 희석하여 부피를 증가시켜 동결 건조하고, 재구성시에는 동결 건조 당시의 부피에 비하여 작은 부피의 재구축 용액으로 희석할 수도 있다. 다만, 예비-제제를 지나치게 희석하는 경우에는, 동결 건조 사이클이 길어질 수 있어(특히, 1차 건조 시간), 생산비용이 증가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제제는 과도한 희석 없이도 고농도의 지속형 hGH 결합체를 동결 건조할 수 있으므로, 상기와 같은 비용적 이점도 지닐 수 있다.
또한, 본 발명의 동결 건조 제제에는 상기 설명한 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제, 또는 재구축 용액의 보존제 외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서는, 지속형 hGH 결합체, 완충용액, 당알코올 및 계면활성제를 포함하는 알부민-비함유 수용액을 예비 제형으로 동결 건조 제제를 제조하였고, 이의 안정성 및 용해속도를 확인하였다. 구체적으로, pH 5.2 또는 pH 5.6의 20mM 시트르산 완충용액, 150mM 염화나트륨, 5% 만니톨 및 0.005% 폴리소르베이트 80으로 구성된 전-동결 건조 제제에 19.5mg/mL 및 78.0mg/mL 농도의 지속형 hGH 결합체를 동결 건조하였고, 증류수를 이용하여 재구축하였다. 그 결과, 상기 농도에서 안정성을 부여하였고, 특히 78.0mg/mL의 고농도에서 안정성이 보다 높은 결과를 나타내었다. 또한, pH 5.2 및 5.6 모두에서 안정성을 나타내는 결과를 보였다(시험예 1-(1)). 또한, pH 5.2 또는 pH 5.6의 20mM 시트르산 완충액, 150mM NaCl, 5% 만니톨 및 0.005% 폴리소르베이트 80으로 구성된 전-동결 건조 제제 및 pH 5.6의 20mM 아세트산 완충액, 4% 만니톨 및 0.005% 폴리소르베이트 80으로 구성된 전-동결 건조 제제에 지속형 hGH 결합체를 용해시킨 예비 제제로 동결 건조한 제제에 보존제로서 m-크레졸, 벤질 알코올 또는 페놀을 포함하는 재구축 용액을 사용하여 재구축하였을 때, 안정성이 유지되는 결과를 나타내었다. 이러한 결과로부터, 보존제를 포함하는 재구축 용액으로 동결 건조 물질을 재구축하여, 활성이 보존된 재구축된 제제를 제조할 수 있음을 확인하였다. 특히, 아세트산염 수용액을 사용하는 경우, 보존제를 포함하는 재구축 용액으로 재구축한 용액의 경우에도 침전이 발생하지 않고 안정성이 우수한 결과를 나타내었다(시험예 1-(2)). 또한, 19.5mg/mL, 39.0mg/mL, 58.5mg/mL 또는 70.0mg/mL의 결합체 농도에서, 결합체 농도 증가에 따라 제조된 동결 건조제제의 용해시간이 증가하는 것을 확인하였다(시험예 1-(3)). 또한, 상기 알부민-비함유 수용액에 포함되는 지속형 hGH 결합체에 대한 안정화제에서, 염을 포함하지 않는 경우에도 용해시간 및 안정도가 모두 우수하였으며, 만니톨의 농도를 증가시킬수록 용해속도를 증가시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또는 히스티딘을 첨가하는 경우, 만니톨의 농도를 증가시키지 않고도 용해속도를 단축시킬 수 있음을 나타내었다(시험예 1-(4)). 또한, 예비 제형을 희석하여, 밀도를 낮게 하는 경우, 용해속도가 보다 개선되는 것을 확인하였으며(시험예 1-(5)), 동결 건조 물질이 완전히 건조될 수 있는 최적 건조 조건을 설정하였다(시험예 1-(6)). 또한, 만니톨의 포함 여부가 용해시간에 영향을 크게 미치는 것을 확인하였고(시험예 1-(7)), 만니톨의 농도가 4 내지 4.5%일 때, 58.5mg/mL의 고농도 지속형 hGH 결합체임에도, 용해시간이 30초 이내이면서도 등장액의 삼투압을 나타내는 결과를 보였다(시험예 1-(8)). 또한, 이와 같이 제조한 동결 건조 제제가 4℃ 및 25℃ 온도 모두에서 6개월간 보관하여도 안정성을 거의 동일하게 유지하는 결과를 나타내었고, 재구축한 물질을 2주간 25℃에 보관하여도 안정성을 유지하는 결과를 나타내었다(시험예 1-(9)).
구체적으로, 상기 제제는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제일 수 있다.
상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같으며, 자세한 내용은 후술한다.
본 발명에서 용어, "지속형 hGH 결합체 액상 제제"는 지속형 hGH 결합체를 포함하는 액상 제제를 의미한다. 상기 액상 제제는 액상의 내용 제제 및 외용 제제를 모두 포함하는 개념이다. 본 발명에서, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 hGH 결합체를 포함할 수 있으며, 일반적으로 hGH의 치료학적 유효량은 1회용 바이알(single-use vial) 내에 약 1 내지 3 mg 정도가 함유된 양이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 액상 제제에 포함되는 지속형 hGH 결합체의 농도는 5.0 내지 60.0mg/mL임이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 약리학적 유효량의 지속형 hGH 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함한다.
