ES2436779T3 - Formulaciones para proteínas de fusión TACI-inmunoglobulina - Google Patents
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Abstract
Una formulación que comprende: a) Proteína de fusión TACI-inmunoglobulina (TACI-5 Ig) que comprende: i. el dominio extracelular de TACI o un fragmento o una variante del mismo que se une a BlyS y/oAPRIL; y ii. un dominio constante de inmunoglobulina; b) un tampón de acetato que tampona la formulación a un pH en el intervalo entre 4,9 y 5,1; y c) trealosa en una concentración en el intervalo de 600 a 100 mg/ml.
Description
Formulaciones para proteínas de fusión TACI-inmunoglobulina.
5 CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención está en el campo de las formulaciones de proteínas terapéuticas. Más específicamente, se refiere a formulaciones para proteínas de fusión TACI-inmunoglobulina (Ig) que tienen un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, como se define en las reivindicaciones.
10 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Familia del ligando receptor BlyS
15 [0002] Se han identificado tres receptores, TACI (activador transmembrana e interactor de CAML), BCMA (antígeno de maduración de linfocitos B) y BAFF-R (receptor para el factor activante de linfocitos B), que tienen afinidades de unión únicas para los dos factores de crecimiento BlyS (estimulador de linfocitos B) y APRIL (un ligando de inducción de la proliferación) (Marsters y col. 2000; Thompson y col. 2001)
20 [0003] Tanto TACI como BCMA se unen a BLyS y APRIL, mientras que parece que BAFF-R es capaz de unirse solo a BlyS con alta afinidad (Marsters y col., 2000; Thompson y col. 2001). Como resultado, BlyS es capaz de señalizar a través de los tres receptores, mientras que parece que APRIL solo es capaz de señalizar a través de TACI y BCMA. Además, se han identificado complejos heterodímeros en la circulación de BlyS y APRIL (agrupamientos de tres subunidades de proteínas, que contienen una o dos copias de cada una de las subunidades
25 de BlyS y APRIL) en muestras de suero tomadas de pacientes con enfermedades reumáticas basadas en sistema inmunitario, y se ha mostrado que inducen la proliferación de linfocitos B in vitro (Roschke y col., 2002).
[0004] BlyS y APRIL son estimuladores potentes de la maduración, proliferación y supervivencia de linfocitos B (Moore y col., 1999; Schneider y col., 1999; Do y col., 2000). BLyS y APRIL pueden ser necesarios para la
30 persistencia de las enfermedades autoinmunitarias, en especial las que implican linfocitos B. Ratones transgénicos genéticamente modificados para expresar niveles altos de BlyS presentan trastornos de células inmunitarias y presentan síntomas similares a los observados en pacientes con lupus eritematoso sistémico (Gross y col. 2000; Mackay y col. 1999). Igualmente, se han medido niveles aumentados de BlyS/APRIL en muestras de suero tomadas de pacientes con lupus eritematoso sistémico y otros pacientes con diferentes enfermedades autoinmunitarias tales
35 como artritis reumatoide (Roschke 2002; Cheema y col. 2001; Groom y col. 2002), que extienden la asociación de BlyS y/o APRIL y las enfermedades mediadas por linfocitos B de modelos animales a seres humanos. La expresión de BlyS y APRIL está regulada por aumento en monocitos de sangre periférica y linfocitos T de pacientes con EM (Thangarajh y col., 2004; Thangarajh y col., 2005). En las lesiones de EM, se encontró que la expresión de BLyS era muy regulada por aumento en astrocitos localizados cerca de las células inmunitarias que expresan BAFF-R
40 (Krumbholz y col., 2005).
Atacicept
[0005] Atacicept (INN) es una proteína de fusión recombinante que contiene la parte extracelular de unión al
45 ligando del receptor TACI (activador transmembrana y modulador de calcio e interactor del ligando de la ciclofilina (CAML)) y la parte Fc modificada de la IgG humana. Atacicept actúa como un antagonista de BLyS (estimulador de linfocitos B) y APRIL (un ligando de inducción de la proliferación), ambos miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). Se ha mostrado que BlyS y APRIL son reguladores importantes de la función de maduración y supervivencia de linfocitos B.
50 [0006] Atacicept es una glicoproteína soluble que contiene 313 aminoácidos, que resulta de la fusión de una IgG1-Fc humana y una porción del dominio extracelular del receptor de BlyS de TACI, con una masa prevista de 35,4 kilodalton (kDa). La conformación del producto es dimérica, con una masa prevista de 73,4 kDa. Atacicept se produce en células de ovario de hámster chino (CHO) por tecnología recombinante.
55 [0007] En atacicept la IgG1-Fc humana se modificó para reducir la unión de Fc al componente C1q del complemento y la interacción con receptores de anticuerpos (Tao y col., 1993; Canfield y col., 1991). Se ensayó atacicept y se confirmó la reducción de estas funciones efectoras de Fc.
Formulaciones de proteínas terapéuticas
[0008] Las proteínas de fusión TACI-Ig como atacicept, son biológicas, es decir, proteínas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades humanas y por lo tanto para la administración humana.
5 [0009] Se desarrollan formulaciones con el fin de apoyar el suministro satisfactorio de proteínas terapéuticas. Los problemas que se encuentran con frecuencia en el contexto de las proteínas terapéuticas son, p. ej., la poca estabilidad de la proteína (a menudo es necesario el almacenamiento en el frigorífico o congelador), poca biodisponibilidad, y formas farmacéuticas antipáticas para el paciente, normalmente por vía parenteral
10 [0010] En los procedimientos de producción biotecnológica, las proteínas terapéuticas en general se obtienen en una forma muy purificada en disolución acuosa. Cuando se formulan estas disoluciones de proteínas, p. ej., para el suministro parenteral, es importante la estabilización de la proteína. Por lo tanto, deben seleccionarse excipientes que estabilicen la proteína. A la estabilidad de proteínas muy purificadas en disolución también le puede afectar el
15 tampón. Los tampones afectan a la estabilidad de una proteína en disolución tanto por la fuerza iónica como por el pH de la disolución. Los ejemplos de tampones que se han usado para este propósito son tampones de fosfato, citrato, maleato y succinato.
[0011] Incluso si la proteína terapéutica esta en disolución al inicio de su vida en anaquel, el reto es mantener la 20 proteína en disolución y prevenir la agregación durante el almacenamiento, que conduce a la formación de partículas
o la precipitación, y prevenir la degradación (p. ej., por hidrólisis, oxidación, desamidación, truncado o desnaturalización).
[0012] La temperatura también influye en la solubilidad. Normalmente, la solubilidad aumenta con la temperatura. 25 Sin embargo, por encima de un determinado umbral de temperatura, la proteína puede desplegarse parcialmente conduciendo a una menor solubilidad o a la agregación/precipitación.
[0013] Con el fin de prevenir la agregación y degradación y con el fin de obtener un fármaco que es estable a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, es necesario desarrollar una formulación que contenga uno o más 30 excipientes que estabilicen la proteína terapéutica.
[0014] La presente invención aborda la necesidad de una formulación estable y farmacéuticamente aceptable de proteínas de fusión TACI-inmunoglobulina, que se usan como proteínas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad humana.
35 [0015] El documento WO 01/60397 describe agonistas y antagonistas de moléculas relacionadas con el factor de necrosis tumoral (TNF) y usos de los mismos.
[0016] El documento WO 02/094852 describe proteínas de fusión TACI-inmunoglobulina para usar como 40 compuestos terapéuticos.
[0017] El documento WO 2007/059188 describe un anticuerpo dirigido contra CD-20 para usar en el tratamiento del daño articular.
45 [0018] El documento US 2006/067933 describe polipéptidos relacionados con el receptor de TNF solubles, polinucleótidos y composiciones relacionadas, y usos de los mismos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
50 [0019] La presente invención se basa en el desarrollo de formulaciones estables para proteínas de fusión TACIinmunoglobulina.
[0020] En un primer aspecto, la formulación de la invención comprende:
55 a) Proteína de fusión TACI-inmunoglobulina (TACI-Ig) que comprende
i. el dominio extracelular de TACI o un fragmento o variante del mismo que se une a Blys y/o APRIL; y
ii. un dominio constante de inmunoglobulina; y b) un tampón de acetato que tampona la formulación a un pH en el intervalo entre 4,9 y 5,1; y
c) trealosa en una concentración en el intervalo de 600 a 100 mg/ml.
5 [0021] En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicha formulación.
[0022] Un tercer aspecto de la invención se refiere a la formulación o la composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno linfoproliferativo.
10 [0023] La memoria descriptiva describe un procedimiento para preparar una formulación de acuerdo con la invención, que comprende la etapa de preparar una disolución líquida de la proteína de fusión TACI-Ig y ajustar el pH de dicha disolución líquida a un pH en el intervalo de 4,5 a 5,5.
15 [0024] Un procedimiento para preparar una formulación de acuerdo con la invención puede comprender la etapa de cargar una cantidad predeterminada de la formulación en un recipiente estéril.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
20 [0025] La presente invención se basa en el desarrollo de una formulación para proteínas de fusión TACIinmunoglobulina (TACI-Ig), en las que la proteína de fusión TACI-Ig es estable a lo largo de un periodo de tiempo prolongado (p. ej., más de 3 meses, más de 6 meses, más de 12 meses, más de 15 meses o más de 18 meses).
[0026] De acuerdo con la presente invención, la formulación comprende: 25 a) Proteína de fusión TACI-inmunoglobulina (TACI-Ig) que comprende
i. el dominio extracelular de TACI o un fragmento o variante del mismo que se une a BlyS y/o APRIL; y
ii. un dominio constante de inmunoglobulina; y
30 b) un tampón de acetato que tampona la formulación a un pH en el intervalo entre 4,9 y 5,1; y c) trealosa en una concentración en el intervalo de 600 a 100 mg/ml.
[0027] En la formulación de la invención, el pH de la formulación tiene un pH en el intervalo de 4,9 a 5,1.
35 [0028] Por lo tanto, la formulación puede tener p. ej. un pH de 4,9, 5,0 o 5,1. En una realización preferida, el pH de la formulación es 5,0.
[0029] El tampón usado en la formulación de la invención es tampón de acetato. El tampón puede tener una
40 concentración en el intervalo de 1 a 50 mM, preferiblemente de 5 a 25 mM. Por ejemplo, el tampón comprendido en la formulación de la invención puede tener una concentración de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 mM.
[0030] En una realización preferida de la formulación de la invención, el tampón es tampón de acetato sódico 45 (acetato-Na). En una realización de la invención, el tampón es tampón de acetato-Na de 5 a 25 mM, preferiblemente de 8 a 12 mM, más preferiblemente aproximadamente 10 mM.
[0031] En una realización, la formulación de la invención comprende un excipiente. Los excipientes adecuados son, p. ej., manitol, sorbitol, glicina o trealosa. El manitol o el sorbitol por ejemplo, pueden estar presentes en la 50 formulación en una concentración en el intervalo de 10 a 30 o preferiblemente de 15 a 25 ó 20 ó 21 mg/ml.
[0032] La trealosa es un disacárido (azúcar) compuesto de dos moléculas de glucosa unidas por un enlace alfa,alfa-1,1. La trealosa, tal como trealosa anhidra, está presente en la formulación de la invención en una concentración en el intervalo de 60 a 100 mg/ml. Por ejemplo, la formulación puede comprender trealosa 70, 75, 80,
55 85, 90, 95 ó 100 mg/ml. En una realización preferida, la formulación comprende aproximadamente 80 mg/ml de trealosa anhidra.
[0033] Aunque la formulación de la invención puede comprender un excipiente o sal tal como NaCl, CaCl2, MgCl2, en el contexto de la presente invención se prefiere que la formulación esté exenta de sales.
[0034] La formulación puede comprender además un tensioactivo, tal como p. ej., Tween 20 o preferiblemente Poloxamer 188 (Lutrol® o Pluronic® F68). De acuerdo con una realización de la invención, la formulación está exenta de tensioactivo.
5 [0035] En una realización, la formulación de la invención comprende además un conservante. Se prefiere usar alcohol bencílico en combinación con cloruro de benzalconio como conservante. Por ejemplo, la formulación puede comprender de 0,1% a 0,5% de alcohol bencílico, p. ej. 0,2%, 0,3% o 0,4% de alcohol bencílico y de 0,0007% a 0,0015% de cloruro de benzalconio, p. ej. 0,0008%, 0,0009%, 0,001%, 0,0011% o 0,0012% de cloruro de
10 benzalconio. En una realización muy preferida, la formulación comprende 0,3% de alcohol bencílico con 0,001% de cloruro de benzalconio.
[0036] La formulación de la presente invención comprende proteína de fusión TACI-inmunoglobulina (TACI-Ig) como el compuesto terapéuticamente activo, es decir, como el principio activo. Dicha proteína de fusión TACI-Ig
15 comprende o consiste en (a) el dominio extracelular de TACI o una variante o fragmento del mismo que se une a BlyS y/o APRIL; y (b) un dominio constante de inmunoglobulina. El experto en la materia entiende que una proteína de fusión TACI-Ig para formular de acuerdo con la presente invención, no es un anticuerpo dirigido contra TACI. Un anticuerpo dirigido contra TACI no comprendería el dominio extracelular de TACI o una variante o fragmento del mismo que se une a BlyS y/o APRIL, si no que estaría dirigido contra un epítopo del dominio extracelular de TACI.
20 [0037] En el marco de la presente invención, la expresión "dominio extracelular de TACI" también se refiere a cualquier variante del mismo que es al menos 80% u 85%, preferiblemente al menos 90% o 95% idéntica al dominio extracelular de TACI (SEQ ID NO: 1). La expresión "dominio extracelular de TACI" también incluye variantes que no comprenden más de 50 ó 40 ó 30 ó 20 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 ó 1 sustituciones de aminoácidos conservativas. Cualquiera
25 de dichas variantes es capaz de unirse a BlyS y/o APRIL y/o cualquier heterotrímero de BlyS-APRIL. Preferiblemente, dicha variante también inhibe la actividad biológica de BlyS y/o de APRIL y/o de cualquier heterotrímero de BlyS/APRIL. La actividad biológica de BlyS o APRIL es, p. ej., la proliferación de linfocitos B.
