CN115845032A - 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途 - Google Patents

生长激素fc融合蛋白注射液及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115845032A
CN115845032A CN202211338540.1A CN202211338540A CN115845032A CN 115845032 A CN115845032 A CN 115845032A CN 202211338540 A CN202211338540 A CN 202211338540A CN 115845032 A CN115845032 A CN 115845032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
growth hormone
concentration
fusion protein
injection
sucrose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211338540.1A
Other languages
English (en)
Inventor
杨经安
秦锁富
司徒嘉欣
曾容贵
黎鼎英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co ltd filed Critical Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202211338540.1A priority Critical patent/CN115845032A/zh
Publication of CN115845032A publication Critical patent/CN115845032A/zh
Priority to PCT/CN2023/114241 priority patent/WO2024087834A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及了一种含有生长激素融合蛋白的组合物及其用途。所述组合物包括：生长激素融合蛋白，以及缓冲剂和保护剂中的至少之一；上述组合物在制备用于治疗和/或预防生长激素异常相关疾病的药物中的用途。本发明的组合物可减少或抑制分子碎片的产生，在制备和贮藏过程中，提高生长激素融合蛋白的稳定性；并且，该组合物不需复杂的制备工艺，可直接制备成稳定性高的注射液，且具有较好的长效药代动力学特征。

Description

生长激素FC融合蛋白注射液及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种生长激素FC融合蛋白注射液及其用途，更具体地，本发明涉及一种组合物和注射液及其用途。
背景技术
生长激素(GH)是一种脑下垂体前叶分泌的内源性激素，在维持人体生长代谢方面有重要作用。人类生长激素(hGH)广泛用于治疗因GH缺乏(GHD)或不足以及其他生长障碍导致的身材矮小。由于GH的半衰期短，需要每日皮下注射，大大增加了治疗者的痛苦。为了延长半衰期，长效化蛋白药物(例如融合蛋白药物、聚乙二醇(PEG)化蛋白药物)成为目前生物技术药物的研发主流。
目前常见的长效化生长激素药物主要有生长激素融合蛋白药物、PEG化生长激素蛋白药物，其常以冻干粉的形式保持长效化蛋白药物的稳定性，在开发的生长激素融合蛋白药物临床试验公开的剂型也以冻干粉居多。但采用冻干粉注射时，其注射步骤较多，需要反复抽取，增加了玻璃碎屑微粒和微生物的风险。而长效化生长激素药物的注射液无需反复抽取，安全性高。
长效化生长激素药物一般7天，甚至14天给药一次，通过皮下注射。7～14天给药一次意味着单次给药剂量的显著增加，另外儿童皮下给药体积通常限制在1ml以内，所以长效化生长激素制剂需要制备成较高的浓度。Fc融合蛋白溶解度一般，所以制备高浓度的、稳定性好的长效化生长激素注射液在技术上具有较大挑战。
因此，亟需开发一种高浓度稳定性好的长效化生长激素药物的注射液。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种含有生长激素融合蛋白的组合物，本发明的组合物可减少或抑制分子碎片的产生，提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性，尤其是可制备成稳定性高的注射液。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前常用的长效化生长激素蛋白药物主要为生长激素融合蛋白药物、PEG化生长激素蛋白药物等，其常以冻干粉的形式保持长效化蛋白药物的稳定性。例如，专利CN101374536A公开了一种PEG共价偶联到生长激素的药物，该药物最终以冻干粉的形式保持PEG化生长激素蛋白的稳定；专利CN108498467A公开了一种重组生长激素的冻干粉针，其采用保护剂、赋形剂、表面活性剂等辅料配方，通过赋形剂在冻干时代替水与蛋白结合，从而提供骨架支撑的作用，同时还加入表面活性剂防止微粒聚集，在分子周围形成亲水结构。
但目前冻干粉的制备是通过冷冻干燥技术获得的，针对长效化生长激素蛋白药物的冻干粉，在制备过程中会改变生长激素蛋白原有的空间结构，增加了聚合体，长期使用容易产生抗体，而且冻干粉针注射步骤较多，需要反复抽取，增加了冻干粉注射液中含有玻璃碎屑微粒和微生物的风险。
长效化生长激素蛋白药物的注射液制备方法简单，制备过程中无需干燥，不会改变生长激素蛋白原有的空间结构，并且在注射时无需反复抽取，安全性高。短效生长激素，也即未与PEG或Fc等连接的生长激素蛋白分子常报道的化学降解是脱酰胺、氧化等部分基团的脱落或加成。发明人发现生长激素Fc融合蛋白极易发生分子链段的截短，截短的位置可能是生长激素片段或者Fc端的连接子或二硫键处。Fc是生长激素Fc融合蛋白实现体内代谢半衰期延长，实现长效化的必不可少的部分，所以生长激素融合蛋白在制备或贮藏过程中存在产生分子碎片(分子截短)将影响其长效药代动力学特征(简称长效药代特征)。