본 발명에서 용어, "안정화제"는 지속형 hGH 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미한다. 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 지속형 hGH 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서뿐만 아니라, 지속형 hGH 결합체에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다.
본 발명에서 용어, "완충용액"은 본 발명의 안정화제에 포함되어 지속형 hGH 결합체가 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 하는 용액을 의미한다. 상기 동결 건조 제제에서 앞서 기술된 완충용액에 대한 구체적인 내용이 여기서도 적용된다.
상기 완충용액은 시트르산염, 아세트산염 또는 히스티딘 완충용액일 수 있으며, 바람직하게는 시트르산염 완충용액이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충용액을 구성하는 염의 농도는 구체적으로는 5 mM 내지 100 mM 이고, 더욱 구체적으로는 10 mM 내지 50 mM이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충용액의 pH는 구체적으로는 4.0 내지 7.0, 더욱 구체적으로는 5.0 내지 6.0이며, 더욱더 구체적으로는 5.2 내지 6.0이며, 가장 구체적으로는 5.2이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "당 알코올"은 본 발명의 액상 제제에 포함되어 지속형 hGH 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 하는 수소화 탄수화물(hydrogenated carbohydrate)을 의미한다. 본 발명에 사용되는 당 알코올의 농도는 바람직하게는 제제 총 부피에 대하여 1 내지 10%(w/v), 더욱 바람직하게는 2 내지 4.5%(w/v), 더욱 더 바람직하게는 4%(w/v)이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 당 알코올은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 만니톨이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "비이온 계면활성제"는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착되거나 응집되는 것을 방지하여 주는 물질을 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 예에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 제제는 등장화제를 함유하지 않는 것일 수 있다.
상기 등장화제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 완충용액으로서 pH 5.2인 아세트산염 또는 시트르산염 수용액을 포함하는 제제로서, 등장화제를 함유하지 않으면서 만니톨을 4%(w/v)로 함유하는 경우, 안정성이 우수한 결과를 나타내었다. 특히, pH 5.2인 시트르산염 수용액을 완충용액으로 포함하며, 등장화제를 함유하지 않으면서 만니톨을 4%(w/v)로 함유하는 제제의 경우, 지속형 hGH 결합체가 10.0mg/mL인 농도에서 가장 높은 안정성을 가져왔다.
지속형 hGH 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류에 대해서는 앞서 기술한 종류가 적용된다. 또한, 본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
특히, 본 발명의 액상 제제는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 등장화제를 포함하지 않는 지속형 hGH 결합체 제제의 경우, pH 5.2인 완충액 조건에서 4%(w/v) 만니톨를 포함하는 경우, 지속형 hGH 결합체가 가장 안정한 결과를 나타내었다. 특히, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0mg/mL일 때, 시트르산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 히스티딘 완충액을 사용하여 비교하였을 때, 안정성이 가장 우수한 결과를 나타내었다(시험예 2).
본 발명의 상기 제제는 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료를 위한 것일 수 있으며, 재구축되어 상기 질환의 치료를 위하여 개체 내에 투여될 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 동결 건조 제제 또는 액상제제의 안정화 대상인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어, "인간 성장 호르몬(hGH, human growth hormone)"은 인간의 성장, 세포 생식(cell reproduction) 및 재생을 촉진할 수 있는 펩타이드 호르몬을 의미한다. 상기 hGH 서열 등의 정보는 NCBI의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있으며, hGH의 활성을 나타내는 한, 천연형 인간 성장호르몬의 서열과 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 더욱더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산의 치환, 제거, 삽입에 의한 변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명에서 유용한 hGH는 천연형 hGH, 이의 변이체, 이의 유도체 또는 이들의 단편의 서열일 수 있다.
본 발명에서 용어, "hGH 변이체"는 천연형 hGH와 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, hGH의 활성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 hGH 변이체는 천연형 hGH에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deleteion) 및 수식(modification) 중에서 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "hGH 유도체"는 천연형 hGH와 비교시 최소한 80% 이상의 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, hGH의 활성을 나타내며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태를 의미한다.
본 발명에서 용어, "hGH 단편"은 hGH의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태로서 hGH의 활성을 보유하는 펩타이드를 의미하며, 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D 형 아미노산)도 가능할 수 있다.
또한, 본 발명에 사용되는 hGH은 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 것이나 모두 가능하며, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 이용하여 제조한 재조합 hGH이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한 면역글로불린의 일부분을 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3) 부분을 일 수 있으며, 상기 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 면역글로불린 Fc는 천연 IgG를 특정 단백질 분해 효소로 처리하여 제조할 수 있으며, 재조합 기술을 이용하여 형질 전환된 세포로부터도 제조할 수 있다. 바람직하게는 E.coli에서 제조한 재조합 인간 면역글로불린 Fc 이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 지속형 hGH 결합체는 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 hGH와, 천연 IgG를 특정 단백질 분해효소로 처리하거나 재조합 기술을 이용하여 형질전환 세포로부터 제조한 면역글로불린 Fc 영역을 서로 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
이때 이용되는 결합 방법으로, hGH와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 hGH와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다. 즉, 상기 결합체는 인간 성장 호르몬과 면역 글로불린 Fc가 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 형태로 제조하거나, hGH 및 면역글로불린 Fc의 융합 단백질 형태로 제조할 수 있다. 상기 융합 단백질은 hGH 및 면역글로불린 Fc가 펩타이드성 링커를 통해 연결된 형태를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
교차 결합 시 사용되는 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이나 이에 제한되지는 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 지속형 hGH 결합체의 제조를 위해 대한민국 등록특허 제10-0725315호 등이 참고문헌으로서 본 발명에 해당된다. 당업자들은 상기의 문헌에 의해 본 발명에 사용되는 지속형 hGH 결합체를 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 아세테이트 완충용액, 폴리소르베이트 80 및 만니톨을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제를 제공한다.