[0038] En el contexto de la presente invención también se pueden usar fragmentos (fragmentos activos) y
30 variantes del dominio extracelular de TACI, siempre que el fragmento sea capaz de unirse a BlyS y/o APRIL y/o un heterotrímero de BlyS-APRIL. Preferiblemente, dicho fragmento también inhibe o reduce la actividad biológica de BlyS y/o de APRIL y/o de un heterotrímero de BlyS-APRIL.
[0039] La capacidad de cualquier dominio extracelular de TACI, proteína de fusión TACI-Ig, o cualquier variante o
35 fragmento del mismo para unirse a BlyS y/o APRIL y/o heterotrímero de BlyS/APRIL, se puede evaluar, por ejemplo, de acuerdo con el ejemplo 2, más adelante. La capacidad para inhibir o reducir la capacidad biológica de BlyS, APRIL o el heterotrímero de BlyS/APRIL se puede evaluar, por ejemplo, de acuerdo con el ejemplo 3, más adelante.
[0040] En el contexto de la presente invención, se prefiere que cualquiera de dichos fragmentos o variantes de un
40 dominio extracelular de TACI o una proteína de fusión TACI-Ig, no tenga actividad biológica que sea significativamente menor que la de atacicept, es decir una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
[0041] La expresión "dominio constante de inmunoglobulina (Ig)", como se usa en el presente documento, también
45 se llama un "dominio Fc" y deriva de una inmunoglobulina (Ig) humana o animal que preferiblemente es una IgG. La IgG puede ser una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El dominio Fc preferiblemente comprende al menos el dominio CH2, CH3 de la IgG1, preferiblemente junto con la región bisagra.
[0042] Preferiblemente, el dominio constante de Ig es un dominio de IgG1 humana.
50 [0043] En una realización, el dominio constante de la IgG1 humana se ha modificado para una menor citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).
[0044] En la ADCC, el dominio Fc de un anticuerpo se une a los receptores de Fc (FcγR) en la superficie de las
55 células inmunoefectoras tales como los linfocitos citolíticos naturales y macrófagos, conduciendo a la fagocitosis o lisis de las células diana. En la CDC, los anticuerpos matan las células diana desencadenando la cascada del complemento en la superficie celular. La unión de la IgG a los FcγR activantes (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa y FcγRIIIb) e inhibidores (FcγRIIb) o el primer componente del complemento (C1q) depende de los restos localizados en la región bisagra y el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son importantes para la unión de los FcγR y el complemento C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4. Por ejemplo, la sustitución de los restos de IgG2 en las posiciones 233-236 en la IgG1 humana reducía mucho la ADCC y CDC (Armour y col., 1999 y Shields y col., 2001). Las siguientes mutaciones de Fc, de acuerdo con las posiciones del índice EU (Kabat y col., 1991), se pueden introducir, por ejemplo, en un Fc derivado de la IgG1:
5
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/LG236 + A327G/A330S/P331S
E333A; K322A.
10 [0045] Otras mutaciones de Fc pueden ser, por ejemplo, las sustituciones en las posiciones del índice EU seleccionadas de 330, 331 234 ó 235, o combinaciones de las mismas. También se puede introducir una sustitución de aminoácido en la posición del índice EU 297 localizada en el dominio CH2, en el dominio Fc en el contexto de la presente invención, eliminando un potencial sitio de unión de hidrato de carbono unido a N. El resto de cisteína en la
15 posición del índice EU 220 también se puede sustituir por un resto de serina, eliminando el resto de cisteína que normalmente forma enlaces disulfuro con la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.
[0046] Se han preparado dominios Fc particulares adecuados para las proteínas de fusión TACI-Ig para usar de acuerdo con la presente invención.
20 [0047] Específicamente, se generaron 6 versiones de un Fc de IgG1 humana modificado para crear proteínas de fusión de Fc y se denominan Fc- 488, así como Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 y Fc8. Fc- 488 (que tiene una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 4 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5) se diseñó para la clonación conveniente de una proteína de fusión que contiene la región Fc γ1 humana, y se construyó usando la región constante γ1 de la
25 inmunoglobulina humana natural como molde. La preocupación sobre los potenciales efectos perjudiciales debido a un resto de cisteína desemparejado condujeron a la decisión de sustituir la cisteína que normalmente forma enlaces disulfuro con la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina por un resto de serina. Se introdujo un cambio adicional en el codón que codifica la posición del índice EU 218 para introducir un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Bg III para facilitar las futuras manipulaciones del ADN. Estos cambios se introdujeron en el
30 producto de la PCR codificado en los cebadores de la PCR. Debido a la localización del sitio BgIII y con el fin de completar la región bisagra de Fc, se incorporaron los codones para las posiciones del índice EU 216 y 217 en las secuencias de la pareja de la proteína de fusión. Fc4, Fc5 y Fc6 contienen mutaciones para reducir las funciones efectoras mediadas por el Fc reduciendo la unión de FcγRI y la unión del complemento C1q. Fc4 contiene las mismas sustituciones de aminoácidos que se introdujeron en Fc-488. Se introdujeron sustituciones de aminoácidos
35 adicionales para reducir las potenciales funciones efectoras mediadas por Fc. Específicamente, se introdujeron 3 sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de FcγRI. Estas son las sustituciones en las posiciones del índice EU 234, 235 y 237. Las sustituciones en estas posiciones han mostrado reducir la unión de FcγRI (Duncan y col., 1988). Estas sustituciones de aminoácidos también pueden reducir la unión de FcγRIIa, así como la unión de FcγRIII (Sondermann y col., 2000; Wines y col., 2000).
40 [0048] Varios grupos han descrito la importancia de las posiciones del índice EU 330 y 331 en la unión del complemento C1q y posterior fijación del complemento (Canfield y Morrison, 1991; Tao y col., 1993). Se introdujeron sustituciones de aminoácidos en estas posiciones en Fc4 para reducir la fijación del complemento. El dominio CH3 de Fc4 es idéntico al encontrado en el correspondiente polipéptido natural, excepto por el codón de parada, que se
45 cambió de TGA a TAA para eliminar un potencial sitio de metilación Dam cuando el ADN clonado se desarrolla en Dam más cepas de E. coli.
[0049] En Fc5, el resto de arginina en la posición del índice EU 218 se volvió a mutar a lisina, porque el esquema de clonación de BgIII no se usó en las proteínas de fusión que contenían este Fc particular. El resto de la secuencia 50 de Fc5 se corresponde con la descripción anterior para Fc4.
[0050] Fc6 es idéntico a Fc5 excepto que se ha eliminado el codón de la lisina carboxilo terminal. La lisina Cterminal de inmunoglobulinas maduras se elimina con frecuencia de las inmunoglobulinas maduras postraduccionalmente antes de la secreción de linfocitos B, o se elimina durante la circulación en el suero. Por
55 consiguiente, el resto de lisina C-terminal típicamente no se encuentra en los anticuerpos en la circulación. Como en los Fc4 y Fc5 anteriores, el codón de parada en la secuencia Fc6 se cambió a TAA.
[0051] Fc7 es idéntico a Fc γ1 natural excepto por una sustitución de aminoácido en la posición del índice EU 297 localizada en el dominio CH2. La posición del índice EU Asn-297 es un sitio de unión de hidrato de carbono unido a N. El hidrato de carbono unido a N introduce una fuente potencial de variabilidad en una proteína expresada de forma recombinante debido a las potenciales variaciones de lote a lote en la estructura del hidrato de carbono. En un intento de eliminar esta potencial variabilidad, Asn-297 se mutó a un resto de glutamina para prevenir la unión del hidrato de carbono unido a N en esta posición de resto. El hidrato de carbono en el resto 297 también está implicado
5 en la unión de Fc a FcRIII (Sondermann y col., Nature 406:267 (2000)). Por lo tanto, la eliminación del hidrato de carbono debería disminuir la unión del Fc7 recombinante que contiene proteínas de fusión a los FcγR en general. Como antes, el codón de parada en la secuencia Fc7 se mutó a TAA.
[0052] Fc8 es idéntico a la región γ1 de la inmunoglobulina natural mostrada en la SEQ ID NO: 4, excepto que el
10 resto de cisteína en la posición del índice EU 220 se sustituyó por un resto de serina. Esta mutación eliminaba el resto de cisteína que normalmente forma enlaces disulfuro con la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina.
[0053] El uso de cualquiera de estos dominios de Fc específicos para la formación de una proteína de fusión TACI15 Ig está dentro del alcance de la presente invención.
[0054] El dominio constante de inmunoglobulina de TACI-Ig preferiblemente comprende o consiste en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, o una variante de la misma, que es al menos 80% u 85%, preferiblemente al menos 90% o 95% o 99% idéntica al dominio constante de Ig de SEQ ID NO: 2, o
20 una variante que comprende menos de 50 ó 40 ó 30 ó 20 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 sustituciones de aminoácidos conservativas, con la condición de que no tenga impacto en la actividad biológica general de la proteína de fusión TACI-Ig, y que la inmunogenicidad de la proteína TACI-Ig no sea significativamente más alta de la de atacicept (SEQ ID NO: 3).
25 [0055] En el contexto de la presente invención, el término "identidad" refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos, determinada por comparación de las secuencias. En general, identidad se refiere a una correspondencia exacta de aminoácido a aminoácido de las dos secuencias de polipéptido, respectivamente, a lo largo de la longitud de la secuencia que se compara.
30 [0056] Para secuencias en las que no hay una correspondencia exacta, se puede determinar un "% de identidad". En general, las dos secuencias que se comparan se alinean para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar "huecos" en una o ambas secuencias, para potenciar el grado de alineamiento. Se puede determinar un % de identidad a lo largo de toda la longitud de cada una de las secuencias que se comparan (llamado alineamiento global), que es particularmente adecuado para secuencias de igual longitud o muy similar, o a
35 lo largo de longitudes más cortas definidas (llamadas alineamiento local), que es más adecuado para las secuencias de longitudes distintas.
[0057] Los procedimientos para comparar la identidad de dos o más secuencias son bien conocidos en la materia. Así, por ejemplo, se pueden usar programas disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 40 (Devereux J y col., 1984), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad entre dos secuencias de polipéptido. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor región individual de similitud entre dos secuencias. También se conocen en la materia otros programas para determinar la identidad de dos secuencias, por ejemplo, la familia de programas BLAST (Altschul S F y col., 1990, Altschul S F y col., 1997, accesible a través de la página de inicio del
45 NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990).
[0058] Las sustituciones de aminoácidos preferidas de acuerdo con la presente invención son las que se conocen como sustituciones "conservativas". Las sustituciones conservativas de aminoácidos del dominio extracelular de TACI o la parte del dominio constante de inmunoglobulina de la proteína de fusión TACI-Ig, incluyen aminoácidos 50 sinónimos en un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares para que la sustitución entre miembros del grupo conserve la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Está claro que también se pueden hacer inserciones y eliminaciones de aminoácidos en las secuencias definidas antes sin alterar su función, en particular si las inserciones o eliminaciones implican solo unos pocos aminoácidos, p. ej., menos de 50 o menos de 30, menos de 20 o preferiblemente menos de 10 o menos de 5 restos de aminoácidos, y no eliminan o desplazan
55 aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, tales como, p. ej., restos de cisteína. Se pueden usar proteínas y variantes producidas por dichas eliminaciones y/o inserciones para el tratamiento de la EM recurrente, con la condición de que su actividad biológica no sea significativamente menor que la actividad biológica de atacicept (una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3).
[0059] Las solicitudes de patente internacional publicadas como WO 00/40716 y WO 02/094852 describen secuencias para el dominio extracelular de TACI así como fragmentos específicos del dominio extracelular de TACI que interaccionan con sus ligandos, BlyS y APRIL.
5 [0060] Como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/40716, el dominio extracelular de TACI comprende dos repeticiones ricas en cisteínas (Cys) que son características para miembros de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), a la que pertenece el receptor TACI. En el documento WO 00/40716 también se ha establecido que una variante de corte y empalme de TACI, denominada BR42x2, que comprende solo la segunda repetición rica en Cys menos conservada, se podía unir a BlyS. Por lo tanto, en el marco de la presente
10 invención, el fragmento del dominio extracelular de TACI preferiblemente al menos comprende o consiste en los restos de aminoácidos 71 a 104 de la SEQ ID NO: 1, que corresponden a la segunda repetición rica en Cys. Se prefiere además que la proteína de fusión TACI-Ig comprenda además los restos de aminoácidos 34 a 66 de la SEQ ID NO: 1, que corresponde a la primera repetición rica en Cys.
15 [0061] En una realización adicional de la presente invención, dicho fragmento del dominio extracelular de TACI, que se une a e inhibe la actividad de BlyS y/o APRIL, comprende o consiste en los restos de aminoácidos 30 a 110 de la SEQ ID NO: 1.
[0062] En una realización adicional más de la presente invención, la proteína de fusión TACI-Ig comprende o
20 consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que es al menos 90% o 95% o 98% o 99% idéntica a la misma o que tiene menos de 30 ó 20 ó 15 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
[0063] En una realización adicional más de la invención, la proteína de fusión TACI-Ig comprende o consiste en un 25 polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8, o una variante de la misma que es al menos 90% o 95% o 98%
o 99% idéntica a la misma o que tiene menos de 30 ó 20 ó 15 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
[0064] En una realización adicional más de la invención, la proteína de fusión TACI-Ig comprende o consiste en un
30 polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 10, o una variante de la misma que es al menos 90% o 95% o 98% o 99% idéntica a la misma o que tiene menos de 30 ó 20 ó 15 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
[0065] En una realización adicional más de la invención, la proteína de fusión TACI-Ig comprende o consiste en un
35 polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12, o una variante de la misma que es al menos 90% o 95% o 98% o 99% idéntica a la misma o que tiene menos de 30 ó 20 ó 15 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
[0066] En una realización adicional más de la invención, la proteína de fusión TACI-Ig comprende o consiste en un
40 polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14, o una variante de la misma que es al menos 90% o 95% o 98% o 99% idéntica a la misma o que tiene menos de 30 ó 20 ó 15 ó 10 ó 5 ó 3 ó 2 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
[0067] En otra realización de la invención, la formulación comprende una proteína de fusión TACI-Ig en una
45 concentración en el intervalo de 20 mg/ml a 180 mg/ml, p. ej., en una concentración de 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 mg/ml.
[0068] En una realización adicional de la invención, la formulación está en forma líquida (p. ej., acuosa).