因此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：生长激素融合蛋白，以及缓冲剂和保护剂中的至少之一。本发明的组合物可减少或抑制分子碎片的产生，在制备和贮藏过程中，提高了生长激素融合蛋白的稳定性。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种注射液。根据本发明的实施例，所述注射液包括：生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇和保护剂；以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL；其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。本发明的注射液可减缓或抑制分子碎片的产生，具有稳定性高的优点。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种注射液。根据本发明的实施例，所述注射液包括生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇、甲硫氨酸和保护剂；以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL，所述甲硫氨酸的浓度为10～20mM；其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。本发明的注射液可减缓或抑制分子碎片的产生，具有稳定性高的优点。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种注射液。根据本发明的实施例，所述注射液包括：生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇、依地酸二钠和保护剂；其中，以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL，所述依地酸二钠的浓度为0.15～1mM；其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。本发明的注射液可减缓或抑制分子碎片的产生，具有稳定性高的优点。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的组合物或前述的注射液在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防生长激素异常相关疾病。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种注射装置或容器。根据本发明的实施例，所述注射装置或容器包括：前述的组合物或前述的注射液。本发明的注射装置或容器方便贮藏前述的组合物或前述的注射液。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中的SEC-HPLC的聚体(％HMW)检测结果；
图2为本发明实施例1中的CE-SDS的截短片段含量(％LMW)检测结果；
图3为本发明实施例2中的SEC-HPLC的聚体(％HMW)检测结果；
图4为本发明实施例2中的CE-SDS的截短片段含量(％LMW)检测结果；
图5为本发明实施例2中的SEC-HPLC的聚体(％HMW)检测结果；
图6为本发明实施例2中的CE-SDS的截短片段含量(％LMW)检测结果；
图7为本发明实施例4中的SEC-HPLC的聚体(％HMW)检测结果；
图8为本发明实施例4中的CE-SDS的截短片段含量(％LMW)检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“生长激素异常相关疾病”通常是指由于生长激素异常引起的疾病，例如生长激素缺乏或异化状态引起的相关疾病，包括但不限于，儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征(TurnersSyndrome)、普拉德威利综合征(Prader Willi Syndrome)、子宫内生长迟缓、特发性身材矮小、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态。生长激素缺乏可包括先天或获得性缺乏。关于先天缺陷，当垂体没有发展成生长激素分泌紊乱时，生长激素缺陷可能发生。获得性生长激素缺乏可能由于难于递送而导致缺氧导致脑组织损伤而发生。生长激素缺乏的其它原因包括由用于治疗脑瘤或出生后结核性脑膜炎的辐射引起的垂体损伤。生长激素缺乏表现出诸如生长迟缓和身材矮小的症状，并且先天生长激素缺乏表现出低葡萄糖症状，从新生儿开始。另外，儿童表现出诸如焦虑增加和活力降低的症状。
在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似相”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“至少90％同一性”指与各参考序列至少为90％，可为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性。
在本文中，术语“片段”是指目标蛋白或多肽，以及具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。例如，Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区或者其部分片段，例如只包含CH2区和CH3区；血清白蛋白片段可为血清白蛋白或者血清白蛋白的截短片段；生长激素片段可为生长激素或者生长激素的截短片段。
本发明提出了一种组合物和注射液及其制备方法和用途，下面将分别对其进行详细描述。
组合物
在本发明的一个方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：生长激素融合蛋白，以及缓冲剂和保护剂中的至少之一。发明人经过大量试验发现，缓冲剂和/或保护剂的添加可减少或抑制分子碎片的产生，在制备和贮藏过程中，提高了生长激素融合蛋白的稳定性。
需要说明的是，本发明中提到的“生长激素融合蛋白”通常是指具有天然生长激素氨基酸序列的生长激素片段和其他蛋白片段或多肽片段融合得到的蛋白，其中，生长激素片段的N端与蛋白片段或多肽片段的C端相连、或者生长激素片段的C端与蛋白片段或多肽片段的N端相连；进一步地，生长激素片段和蛋白片段或多肽片段之间可通过连接肽相连。优选地，该蛋白片段或多肽片段为具有一定的功能的片段，例如该蛋白片段或多肽片段可提高生长激素片段与生长激素受体结合活性，或者可降低生长激素ADCC效应；其中，蛋白片段或多肽片段包括但不限于Fc片段和血清白蛋白片段。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白为生长激素FC融合蛋白。发明人经过试验意外的发现，本发明的组合物对生长激素FC融合蛋白具有较好的保护作用，在生长激素Fc融合蛋白在生产和/或贮藏过程中，可减缓或抑制生长激素及Fc片段发生断裂、以及断裂后生长激素和Fc进一步发生化学降解，从而减少或避免分子碎片的产生，防止分子碎片过高影响其长效药代特征。