상기 인간 성장 호르몬, 면역글로불린 Fc 영역, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 알부민-비함유 수용액, 동결 건조 및 동결 건조 제제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 및 시트르산염 완충용액, 폴리소르베이트 80 및 만니톨을 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 함유하고, 상기 안정화제는 등장화제를 포함하지 않는 것이 특징인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제를 제공한다.
상기 인간 성장 호르몬, 면역글로불린 Fc 영역, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체, 알부민-비함유 안정화제, 및 액상 제제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 지속형 hGH 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조하는 단계를 포함하는, 상기 동결 건조 제제의 제조 방법을 제공한다.
상기 지속형 hGH 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제, 당 알코올, 알부민-비함유 수용액, 동결 건조 및 동결 건조 제제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 동결 건조 제제에 재구축 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 상기 동결 건조 제제를 재구축하는 방법을 제공한다.
상기 동결 건조 제제 및 재구축에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "재구축 용액"은 고체 상태의 동결 건조 물질에 첨가하여 재구축하는 용액을 의미한다. 이러한 재구축 용액은 주사용수(water for injection)일 수 있으며, 이의 예로는, 멸균된 증류수가 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 재구축 용액은 추가로 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "보존제"는 제제에서 박테리아, 곰팡이의 작용을 실질적으로 감소시키는 물질로서, 특히 다회 투여용 제제의 생산을 용이하게 하기 위하여 제제에 포함되는 화합물이다. 잠재적 보존제의 실례로서, 옥타데실디메틸-벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethyl-benzyl ammonium chloride), 헥사메소늄 클로라이드(hexamethonium chloride), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)(알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 벤제소늄 클로라 이드(benzethonium chloride) 등이 있으며, 이와 다른 유형의 보존제로는 방향족 알코올, 예를 들면, 페놀, 부틸, 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸이나 프로필 파라벤; 카테콜(catechol), 레조르시놀(resorcinol), 시클로헥산올(cyclohexanol), 3-펜탄올(3-pentanol), m-크레졸(m-cresol) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 보존제는 그 중에서도 벤질 알코올, m-크레졸 또는 페놀이 더욱 바람직하며, 더욱더 바람직하게는 벤질 알코올이나, 이에 제한되지 않는다. 보존제의 바람직한 농도는 0.001내지 0.9%(w/v)이고, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.9%(w/v) 이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 과정으로 재구축된 본 발명의 제제는 지속형 hGH 결합체를 10 내지 100mg/mL 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기 동결 건조 제제 및 재구축 용액을 포함하는, 키트를 제공한다.
상기 동결 건조 제제 및 관련 내용에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 키트는 동결 건조 제제 및 재구축 용액을 포함하며, 재구축에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의하여 좀 더 상세히 설명한다. 단, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예: 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 약 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD를 인간 성장 호르몬(hGH, 분자량 22 kDa)과 결합시키고, 이를 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역(약 50 kDa) N 말단에 결합시켜, 본 발명의 대표적인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체인 hGH-PEG-Fc 결합체(이하 "지속형 hGH 결합체"로 명명)를 제조 및 정제하였다.
시험예 1: 지속형 hGH 결합체 동결 건조 제제의 평가
(1) 농도 및 완충용액에 따른 지속형 hGH 결합체 동결 건조 제제의 안정성 평가
지속형 hGH 결합체를 하기 표 1과 같은 농도로 포함하는 동결 건조 제제를 제조한 뒤 재구축(reconstitution)하여 물질의 안정성을 확인하였다. 완충용액과 pH 변경에 따른 지속형 hGH 결합체의 안정화를 평가하기 위해 완충용액과 pH를 변경한 제제의 안정성을 또한 확인하였다.
하기 표 1과 같이 동결 건조물질의 안정화제로서, 완충용액과 염화나트륨(NaCl), 만니톨(mannitol), 및 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)으로 이루어진 제제를 전-동결 건조 제제(pre-lyophilized formulation)로 사용하여, 해당 농도의 지속형 hGH 결합체를 동결 건조하였고, 증류수를 이용하여 재구축하였다. 동결 건조는 1차, 2차 건조로 나누어 진행하였으며, 동결 건조의 온도 구배는 도 1과 같이 동결-1차 건조(4℃)-2차 건조(20℃)로 설정하였다. 재구축은 동결 건조 전 제제의 부피와 같은 양의 증류수로 동결 건조물질을 용해하였다. 재구축한 액상형태의 제제를 40℃에서 4주간 보관 후, 이온 교환 크로마토그래피법(Ion exchange chromatography, IE-HPLC)을 이용해 안정성 평가를 하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2의 IE-HPLC(%)는 분석 시점에서의 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다.