50 [0069] En otra realización adicional más, la formulación es para la administración de múltiples dosis. En el contexto de una formulación de múltiples dosis se prefiere incluir un conservante. Como se ha mencionado antes, en una realización preferida, la formulación comprende alcohol bencílico (p. ej., al 0,3%) y cloruro de benzalconio (p. ej., al 0,001%).
55 [0070] La formulación de la proteína de fusión TACI-Ig puede ser para la administración diaria o en días alternos, preferiblemente dos veces por semana o semanalmente. Preferiblemente, la administración de TACI-Ig es una administración de bolo una vez por semana. Alternativamente, la formulación también puede ser para la administración en semanas alternas o una vez al mes.
[0071] La formulación de la presente invención puede ser, p. ej., para la vía intravenosa, subcutánea o intramuscular. En una realización de la invención, la formulación es para la administración subcutánea.
[0072] La formulación de la presente invención está dirigida al tratamiento de una enfermedad, preferiblemente 5 para el tratamiento de una enfermedad humana. Por lo tanto, en una realización, la formulación de la invención se prepara como composición farmacéutica.
[0073] La formulación o composición que comprende la proteína de fusión TACI-Ig, preferiblemente es para usar en el tratamiento de, o para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o un
10 trastorno linfoproliferativo.
[0074] Una enfermedad autoinmunitaria, en el contexto de la presente invención, incluye, pero no está limitada a,
p. ej., lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica, artritis reumatoide, esclerosis múltiple o neuritis óptica.
15 [0075] Un trastorno linfoproliferativo es una enfermedad en la que las células del sistema linfático crecen excesivamente. Las neoplasias malignas de linfocitos B, por ejemplo, son trastornos linfoproliferativos. Las neoplasias malignas de linfocitos B incluyen, pero sin limitar, leucemias y linfomas, tales como por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica, leucemia promielocítica, leucemia mielomonocítica, eritroleucemia monocítica, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica (granulocítica),
20 leucemia linfocítica crónica, policitemia vera, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, mieloma múltiple, y macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0076] La presente invención también se refiere a un procedimiento (como se define en las reivindicaciones) para producir o preparar una formulación de acuerdo con la invención, que comprende la etapa de mezclar los
25 componentes (a) a (c), preferiblemente en una disolución líquida (p. ej., acuosa).
[0077] La presente invención también se refiere a un procedimiento (como se define en las reivindicaciones) para producir o preparar una formulación de acuerdo con la invención, que comprende la etapa de poner una cantidad predeterminada de la formulación en un recipiente estéril. Una cantidad predeterminada puede ser, p. ej., de 0,5 a 5
30 ml, preferiblemente de 1 a 2 ml.
[0078] En una realización de la invención, el recipiente se selecciona de un vial de vidrio o una jeringa precargada. El vial de vidrio puede estar, p. ej., cerrado usando un tapón no recubierto o un tapón recubierto. El tapón puede ser,
p. ej., un tapón de caucho o un tapón de bromobutilo. La jeringa, p. ej., una jeringa precargada, puede estar tapada
35 con un émbolo de caucho o con un émbolo recubierto. El recubrimiento puede ser, p. ej., un recubrimiento de silicona exento de aceite.
[0079] Una jeringa precargada puede tener diferentes volúmenes tales como 0,5, 1, 1,5, o 2 ml. Preferiblemente, es una jeringa de 1 ml. El volumen de carga de la jeringa preferiblemente es 1 ó 1,2 ml. La jeringa precargada puede 40 estar hecha de plástico o, preferiblemente, puede ser una jeringa de vidrio. Una jeringa de vidrio adecuada es, p. ej., la jeringa de vidrio Hypac 27G1/2 RNG W 7974/50G, fabricada por Becton Dickinson. La jeringa precargada puede estar preferiblemente tapada con un tapón recubierto (p. ej. W4023/50G, fabricado por FluroTec) y un émbolo no recubierto (p. ej. W4023/50G, fabricado por West Pharmaceutical). De acuerdo con la presente invención, la jeringa precargada preferiblemente comprende una cantidad de una proteína de fusión TACI-Ig en el intervalo de 20 a 160
45 mg, tal como por ejemplo 20, 25, 50, 75, 100, 125 ó 150 mg de fármaco. Como se muestra en el ejemplo 4 a continuación, una formulación de una proteína de fusión TACI-Ig a pH 5,0, que comprende tampón de acetato sódico y trealosa, era estable a lo largo de periodos de tiempo prolongados, p. ej., hasta 18 meses, cuando se mantenía a 5 ó 25ºC.
50 [0080] El uso de valores numéricos en los diferentes intervalos especificados en esta solicitud, salvo que se indique expresamente lo contrario, se indican como aproximaciones como si los valores mínimos y máximos dentro de los intervalos indicados estuvieran ambos precedidos por la palabra "aproximadamente". De esta forma, se pueden usar ligeras variaciones por encima y por debajo de los intervalos indicados para lograr sustancialmente los mismos resultados que con los valores dentro de los intervalos. Además, la descripción de los intervalos se pretende
55 que sea un intervalo continuo que incluye cada valor entre los valores mínimo y máximo citados así como cualquier intervalo que se pueda formar así.
[0081] En el contexto de la presente invención, la formulación o composición farmacéutica de la invención puede comprender o se puede administrar en combinación con otros principios activos además de una proteína de fusión TACI-Ig. Por ejemplo, puede estar presente un corticoesteroide, en particular metilprednisolona. Además, interferónbeta, cladribina, mitoxantrona, acetato de glatiramer, natalizumab, rituximab, teriflunomida, fingolimod, laquinimod, o BG-12 (un fumarato oral). El tratamiento combinado puede ser simultáneo, separado o secuencial.
5 [0082] Habiendo ahora descrito completamente esta invención, los expertos en la materia apreciarán que se puede llevar a cabo la misma con un amplio intervalo de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes, sin salirse de la invención como se define en las reivindicaciones y sin excesiva experimentación.
[0083] Aunque esta invención se ha descrito en relación con sus realizaciones específicas, se entenderá que
10 puede tener más modificaciones. Se pretende que esta solicitud cubra cualquier variación, uso o adaptación de la invención que siga en general los principios de la invención, e incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción como vienen en la práctica conocida o habitual de la técnica a la que pertenece la invención y como se pueden aplicar a las características esenciales anteriores expuestas como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
15 [0084] La referencia a etapas de procedimientos conocidos, etapas de procedimientos convencionales, procedimientos conocidos o procedimientos convencionales, no es de ninguna forma la admisión de que cualquier aspecto, descripción o realización de la presente invención está descrita, enseñada o sugerida en la técnica relevante.
20 [0085] La descripción anterior de las realizaciones específicas pondrá así de manifiesto completamente la naturaleza general de la invención que otros, aplicando el conocimiento del experto en la materia (incluyendo los contenidos de las referencias citadas en el presente documento), pueden modificar y/o adaptar fácilmente para diferentes aplicaciones tales como realizaciones específicas, sin excesiva experimentación, sin desviarse del
25 concepto general de la presente invención, como se define en las reivindicaciones. Por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones se pretende que estén dentro de un intervalo de equivalentes de las realizaciones descritas, basadas en la enseñanza y guía presentadas en el presente documento. Se entiende que las expresiones o terminología usados en el presente documento tienen el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o las expresiones de la presente memoria descriptiva, el experto en la materia las debe interpretar a la
30 luz de las enseñanzas y guía presentados en el presente documento, en combinación con el conocimiento de un experto en la materia.
[0086] Habiendo descrito ahora la invención, se entenderá más fácilmente por referencia al siguiente ejemplo de un resumen de estudio clínico de ejemplo, que se proporciona a modo de ilustración, y no se pretende que sea 35 limitante de la presente invención.
EJEMPLO 1: DESARROLLO DE UNA FORMULACIÓN LÍQUIDA
GLOSARIO
AUC: Ultracentrifugación analítica
DC: Dicroísmo circular
DLS: Dispersión de la luz dinámica
45 DSC: Calorimetría diferencial de barrido IEC: Cromatografía de intercambio iónico MALDI-ToF: Espectrometría de masas con ionización por desorción por láser asistida por matriz en tiempo de vuelo DO: Densidad óptica RALS: Dispersión de la luz en ángulo recto
50 RP: Cromatografía de fase inversa SEC: Cromatografía por exclusión de tamaños
MATERIALES
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- Fármaco de TACI-Fc en tampón de fosfato a pH 6 + NaCl 140 mM
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- Fármaco de TACI-Fc en tampón de fosfato a pH 5
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- Fármaco de TACI-Fc en tampón de acetato a pH 5
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- Ácido ortofosfórico (1.00563, Merck)
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- Ácido succínico (1.00682, Merck)
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- Ácido cítrico (1.59134, Merck)
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- Histidina (1.04351, Merck)
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- Ácido acético glacial al 100% (1.00063, Merck); 5 - D-Manitol DAB, Ph Eur, BP; USP, FCC, E421 (1.05980, Merck)
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- D-Sorbitol (S-1876, Sigma)
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- Sacarosa DAB, Ph Eur, BP, NF (1.07653, Merck)
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- Trealosa (1.08216, Merck)
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- D-Glucosa monohidrato (346971, Carlo Erba) 10 - Gránulos de hidróxido sódico GR (1.06498, Merck)
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- Tween 20 para síntesis (8.22184, Merck);
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- Poloxamer 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf)
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- Cloruro cálcico dihidrato (1.02382, Merck)
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- Cloruro magnésico (1.05833, Merck) 15 - Cloruro sódico (1.06404, Merck)
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- Hidrocloruro de arginina (A-5131, Sigma);
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- Hidrocloruro de lisina (1.0571, Merck)
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- Glicina (5.00190, Merck);
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- Acetonitrilo (00030, Merck) 20 - 10xPBS (P/N 70013-032, Gibco)
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- Ácido trifluoroacético (9470, Baker)
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- Sulfato amónico (1.01217, Merck)
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- Hidróxido sódico 1 N (1.09137, Merck)
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- Ácido clorhídrico 1 N (1.09057, Merck) 25 - Agua de calidad para HPLC (MilliQ)
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- Agua para inyección
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- Sulfato sódico anhidro (código 6649, Merck)
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- Metanol (código 06009, Merck)
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- Azida sódica (código 6688, Merck) 30 - Dihidrogenofosfato sódico monohidrato (código 06346, Merck)
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- Hidrogenofosfato disódico dihidrato (código 06580, Merck)
[0089] Para el bioensayo:
35 - células Jurkat pKZ142 clon 24 (WCB)
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- TACI-Fc5 (1-8,66 mg/ml)
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- zTNF4 (1,44 mg/ml)
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- RPMI 1640 con y sin rojo de fenol (Gibco)
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- Suero bovino fetal (FBS) (GIBCO) 40 - L-glutamina (Hyclone)
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- Piruvato sódico (Gibco) Puromicina (Sigma)
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- Sustrato y tampón de ensayo de luciferasa Steady GLO (ProMega. E251 0) Placas de cultivo tisular blancas de 96 pocillos con tapas (Dynex)
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- Placas de 96 pocillos con cubiertas (Falcon) 45 - Tubos de polipropileno de 5 ml (Falcon)
EQUIPAMIENTO
50 - Sistemas de HPLC (Waters)
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- Pipetas calibradas (Gilson)
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- Calorímetro diferencial de barrido (mod. 2920, TA Instruments)
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- Microcalorímetro (mod. VP-DSC, MicroCal)
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- Medidor de pH (mod. 713, Metrohm) 55 - Osmómetro (Osmomat 030-D, Gonotec)
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- Espectropolarímetro J-810 equipado con un control Peltier para la temperatura, PTC-423S (Jasco)
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- Espectrofluorómetro FluoroMax3 equipado con un lector de microplaca, MicroMax384 (Jobin Yvon)
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- Placas de 96 pocillos MaxSorp (Nunc)
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- Espectrofotómetro lambda 354 (Perkin Elmer)
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- Cubetas de cuarzo de 0,1 y 1 cm de paso óptico (Perkin Elmer)
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- Zetasizer Nano Series (Malvern)
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- Cubetas de cuarzo de volumen reducido (-70 μl)
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- Sistema celular agitado (mod. 8400 o 8450, Amicon) 5 - Membrana con corte de exclusión de 10 kDa (tipo YM10, Amicon)
[0091] Contenedores de acero inoxidable de 22 ml y 220 ml de capacidad (Sartorius)
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- Filtros de membrana de 0,22 μm (Durapore tipo GWVP, Millipore) 10 - Filtros de membrana de 0,45 μm (Durapore tipo HVLP, Millipore)
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- Espectrómetro de fluorescencia/RALS (Photon Technology International)
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- Agitador VXR Vibrax IKA (IKA Works, Inc.)
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- Liofilizadores (Lyoflex 06, Lyoflex 08, Edwards)
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- Agitador Vortex (Falc) 15 - Armarios termostáticos (Heraeus)
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- Congeladores (Angelantoni)
[0092] Para el bioensayo:
20 - Lector de placa luminómetro, Lumicount Packard
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- Software Graph Pad Prism
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- Campana de flujo laminar (Flow Laboratories)
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- Incubador a 37°C y CO2 (Heraeus)
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- Baño de agua a 37°C 25 - Contador de células Coulter
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- Microscopio
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- Plataforma agitadora
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- Centrífuga de sobremesa
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- Pipetas de un canal y de múltiples canales calibradas y puntas de pipeta 30 - Ayuda de pipeta
MATERIAL DE ACONDICIONAMIENTO PRIMARIO
35 - Viales de vidrio DIN2R (3 ml) (Nuova OMPI)
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- Tapones de caucho Flurotec (S2F452, D777-1, B2-40, West Pharmaceutical)
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- Tapones de caucho (1779 W1816 gris, Pharmagummi)
PROCEDIMIENTOS
Cromatografía de exclusión por tamaños (SEC)
45 [0094] Las muestras se diluyeron hasta 0,5 mg/ml con PBS1X a pH = 7,2 y se cargaron 40 μl (20 μg) en una columna TSK-gel G3000SWXL 5 μm, 7,8 x 300 mm. Para cada experimento, el eluyente era fosfato sódico 0,05 M, sulfato amónico 0,5 M, pH = 6,0.