需要说明的是，本发明中提到的“生长激素FC融合蛋白”通常是指生长激素片段与FC片段融合得到的蛋白。其中，Fc片段可自于鼠源抗体、人源抗体和灵长目源抗体或其突变体。Fc片段是指免疫球蛋白IgG的Fc端，其具有不同的亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。Fc片段可以是天然的鼠源、人源或灵长源抗体(IgG)的完整Fc片段、或者在IgG完整Fc片段上通过氨基酸点突变插入、替换、删减某些氨基酸。
示例性地，本发明的生长激素FC融合蛋白可为专利申请号为202210459224.3、202210395423.2、202210395418.1中提到的生长激素FC融合蛋白。
根据本发明的实施例，所述缓冲剂包括选自组氨酸和盐酸组氨酸、柠檬酸钠和柠檬酸、醋酸/醋酸钠中的至少之一。由此，可提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述缓冲剂包括组氨酸和盐酸组氨酸。发明人经过试验发现，相对于其他缓冲对(例如柠檬酸钠/柠檬酸、醋酸/醋酸钠)，组氨酸和盐酸组氨酸的缓冲对可有效减少或避免组合物中分子碎片的产生，提高组合物的稳定性，以及防止分子碎片过高影响组合物的长效药代特征。
需要说明的是，在本文中，缓冲剂的摩尔浓度为缓冲对的总摩尔浓度。示例性地，缓冲剂的摩尔浓度为组氨酸和盐酸组氨酸的总摩尔浓度。其中，“组氨酸和盐酸组氨酸”与“组氨酸和盐酸组氨酸缓冲对”同义。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白和缓冲剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.005～0.04)mmol，优选为(50～70)mg：(0.015～0.03)mmol。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述保护剂包括选自蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇中的至少之一。由此，可调节组合物中的渗透压，进一步提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白和保护剂的摩尔比为(20～90)mg：(20～90)mg，优选为(50～70)mg：(40～70)mg，更优选为(50～70)mg：(42～64)mg。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。根据本发明的实施例，保护剂优选为蔗糖。
根据本发明的实施例，所述保护剂包括蔗糖和海藻糖。发明人经过试验发现，采用蔗糖与海藻糖的组合，可防止蛋白聚集，进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白、蔗糖和海藻糖的质量比为(20～90)mg：(20～45)mg：(20～45)mg，优选为(40～90)mg：(15～35)mg：(15～35)mg。由此，可进一步提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述组合物包括生长激素融合蛋白、缓冲剂和保护剂。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白、保护剂和缓冲剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(20～90)mg：(0.015～0.03)mmol。由此，可提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述组合物进一步包括稳定剂、表面活性剂、抗氧化剂和金属螯合剂中的至少之一。由此，可进一步提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述稳定剂包括选自氨丁三醇和氨丁三醇盐酸盐中的至少之一。发明人发现，氨丁三醇或氨丁三醇盐酸盐可与生长激素分子(例如hGH分子)形成非共价健结合的空间结构(比如氢键)，提高反应能量，使生长激素融合蛋白更稳定，从而进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述稳定剂为氨丁三醇。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白和稳定剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.01～0.05)mmol，优选为(50～70)mg：(0.015～0.035)mmol。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白和抗氧化剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.01～0.02)mmol。由此，可进一步提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白和金属螯合剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.00015～0.01)mmol，优选为(40～90)mg：(0.00015～0.0003)mmol。由此，可进一步提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述抗氧化剂包括选自甲硫氨酸。由此，该抗氧化剂可竞争性地与注射液中溶解氧结合，保护生长激素融合蛋白避免被氧化。
根据本发明的实施例，所述金属螯合剂包括选自依地酸二钠(又称ETDA-2Na)。由此，该金属螯合剂能与金属离子生成螯合物，防止金属离子催化蛋白降解。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白和表面活性剂的质量比为(1～50)：(0.1～1)。