번호 농도 완충용액 염 당알코올 계면 활성제
실시예 1 19.5 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(Na-Citrate)
(pH 5.2)		 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 2 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨
(pH 5.2)		 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 3 78.0 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨
(pH 5.6)		 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 IE-HPLC (%)
0주 1주 2주 4주
실시예 1 96.2 93.6 87.1 76.8
실시예 2 96.4 95.9 92.8 82.0
실시예 3 96.4 93.6 88.8 82.2
상기 표 2의 결과에서 보듯이, 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 40℃에서 4주간 보관하였을 때, 농도에 따른 안정성이 차이가 없이 유지되는 것으로 나타나, 고농도의 지속형 인간 성장 호르몬에도 안정성을 부여할 수 있는 것을 나타내었다. 또한, 표 2의 결과에서 실시예 2 및 실시예 3을 비교하였을 때, 완충용액 및 pH를 변경한 제제도 안정성이 유지되는 것을 확인하였다.
(2) 보존제의 종류에 따른 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체 동결 건조 제제의 안정성 및 용해도 평가
상기 시험예 1-(1)의 제제인 실시예 2(20mM 시트르산 나트륨, pH 5.2, 150 mM 염화나트륨, 5% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80), 실시예 3(20mM 아세트산 나트륨, pH 5.6, 150mM 염화나트륨, 5% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80) 및 실시예 3을 기본으로 한 등장성 제제(20mM 아세트산 나트륨, pH 5.6, 4% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80)를 기초로 하여 지속형 hGH 결합체를 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 68.25 mg/mL 및 58.5 mg/mL 농도로 혼합한 뒤, 동결 건조하고, 그 뒤 하기 표 3의 보존제를 포함하는 재구축 용액을 사용하여 용해시간 측정 및 안정성을 확인하였다. 제품 성상은 눈으로 확인하여 비교하였다. 동결 건조 및 재구축 방법은 상기 시험예 1-(1)과 같이 진행하였다. 재구축한 액상형태의 제제를 25℃에서 4주간 보관 후, 이온 교환 크로마토그래피법(Ion exchange chromatography, IE-HPLC) 및 눈을 통한 성상 확인을 이용해 안정성 평가를 하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4의 IE-HPLC(%)는 분석 시점에서의 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다.
번호 농도 완충용액 염 당알코올 계면 활성제 보존제
실시예 4 68.25 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80 0.3% m-크레졸(m-cresol)
실시예 5 68.25 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80 0.9% 벤질 알코올(Benzyl alcohol)
실시예 6 68.25 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80 0.3% m-크레졸
실시예 7 68.25 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80 0.9% 벤질 알코올
실시예 8 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80 0.3% m-크레졸
실시예 9 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80 0.3% 페놀(phenol)
번호 IE-HPLC (%) 비고
0주 1주 2주 4주
실시예 4 96.7 93.2 90.0 83.7 3주 뒤 침전 형성
실시예 5 96.7 92.6 89.8 83.1 3주 뒤 침전 형성
실시예 6 96.6 93.1 89.4 87.7 -
실시예 7 96.5 93.1 89.6 87.5 -
실시예 8 97.6 95.4 92.3 88.1 -
실시예 9 97.4 95.3 92.4 87.4 -
상기 표 4의 결과에서 보듯이, 실시예 4 및 5보다 실시예 6 및 7에서 지속형 hGH 결합체의 안정성이 유지되는 결과를 확인할 수 있었다. 하지만, 실시예 6 내지 9의 결과에서 보듯 보존제의 종류에 따른 지속형 hGH 결합체의 안정성 차이는 없는 결과를 나타내었다. 다만, m-크레졸을 포함하는 재구축 용액을 사용하는 경우 용해시 액상의 형태가 뿌옇게 흐려지는 현상이 나타났다.
(3) 결합체의 농도에 따른 지속형 hGH 결합체 동결 건조 제제의 용해도 평가
지속형 hGH 결합체를 하기 농도별로 포함하는 동결 건조 제제를 제조한 뒤 동결 건조 물질의 제품 성상 및 재구축 용해도를 확인하였다. 상기 시험예 1-(1)의 제제인 실시예 1의 조성(20mM 시트르산 나트륨, pH 5.2, 150 mM 염화나트륨, 5% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80)을 기초로 하여 지속형 hGH 결합체를 하기 표 5와 같은 농도 별로 혼합한 뒤, 동결 건조하고, 그 뒤 증류수를 이용하여 재구축 용해시간을 측정하였다. 동결 건조 및 재구축 방법은 상기 시험예 1-(1)과 같이 진행하였다. 제품 성상은 눈으로 확인하여 비교하였다. 용해는 자동 쉐이커를 사용하여 진폭 60도, 30 rpm으로 설정하여 재구축하였다. 하기 표 6은 용해가 완료되는데 걸리는 시간을 나타낸다.
번호 농도 완충용액 염 당알코올 계면 활성제
실시예 1 19.5 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 10 39.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 11 58.5 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 12 70.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 실시예 1 실시예 10 실시예 11 실시예 12
용해시간 (초) 10 30 90 150
동결 건조 물질의 제품 성상은 농도와 관계없이 안정하게 형성되었으나, 농도가 높을수록 더 단단한 케이크를 확인할 수 있었다. 상기 표 6의 결과에서 보듯이, 농도가 높을수록 용해시간이 늘어나는 결과를 나타내었다.