50 [0095] Las muestras se diluyeron hasta 0,25 mg/ml en la fase móvil y se cargaron 40 μl (20 μg) en una columna TSK-gel G3000SWXL 5 μm, 7,8 x 300 mm, conectada a una precolumna TSK-gel SWXL de 6 mm x 4 cm. Para cada experimento, el eluyente era fosfato sódico 0,05 M, sulfato amónico 0,5 M, pH = 6,0.
[0096] Las muestras se diluyeron hasta 0,5 mg/ml con PBS1X a pH = 7,2 y se cargaron 40 μl (20 μg) en una columna PLRP 4000 A 8 μm, 50 x 4,6 mm equilibrada en 71% de tampón A (TFA al 0,1% en agua) y 29% de tampón
B (TFA al 0,1% en acetonitrilo). Las muestras se eluyeron usando un gradiente lineal con un caudal de 2 ml/min. La curva de calibración se generó inyectando diferentes cantidades de la referencia (IRS TACI-Fc5 2002/2001).
5 [0097] Las muestras se sometieron a digestión enzimática (Lys-C) durante 2 h a 37ºC y después se llevaron a la cromatografía en fase inversa en Vydac C18 (4,6 x 50 mm) con precolumna,
Eluyente A: TFA al 0,1% en agua
10 B: TFA al 0,08% en CH3CN, 70% Caudal: 1 ml/min
T: 40º+/-5ºC
Detección: 214 nm
Gradiente de elución: de 15% de B a 23% en 7 min. Total 15 min
[0098] Se diluyeron muestras de fármaco de TACI-Fc en agua purificada con el fin de obtener una concentración de proteína de 4 mg/ml. Después, 10 μl de la muestra diluida se diluyen en 200 μl de disolución de
20 desnaturalización-reducción (DTT 0,15 M en guanidina 6 M), se mezclan con vórtice y finalmente se incuban a 60 ± 2ºC durante 90 min. Se inyectan 75-150 μl (15-35 μg) en la columna (Wide-Pore Butyl, 5 mm, 4,6 mm de d.i. x 50 mm, código 7116-05 de J.T. Baker) previamente equilibrada con las condiciones iniciales (71% de eluyente A, ácido trifluoroacético al 0,05% en agua y 29% de eluyente B, ácido trifluoroacético al 0,04% en acetonitrilo).
[0099] Se diluyeron muestras de fármaco de TACI-Fc en una disolución de Poloxamer 188 100 mg/ml en tampón de fosfato sódico 10 mM a pH 4,00, con el fin de obtener una concentración de proteína de 10 mg/ml. En el caso de una concentración de TACI-Fc mayor de 100 mg/ml, la dilución de las muestras debe llevarse a cabo por pesada.
30 [0100] Se inyectan 25 μl (250 μg) en la columna (ProPac WCX-10G (precolumna), 4 x 50 mm, código 054994 de Dionex) previamente equilibrada con las condiciones iniciales (80% de eluyente A, fosfato sódico 10 mM a pH 4,00 y 20% de eluyente B, fosfato sódico 10 mM a pH 4,00 + KCI 0,5 M).
[0101] Se desarrolló la cartografía peptídica en las muestras de fármaco de TACI-Fc y se verificó la aplicabilidad de la detección por MALDI-ToF para la cuantificación de las formas oxidadas.
[0102] Las muestras se cargaron en celdas con piezas centrales de Epon-charcoal de 2 canales de 12 mm de paso óptico. Las muestras se diluyeron usando tampón de elución de SE-HPLC como diluyente para así imitar las condiciones del ensayo de HPLC. El correspondiente tampón se cargó en el canal de referencia (el instrumento
45 funciona como un espectrofotómetro de doble haz). Las celdas cargadas después se pusieron en un rotor analítico AN-50Ti, se cargaron en una centrífuga analítica Beckman Optima XL-I. El análisis se llevó a cabo con los siguientes ajustes experimentales:
Tipo de rotos: rotor de 8 agujeros
50 Velocidad del rotor: 40K rpm Piezas centrales: Epon-charcoal Longitud del canal: 12 mm Temperatura durante el experimento de AUC: 20ºC ± 0,2ºC Longitud de onda de detección: 280 nm
55 Concentración de la muestra: 0,5 mg/ml Volumen de muestra: 432 ml/canal Volumen de referencia: 442 ml/canal
[0103] Los datos se analizaron usando el procedimiento c(s) desarrollado por Peter Schuck en el N.I.H. e implementado en su programa de análisis SEDFIT (versión 8.7).
5 [0104] DSC 2920 CE de TA Instruments: Intervalo de T = 25-100°C; velocidad de calentamiento = 2°C/min; se cargaron cubetas de alto volumen (HVP) con 75 μl de disolución; se usaron placebos como disoluciones de referencia. Microcalorímetro MicroCal VP-DSC: Intervalo de T = 25-100°C; velocidad de calentamiento = 70 °C/h; respuesta = 15 s; separación de datos = 0,2-8°C; la celda de muestra se cargó con aproximadamente 600 ml de disolución de Taci-Fc5 5 mg/ml; se usó agua como disolución de referencia.
[0105] Se prepararon disoluciones de TACI-Fc5 de 0,5 mg/ml (por dilución con agua) y sus concentraciones (c) se obtuvieron por la ecuación de Lambert-Beer: DO = £ b c (£ = coeficiente de extinción molar; b = grosor de la celda
15 óptica). £ (280 nm) = 1,56 (ml/mg).cm-1. La concentración de las disoluciones iniciales se determinó multiplicando estos valores calculados por el factor de dilución.
Dicroísmo circular (DC)
[0106] El DC se usa habitualmente para estudiar la conformación de péptidos y proteínas. Varios factores pueden afectar al aspecto de los picos característicos en los espectros de DC, tanto en la región del UV lejano (180-250 nm) como del UV cercano (250-350 nm), tal como la concentración de proteína, temperatura, pH y concentración iónica.
25 Las posiciones de las bandas generales observadas en el UV lejano se describen en la bibliografía y representan tipos particulares de la estructura secundaria (hélice α, lámina β, espiral aleatoria). Las bandas de DC observadas en el intervalo de UV cercano se deben principalmente al Trp, Tyr, Phe y los enlaces disulfuro.
[0107] Sin embargo, se debe señalar que la señal del enlace disulfuro en general es mucho más débil que la de
30 los aminoácidos aromáticos. Siempre que estos restos estén en un entorno asimétrico, se puede proporcionar una señal de DC. Los cambios conformacionales en la estructura terciaria de la proteína normalmente conducen a variaciones del entorno inicial produciendo así una modificación en el espectro de DC. De hecho, en una proteína natural los aminoácidos individuales ocupan posiciones únicas dentro de la estructura tridimensional. Las alteraciones en esta estructura podrían conducir a un cambio en su accesibilidad.
Ajustes de los espectros de DC en el UV cercano
[0108] Velocidad de barrido 5-20 nm/min; intervalo = 250-350 nm; respuesta = 8 s; concentración = 2 mg/ml; paso óptico = 1 cm; separación de datos = 0,5 nm; anchura de banda = 1 nm; acumulaciones = 2. Sensibilidad estándar.
40 Los espectros se adquirieron a temperatura ambiente.
Ajustes de los espectros de DC en el UV lejano
[0109] Velocidad de barrido 5-20 nm/min; intervalo = 200-300 nm; respuesta = 8 s; concentración = 0,25 mg/ml;
45 paso óptico = 0,1 cm; separación de datos = 0,5 nm; anchura de banda = 1 nm; acumulaciones = 2. Sensibilidad estándar. Los espectros se adquirieron a temperatura ambiente.
50 [0110] Los barridos de temperatura controlados por DC a una longitud de onda fija son una herramienta valiosa para investigar tanto la estructura secundaria como la terciaria de la proteína a diferentes temperaturas. Dicha medición permite evaluar la temperatura de desplegado de la proteína (Tdesp) en diferentes formulaciones. Aunque la Tdesp no tiene una relación directa con la energía libre del desplegado de la proteína (que es un indicador de la estabilidad de la proteína), está ampliamente aceptado que cualquier aumento de la Tdesp debería correlacionarse
55 con un aumento en la estabilidad de la proteína. Por lo tanto, un cambio en la Tm puede indicar si una composición particular tiene cualquier efecto estabilizante o desestabilizante. La desnaturalización térmica se investigó controlando la variación de la señal del Trp (triptófano) asociada con el cambio conformacional de la proteína con la temperatura. Las formulaciones de fármaco se sometieron a un calentamiento (1ºC/min) en el intervalo de 55-70ºC. El efecto de la temperatura en la estructura terciaria se detectó por cambios en la elipticidad del DC con respecto al mínimo a 292,5 nm. Se usaron ajustes polinomiales de cuarto grado para calcular los valores de las temperaturas de transición.
Ajustes del barrido de temperatura del DC
5 [0111] Intervalo de T = 55-70°C; velocidad de calentamient o = 1°C/min; A = 292,5 nm; concentración = 2 mg/ml; respuesta = 8 s; separación de datos = 0,2-8°C; anc hura de banda = 1,5 nm. Sensibilidad estándar. Velocidad de agitación = baja.
[0112] La dispersión de luz dinámica mide la dispersión inducia por el movimiento Browniano de las partículas y se relaciona con el tamaño de las partículas. Requiere someter las partículas a un haz láser y analizar las fluctuaciones de la intensidad en la luz dispersada. Más precisamente, la velocidad de las partículas que se mueven debido al
15 movimiento Browniano está relacionado con el tamaño de las partículas (ecuación de Stokes-Einsein). El correlador digital mide el grado de similitud entre dos señales (intensidad de las señales en este caso) a lo largo de un periodo de tiempo y da información relacionada con la naturaleza y la extensión de las fluctuaciones de la intensidad de la dispersión, que están relacionadas con las dimensiones de las partículas. Después de determinar la función de correlación, entonces se puede usar para calcular la distribución de tamaños.
20 [0113] El Zetasixer Nano Series mide la intensidad de la dispersión cercana a 180ºC (detección de retrodispersión). Dicha configuración reduce el efecto de la dispersión múltiple a través de la muestra y el efecto de los contaminantes grandes. Se usó la cubeta de calibrado desechable (volumen interno ~70 μl). Las mediciones se llevaron a cabo a T = 25ºC. Tiempo de equilibrado = 1 min; número de experimentos = 11; duración del experimento
25 = 10 s; número de mediciones = 2. Dispersante: agua (viscosidad = 0,8872 cP; índice de refracción = 1,330). No se hicieron diluciones.
30 [0114] La RALS se mide usando un detector de fluorescencia en el que las longitudes de onda de excitación y emisión se han ajustado de forma idéntica. En esta configuración, el detector de fluorescencia se convierte en un detector de RALS muy sensible. Los aumentos de RALS son indicativos de agregación/precipitación en la muestra.
[0115] Las proteínas contienen tres restos de aminoácidos aromáticos (triptófano: Trp; tirosina: Tyr; fenilalanina: Phe), que pueden contribuir a su fluorescencia intrínseca. La fluorescencia de una proteína plegada es una
40 combinación de la fluorescencia de los restos aromáticos individuales. La fluorescencia de la proteína en general se excita a 280 nm o longitudes de onda mayores, normalmente a 295 nm. La mayoría de las emisiones se deben a la excitación de los restos de triptófano, con unas pocas emisiones debidas a la tirosina y la fenilalanina. La intensidad, rendimiento cuántico y longitud de onda de la emisión de fluorescencia máxima del triptófano es muy dependiente del disolvente. El espectro de fluorescencia se desplaza a longitud de onda más corta y la intensidad de la
45 fluorescencia aumenta al disminuir la polaridad del disolvente alrededor de los restos de triptófano. Los restos de triptófano, que están enterrados en el centro hidrófobo de las proteínas, pueden tener espectros que están desplazados de 10 a 20 nm comparado con los triptófanos en la superficie de la proteína. Además, la fluorescencia del triptófano se puede atenuar mediante grupos ácidos protonados cercanos tales como Asp o Glu. Por lo tanto, la fluorescencia se puede usar como una herramienta de control poderosa, que refleja las variaciones en el
50 microentorno en el que están los restos aromáticos.
[0116] El MicroMax 384 es un lector de placa de micropocillos que puede aceptar placas con hasta 384 pocillos y conecta con el espectrofluorómetro FluoroMax. La luz de los monocromadores de excitación y emisión se lleva por un haz de fibra óptica a y desde el MicroMax 384, de esta forma, el usuario puede hacer el barrido con el
55 espectrofluorómetro principal y seleccionar cualquier pareja de longitudes de onda de excitación y emisión para las mediciones de la intensidad. Todo el control del MicroMax 384 es automático mediante el software DataMax; es posible la selección por el usuario de los micropocillos en la placa mediante el software.
[0117] Los barridos de fluorescencia de alto rendimiento se llevaron a cabo usando el lector de placa MicroMax 384 usando los siguientes ajustes: rendijas de excitación y emisión = 5 nm; λexc = 280 nm; intervalo de emisión = 300-450 nm; tiempo de integración = 0,1 s. No se hizo dilución. La longitud de onda de emisión máxima se calculó automáticamente mediante el software Fluoromax 3.
[0118] Las mediciones de RALS se llevan a cabo realizando barridos sincrónicos (λexc = λem) con el espectrofluorímetro FluoroMax entre 500-800 nm. En estas condiciones (no hay absorción por la muestra ni influencia por la fuente de luz) la intensidad manifestada se debe principalmente al fenómeno de dispersión (luz
10 incidente/proteína) que se produce en disolución. La intensidad dispersada total aumenta al aumentar las dimensiones de la proteína, y por lo tanto esta técnica puede ser útil para controlar la aparición de sucesos tales como la agregación, disociación de subunidades, degradaciones, etc.
[0119] La intensidad de la dispersión también depende de la concentración de proteína y del índice de refracción, 15 de modo que se deben llevar a cabo mediciones comparativas con la misma concentración de proteína.
[0120] Las mediciones de RALS se llevaron a cabo ajustando los siguientes parámetros; barrido sincrónico; intervalo de longitud de onda = 500-800 nm; rendijas = 15 nm; tiempo de integración = 0,5 s; desplazamiento = 0 nm; concentración de la muestra = 35 mg/ml (se usó agua milliQ como diluyente).