根据本发明的实施例，所述表面活性剂包括选自吐温80、吐温20和泊洛沙姆P188中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述组合物包括生长激素融合蛋白、缓冲剂和稳定剂。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白、缓冲剂和稳定剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.015～0.03)mmol：(0.015～0.035)mmol。由此，可提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
在本发明的一个优选实施例中，所述缓冲剂包括柠组氨酸和盐酸组氨酸，所述稳定剂为氨丁三醇。发明人经过试验发现，当组合物中同时含有组氨酸和盐酸组氨酸缓冲对及氨丁三醇时，可进一步减缓或抑制生长激素和其他蛋白片段或多肽片段之间产生断裂、以及断裂后的生长激素和蛋白片段或多肽片段进一步发生化学降解，减少组合物中分子碎片的产生，提高对生长激素融合蛋白的保护效果。
根据本发明的实施例，所述组合物包括生长激素融合蛋白、保护剂和稳定剂。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白、保护剂和稳定剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(40～90)mg：(0.015～0.035)mmol，优选为(40～90)mg：(50～80)mg：(0.015～0.035)mmol，更优选为(40～90)mg：(51～77)mg：(0.015～0.035)mmol。由此，可提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
在本发明的一个优选实施例中，所述稳定剂为氨丁三醇，所述保护剂包括蔗糖。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
在本发明的一个优选实施例中，所述稳定剂为氨丁三醇，所述保护剂包括蔗糖和海藻糖。由此，可进一步提高生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述组合物包括生长激素融合蛋白、缓冲剂、保护剂和稳定剂。发明人经过大量试验发现，缓冲剂、保护剂和稳定剂的添加可有效保护生长激素融合蛋白，减缓或抑制生长激素片段和其他蛋白片段或多肽片段之间产生断裂、以及断裂后的生长激素片段和蛋白片段或多肽片段进一步发生化学降解，从而减少组合物中分子碎片的产生，提高组合物的稳定性。并且，发明人经过大量试验还发现，由于该组合物中生长激素融合蛋白的稳定性高，该组合物无需复杂的制备工艺，可直接制备成高稳定性的注射液，且该注射液具有较好的长效药代特征。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白、保护剂、稳定剂和缓冲剂的质量摩尔比为(40～90)mg：(20～90)mg：(0.01～0.05)mmol：(0.005～0.04)mmol。由此，可提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白、保护剂、稳定剂和缓冲剂的质量摩尔比为(50～70)mg：(30～70)mg：(0.015～0.035)mmol：(0.015～0.03)mmol。由此，可进一步提高组合物中生长激素融合蛋白的稳定性。
在本发明的一个优选实施例中，所述生长激素融合蛋白、氨丁三醇、组氨酸和盐酸组氨酸缓冲对、蔗糖和海藻糖的质量摩尔比(50～70)mg：(0.015～0.035)mmol：(0.015～0.03)mmol：(20～45)mg：(20～45)mg。由此，可减缓或抑制生长激素与其他蛋白片段或多肽片段之间发生断裂、以及断裂后生长激素和其他蛋白片段或多肽片段发生化学降解，减少注射液中分子碎片的产生，具有分子碎片含量低、稳定性高等优点。尤其是该组合物在不同贮藏条件下的Nr-CE SDS和SEC纯度均在90％及以上。
根据本发明的实施例，所述组合物为注射液。
根据本发明的实施例，所述组合物的pH值为6.1-7.2，优选为6.4～7.2。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白的浓度为20～90mg/mL，优选为50～70mg/mL。
根据本发明的实施例，所述保护剂的浓度为20～90mg/mL，优选为30～70mg/mL。
根据本发明的实施例，所述缓冲剂的浓度为5～40mM，优选为15～30mM。
根据本发明的实施例，所述稳定剂的浓度为10～50mM，优选为15～35mM。
根据本发明的实施例，所述抗氧剂的浓度为10～20mM。
根据本发明的实施例，所述螯合剂的浓度为0.15～1mM，优选0.15～0.3mM。
根据本发明的实施例，生长激素FC融合蛋白具有如SEQ ID NO:1～4任一项所示的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRNTGKGGEEKKKEKEEKENEEEEEREPECPESKYGPPCPPCPAPEVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:1)。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVYHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:2)
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:3)
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPPVEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:4)
注射液