(4) 안정화제의 종류에 따른 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체 동결 건조 제제의 안정성 및 용해도 평가
안정화제의 종류에 따른 지속형 hGH 결합체 동결 건조 제제를 제조하여 용해시간, 용해 성상 및 지속형 hGH 결합체의 안정성을 확인하였다. 동결 건조 전 예비 제제는 하기 표 7과 같은 조성으로 준비하였고, 상기 제제로 78.0 mg/mL의 지속형 hGH 결합체를 동결 건조한 다음, 증류수를 이용하여 재구축하였고, 이때 재구축에 따른 용해시간을 평가하였다. 동결 건조 및 재구축 방법은 상기 시험예 1-(1)과 같이 진행하였다. 제품 성상은 눈으로 확인하여 비교하였다. 용해는 자동 쉐이커를 사용하여 진폭 60도, 30 rpm으로 설정하여 재구축하였고, 용해 시간을 확인한 결과를 표 8에 나타내었다.
또한, 재구축한 액상형태의 제제를 40℃에서 4주간 보관 후, 이온 교환 크로마토그래피법 (Ion exchange chromatography, IE-HPLC)을 이용해 안정성 평가를 하였다. 표 9의 IE-HPLC(%)는 분석 시점에서의 초기 결과 값에 대비한 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다
번호 농도 완충용액 염 당알코올 및 그 외 계면 활성제
실시예 13 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 14 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.02% 폴리소르베이트 80
실시예 15 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 150 mM NaCl 10% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 16 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 150 mM NaCl 2.5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 17 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 10% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 18 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 5% 만니톨
2% 글리신(Glycine)		 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 19 78.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨(pH 5.2) 5% 만니톨
5 mM 히스티딘(Histidine)		 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 실시예 13 실시예 14 실시예 15 실시예 16 실시예 17 실시예 18 실시예 19
용해시간 (초) 120 120 80 180 90 130 90
번호 IE-HPLC (%)
0주 2주 4주
실시예 13 100.0 97.8 87.9
실시예 14 100.0 97.8 88.3
실시예 15 100.0 96.3 85.8
실시예 16 100.0 98.1 86.8
실시예 17 100.0 94.7 82.6
실시예 18 100.0 96.3 81.6
실시예 19 100.0 95.4 83.7
상기 표 8의 결과에서 보듯이, 만니톨의 농도가 높을 때, 용해속도가 높은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 5 mM의 히스티딘(Histidine)을 첨가하였을 때, 용해속도가 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 15 및 17번 제제의 경우 실시예 19번 제제에 비해 재구축시 거품이 많이 생성되는 것을 확인하였다. 상기 표 9의 결과에서 보듯이, 용해 후 안정성은 각 제제에서 유사하게 나타났다. 다만, 염화나트륨을 안정화제로 포함하는 경우 지속형 hGH 결합체의 안정성이 조금 더 높게 나타나는 결과를 보였다.
(5) 동결 건조 물질의 밀도와 지속형 hGH 결합체의 농도에 따른 동결 건조 제제의 용해도 평가
상기 시험예 1-(4)에서 확인된 제제인 실시예 19의 조성(20 mM 시트르산나트륨, pH 5.2, 5%(w/v) 만니톨, 5 mM 히스티딘, 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 80)을 기초하여 지속형 hGH 결합체 농도에 따른 동결 건조 물질의 용해도를 확인하였다. 하기 표 10과 같은 조성으로 예비 제형을 제조하여 동결 건조하였다. 동결 건조 시, 예비 제형을 증류수를 이용하여 각각 1배, 1/2배, 1/4배 희석하여 동결 건조 물질을 제조하였다. 건조는 1차, 2차 건조로 나누어 진행하였으며, 동결 건조의 온도 구배는 도 1과 같이 설정하였다. 재구축은 희석하기 전 부피의 양에 해당하는 증류수로 용해하였다. 용해는 자동 쉐이커를 사용하여 진폭 60도, 30 rpm으로 설정하여 재구축하였다. 표 11은 용해가 완료되는데 걸리는 시간을 나타낸다.
번호 농도 완충용액 염 당알코올 및 그 외 계면 활성제
실시예 20 39.0 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) - 5% 만니톨
5 mM 히스티딘		 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 21 48.8 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) - 5% 만니톨
5 mM 히스티딘		 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 22 58.5 mg/mL 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 5.2) - 5% 만니톨
5 mM 히스티딘		 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 실시예 20 실시예 21 실시예 22
희석 배율 1 1/2 1/4 1 1/2 1/4 1 1/2 1/4
용해시간 (초) 10 10 5 15 10 5 15 10 10
상기 표 11에서 보듯이, 희석하여 동결 건조 물질의 밀도를 적게 하는 경우 용해 속도가 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 제제의 조성(20 mM 시트르산 나트륨, 5% 만니톨, 5 mM 히스티딘, 0.005% 폴리소르베이트 80)에서 지속형 hGH 결합체의 농도를 39.0 mg/mL에서, 48.8mg/mL 및 58.5 mg/mL로 증가시켜도, 용해 속도는 유사하게 증가되었다.