[0121] La rotación de las macromoléculas depende de su tamaño, forma y entorno local (es decir, disolvente). Las mediciones de emisión polarizada a menudo se usan para detectar pequeños cambios en el tamaño molecular 25 (agregación, unión, escisión) así como cambios en el entorno (viscosidad local, transiciones de fase, etc.). La primera etapa en estas mediciones es la excitación de un grupo seleccionado de fluoróforos (fotoselección). Típicamente se usa luz polarizada en dirección vertical para excitar una población de moléculas cuyo dipolo de absorción está orientado en la dirección vertical. En esta fase, la luz de excitación polarizada en dirección vertical se produce usando un polarizador en el camino de excitación. Una vez excitada, la molécula puede rotar durante el 30 tiempo de vida del estado excitado (~10-9 s). Dicha rotación despolarizará la emisión de fluorescencia. Las mediciones de los componentes de emisión polarizados permiten el cálculo del tipo y extensión de los movimientos rotacionales de la molécula. Los componentes polarizados de la emisión de fluorescencia se miden usando un polarizador en el camino de emisión. A partir de la magnitud de los componentes de emisión vertical (V) y horizontal (H), se puede calcular el tipo y extensión de comportamiento rotacional. La anisotropía (A) es una relación definida
35 como la diferencia entre la intensidad de los componentes polarizados linealmente dividido entre la intensidad de la luz total:
A = (IVV - G*IVH)/(IVV + 2G*IVH)
40 donde: G es un factor de corrección, G = IHV/IHH
[0122] En estas ecuaciones, el primer subíndice de la intensidad I indica la posición del polarizador de excitación (H o V) y el segundo del polarizador de emisión (H o V). La anisotropía de la fluorescencia, cuando la longitud de
45 onda de excitación se ajusta a λ = 295 nm, da información relacionada con la movilidad de los restos de Trp y de la viscosidad local que experimentan. Por lo tanto, un aumento de la anisotropía de la fluorescencia puede reflejar un entorno más rígido de estos restos en las proteínas.
[0123] Las mediciones de anisotropía se llevaron a cabo ajustando los siguiente parámetros: λexc = 295 nm;
50 intervalo de emisión = 300-350 nm; tiempo de integración = 0,5 s; rendijas = 15 nm; concentración de la muestra = 35 mg/ml (se usó agua milliQ como diluyente).
55 [0124] El bioensayo in vitro de TACI-Fc se basa en células transfectadas Jurkat (linfocitos T agudos humanos) (Jurkat pKZ142). Esta línea celular se ha transfectado con 2 plásmidos. El primero codifica el ADNc de TACI de longitud entera bajo el control del promotor de CMV y el segundo con NF-kB/AP-1 que dirige un gen indicador de luciferasa. El procedimiento se basa en la capacidad de zTNF4 para unirse al receptor TACI de superficie celular, desencadenando una cascada de transducción de señales, que produce la estimulación del gen indicador de luciferasa NF-kB/AP-1 transfectado. La presencia de TACI-Fc soluble inhibe la unión de zTNF4 al receptor TACI, reduciendo de esta forma la expresión de la luciferasa.
[0125] Las células Jurkat pKZ142 se incubaron con TACI-Fc de referencia para construir una curva de dosis5 respuesta completa (de 27,86 a 1,63 U/ml) y con muestras ensayadas en dos concentraciones situadas en la parte lineal de la curva de referencia (es decir, 4 y 6 U/ml).
[0126] Después se añade la disolución de zTNF4 tanto a la curva de referencia como a las muestras en una concentración que sea capaz de inducir la producción submáxima de luciferasa (es decir, 150 ng/ml/pocillo); también
10 se lleva a cabo como control la producción mínima y máxima de luciferasa. Después de 4 h de incubación a 37ºC (5% de CO2), se añade a las células el kit de luciferasa Steady Go y se detecta la expresión de luciferasa mediante un luminómetro.
[0127] La potencia de las muestras se calcula por interpolación de los valores Y (URL) para las dos
15 concentraciones ensayadas en la parte lineal de la curva de dosis-respuesta de referencia, consiguiendo así la concentración de TACI-Fc en el eje X (software Graph Pad). Los valores de las dos concentraciones de ensayos independientes se promedian y después se calcula la actividad biológica de TACI-Fc5 llevando a cabo la media aritmética de la potencia obtenida de cada ensayo independiente.
[0128] Se evaluó el efecto del pH, tipo de tampón y excipientes en la estabilidad de la proteína. Se prepararon disoluciones de TACI-Fc con una concentración de 70 ó 100 mg/ml para investigar preliminarmente las siguientes variables:
- -
- pH (4, 5, 6, 7)
- -
- tampón (acetato, fosfato, succinato, citrato, histidina)
- -
- azúcares (manitol, sorbitol, glucosa, sacarosa, trealosa)
- -
- excipientes (cloruro sódico, cloruro magnésico, cloruro cálcico, glicina)
30 [0129] Además de esto, se llevaron a cabo los siguientes estudios de precribado de TACI-Fc5 con 70 mg/ml:
- -
- Ciclos de congelación-descongelación (F-T) (1, 3, 5 F-T) en tampón 20 mM (histidina, fosfato, succinato, citrato) a
pH 5-6-7; 35 - incubación a 40°C (condiciones con agitación y si n agitación);
- -
- almacenamiento a 2-8°C en tampón 20 mM (acetato, histidina, fosfato) a pH 4-5-6.
[0130] Basándose en los resultados procedentes de estas primeras observaciones, se seleccionaron dos tampones (fosfato e histidina) a pH 5 y 6 y un segundo conjunto de formulaciones preparadas para investigar el
40 efecto de la inclusión de agentes estabilizantes adicionales (a 0,280 OSM de osmolalidad residual). Se ensayaron los siguientes agentes estabilizantes: glucosa, manitol, sorbitol, sacarosa, trealosa, glicina, NaCl, MgCl2, CaCl2.
[0131] Las disoluciones se almacenaron a 2-8ºC, 25ºC y 40ºC y se ensayaron hasta 14 días los agregados (SE-HPLC), contenido de proteína (RP-HPLC), pH y aspecto.
[0132] Basándose en la selección hecha durante la fase previa, se preparó un diseño experimental para evaluar la influencia de los factores investigados previamente en diferentes niveles en relación con la estabilidad de la proteína.
50 Se ensayaron formulaciones en tampones de acetato e histidina junto con los siguientes tensioactivos: Poloxamer 188 (Lutrol® F-68) y Tween 20, y con los siguientes excipientes: arginina, glicina, lisina, manitol y trealosa. Estas formulaciones se almacenaron en viales de vidrio a 2-8°C, 25° y 40°C y se ensayaron los agregados (por SE-HPLC y AUC), pH, aspecto y osmolalidad. También se aplicaron procedimientos analíticos biofísicos (p. ej., dicroísmo circular, espectroscopía de 2ª derivada UV, fluorescencia intrínseca).
[0133] Al final de la fase de preformulación, se identificaron algunas formulaciones candidatas que contenían TACI-Gc 70 ó 100 mg/ml, tampón acetato 10 mM, manitol (51 mg/ml) o trealosa anhidra (80 ó 96 mg/ml) como
excipiente, con o sin Poloxamer 188 (Lutrol® F-68) (0,05 mg/ml). Se ensayaron valores de pH de 4,8, 5,0, 5,2 y 5,4.
[0134] Todas las disoluciones se filtraron de forma aséptica a través de una membrana Durapore de 0,22 μm y se recogieron en un recipiente esterilizado. Después, las disoluciones se cargaron en viales de vidrio DIN2R (volumen 5 de carga de 1 ml). Se tomaron muestras durante el procedimiento (antes y después de la filtración) durante la fabricación para evaluar la pérdida de proteína o aumento de agregación.
[0135] Las muestras se almacenaron a 2-8°C, 25° y 40°C y s e ensayaron hasta 1 mes (40ºC) y 6 meses (2-8°C, 25°C).
10 [0136] Se ensayaron en las formulaciones candidatas los agregados (SE-HPLC, AUC), contenido de proteína (SE-HPLC), pH, osmolalidad y actividad biológica. También se determinó la extensión del truncado del extremo C y el porcentaje de formas truncadas/enlazadas. También se aplicaron procedimientos biofísicos (fluorescencia intrínseca, dispersión de luz dinámica, dispersión de luz a 90º).
15 [0137] También se evaluó el efecto de congelación-descongelación de las muestras líquidas de las formulaciones candidatas almacenadas a 2-8ºC: las muestras se congelaron a -80ºC y después se descongelaron a temperatura ambiente. Se evaluó la cantidad de agregados antes y después de la congelación-descongelación por SE-HPLC.
20 [0138] Se evaluó el efecto de agitación 24 h para simular el transporte del fármaco en las muestras almacenadas a 2-8ºC, que se pusieron en agitación en un agitador de microplaca a temperatura ambiente durante 24 h. Se evaluó el nivel de agregados por SE-HPLC frente al nivel inicial.
RESULTADOS 25 [0139] Las formulaciones candidatas estaban en acetato-Na 10 mM
- Formulación nº
- TACI-Fc (mg/ml) Composición
- 21A
- 70 pH 5, trealosa 96 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
- 21B
- 70 pH 5, trealosa 80 mg/ml
- 21C
- 70 pH 5,4, trealosa 80 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
- 21D
- 100 pH 5, trealosa 80 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
- 21E
- 100 pH 5, trealosa 80 mg/ml
- 21F
- 100 pH 5,4, trealosa 80 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
- 21G
- 100 pH 5, manitol 51 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
- 21H
- 100 pH 5, manitol 51 mg/ml
- 21I
- 100 pH 4,8, trealosa 80 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
- 21L
- 100 pH 5,2, trealosa 80 mg/ml, Poloxamer 188 0,05 mg/ml (Lutrol® F-68)
[0140] Los resultados detallados se dan en las siguientes tablas A a T.
Tabla A: % de agregados totales por SE-HPLC (2-8ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 4 sem. 6 sem. 8 sem. 12 sem. 16 sem. 26 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 3,3 3,6 3,7 3,2 2,9 - 2,0
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,4 3,7 3,8 3,5 3,0 - 2,1
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,4 3,6 3,8 3,9 3,1 2,2
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,4 3,6 3,9 3,5 3,0 - 2,3
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,7 4,5 3,8 3,8 3,3 - 2,3
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 3,7 3,9 3,4 3,4 2,8
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 3,7 3,7 3,9 4,1 3,2 - 2,6
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 3,8 3,7 4,1 3,6 3,3 - 2,6
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 3,3 2,9 3,0 - 2,6 -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 3,4 3,3 3,3 - 2,7 -
- Carga usada: S128 / L20a (tampón de acetato sódico 10 mM, pH = 5,0). % de agregados totales = 3,9
Tabla B: % de agregados totales por SE-HPLC (25ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 2 sem. 4 sem. 6 sem. 8 sem. 12 sem. 17 sem. 27 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 3,3 2,6 4,0 3,8 3,7 3,5 - 3,4
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,4 3,0 3,7 4,1 3,9 3,4 - 3,5
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,4 3,1 3,9 4,2 4,6 4,0 4,5
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,4 5,0 4,0 4,1 4,4 4,2 - 4,4
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,7 3,3 3,9 4,6 4,5 4,4 - 4,7
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 3,8 4,5 5,0 5,1 5,2 6,5
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 3,7 3,9 3,9 4,7 4,7 4,5 - 4,9
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 3,8 3,4 3,9 4,6 4,5 4,4 - 4,9
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 3,0 3,6 3,3 3,5 - 5,0 -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 3,4 4,1 3,8 4,2 - 4,9 -
- Carga usada: S128 / L20a (tampón de acetato sódico 10 mM, pH = 5,0). % de agregados totales = 3,9
5 Tabla C: % de agregados totales por SE-HPLC (40ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 1 sem. 2 sem. 4 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 3,3 3,9 4,1 6,1
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,4 4,0 4,4 6,3
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,4 4,4 5,3 7,4
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,4 5,0 5,3 7,9
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,7 5,0 5,5 7,9
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 6,2 7,4 11,0
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 3,7 5,0 6,1 8,4
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 3,8 5,9 6,1 8,4
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 6,1 7,4 12,2
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,6 7,6 8,9 14,0
- Carga usada: S128 / L20a (tampón de acetato sódico 10 mM, pH = 5,0). % de agregados totales = 3,9
Tabla D: % de dímeros por AUC (2-8ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición 4 sem. 8 sem. 13 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 4,0 7,4 3,0
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,2 1,6 3,6
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 7,5 2,6
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 4,2 3,7
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,3 4,5 3,2
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 4,0 2,9 4,1
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 3,1 4,0 3,1
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 3,7 4,7 2,8
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,9 - -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,5 - -
Tabla E: % de agregados grandes por AUC (2-8ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición 4 sem. 8 sem. 13 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 2,3 2,8 1,1
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 2,0 0,5 2,5
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 3,0 0,6
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 2,1 1,4
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 1,2 1,5 1,2
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 1,1 0,8 1,6
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 1,5 2,1 1,5
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 1,9 2,1 1,3
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 1,9 - -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 2,0 - -
Tabla F: % de dímeros por AUC (25ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición T=0 (4 sem. 5°C) 4 sem. 8 sem. 13 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 4,0 2,6 3,8 5,3
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,2 3,9 3,4 2,7
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 2,8 4,0 5,6
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 2,4 4,2 3,2
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,3 3,3 3,7 3,7
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 4,0 4,3 5,2 4,2
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 3,1 3,9 3,9 3,8
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 3,7 3,0 4,3 6,6
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,9 - - -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,5 - - -
Tabla G: % de agregados grandes por AUC (25ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición T=0 (4 sem. 5°C) 4 sem. 8 sem. 13 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 2,3 0,3 0,8 2,5
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 2,0 1,1 0,6 0,2
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 0,1 0,8 1,3
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - 0,4 1,3 0,2
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 1,2 0,9 0,9 0,9
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 1,1 1,6 1,2 0,7
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 1,5 1,9 1,1 1,1
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 1,9 1,5 2,6 3,6
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 1,9 - - -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 2,0 - - -
Tabla H: % de dímeros por AUC (40ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición T=0 (4 sem. 5°C) 2 sem. 3 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 4,0 - 4,4
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,2 - 3,9
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - - 5,3
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - - -
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 3,3 - 6,4
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 4,0 - 7,0
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 3,1 - 6,0
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 3,7 - 6,4
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,9 4,9 -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 3,5 8,0 -