在本发明的又一方面，本发明提出了一种注射液。根据本发明的实施例，所述注射液包括：生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇和保护剂；以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL；其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。本发明的注射液在生产和/或贮藏过程中，可减缓或抑制生长激素与其他蛋白片段或多肽片段之间发生断裂、以及断裂后生长激素和其他蛋白片段或多肽片段发生化学降解，减少注射液中分子碎片的产生，具有分子碎片含量低、稳定性高等优点。并且，相比其他方案，该注射液在室温光照和40℃等压力条件下可见Nr-CE SDS和SEC纯度的下降变化更加缓慢，预示其在生物制品常规2～8℃，避光保存长期稳定性将更稳定。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白为生长激素FC融合蛋白，具体生长激素FC融合蛋白参见上述组合物中的生长激素FC融合蛋白。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种注射液。根据本发明的实施例，所述注射液包括生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇、甲硫氨酸和保护剂；以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL，所述甲硫氨酸的浓度为10～20mM；其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。本发明的注射液更进一步观察到抗聚集改善。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白为生长激素FC融合蛋白，具体生长激素FC融合蛋白参见上述组合物中的生长激素FC融合蛋白。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种注射液。根据本发明的实施例，所述注射液包括：生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇、依地酸二钠和保护剂；其中，以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL，所述依地酸二钠的浓度为0.15～1mM；其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。本发明的注射液更进一步观察到抗聚集和分子截断的显著改善，从而达到2-8℃长期的产品稳定要求。
根据本发明的实施例，所述生长激素融合蛋白为生长激素FC融合蛋白，具体生长激素FC融合蛋白参见上述组合物中的生长激素FC融合蛋白。
制备组合物和注射液的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前述的组合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将生长激素融合蛋白、缓冲剂、保护剂和稳定剂进行混合处理，以便获得所述组合物；其中，所述缓冲剂包括柠檬酸钠和柠檬酸。本发明的方法可制备得到组合物，且制备方法简单。
根据本发明的实施例，所述组合物为注射液，所述混合处理是通过如下方法进行的：将含有所述生长激素融合蛋白的第一溶液与含有所述保护剂的第二溶液进行第一混合处理；将所述缓冲液和稳定剂以及任选地抗氧化剂和/或金属螯合剂进行第二混合处理；将第一混合处理产物进行第一超滤处理，将第一超滤处理产物和所述第二混合处理产物进行第三混合处理，以便得到所述组合物。
根据本发明的实施例，所述第一溶液中所述生长激素融合蛋白的浓度为1～10mg/mL。
根据本发明的实施例，在所述第一超滤处理之前，预先将第一混合处理产物进行第一浓缩处理，得到所述生长激素融合蛋白的浓度为10～20mg/mL的第一浓缩液。
根据本发明的实施例，所述第三混合处理产物中所述生长激素融合蛋白的浓度为10～20mg/mL。
根据本发明的实施例，在所述第三混合处理之后，将第三混合处理产物进行第二浓缩处理，得到所述生长激素融合蛋白的浓度大于50mg/mL的第二浓缩液。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：在所述第二浓缩处理之后，将所述第二浓缩液进行稀释处理，以便得到所述生长激素融合蛋白的浓度为40～90mg/mL的组合物。
用途
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的组合物、前述的注射液或依据前述的方法制备的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病包括选自儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病和子宫内生长迟缓中的至少之一。
治疗和/或预防生长激素异常相关疾病的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种预防和/或治疗生长激素异常相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：向受试者施用药学上可接受量的前述的组合物或前述的注射液。根据本发明的实施例，该方法可有效预防或治疗生长激素异常相关疾病。
本发明所述的组合物或注射液的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
根据本发明的实施例，所述方法的给药途径包括皮下注射或静脉注射。
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病、子宫内生长迟缓。
注射装置或容器
在本发明的另一方面，本发明提出了一种注射装置或容器。根据本发明的实施例，所述注射装置或容器包括：前述的组合物或前述的注射液。本发明的注射装置或容器方便贮藏前述的组合物或前述的注射液。
在本文中，本发明的注射装置或容器应作广义理解，其包含任何可容纳本发明的组合物或注射液的产品。
根据本发明的实施例，所述注射装置或容器包括选自容纳瓶和注射器中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述注射器包括选自自动注射器和预填充注射器中的至少之一。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本文提及的制剂的“高分子量”(HMW)种类的相关蛋白是指从尺寸排阻色谱柱(SEC)洗脱下来的任何出峰时间早于主峰的相关蛋白的含量，HMW的含量用于指示蛋白的聚集程度。％HMW是指SEC-HPLC色谱检测时高分子量蛋白峰面积相对于制剂中所有可检测蛋白峰总和的百分比。
本文提及的“低分子量”(LMW)种类的相关蛋白是从非还原毛细管电泳(nrCE-SDS检)洗脱下来的任何出峰时间早于主峰的相关蛋白的含量。％HMW是指SEC-HPLC色谱检测时高分子量蛋白峰面积相对于制剂中所有可检测蛋白峰总和的百分比，HMW的含量用于指示活性蛋白分子降解产生截短碎片的程度。
本文实施例中的N/A指未添加。