(6) 동결 건조 과정의 온도 구배 설정
상기 시험예 1-(1)의 온도 구배 설정(도 1)에서 1차 건조 시간을 10시간에서 20시간으로 증가시키고 1차 건조 온도를 4℃의 한 구간에서 -20℃, -5℃ 두 구간으로 나누어 설정하였다(도 2). 기존 온도 구배 방법에서는, 동결 건조 물질에 수분이 3~5% 남아 있어 동결 건조 물질이 붕괴 되는 현상을 보였다. 온도 구배를 도 2와 같이 변경하였을 때, 부피가 커져도(~ 5mL) 건조가 완전하게 되는 동결 건조 물질을 확인할 수 있었다.
(7) 삼투압을 고려한 지속형 hGH 결합체의 동결 건조 제제의 용해도 평가
상기 시험예 1-(1) 및 (2)에서 확인된 제제의 조성(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6, 5%(w/v) 만니톨, 150mM 염화나트륨, 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 80)을 기초하여 삼투압을 고려한 안정화제의 농도를 설정하였고, 그에 따른 동결 건조 물질의 용해도를 확인하였다. 하기 표 12와 같은 조성으로 예비 제형을 제조하여 동결 건조하였다.
동결 건조 시, 예비 제형을 증류수를 이용하여 1/2배 희석하여 동결 건조 물질을 제조하였다. 건조는 1차, 2차 건조로 나누어 진행하였으며, 동결 건조의 온도 구배는 도 2와 같이 설정하였다. 재구축은 희석하기 전 부피에 해당하는 양을 가지며 0.9% 벤질알코올을 포함하는 증류수를 이용하여 용해하였다.
용해는 자동 쉐이커를 사용하여 진폭 60도, 30 rpm으로 설정하여 재구축하였다. 표 13은 용해가 완료되는데 걸리는 시간 및 동결 건조 물질을 재구축한 후, 샘플의 삼투압을 측정한 결과를 나타낸다.
번호 농도 완충용액 염 당알코올 및 그 외 계면 활성제
실시예 23 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) 150mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 24 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) 150mM NaCl - 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 25 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 26 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) 75mM NaCl 2.5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 실시예 23 실시예 24 실시예 25 실시예 26
용해시간 (초) 30 180 15 60
삼투압 (mOsm/Kg) 662 338 365 355
상기 표 13에서 보듯이, 만니톨을 제거하는 경우 용해시간이 크게 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 삼투압은 5%(w/v) 만니톨의 경우 등장액의 범위인 280 ~ 320 mOsm/Kg 보다 높게 나타나는 것으로 나타났다.
(8) 만니톨의 농도에 따른 지속형 hGH 결합체의 동결 건조 제제의 용해도 및 삼투압 확인
상기 시험예 1-(7)에서 확인된 제제(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6, 5%(w/v) 만니톨, 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 80)를 기초하여 만니톨의 농도에 따른 동결 건조 물질의 용해도 및 삼투압을 확인하였다.
하기 표 14와 같은 조성으로 예비 제형을 제조하여 동결 건조하였다. 이때, 동결 건조 및 재구축의 방법 및 조건은 상기 시험예 1-(7)과 같았다. 표 15는 용해가 완료되는데 걸리는 시간 및 동결 건조 물질을 재구축 한 후, 샘플의 삼투압을 측정한 결과를 나타낸다.
번호 농도 완충용액 염 당알코올 및 그 외 계면 활성제
실시예 23 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) 150 mM NaCl 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 25 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 27 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 4.5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 28 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 29 58.5 mg/mL 20 mM 아세트산 나트륨 (pH 5.6) - 3.5% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 실시예 23 실시예 25 실시예 27 실시예 28 실시예 29
용해시간 (초) 30 20 22 25 27
삼투압 (mOsm/Kg) 632 350 318 291 258
상기 표 15에서 보듯이, 만니톨의 농도가 4~4.5% 일 때, 등장액 범위의 삼투압을 가지는 것으로 나타났다. 만니톨의 농도가 낮을수록 용해시간이 길어지는 것을 확인할 수 있으나, 염화나트륨을 포함하는 경우보다는 적게 나타났다.
(9) 지속형 hGH 결합체의 동결 건조 제제의 4℃, 25℃ 보관 안정성 확인
상기 시험예 1-(8)에서 확인된 제제(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6, 4%(w/v) 만니톨, 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 80)를 기초하여 동결 건조 물질의 4℃, 25℃ 보관 안정성을 확인하였다. 안정성은 동결 건조 상태로 4℃, 25℃에서 6개월간 보관한 후 재구축하여 이온 교환 크로마토그래피법(Ion exchange chromatography, IE-HPLC)을 이용해 평가하였다. 초기 재구축 용액은 액상 상태로 25℃에서 4주간 보관 한 후 재구축하여 이온 교환 크로마토그래피법 (Ion exchange chromatography, IE-HPLC)을 이용해 평가하였다. 표 16의 IE-HPLC(%)는 분석 시점에서의 동결 건조 물질의 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다. 표 17의 IE-HPLC(%)는 재구축 액상 형태의 물질의 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다.