Tabla I: % de agregados grandes por AUC (40ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición T=0 (4 sem. 5°C) 2 sem. 3 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 2,3 - 1,8
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 2,0 - 1,5
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - - 2,0
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 - - -
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 1,2 - 2,8
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 1,1 - 2,6
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 1,5 - 3,0
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 1,9 - 3,9
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 1,9 5,8 -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 2,0 4,6 -
5 Tabla J: Contenido de proteína por SE-HPLC (2-8ºC) 5 Tabla M: Valores de pH (2-8ºC) 5 Tabla P: Osmolalidad (osm/kg)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 4 sem. 6 sem. 8 sem. 12 sem. 16 sem. 26 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 64,7 64,2 66,3 63,2 66,9 66,0
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 69,8 62,2 67,3 62,1 67,6 63,1
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 62,1 64,7 66,4 63,7 65,7 64,4
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 90,7 91,5 91,8 89,1 96,8 92,5
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 92,6 97,7 99,8 87,7 92,9 92,4
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 96,1 91,8 94,3 90,4 92,8 93,5
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 94,7 100,4 95,7 91,2 93,3 90,4
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 89,0 98,6 90,6 89,0 93,3 88,8
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 94,3 99,5 88,8 100,0 91,5
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 96,9 85,2 93,3 99,6 98,2
Tabla K: Contenido de proteína por SE-HPLC (25ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 2 sem. 4 sem. 6 sem. 8 sem. 12 sem. 17 sem. 27 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 64,7 61,6 66,8 67,5 65,3 68,3 63,3 63,3
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 69,8 60,0 63,2 66,1 63,4 64,7 62,7
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 62,1 59,0 64,1 66,8 64,5 64,4 62,9
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 90,7 99,5 89,6 94,9 91,6 94,3 89,4
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 92,6 85,0 91,0 98,0 92,0 95,6 82,1
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 96,1 n,v, 90,9 96,0 94,5 94,4 91,1
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 94,7 88,4 96,1 92,7 105,0 93,5 87,8
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 89,0 88,4 94,4 94,7 89,9 91,3 88,5
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 94,3 95,3 97,8 89,7 98,6 95,2
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 96,9 100,0 100,1 92,7 103,0 92,7
Tabla L: Contenido de proteína por SE-HPLC (40ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 1 sem. 2 sem. 4 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 64,7 64,9 60,9 67,1
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 69,8 64,5 59,8 66,9
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 62,1 63,8 61,2 65,2
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 90,7 89,3 85,7 91,4
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 92,6 90,5 86,2 88,6
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 96,1 93,5 85,1 90,7
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 94,7 88,6 85,6 97,8
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 89,0 93,0 83,9 96,5
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 94,3 92,0 91,2 99,7
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 96,9 97,1 94,9 103,3
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 4 sem. 6 sem. 8 sem. 12 sem. 16 sem. 26 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,4 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,1 5,0 5,0 5,0 5,0 - 5,0
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 5,1 5,0 5,1 5,0 5,1 - 5,1
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,5 5,4 5,4 5,4 5,3 5,4
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 4,8 4,8 4,9 4,8 - 4,8 -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,2 5,3 5,2 - 5,2 -
Tabla N: Valores de pH (25ºC)
- TACI- Fc5 (mg/ ml )
- Composición tiempo 0 2 sem. 4 sem. 6 sem. 8 sem. 12 sem. 17 sem. 27 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,2 5,1 5,1 5,0 5,1 - 5,1
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 5,2 5,1 5,0 5,1 5,0 5,1 - 5,1
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,4 5,4 5,3 5,3 5,3 5,4 - 5,3
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,1 5,0 5,0 5,0 5,1 5,1 - 5,0
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 5,1 5,1 5,0 5,1 5,0 5,1 - 5,0
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,5 5,4 5,4 5,4 5,4 5,4 5,3
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 4,8 4,8 4,8 4,9 4,9 - 4,9 -
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,3 5,2 5,2 5,3 - 5,2 -
Tabla O: Valores de pH (40ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición tiempo 0 1 sem. 2 sem. 4 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,1 5,2 5,1
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 5,2 5,1 5,1 5,1
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,4 5,4 5,4 5,4
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,1 5,0 5,1 5,0
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 5,1 5,1 5,1 5,0
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,5 5,4 5,4 5,4
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,1 5,1 5,1
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 5,2 5,1 5,1 5,1
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 4,8 4,9 4,9 4,9
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 5,2 5,3 5,3 5,3
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición T=0
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 0,444
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 0,359
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 0,359
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 0,409
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 0,414
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 0,414
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 0,445
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 0,438
- 21I
- 100 pH 4,8, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 0,388
- 21L
- 100 pH 5,2, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 0,368
Tabla Q: Bioensayo (U/ml) (2-8ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición Esperado tiempo 0 4 sem. 8 sem. 13 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 350000 347704 365778 319050 387896
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 350000 336185 318012 289824 357861
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 350000 323222 333715 306941 335181
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 500000 461204 452442 431738 489743
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 500000 458617 439084 435680 470251
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 500000 455676 470037 407200 424278
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 500000 494293 543338 401277 445267
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 500000 471667 446056 387503 445371
Tabla R: Bioensayo (U/ml) (25ºC)
- TACI-Fc5 (mg/ml)
- Composición Esperado tiempo 0 4 sem. 8 sem. 13 sem.
- 21A
- 70 pH 5, Tre 96 mg/ml, F68 0,05 350000 347704 311541 279159 304644
- 21B
- 70 pH 5, Tre 80 mg/ml 350000 336185 302066 268469 342827
- 21C
- 70 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 350000 323222 315938 269441 318150
- 21D
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 500000 461204 508830 431335 418713
- 21E
- 100 pH 5, Tre 80 mg/ml 500000 458617 441768 396159 405400
- 21F
- 100 pH 5,4, Tre 80 mg/ml, F68 0,05 500000 455676 449141 387455 476384
- 21G
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml, F68 0,05 500000 494293 496542 433228 440685
- 21H
- 100 pH 5, Man 51 mg/ml 500000 471667 465114 365910 433696
5 Tabla S: Truncado del extremo C
- Muestra
- Tiempo de estabilidad Truncado
- Carga S128/L20a
- - 95,0 %
- 21E
- 8 meses 2-8°C 95,3 %
- 21E
- 8 meses 25°C 94,7 %
Tabla T: formas enlazadas
- Muestra
- Tiempo de estabilidad Pico 1 (fragmento Fc) Picos 2+3 Pico 4 (Intacto) Enlazado total
- Carga S128/L20a
- - 4,2 % 14,0 % 81,8 % 18,2 %
- 21E
- 10 meses 2-8°C 4,5 % 15,0 % 80,5% 19,5 %
- 21E
- 10 meses 25°C 8,2 % 37,5 % 54,3 % 45,7 %
[0141] A 25ºC, las formulaciones de 70 mg/ml en general mostraron pendientes menores en relación con la tasa de agregación (% de agregación/mes) que las de 100 mg/ml. En este último grupo, las formulaciones 21D y 21E 15 eran las que presentaban las menores pendientes. A 40ºC, la formulación 21E presentaba el valor más bajo de pendiente en el grupo de formulaciones líquidas de 100 mg/ml.
AUC
20 [0142] No se observó cambio en el perfil del AUC a 2-8 y 25ºC para la formulación 21E. Se detectó una tendencia hacia el aumento de monómero a lo largo del tiempo de estabilidad para las formulaciones de 70 mg/ml.
25 [0143] En el grupo de las formulaciones de 100 mg/ml, 21E era la que presentaba la Tdesp más alta. Los valores de pH diferentes de 5,0 condujeron a una menor Tdesp. Las formulaciones de 70 mg/ml presentan valores más altos de Tdesp (es decir, mayor estabilidad).
30 [0144] A 40ºC, se detectaron variaciones poco importantes en la longitud de onda de emisión máxima para las formulaciones de 70 mg/ml y, en el grupo de candidatos de 100 mg/ml, para la formulación 21E.
[0145] Se producen aumentos notables en RALS para las formulaciones a pH diferente del "óptimo" de 5, después
5 de almacenamiento a 40ºC. La dispersión de las formulaciones con manitol era considerablemente más alta que las otras. Las formulaciones 21A, 21B, 21D y 21E eran las que presentaban menores valores de dispersión. Después de almacenamiento a 2-8ºC, no mostraron ningún aumento en la luz dispersada.
10 [0146] No se observaron variaciones en la anisotropía para las formulaciones 21A y 21B después de almacenamiento a 40ºC (1 mes). Había variaciones relevantes para las formulaciones 21F y 21H. Se observaron variaciones intermedias para las otras.
[0147] A 2-8ºC, no se detectaron variaciones relevantes en la distribución de tamaños. Se observaron algunas disminuciones en el % de especies más grandes después de almacenamiento a 25ºC. No se produjeron aumentos notables de especies de mayor peso molecular después de almacenamiento a 40ºC para todas las formulaciones
20 excepto tanto para las que contenían manitol como aquellas a pH diferente de 5,0.
[0148] En el grupo de las formulaciones de 100 mg/ml, se observó mayor estabilidad termodinámica para las 25 formulaciones 21D y 21E.
[0149] No se observaron disminuciones en la bioactividad a lo largo de 3 meses a 25 y 40ºC. 30
[0150] Los estudios de precribado de las formulaciones líquidas han mostrado que el pH óptimo para la estabilización de disoluciones de TACI-Fc5 de 70 mg/ml era aproximadamente pH 5. Cuanto más altos eran los 35 valores de pH, más fuerte era el fenómeno de agregación (evaluado por SE-HPLC) y la aparición de gotas de concentración (calculado por RP-HPLC y densidad óptica). La presencia de sales (tales como NaCl, CaCl2 y MgCl2) también conduce a aumentos en los agregados. Los valores de pH menores de 5 tampoco eran óptimos, como se muestra también por los estudios conformacionales por dicroísmo circular a pH = 4,0 comparado con 5,0 en diferentes tampones. Los experimentos de DSC preliminares mostraron que la trealosa y sacarosa tenían algún
40 efecto positivo en la estabilidad de la molécula (es decir, mayores temperaturas de desplegado).
[0151] La fase de diseño experimental se dirigía a investigar el efecto de varios excipientes disueltos en tampón de acetato o histidina a pH = 5,0 (también se ensayaron diferentes concentraciones de tampón) en presencia de tensioactivos tales como Lutrol® F-68 y Tween 20. Concentraciones bajas de tampón de acetato en presencia de
45 manitol o trealosa proporcionaron las muestras con una mayor estabilidad frente a la degradación. Lutrol® F-68 parecía más eficaz que Tween 20 en la estabilización de la proteína.
[0152] Los ensayos de fluorescencia y dispersión de la luz dinámica estaban de acuerdo con dichos resultados.
50 [0153] Las muestras candidatas se fabricaron a escala de laboratorio con concentraciones de TACI-FC tanto de 70 como de 100 mg/ml. La trealosa y el manitol se usaron como excipientes (en presencia de tampón de acetato sódico a pH = 4,8, 5,0, 5,2 y 5,4). La evolución de los candidatos a lo largo del tiempo se controló por SE-HPLC y AUC junto con varias herramientas espectroscópicas.
55 [0154] A partir de este estudio, resultó que concentraciones menores de proteína conducían a menor agregación. Se confirmó que el valor de pH óptimo era 5,0. La trealosa era mejor que el manitol en la estabilización de las formulaciones de TACI-Fc. En el grupo de los candidatos de TACI-Fc de 100 mg/ml, la formulación 21E (acetato sódico 10 mM, pH = 5,0, trealosa anhidra 80 mg/ml) presentaba una mayor resistencia frente a la agregación a 40ºC (sin aumento estadísticamente significativo de la agregación detectado a 2-8ºC). Más precisamente, a 2-8ºC el candidato líquido 21E aumentó su pureza en 1,4% en 26 semanas. A 25ºC, la pureza disminuyó en solo 1% (26 semanas).
[0155] Las formas enlazadas totales del candidato 21E (10 meses a 2-8 y 25ºC) se determinaron por análisis de
5 RP-HPLC: no se produjo variación en el contenido de formas enlazadas comparado con el material de fármaco inicial (aproximadamente 19%). Se encontró que el truncado del extremo C era aproximadamente 95%, el mismo que en el material de fármaco inicial; este nivel de truncado se observa normalmente para anticuerpos humanos.
[0156] El nivel de formas oxidadas también se comprobó por análisis de RP-MALDI en el candidato líquido 21E
10 (almacenado durante 10 meses a 2-8 y 25ºC): comparado con el fármaco a partir del cual se prepara, no se observó aumento significativo en la oxidación tras almacenamiento (aproximadamente 2,4%).
EJEMPLO 2: COMPATIBILIDAD DE TACI-FC CON AGENTES BACTERIOSTÁTICOS
[0157] El objetivo de este estudio era evaluar la compatibilidad de TACI-Fc con diferentes agentes bacteriostáticos en vista de una formulación de múltiples dosis. Se ensayaron los siguientes agentes bacteriostáticos: alcohol bencílico al 0,9%; m-cresol al 0,3%; fenol al 0,5%; clorobutanol al 0,5%; feniletanol al 0,5%, alcohol bencílico al 0,3%
20 + cloruro de benzalconio al 0,001%.
Fármaco + bacteriostáticos:
- -
- Se observaron aumentos (15-70%) en los agregados totales (por SEC), después de 2 semanas de almacenamiento a 40ºC, para el fármaco en presencia de conservantes, comparado con la muestra de referencia (sin bacteriostático añadido); se observaron tasas de degradación comparables a 25ºC y 2-8ºC.
- -
- El agente bacteriostático que demostró tener la influencia menos negativa (de acuerdo con los análisis de SEC y DC) era la mezcla de alcohol bencílico + cloruro de benzalconio.
Candidato líquido + bacteriostáticos:
- -
- La adición de conservantes al candidato líquido de TACI-Fc (acetato pH 5, trealosa) conduce a aumentos de la agregación menos pronunciados (aproximadamente 10-25%, después de 2 semanas a 40ºC) que los observados para el fármaco. Esto demuestra la eficacia de la trealosa para prevenir la agregación y pérdida de la estructura
40 secundaria natural (como se pone de manifiesto por los experimentos de DC de UV lejano).
- -
- La asociación de alcohol bencílico + cloruro de benzalconio proporciona los mejores resultados, entre el grupo de formulaciones en presencia de conservantes, en términos de tasa de agregación.
[0160] Se evaluó el impacto de varios agentes bacteriostáticos en la integridad de la proteína en fármacos de TACI-Fc (fármaco natural) y en TACI-Fc formulado con 100 mg/ml formulado en acetato-Na y trealosa a pH 5.