需要说明的是，本申请实施例中采用的人生长激素Fc融合蛋白具体氨基酸序列如SEQ ID NO:1，其通过常规的方法制备得到；其余辅料均通过市购获得。
实施例1：人生长激素Fc融合蛋白注射液中缓冲液和pH值的筛选
1、注射液中人生长激素Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的终浓度和各辅料的种类及其终浓度具体参见表1。
2、注射液的制备方法如下所示：
1)取一定体积的含磷酸缓冲液的蛋白液，该蛋白液中人生长激素Fc融合蛋白的浓度为2-3mg/mL，按30mg/mL量加入蔗糖溶解。然后用0.45μm过滤器过滤除颗粒，得到过滤液。
2)使用milipore pellicon2 30KD超滤膜包对过滤液进行预浓缩处理，预浓缩至人生长激素Fc融合蛋白的浓度为10-20mg/mL，得到蛋白预浓缩液。
3)按照表1配方，将人生长激素Fc融合蛋白和蔗糖之外的其他辅料配制成buffer液，用盐酸或氢氧化钠将buffer液的pH值调节至规定值(具体参见表1)。
4)蛋白预浓缩液在维持固定体积下，通过超滤将蛋白预浓缩液的磷酸缓冲液置换成buffer液。然后继续超滤浓缩，ProteinA-HPLC检测目标蛋白含量，应浓缩至人生长激素Fc融合蛋白的浓度为至20mg/ml及以上，例如大约20mg/ml、50mg/ml、70mg/ml或80mg/ml或最高可以达到大约90mg/ml。
5)向浓缩结束的蛋白液加入一定体积的buffer液稀释至制剂中拟定的人生长激素Fc融合蛋白浓度(具体参见表1)，得到注射液原液，当浓缩的人生长激素Fc融合蛋白浓度和所需浓度相同，无需进行第4)的稀释处理。
6)根据注射液原液保存条件，经必要的解冻、混匀、0.2μm除菌滤器过滤后分装至西林瓶，密封即得注射液。
3、然后将各样品得到的注射液在40℃条件下进行SEC-HPLC和nrCE-SDS检测，具体检测结果参见表2和图1～2。
SEC-HPLC和nrCE-SDS检测如下所示：
SEC-HPLC是根据填料孔隙而分离样品分子，样品大分子不能进入或只能进入部分孔隙，而较小分子则能进入大多数或全部孔隙，从而使不同分子量的蛋白分离。本文所述的SEC-HPLC检测方法主要参数为：
参数 参数值
模式 pH7.0 100mM磷酸缓冲液等度洗脱
色谱柱 填料粒径5μm，柱径*柱长7.8×30mm
检测波长 280nm
流速 0.5mL/min
进样量 50μl
柱温 30℃
进样器温度 8℃
Nr-CE-SDS检测使用AB SCIEX公司PA800plus型毛细管电泳仪及该公司货号为A30341的SDS凝胶缓冲液，设备主要参数为：
Figure BDA0003915521840000131
Figure BDA0003915521840000141
表1：样品1～8的注射液中各成分的配比
Figure BDA0003915521840000142
表2：样品1～8中SEC-HPLC和nrCE-SDS的检测结果
Figure BDA0003915521840000143
由表1～2和图1～2可知，不同缓冲体系和pH值条件的注射液中，SEC-HPLC检测到的蛋白聚体(％HMW)和CE-SDS检测的截短碎片含量(％LMW)不同。就SEC-HPLC的％HMW而言，其他如柠檬酸体系(柠檬酸/柠檬酸钠)和磷酸体系(磷酸氢二钠/磷酸钠)随pH升高而增加，而组氨酸体系(组氨酸/盐酸组氨酸)随pH升高而减少，说明组氨酸体系在pH值为6.1～7.0范围升高pH时可以降低聚集体。就CE-SDS的％LMW而言，组氨酸体系(组氨酸/盐酸组氨酸)在pH值为6.1-7.0范围变化较小，柠檬酸体系和磷酸体系则随pH升高而增加，将增加截短碎片。综合比较，组氨酸体系无论SEC还是CE的结果都优于柠檬酸体系、磷酸体系。根据组氨酸体系的趋势，还可尝试再高些的pH，例如pH值为7.2。
实施例2：人生长激素Fc融合蛋白注射液中保护剂的筛选
发明人为了筛选出较适的保护剂，测试了5种保护剂对生长激素融合蛋白的热稳定性和冻融保护。注射液中人生长激素Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的终浓度和各辅料的种类及其终浓度具体参见表3，注射液的制备方法和检测方法参见实施例1，检测结果参见表4和图3～4。结果发现，在高温和冻融等热稳定性抗聚集(SEC的％HMW)方面的优势顺序为：海藻糖≈蔗糖>甘露醇>盐酸精氨酸>氯化钠。盐酸精氨酸和氯化钠属于离子型盐类保护剂，整体保护效果不如其他糖醇类的非离子型保护剂。
表3：样品9～13的注射液中各成分的配比
Figure BDA0003915521840000151
表4：样品9～13中SEC-HPLC和nrCE-SDS的检测结果
Figure BDA0003915521840000152
Figure BDA0003915521840000161
进一步地，发明人测试了非离子型糖醇保护剂组合与单独保护剂的差异。注射液中人生长激素Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的终浓度和各辅料的种类及其终浓度具体参见表5。注射液的制备方法和检测方法参见实施例1，检测结果参见图5～6。综合CE-SDS和SEC30天的增长变化趋势来评判，蔗糖与海藻糖显现了协同效应，蔗糖与海藻糖组合使用较单独使用的稳定性更优。
表5：样品14～18的注射液中各成分的配比
Figure BDA0003915521840000162
/>
实施例3：人生长激素Fc融合蛋白注射液中稳定剂的筛选
稳定剂是对活性分子稳定有益的成分，例如某些稳定剂可以通过分子相互作用(如氢键、疏水作用)等与活性分子非共价结合，提高其反应所需的能量。发明人为了筛选出最适的稳定剂，测试了稳定剂对生长激素融合蛋白的热稳定性，发现Tris或Tris-盐酸盐(氨基丁三醇)就有类似作用，Tris具有多个氢键供体和受体，可与蛋白分子结合。
本实施例中，注射液中人生长激素Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的终浓度和各辅料的种类及其终浓度具体参见表6，注射液的制备方法和检测方法参见实施例1，检测结果参见表7。由于上游发酵提纯工艺进行调整，提供的蛋白的稳定性情况更加糟糕，在40℃、光照及5℃等都发生显著的聚集和分子截短现象。但在相同批次原液平行比较表6处方样品，结果表明相较于不添加稳定剂，添加Tris在光照和5℃下CE-SDS检测％LMW显现了1～2百分点的改善，尽管不太显著，但对于人生长激素Fc融合蛋白所面临的极易产生LMW而言，该细微的有益改善也具有非凡价值的；并且，发明人进一步对稳定剂的添加量进行探究，Tris的量在15-25mM随用量增加，CE-SDS检测的％LMW改善相应增加。