번호 IE-HPLC (%)
0개월 3개월 6개월
4℃ 96.6 96.5 96.2
25℃ 96.5 95.6 96.0
IE-HPLC (%)
0주 1주 2주 4주
96.6 93.1 89.4 87.7
상기 표 16에서 보듯이, 동결 건조 물질의 경우, 4℃, 25℃ 보관하는 경우에 6개월이 되어도 안정성을 유지하는 결과를 나타내었다. 또한, 재구축한 물질의 경우 2주간 25℃에 보관하여도 안정성을 유지하는 것으로 나타났다.
시험예 2: 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 개발 및 평가
(1) pH와 완충용액의 종류 및 등장화제와 당알코올의 농도에 따른 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 안정성 평가
본 발명에서 안정화제로서 완충용액의 종류 및 등장화제와 당알코올의 농도가 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다. 하기 표 18과 같은 조성으로 25℃에서 0 내지 4주 동안 보관 후 이온 교환 크로마토그래피법과 크기 배제 크로마토그래피법을 이용하여 분석하였다. 표 19 및 20에서 IE-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다. 표 19는 보관 후 지속형 hGH 결합체의 IE-HPLC 잔존율, 표 20은 보관 후 지속형 hGH 결합체의 SE-HPLC 잔존율을 각각 나타낸다.
번호 지속형
hGH 결합체		 pH 완충용액 등장화제 당알코올 및
그 외		 계면활성제
실시예 30 58.5 mg/mL 5.2 20 mM
아세트산 나트륨		 75 mM
NaCl		 2% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 31 58.5 mg/mL 5.2 20 mM
아세트산 나트륨		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 32 58.5 mg/mL 5.6 20 mM
아세트산 나트륨		 75 mM
NaCl		 2% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 33 58.5 mg/mL 5.6 20mM
아세트산 나트륨		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 34 58.5 mg/mL 5.6 20 mM
히스티딘		 75 mM
NaCl		 2% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 35 58.5 mg/mL 5.6 20 mM
히스티딘		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 IE-HPLC (%)
0주 1주 2주 3주 4주
실시예 30 100.0 98.5 97.0 95.3 91.9
실시예 31 100.0 98.9 96.9 94.8 91.9
실시예 32 100.0 96.9 94.9 92.2 87.2
실시예 33 100.0 97.8 96.7 94.7 90.2
실시예 34 100.0 97.8 94.7 92.4 86.5
실시예 35 100.0 96.1 93.0 88.4 82.9
번호 SE-HPLC (%)
0주 1주 2주 3주 4주
실시예 30 100.0 99.6 99.4 99.3 99.1
실시예 31 100.0 100.2 100.0 99.9 99.8
실시예 32 100.0 99.6 99.6 99.5 99.4
실시예 33 100.0 99.6 99.6 99.4 99.3
실시예 34 100.0 100.1 100.1 99.9 99.7
실시예 35 100.0 99.9 99.8 99.7 99.3
상기 결과에서 볼 수 있듯이, IE-HPLC 결과 20mM 아세트산 나트륨 (pH5.2) 조건일 때 지속형 hGH 결합체가 안정하였다. SE-HPLC 결과 20mM 아세트산 나트륨(pH 5.2), 4%(w/v) 만니톨 조건일 때 지속형 hGH 결합체가 가장 안정하였다.
(2) 완충용액의 종류에 따른 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 안정성 평가
본 발명에서 안정화제로서 완충용액의 종류가 지속형 hGH 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다. 시험예 2-(1)을 통해 선택한 pH5.2, 4% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80을 기준으로 하여, 하기 표 21과 같은 조성으로 25℃에서 0 내지 4주 동안 보관 후 IE-HPLC와 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 22 및 23에서 IE-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 hGH 결합체의 잔존율을 나타낸다. 표 22는 보관 후 지속형 hGH 결합체의 IE-HPLC 잔존율, 표 23은 보관 후 지속형 hGH 결합체의 SE-HPLC 잔존율을 각각 나타낸다.
번호 지속형
hGH 결합체		 pH 완충용액 등장화제 당알코올 및
그 외		 계면활성제
실시예 36 10.0 mg/mL 5.2 20 mM
시트르산 나트륨		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 37 10.0 mg/mL 5.2 20 mM
아세트산 나트륨		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 38 10.0 mg/mL 5.2 20 mM
히스티딘		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 39 58.5 mg/mL 5.2 20mM
시트르산 나트륨		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 31 58.5 mg/mL 5.2 20 mM
아세트산 나트륨		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
실시예 40 58.5 mg/mL 5.2 20 mM
히스티딘		 - 4% 만니톨 0.005% 폴리소르베이트 80
번호 IE-HPLC (%)
0주 1주 2주 3주 4주
실시예 36 100.0 97.4 96.1 94.9 93.1
실시예 37 100.0 98.3 96.5 92.7 88.5
실시예 38 100.0 97.9 96.4 93.9 91.7
실시예 39 100.0 98.4 96.7 94.8 92.7
실시예 31 100.0 97.9 96.3 94.6 92.8
실시예 40 100.0 98.2 96.3 94.2 92.2
번호 SE-HPLC (%)
0주 1주 2주 3주 4주
실시예 36 100.0 98.9 98.7 98.7 98.4
실시예 37 100.0 98.6 98.6 98.8 98.1
실시예 38 100.0 98.7 98.8 98.8 98.6
실시예 39 100.0 99.4 99.2 99.2 98.9
실시예 31 100.0 99.8 99.1 99.2 98.8
실시예 40 100.0 100.0 99.2 99.4 99.1
상기 결과에서 볼 수 있듯이, IE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0mg/mL인 경우, 시트르산 나트륨 조건일 때 가장 안정하였다. SE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 10.0mg/mL인 경우, 히스티딘, 시트르산 나트륨 조건 순으로 안정하였다.