50 [0161] La inclusión de cualquiera de los agentes bacteriostáticos afectaba negativamente a la integridad de la proteína en particular en el fármaco natural. La asociación de alcohol bencílico al 0,3% + cloruro de benzalconio al 0,001% resultó ser la menos perjudicial para la estructura de la proteína.
[0162] El objetivo del estudio era evaluar la estabilidad de la formulación líquida de TACI-Fc (Acetato-Na, trealosa, pH 5) de 100 mg/ml cargada en jeringas Hypak de 1 ml tapadas con dos tipos de émbolos de caucho (W4023/50 y W4023/50G FluroTec).
5 [0163] Los resultados se pueden resumir como sigue para TACI-Fc 100 mg/ml cargado en jeringas de vidrio de 1 ml tapadas con émbolos recubiertos (W4023/50G FluroTec) y no recubiertos (W4023/50G), ensayados hasta 6 meses:
- -
- Dímeros y HMW (alto peso molecular): la tasa de degradación era comparable a 40ºC (1,5% de aumento/semana)
10 y 25ºC (0,5% de aumento/mes). Se observó un comportamiento ligeramente diferente a 2-8ºC, aunque no impactaba significativamente en la estabilidad global: 0,2% y 0,1% de aumento/mes para dos lotes de fabricación diferentes;
- -
- Contenido de proteína: no se observó disminución del contenido de proteína tras almacenamiento;
15 - Formas enlazadas: se midió un nivel comparable de formas enlazadas frente al producto en los viales (sin aumento a 2-8ºC comparado con el fármaco, aproximadamente 40% a 25ºC después de 5 meses);
- -
- Biopotencia: la actividad biológica se retiene hasta 3 meses (2-8ºC y 25ºC) 20 - pH: no se observó desplazamiento del pH tras almacenamiento.
[0164] La formulación líquida de TACI-Fc de 100 mg/ml (tampón de acetato a pH 5 + trealosa) cargada en jeringas 25 Hypak de 1 ml era estable. Los dos tipos de émbolos de caucho (W4023/50 y W4023/50G FluroTec) evaluados en el estudio eran equivalentes y no afectaban a la estabilidad de la formulación líquida.
30 [0165] Se evaluó la estabilidad de atacicept en diferentes concentraciones en jeringas precargadas. La metodología se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.
[0166] La composición de las muestras ensayadas era la siguiente: 35
- Lote ID
- Atacicept mg/ml Tampón Trealosa dihidrato mg/ml
- Atacicept 25/1
- 25 acetato sódico 10 mM, pH 5 88,4
- Atacicept 75/1
- 75 acetato sódico 10 mM, pH 5 88,4
- Atacicept 150/1
- 150 acetato sódico 10 mM, pH 5 88,4
- Atacicept 25/1,2
- 20,5 acetato sódico 10 mM, pH 5 88,4
- Atacicept 150/1,2
- 125 acetato sódico 10 mM, pH 5 88,4
[0167] Los resultados del estudio de estabilidad se dan en las siguientes tablas U a Z Tabla U: % de pureza por SE-HPLC
- A 5 °C, después de 1, 2, 3, 6, 9, 12 y 18 meses:
- Tiempo cero
- 1 mes +5°C
- HMW+Dímero
- M LMW HMW+Dímero M LMW
- Atacicept 25/1
- 0,4 99,0 0,5 0,4 99,2 0,4
- Atacicept 75/1
- 0,5 99,0 0,5 0,6 99,1 0,3
- Atacicept 150/1
- 0,5 99,0 0,5 0,7 98,8 0,4
- Atacicept 25/1,2
- 0,5 99,1 0,4 0,5 99,1 0,4
- Atacicept 150/1,2
- 0,6 99,0 0,4 0,7 98,9 0,5
- 2 meses + 5ºC
- 3 meses +5°C
- HMW+Dímero
- M LMW HMW+Dímero M LMW
- Atacicept 25/1
- 0,4 99,2 0,4 0,4 99,1 0,5
- Atacicept 75/1
- 0,6 99,1 0,3 0,6 99,2 0,3
- Atacicept 150/1
- 0,8 98,7 0,5 1,0 98,4 0,7
- Atacicept 25/1,2
- 0,5 99,2 0,3 0,4 98,7 1,0
- Atacicept 150/1,2
- 0,7 98,8 0,5 0,6 98,9 0,6
- 6 meses + 5ºC
- 3 meses +5°C
- HMW+Dímero
- M LMW HMW+Dímero M LMW
- Atacicept 25/1
- 0,4 99,3 0,4 0,3 99,3 0,4
- Atacicept 75/1
- 0,7 99,0 0,4 0,8 98,9 0,3
- Atacicept 150/1
- 1,1 98,7 0,3 1,2 98,4 0,4
- Atacicept 25/1,2
- 0,3 99,3 0,4 0,4 99,3 0,4
- Atacicept 150/1,2
- 0,8 98,7 0,4 1,0 98,5 0,5
- 12 meses + 5ºC
- 18 meses +5°C
- HMW+Dímero
- M LMW HMW+Dímero M LMW
- Atacicept 25/1
- 0,3 99,2 0,4 0,4 99,3 0,3
- Atacicept 75/1
- 0,9 98,9 0,3
- Atacicept 150/1
- 1,3 98,2 0,5 1,9 97,8 0,4
- Atacicept 25/1,2
- 0,4 99,2 0,4 0,4 99,3 0,3
- Atacicept 150/1,2
- 1,3 98,3 0,5 1,6 97,9 0,5
- A 25 °C, después de 1, 2, 3 y 6 meses:
- Tiempo cero
- 1 mes +25°C 2 meses +25°C
- HMW+Dímero
- M LMW HMW+Dímero M LMW HMW+Dímero M LMW
- Atacicept 25/1
- 0,4 99,0 0,5 0,4 98,9 0,7 0,4 98,8 0,8
- Atacicept 75/1
- 0,5 99,0 0,5 0,9 98,5 0,6 1,4 97,8 0,8
- Atacicept 150/1
- 0,5 99,0 0,5 2,0 97,1 0,9 2,8 96,1 1,2
- Atacicept 25/1,2
- 0,5 99,1 0,4 0,4 99,0 0,6 0,3 98,8 0,9
- Atacicept 150/1,2
- 0,6 99,0 0,4 1,5 97,7 0,9 2,3 96,3 1,4
- 3 meses +25°C
- 6 meses +25°C
- HMW+Dímero
- M LMW HMW+Dímero M LMW
- Atacicept 25/1
- 0,4 98,5 1,1 0,4 98,2 1,4
- Atacicept 75/1
- 1,6 97,7 0,7 2,6 96,1 1,3
- Atacicept 150/1
- 3,7 94,8 1,5 5,8 92,1 2,1
- Atacicept 25/1,2
- 0,3 98,5 1,2 0,3 98,4 1,3
- Atacicept 150/1,2
- 2,5 96,0 1,5 4,3 94,1 1,6
Tabla V: Contenido de proteína por SE-HPLC (mg/ml)
5 5
- A 5 °C, después de 1, 2, 3, 6, 9, 12 y 18 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +5°C 2 Meses +5°C 3 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 23,9 27,9 22,7 21,9
- Atacicept 75/1
- 75,0 80,4 77,9 76,6
- Atacicept 150/1
- 150,0 165,5 160,2 161,0
- Atacicept 25/1,2
- 21,8 24,3 23,6 22,0
- Atacicept 150/1,2
- 138,1 138,4 144,9 148,5
- 6 Meses +5°C
- 9 Meses +5°C 12 Meses +5°C 18 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 25,1 24,9 26,1 25,2
- Atacicept 75/1
- 80,1 78,8 77,2
- Atacicept 150/1
- 156,5 152,0 157,9 152,1
- Atacicept 25/1,2
- 22,3 21,3 22,2 21,6
- Atacicept 150/1,2
- 136,3 134,1 132,4 126,1
- A 25 °C, después de 1, 2, 3 y 6 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +25°C 2 Meses +25°C 3 Meses +25°C 6 Meses +25°C
- Atacicept 25/1
- 23,9 28,0 21,5 21,9 25,1
- Atacicept 75/1
- 75,0 80,1 77,4 73,5 79,8
- Atacicept 150/1
- 150,0 163,8 165,5 162,8 152,2
- Atacicept 25/1,2
- 21,8 22,9 23,4 21,3 21,6
- Atacicept 150/1,2
- 138,1 141,6 137,2 147,7 128,6
- A 40 °C, después de 1, 2 y 4 semanas:
- Tiempo cero
- 1 semana +40°C 2 semanas +40°C 4 semanas +40°C
- Atacicept 75/1
- 75,0 71,7 71,9 71,8
Tabla W: Formas enlazadas (%)
- A 5 °C, después de 1, 2, 3, 6, 9, 12 y 18 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +5°C 2 Meses +5°C 3 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 11,0 12,8 12,8 12,5
- Atacicept 75/1
- 11,6 13,8 12,1 13,0
- Atacicept 150/1
- 11,5 12,3 13,5 13,1
- Atacicept 25/1,2
- 12,7 12,7 12,8 13,5
- Atacicept 150/1,2
- 12,3 13,0 12,5 14,1
- 6 Meses +5°C
- 9 Meses +5°C 12 Meses +5°C 18 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 14,1 14,7 15,4 18,4
- Atacicept 75/1
- 13,5 15,4 16,7
- Atacicept 150/1
- 14,3 16,1 16,7 19,3
- Atacicept 25/1,2
- 15,9 15,8 16,9 18,5
- Atacicept 150/1,2
- 15,4 16,5 18,6 18,7
- A 25 °C, después de 1, 2, 3 y 6 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +25°C 2 Meses +25°C 3 Meses +25°C 6 Meses +25°C
- Atacicept 25/1
- 11,0 17,5 20,1 25,8 32,8
- Atacicept 75/1
- 11,6 17,4 20,4 24,1 33,8
- Atacicept 150/1
- 11,5 18,3 21,7 26,7 35,1
- Atacicept 25/1,2
- 12,7 16,7 20,6 25,4 34,9
- Atacicept 150/1,2
- 12,3 17,1 22,1 26,7 37,3
Tabla X: % de Fc libre por IEC-HPLC
- A 5 °C, después de 1, 2, 3, 6, 9, 12 y 18 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +5°C 2 Meses +5°C 3 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- - 0,08 0,08 0,08
- Atacicept 75/1
- 0,09 0,14 0,14 0,11
- Atacicept 150/1
- - 0,09 0,09 0,10
- Atacicept 25/1,2
- 0,09 0,08 0,09 0,09
- Atacicept 150/1,2
- 0,08 0,09 0,11 0,13
- 6 Meses +5°C
- 9 Meses +5°C 12 Meses +5°C 18 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 0,18 0,13 0,12 0,12
- Atacicept 75/1
- 0,12 0,13 0,12
- Atacicept 150/1
- 0,19 0,16 0,15 0,16
- Atacicept 25/1,2
- 0,11 0,11 0,12 0,11
- Atacicept 150/1,2
- 0,13 0,17 0,15 0,16
- A 25 °C, después de 1, 2, 3 y 6 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +25°C 2 Meses +25°C 3 Meses +25°C 6 Meses +25°C
- Atacicept 25/1
- - 0,17 0,22 0,40 0,77
- Atacicept 75/1
- 0,09 0,25 0,39 0,43 0,72
- Atacicept 150/1
- - 0,20 0,32 0,52 0,87
- Atacicept 25/1,2
- 0,09 0,13 0,30 0,49 0,70
- Atacicept 150/1,2
- 0,08 0,18 0,38 0,51 0,81
Tabla Y: Actividad biológica (U/ml)
- A 5 °C, después de 1, 2, 3, 6, 9, 12 y 18 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +5°C 2 Meses +5°C 3 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 140213 137160 134504 135542
- Atacicept 75/1
- 423184 410261 379575 374383
- Atacicept 150/1
- 836070 774584 754834 819172
- Atacicept 25/1,2
- 111981 115990 126041 121648
- Atacicept 150/1,2
- 646679 642858 743090 694864
- 6 Meses +5°C
- 9 Meses +5°C 12 Meses +5°C 18 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 126923 147341 130609 108207
- Atacicept 75/1
- 363668 468484 346080
- Atacicept 150/1
- 814539 843419 809840 565084
- Atacicept 25/1,2
- 114946 123750 106004 113312
- Atacicept 150/1,2
- 645404 714223 620301 550851
- A 25 °C, después de 1, 2, 3 y 6 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +25°C 2 Meses +25°C 3 Meses +25°C 6 Meses +25°C
- Atacicept 25/1
- 140213 134212 124601 132349 118224
- Atacicept 75/1
- 423184 387654 336790 365202 327925
- Atacicept 150/1
- 836070 776645 719725 760795 677110
- Atacicept 25/1,2
- 111981 114068 117615 114296 103328
- Atacicept 150/1,2
- 646679 694993 696945 606957 586586
Tabla Z: Determinación de pH
5 EJEMPLO 5: PRODUCCIÓN DE ANTAGONISTA DE BLYS
- A 5 °C, después de 1, 2 y 3 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +5°C 2 Meses +5°C 3 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 5,0 5,0 4,9 4,9
- Atacicept 75/1
- 5,1 5,1 5,1 5,1
- Atacicept 150/1
- 5,0 5,1 5,0 4,9
- Atacicept 25/1,2
- 5,0 4,9 4,9 4,8
- Atacicept 150/1,2
- 5,0 5,0 4,9 4,9
- 6 Meses +5°C
- 9 Meses +5°C 12 Meses +5°C 18 Meses +5°C
- Atacicept 25/1
- 5,0 4,9 5,1 4,9
- Atacicept 75/1
- 5,0 5,1 5,1
- Atacicept 150/1
- 5,1 5,0 5,2 5,0
- Atacicept 25/1,2
- 4,9 4,9 5,0 5,0
- Atacicept 150/1,2
- 5,0 5,0 5,0 5,0
- A 25 °C, después de 1, 2, 3 y 6 meses:
- Tiempo cero
- 1 Mes +25°C 2 Meses +25°C 3 Meses +25°C 6 Meses +25°C
- Atacicept 25/1
- 5,0 4,9 4,9 4,9 5,0
- Atacicept 75/1
- 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1
- Atacicept 150/1
- 5,0 5,0 5,0 4,9 5,1
- Atacicept 25/1,2
- 5,0 4,9 4,9 4,8 4,9
- Atacicept 150/1,2
- 5,0 5,0 4,9 4,9 5,0
[0168] Se generaron 4 versiones truncadas amino terminales de TACI-Fc. Las 4 tenían una secuencia señal del activador tisular de plasminógeno humano modificada como se describe en el documento WO 02/094852 (SEQ ID
5 NO: 25) fusionada con el resto de aminoácido número 30 de la SEQ ID NO: 6. Sin embargo, las 4 proteínas diferían en la localización del punto en el que el "Fc5" estaba fusionado con la secuencia de aminoácidos de TACI del SEQ ID NO: 6. La tabla 1 resume las estructuras de las 4 proteínas de fusión.
Tabla 1
- Proteínas de fusión TACI-Fc
- Designación de TACI-Fc
- Restos de aminoácidos de TACI
- TACI(d1-29)-Fc5
- de 30 a 154 de SEQ ID NO: 6
- TACI(d1-29, d107-154)-Fc5
- de 30 a 106 de SEQ ID NO: 6
- TACI(d1-29, d111-154)-Fc5
- de 30 a 110 de SEQ ID NO: 6
- TACI(d1-29, d120-154)-Fc5
- de 30 a 119 de SEQ ID NO: 6
10 [0169] Se generaron casetes de expresión que codifican la proteína por superposición de PCR usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Horton y col., 1989). Se usaron una molécula de ácido nucleico que codifica TACI y una molécula de ácido nucleico que codifica Fc5 para los moldes de la PCR. Los cebadores oligonucleótidos se identifican en las tablas 2 y 3. 15 Tabla 2
- Cebadores oligonucleótidos para producir proteínas de fusión de TACI
- Designaciones de TACI-Fc
- Designaciones de oligonucleótidos
- 5' TACI
- 3' TACI 5' Fc5 3' Fc5
- TACI(d1-29)-Fc5
- ZC24,90 3 ZC24,95 5 ZC24,95 2 ZC24,94 6
- TACI(d1-29, d107-154)-Fc5
- ZC24,90 3 ZC24,95 1 ZC24,94 9 ZC24,94 6
- TACI(d1-29, d111-154)-Fc5
- ZC24,90 3 ZC28,97 8 ZC28,97 9 ZC24,94 6
- TACI(d1-29, d120-154)-Fc5
- ZC24,90 3 ZC28,98 1 ZC28,98 0 ZC24,94 6
Tabla 3
- Secuencias de oligonucleótidos
- Cebador
- Secuencia de nucleótidos SEQ ID NO
- ZC24,90 3
- 5' TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3' 15
- ZC24,95 5
- 5' TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3' 16
- ZC24,95 2
- 5' TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3' 17
- ZC24,94 6
- 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' 18
- ZC24,95 1
- 5' TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3' 19
- ZC24,94 9
- 5' ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3' 20
- ZC28,97 8
- 5' TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3' 21
- ZC28,97 9
- 5' CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 22
- ZC28,98 1
- 5' TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3' 23
- ZC28,98 0
- 5' GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 24
20 [0170] La primera amplificación por PCR consistía en dos reacciones para cada una de las cuatro versiones truncadas amino terminales. Las dos reacciones se llevaron a cabo por separado usando los oligonucleótidos 5' y 3' TACI en una reacción, y los oligonucleótidos 5' y 3' Fc5 en otra reacción, para cada versión. Las condiciones de la primera serie de amplificaciones por PCR eran las siguientes. A un volumen final de 25 μl se añadieron aproximadamente 200 ng de ADN molde, 2,5 μl de 10x tampón de reacción de Pfu (Strategene), 2 μl de dNTP 2,5
25 mM, 0,5 μl de cada uno del oligonucleótido 5' y oligonucleótido 3' 20 μM y 0,5 μl de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistía en 94ºC durante 3 min, 35 ciclos a 94ºC durante 15 s, 50ºC durante 15 s, 72ºC durante 2 min, seguido por una extensión de 2 min a 72ºC. Los productos de reacción se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa, y las bandas correspondientes a los tamaños previstos se cortaron del gel y se recuperaron usando un kit de extracción de gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen), de acuerdo con las
30 instrucciones del fabricante.
[0171] La segunda amplificación por PCR, o reacción de amplificación de superposición de PCR, se llevó a cabo usando fragmentos purificados de gel de la primera PCR como molde de ADN. Las condiciones de la segunda amplificación por PCR eran las siguientes. A un volumen final de 25 μl se añadieron aproximadamente 10 ng de ADN molde de cada uno del fragmento de TACI y fragmento de Fc5, 2,5 μl de 10x tampón de reacción de Pfu (Strategene), 2 μl de dNTP 2,5 mM, 0,5 μl de cada uno de ZC24, 903 (SEQ ID NO: 15) y ZC24, 946 (SEQ ID NO:
5 18) 20 μM y 0,5 μl de Pfu polimerasa (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistía en 94ºC durante 1 min, 35 ciclos a 94ºC durante 15 s, 55ºC durante 15 s, 72ºC durante 2 min, seguido por una extensión de 2 min a 72ºC. Los productos de reacción se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa, y las bandas correspondientes a los tamaños previstos se cortaron del gel y se recuperaron usando un kit de extracción de gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10 [0172] Cada una de las 4 versiones de los productos de PCR de TACI-Fc truncados en el amino terminal se clonaron por separado usando el kit de clonación ZEROBLUNT TOPO PCR de Invitrogen, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La tabla 4 identifica las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de estas construcciones de TACI-Fc.
15 Tabla 4
- Secuencias de variantes de TACI-Fc
- Designación de TACI-Fc
- SEQ ID Nº
- Nucleótidos
- Aminoácidos
- TACI(d1-29)-Fc5
- 7 8
- TACI(d1-29, d107-154)-Fc5
- 9 10
- TACI(d1-29, d111-154)-Fc5
- 11 12
- TACI(d1-29, d120-154)-Fc5
- 13 14
[0173] Después de verificar las secuencias de nucleótidos, los plásmidos que comprendían cada una de las cuatro versiones de las fusiones de TACI-Fc truncadas en el amino terminal, se digirieron con FseI y AscI para liberar los
20 segmentos que codifican aminoácidos. Los fragmentos FseI-AscI se ligaron en un vector de expresión de mamífero que contenía un promotor de CMV y un segmento SV40 poliA. Se introdujeron vectores de expresión en células de ovario de hámster chino como se describe a continuación.
EJEMPLO 6: PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS TACI-FC POR CÉLULAS DE OVARIO DE HÁMSTER CHINO
25 [0174] Se usaron las construcciones de expresión de TACI-Fc para la transfección por electroporación de células DG44 de ovario de hámster chino (CHO) adaptadas a suspensión, cultivadas en medio exento de proteínas animales (Urlaub y col., 1986). Las células de CHO DG44 carecen de un gen funcional de dihidrofolato reductasa debido a eliminaciones en ambas localizaciones cromosómicas de dihidrofolato reductasa. El cultivo de las células
30 en presencia de concentraciones crecientes de metotrexato produce la amplificación del gen de la dihidrofolato reductasa, y la proteína recombinante codificada por el gen unido en la construcción de expresión.
[0175] Las células CHO DG44 se pasaron en medio PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-glutamina 4 mM (JRH Biosciences), y 1x complemento de hipoxantina-timidina (Life Technologies), y las células se incubaron a 37ºC 35 y CO2 al 5% en matraces de agitación Corning a 120 rpm en una plataforma de agitador giratorio. Las células se transfectaron por separado con plásmidos de expresión linearizados. Para asegurar la esterilidad, se llevó a cabo una sola etapa de precipitación con etanol sobre hielo durante 25 min, combinando 200 μg de ADN plasmídico en un tubo Eppendorf con 20 μl de ADN vehículo de esperma de salmón fraccionado (5’ - 3’ Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22 μl de NaOAc 3 M (pH 5,2), y 484 μl de etanol al 100% (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Después de
40 incubación, el tubo se centrifugó a 14.000 rpm en una microfuga puesta en una habitación fría a 4ºC, se separó el líquido sobrenadante y el sedimento se lavó dos veces con 0,5 ml de etanol al 70% y se dejó secar al aire.
[0176] Las células CHO DG44 se prepararon mientras el sedimento de ADN se secaba por centrifugación de 106 células totales (16,5 ml) en un tubo de centrífuga cónico de 25 ml a 900 rpm durante 5 min. Las células CHO DG44 45 se volvieron a suspender en un volumen total de 300 μl de medio de crecimiento PFCHO, y se pusieron en una cubeta Gene-Pulser con una separación de electrodos de 0,4 cm (Bio-Rad). El ADN, después de aproximadamente 50 min de tiempo de secado, se volvió a suspender en 500 μl de medio de crecimiento PFCHO y se añadió a las células en la cubeta de modo que el volumen total no superaba 800 μl y se dejó depositar a temperatura ambiente durante 5 min para disminuir la formación de burbujas. La cubeta se puso en una unidad Gene Pulser II de BioRad a
50 0,296 kV (kilovoltios) y 0,950 HC (alta capacitancia) y se electroporó inmediatamente.
[0177] Las células se incubaron 5 min a temperatura ambiente antes de ponerlas en un volumen total de 20 ml de medio PFCHO en un matraz T-75 CoStar. El matraz se puso a 37ºC y CO2 al 5% durante 48 h y después se contaron las células con un hemocitómetro usando exclusión con tinta azul de trypan y se pusieron en medio de selección PFCHO sin complemento de hipoxantina-timidina y que contenía metotrexato 200 mM (Cal Biochem).
5 [0178] Después de recuperación del procedimiento de selección con metotrexato, el medio condicionado que contenía las proteínas TACI-Fc secretadas se examinó por análisis de transferencia Western.
REFERENCIAS 10
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<150> EP 07120489.5
<151> 2007-11-12
<150> EP 07120490.3
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<151> 2008-03-27
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5 20 <210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1 25
<210> 2
- <211>
- 232 5 <212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 313
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
<210> 4
- <211>
- 762 5 <212> ADN
<213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (7)..(759) 10 <400> 4
<210> 5
<211> 251
<212> PRT
<213> homo sapiens 5 <400> 5
<210> 6
<211> 293
<212> PRT 5 <213> homo sapiens
<400> 6 <210> 7
<211> 1214
5 <212> ADN
<213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (17) .. (1192) 10 <400> 7
<210> 8
<211> 392 5 <212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 1070
<212> ADN 5 <213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (17) .. (1048)
<400> 9 10
<210> 10
- <211>
- 344 5 <212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 10
<210> 11
- <211>
- 1082 5 <212> ADN
<213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (17) .. (1060)
<400> 11
<210> 12
- <211>
- 348 5 <212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 12
<210> 13
- <211>
- 1109 5 <212> ADN
<213> homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (17) .. (1090) 10 <400> 13
<210> 14
- <211>
- 357 5 <212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 14
<210> 15
- <211>
- 29 5 <212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 15 10
<210> 16
<211> 29 15 <212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 16
<210> 17
<211> 29
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 17
<210> 18
<211> 36
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 18
<210> 19
<211> 30
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 19
<210> 20
<211> 31
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 20
<210> 21
<211> 30
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 21
<210> 22
<211> 28
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 22 <210> 23
<211> 26
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 23
<210> 24
<211> 28
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
<400> 24
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de péptido señal modificado
<400> 25
Claims (20)
- REIVINDICACIONES1. Una formulación que comprende:a) Proteína de fusión TACI-inmunoglobulina (TACI-Ig) que comprende:i. el dominio extracelular de TACI o un fragmento o una variante del mismo que se une a BlyS y/o APRIL; yii. un dominio constante de inmunoglobulina;b) un tampón de acetato que tampona la formulación a un pH en el intervalo entre 4,9 y 5,1; yc) trealosa en una concentración en el intervalo de 600 a 100 mg/ml.
-
- 2.
- La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho tampón de acetato está en una concentración de 5 a 25 mM.
-
- 3.
- La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho tampón de acetato está en una concentración 10 mM.
-
- 4.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho tampón de acetato es tampón de acetato sódico.
-
- 5.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene un pH de 5,0.
-
- 6.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la trealosa está en una concentración de 80 mg/ml.
-
- 7.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína de fusión TACI-Ig está comprendida en una concentración entre 20 y 180 mg/ml.
-
- 8.
- La formulación de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha proteína de fusión TACI-Ig está en una concentración de 70, 75, 100, 125 ó 150 mg/ml.
-
- 9.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho fragmento del dominio extracelular de TACI comprende los restos de aminoácidos de 34 a 66 y/o los restos de aminoácidos de 71 a 104 de la SEQ ID NO: 1.
-
- 10.
- La formulación de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho fragmento del dominio extracelular de TACI comprende los restos de aminoácidos de 30 a 110 de la SEQ ID NO: 1, o una variante de los mismos que son al menos 90% idénticos a los mismos, o que tienen menos de 10 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
-
- 11.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho dominio constante de inmunoglobulina comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que comprende menos de 20 sustituciones de aminoácidos conservativas.
-
- 12.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína de fusión TACI-Ig comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3, o una variante de la misma que es al menos 90% idéntica a la misma, o que tiene menos de 30 sustituciones de aminoácidos conservativas, uniéndose la variante a BlyS y/o APRIL.
-
- 13.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una combinación de alcohol bencílico y cloruro de benzalconio.
-
- 14.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la formulación está en forma líquida.
-
- 15.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la formulación es para la administración de múltiples dosis.
- 16. La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la 5 formulación comprende:dicha proteína de fusión TACI-Ig en una concentración comprendida entre 70 y 180 mg/ml; trealosa en una concentración comprendida entre 60 y 100 mg/ml; y tampón de acetato sódico en una concentración 10 mM.
-
- 17.
- La formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para usar en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad linfoproliferativa.
-
- 18.
- Un procedimiento para preparar la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
15 16, que comprende la etapa de mezclar la proteína de fusión TACI-Ig, tampón de acetato y trealosa en una concentración en el intervalo de 60 a 100 mg/ml, y ajustar el pH en el intervalo de 4,9 a 5,1. - 19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, que además comprende la etapa de poner unacantidad predeterminada de la formulación en un recipiente estéril. 20
- 20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el recipiente estéril se selecciona de un vial de vidrio o una jeringa precargada.
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