表6：样品19～23的注射液中各成分的配比
Figure BDA0003915521840000171
表7：样品19～23中SEC-HPLC和nrCE-SDS的检测结果
Figure BDA0003915521840000172
Figure BDA0003915521840000181
实施例4：人生长激素Fc融合蛋白注射液中抗氧化剂和金属螯合剂的筛选
发明人为了进一步提高注射液的稳定性，对抗氧化剂(甲硫氨酸)和金属螯合剂(EDTA-2Na，又称依地酸二钠)进行筛选。发明人发现，甲硫氨酸、依地酸二钠对融合蛋白具有一定的稳定作用，通过与稳定剂组合可进一步的提高稳定性。
本实施例中，注射液中人生长激素Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的终浓度和各辅料的种类及其终浓度具体参见表8，注射液的制备方法和检测方法参见实施例1，检测结果参见图7～8和表9。结果发现，相较于不添加甲硫氨酸和EDTA-2Na，甲硫氨酸则有轻微改善HMW，添加0.15-0.3mM的EDTA-2Na可显著改善CE-SDS％LMW，同时还能改善高温40℃的聚集(HMW)。
表8：样品24～28的注射液中各成分的配比
Figure BDA0003915521840000182
表9：样品24、26和28中SEC-HPLC和nrCE-SDS的检测结果
Figure BDA0003915521840000183
实施例5：人生长激素Fc融合蛋白注射液中组氨酸缓冲液添加量的筛选
注射液中人生长激素Fc融合蛋白(简称融合蛋白)的终浓度和各辅料的种类及其终浓度具体参见表10。其中，注射液的制备方法和检测方法参见实施例1，检测结果参见表11。
表10：样品29～32的注射液中各成分的配比
Figure BDA0003915521840000191
表11：样品29～32中SEC-HPLC和nrCE-SDS的检测结果
Figure BDA0003915521840000192
由表10～11可知，相较于40mM的组氨酸体系，10～30mM的组氨酸体系中CE-SDS的％LMW较低。因此，10～30mM的组氨酸体系的稳定性相对更优。最终在合适的离子强度及相应的保护剂、稳定剂的共同作用下，本实施例的样品制剂在真实货架期保存条件2-8℃下已积累6个月的稳定性数据，从SEC和CE-SDS结果看增长较慢，预期能维持货架期18-24个月内SEC和CE-SDS纯度大于90％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括：
生长激素融合蛋白，以及缓冲剂和保护剂中的至少之一。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述生长激素融合蛋白为生长激素FC融合蛋白；
任选地，所述缓冲剂包括选自组氨酸和盐酸组氨酸、柠檬酸钠和柠檬酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的至少之一；
任选地，所述生长激素融合蛋白和缓冲剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.005～0.04)mmol，优选为(50～70)mg：(0.015～0.03)mmol；
任选地，所述保护剂包括选自蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇中的至少之一；
任选地，所述生长激素融合蛋白和保护剂的摩尔比为(20～90)mg：(20～90)mg。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂包括组氨酸和盐酸组氨酸；
任选地，所述保护剂包括蔗糖和海藻糖；
任选地，所述生长激素融合蛋白、蔗糖和海藻糖的质量比为(20～90)mg：(20～45)mg：(20～45)mg，优选为(50～70)mg：(15～35)mg：(15～35)mg。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，进一步包括稳定剂、表面活性剂、抗氧化剂和金属螯合剂中的至少之一；
任选地，所述稳定剂包括选自氨丁三醇和氨丁三醇盐酸盐中的至少之一；
任选地，所述生长激素融合蛋白和稳定剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.01～0.05)mmol，优选为(50～70)mg：(0.015～0.035)mmol；
任选地，所述生长激素融合蛋白和抗氧化剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.01～0.02)mmol；
任选地，所述生长激素融合蛋白和金属螯合剂的质量摩尔比为(20～90)mg：(0.00015～0.01)mmol，优选为(50～70)mg：(0.00015～0.0003)mmol；
任选地，所述抗氧化剂为甲硫氨酸；
任选地，所述金属螯合剂为依地酸二钠；
任选地，所述生长激素融合蛋白和表面活性剂的质量比为(1～50)：(0.1～1)；
任选地，所述表面活性剂包括选自吐温80、吐温20和泊洛沙姆P188中的至少之一。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为注射液；
任选地，所述组合物的pH值为6.1-7.2，优选为6.4～7.2；
优选地，所述生长激素融合蛋白的浓度为20～90mg/mL，优选为50～70mg/mL；
优选地，所述保护剂的浓度为20～90mg/mL，优选为30～70mg/mL；
优选地，所述缓冲剂的浓度为5～40mM，优选为15～30mM；
优选地，所述稳定剂的浓度为10～50mM，优选为15～35mM；
任选地，所述生长激素融合蛋白具有如SEQ ID NO:1～4任一项所示的氨基酸序列。
6.一种注射液，其特征在于，包括：
生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇和保护剂；
以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL；
其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。
7.一种注射液，其特征在于，包括：
生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇、甲硫氨酸和保护剂；