또한, IE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 58.5mg/mL인 경우, 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨 조건 순으로 안정하였다. SE-HPLC 결과, 지속형 hGH 결합체의 농도가 58.5mg/mL인 경우, 히스티딘, 시트르산 나트륨 조건 순으로 안정하였다.
지속형 hGH 결합체의 농도가 10mg/mL 내지 58.5mg/mL인 경우, 20mM 시트르산 나트륨(pH 5.2), 4% 만니톨, 0.005% 폴리소르베이트 80 조건일 때 안정성이 우수한 결과를 보였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예 들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (49)

  1. 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 hGH 결합체, 및 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 혼합한 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 완충용액은 아세트산염, 히스티딘 또는 시트르산염 완충용액인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 완충용액은 아세트산염 완충용액인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  5. 제3항에 있어서, 상기 아세트산염은 아세트산 나트륨이고, 시트르산염은 시트르산 나트륨인 것인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  6. 제2항에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 5.0 내지 6.0인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  7. 제2항에 있어서, 상기 당알코올은 만니톨 또는 소르비톨인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  8. 제2항에 있어서, 상기 당알코올은 수용액 전체 부피에 대하여 1%(w/v) 내지 10%(w/v)의 범위로 포함되는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 당알코올은 2.5%(w/v) 내지 5%(w/v)의 범위로 포함되는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  10. 제2항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  11. 제2항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 수용액 총 부피에 대하여 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v) 농도인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  12. 제2항에 있어서, 상기 알부민-비함유 수용액은 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 함유하는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아미노산은 히스티딘 또는 글라이신인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 히스티딘의 농도는 1 내지 10mM인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  15. 제2항에 있어서, 상기 지속형 hGH 결합체는 10 내지 100mg/mL 농도인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  16. 제2항에 있어서, 상기 알부민-비함유 수용액은 추가로 등장화제를 포함하는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 등장화제는 염화나트륨인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 염화나트륨은 0 내지 200mM인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  19. 제2항에 있어서, 상기 동결 건조 제제의 용기는 바이알, 듀얼 챔버 카트리지 또는 듀얼 챔버 시린지 형태인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제제는 등장화제를 함유하지 않는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 완충용액은 시트르산염, 아세트산염 또는 히스티딘 완충용액인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  23. 제20항에 있어서, 상기 당알코올은 만니톨 또는 소르비톨인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  24. 제20항에 있어서, 상기 당알코올은 2%(w/v) 내지 4.5%(w/v)의 농도로 제제에 포함되는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  25. 제24항에 있어서, 상기 당알코올은 4%(w/v)의 농도로 제제에 포함되는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  26. 제20항에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 5.0 내지 6.0인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  27. 제26항에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 5.2인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  28. 제20항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  29. 제20항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 제제 총 부피에 대하여 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v) 농도인 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  30. 제20항에 있어서, 상기 지속형 hGH 결합체는 5.0mg/mL 내지 60.0mg/mL의 농도로 제제에 포함되는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  31. 제1항, 제2항 또는 제20항에 있어서, 상기 인간 성장 호르몬(hGH)은 천연형 hGH와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  32. 제1항, 제2항 또는 제20항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  33. 제32항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  34. 제32항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  35. 제32항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  36. 제32항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  37. 제1항, 제2항 또는 제20항에 있어서, 상기 결합체는 인간 성장 호르몬 및 면역글로불린 Fc가 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 연결된 형태이거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 연결된 형태인 것인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  38. 제37항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  39. 제38항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  40. 제1항, 제2항 또는 제20항에 있어서, 상기 제제는 뇌하수체성 왜소증, 성장 호르몬 결핍증, 프레더 윌리 증후군 또는 특발성 저신장의 치료를 위한 것인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 제제.
  41. 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 아세테이트 완충용액, 폴리소르베이트 80 및 만니톨을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물을 포함하는, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체의 동결 건조 제제.
  42. 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 시트르산염 완충용액, 폴리소르베이트 80 및 만니톨을 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 함유하고, 상기 안정화제는 등장화제를 포함하지 않는 것이 특징인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제.
  43. 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조하는 단계를 포함하는, 제2항의 동결 건조 제제의 제조 방법.
  44. 제2항의 동결 건조 제제에 포함된, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 완충용액, 비이온성 계면활성제 및 당알코올을 함유하는 알부민-비함유 수용액을 동결 건조한 혼합물에 재구축 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 제2항의 동결 건조 제제를 재구축하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 재구축 용액은 주사용수인 것인, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 재구축 용액은 추가로 보존제를 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 보존제는 벤질 알코올, m-크레졸 또는 페놀인 것인, 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 방법으로 재구축된 제제는 지속형 hGH 결합체를 10 내지 100mg/mL 농도로 포함하는 것인 방법.
  49. 제2항의 동결 건조 제제 및 재구축 용액을 포함하는, 키트.
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