以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL，所述甲硫氨酸的浓度为10～20mM；
其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。
8.一种注射液，其特征在于，包括：
生长激素融合蛋白、组氨酸、盐酸组氨酸、氨丁三醇、依地酸二钠和保护剂；
其中，以所述注射液总体积计，所述生长激素融合蛋白的浓度为50～70mg/mL，所述组氨酸和盐酸组氨酸的总浓度为15～30mM，所述氨丁三醇的浓度为15～35mM，所述保护剂的浓度为40～90mg/mL，所述依地酸二钠的浓度为0.15～1mM；
其中，所述保护剂为蔗糖，所述蔗糖的浓度为40～90mg/mL；或者，所述保护剂为蔗糖和海藻糖，所述蔗糖的浓度为20～45mg/mL，所述海藻糖的浓度为20～45mg/mL。
9.权利要求1～5任一项所述的组合物或权利要求6～8任一项所述的注射液在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防生长激素异常相关疾病；
任选地，所述生长激素异常相关疾病包括选自儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德 威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病和子宫内生长迟缓中的至少之一。
10.一种注射装置或容器，其特征在于，包括：
权利要求1～5任一项所述的组合物或权利要求6～8任一项所述的注射液；
任选地，所述注射装置或容器包括选自容纳瓶和注射器中的至少之一；
优选地，所述注射器包括选自自动注射器和预填充注射器中的至少之一。
CN202211338540.1A 2022-10-28 2022-10-28 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途 Pending CN115845032A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211338540.1A CN115845032A (zh) 2022-10-28 2022-10-28 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途
PCT/CN2023/114241 WO2024087834A1 (zh) 2022-10-28 2023-08-22 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211338540.1A CN115845032A (zh) 2022-10-28 2022-10-28 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115845032A true CN115845032A (zh) 2023-03-28

Family

ID=85662066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211338540.1A Pending CN115845032A (zh) 2022-10-28 2022-10-28 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115845032A (zh)
WO (1) WO2024087834A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024087834A1 (zh) * 2022-10-28 2024-05-02 深圳科兴药业有限公司 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6549104B2 (ja) * 2013-09-27 2019-07-24 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 持続型ヒト成長ホルモン製剤
MA43348A (fr) * 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
JOP20190019A1 (ar) * 2016-08-30 2019-02-12 Genexine Inc تركيبة صيدلانية لعلاج نقص في هرمون نمو يحتوي على بروتين اندماجي لهرمون نمو بشري (hGH)
US20180127478A1 (en) * 2016-09-16 2018-05-10 Wei-Chiang Shen SINGLE CHAIN Fc-DIMER-HUMAN GROWTH HORMONE FUSION PROTEIN FOR IMPROVED DRUG DELIVERY
AU2022246997A1 (en) * 2021-04-01 2023-09-28 Ascendis Pharma A/S Use of long-acting growth hormone for treating inflammation-induced diseases
CN115845032A (zh) * 2022-10-28 2023-03-28 深圳科兴药业有限公司 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024087834A1 (zh) * 2022-10-28 2024-05-02 深圳科兴药业有限公司 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024087834A1 (zh) 2024-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10987405B2 (en) Method of reducing formation of etanercept aggregates or fragments
US11000588B2 (en) Etanercept formulations stabilized with sodium chloride
WO2024087834A1 (zh) 生长激素fc融合蛋白注射液及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination