KR20080071192A

KR20080071192A - 면역글로불린 융합 단백질 제형

Info

Publication number: KR20080071192A
Application number: KR1020087015109A
Authority: KR
Inventors: 안토니 배리; 토마스 크로울리; 다니엘 딕슨; 제니퍼 주노; 아제이 쿠마; 리 리; 니콜라스 룩사; 마이클 사마스킨; 에린 솔리; 니콜라스 원; 찬드라 웹
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2005-11-22
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2008-08-01
Also published as: EP1951305A1; BRPI0618893A2; CN101312744A; WO2007062040A1; CA2630115A1; CR10012A; ECSP088459A; NO20082133L; SV2009002911A; JP2009516692A; AU2006318583A1; US20110033464A1; RU2008118166A; US20070237758A1

Abstract

본 발명은 Ig 융합 단백질의 조성물, 특히 Ig 융합 단백질, 충전제, 디사카라이드, 표면활성제 및 완충제를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 측면에서, 이러한 조성물들은 장기간의 저장 또는 1회 이상의 동결/해동 주기에서 안정하다. 본 발명은 또한 Ig 융합 단백질 조성물의 제조방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된다. 추가의 측면에서, 조성물은 어닐링 단계를 포함하는 과정에 의해 동결건조된다.

Ig 융합 단백질 조성물, 어닐링 단계, 동결건조

Description

면역글로불린 융합 단백질 제형{Immunoglobulin fusion protein formulations}

본 출원은 본원에 참조로 인용된, 2005년 11월 22일자로 출원된 미국 특허원 제60/739,271호에 대한 우선권을 청구한다.

본 발명은 단백질 제형 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 면역글로불린(Ig) 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

생명공학에 있어서의 발전으로 약제 적용을 위한 광범위한 각종 단백질을 제조하는 것이 가능해졌다. 제조 후, 단백질 약제는 흔히 사용전에 저장되어야 한다. 단백질이 "전통적" 약제보다 일반적으로 더 크고 더 복잡하다는 일부 사실로 인하여, 저장에 적합한 단백질 약제의 제형 및 가공은 특히 관심을 불어 일으킬 수 있다. 단백질 약제 제형 및 가공 설계에 대한 문헌은 다음을 참조한다: Carpenter et al., Pharmaceutical Research 14:969-975 (1997); Wang, International Journal of Pharmaceutics 203:1-60 (2000); and Tang and Pikal, Pharmaceutical Research 21:191-200 (2004).

몇가지 인자들이 단백질 약제 제조를 위한 제형 및 과정을 설계하는데 있어 고려될 수 있다. 주요 관심은 조성물의 제조, 동결, 건조, 저장, 선적, 재구성, 동결/해동 주기, 및 최종 사용자에 의한 재구성 후 저장을 포함할 수 있는, 어떠한 또는 모든 제조, 선적 및 취급 단계에 걸친 단백질의 안정성이다. 다른 강력한 고려대상은 제조, 취급 및 배급의 용이성 및 경제성; 환자 투여용 최종 생성물의 조성; 및 재구성시 동결건조된 제형의 가용성을 포함하는, 최종 사용자에 의한 사용 용이성을 포함한다.

액제 제형은 특정 대상자를 만족시킬 수 있다. 액제 제형의 가능한 장점은 제조 용이성 및 경제성, 및 최종 사용자에 대한 편의성을 포함한다.

동결건조된 제형은 또한 특정의 장점을 제공할 수 있다. 동결건조의 강력한 이점은 단백질 안정성 증진, 및 선적 및 저장의 용이성과 경제성을 포함한다.

조성물의 기본 형태(예를 들면, 동결건조된 형태, 액체, 동결된 형태 등)의 선택외에, 단백질 제형의 최적화는 통상적으로 단백질 안정성을 극대화시키기 위한 제형의 성분들의 변화 및 이들 성분들 각각의 농도를 포함한다. 이온 강도, pH, 온도, 동결/해동 주기, 전단력(shear force), 동결, 건조, 교반 및 재구성을 포함하는 다양한 인자들이 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 불안정성은 물리적 분해(예를 들면, 변성, 응집 또는 침전) 또는 화학적 분해(예를 들면, 탈아미드화, 산화 또는 가수분해)에 의해 유발될 수 있다. 제형 성분들 및 농도의 최적화는 불안정성의 근원을 극복하기 위한 실험적 연구 및/또는 합리적 시도를 포함할 수 있다.

따라서, 각종 단백질의 안정한 저장을 허용하고 다양한 부류의 단백질 약제, 및 특히, 면역글로불린(Ig) 융합 단백질에 적합한 제형의 제공이 요구되고 있다.

개요

본 발명은 적어도 일부는 장기간의 저장 동안 및/또는 하나 이상의 동결/해동 주기 후에도 충분히 안정한 Ig 융합 단백질을 함유하는 특정 조성물의 발견에 기초한다. 본 발명은 Ig 융합 단백질 및 적어도 다음 4개의 비-단백질성 성분: (1) 충전제(bulking agent), (2) 디사카라이드, (3) 표면활성제, 및 (4) 완충제를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 당해 조성물은 NaCl을 추가로 포함한다. 당해 조성물은 아르기닌 또는 시스테인을 함유하지 않는다.

Ig 융합 단백질은 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들면, 미국 특허 제5,516,964호, 제5,225,538호, 제5,428,130호, 제5,514,582호, 제5,714,147호, 제5,455,165호 및 제6,136,310호에 기술되어 있다. 일부 양태에서, Ig 융합 단백질은 산성이며, 예를 들어, Ig 융합 단백질의 pI는 6.0 미만이다. 예시적인 양태에서, 산성 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig, GP1b-Ig, IL-13R-Ig, 및 IL-21R-Ig이다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질은 고도로 산성이며, 예를 들어, Ig 융합 단백질의 pI는 4.0 미만이다. 예시적인 양태에서, 고도로 산성인 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig이다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질의 비-Ig 부위는 사이토킨 수용체, 예를 들면, 인터루킨 수용체이다. 예시적인 양태에서, 사이토킨 수용체는 IL-13R 및 IL-21R이다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질의 비-Ig 부위는 설페이트화, 포스포릴화 및/또는 글리코실화되어 있다. 예시적인 양태에서, 설페이트화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig 및 GP1b-Ig이다. 예시적인 양태에서, 글리코실화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig, GP1b-Ig 및 IL-13R-Ig이다. 일부 양태에서, 글리코실화된 Ig 융합 단백질은 푸코실화 및/또는 시알릴화되어 있다. 예시적인 양태에서, 푸코실화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig 및 GP1b-Ig이다. 예시적인 양태에서, 시알릴화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig, GP1b-Ig 및 IL-13R-Ig이다.

충전제의 예시적인 예는 글리신 및 만니톨이다. 예시적인 디사카라이드는 슈크로즈 및 트레할로즈를 포함한다. 표면활성제의 예시적인 예는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80이다. 완충제의 예시적인 예는 아민 및 포스페이트 완충액이다. 아민계 완충제의 예시적인 예는 히스티딘 및 트로메타민(트리스)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 조성물의 성분들은 규정된 농도 범위로 존재한다. 일부 양태에서, 모두 각각 서로 독립적으로, 단백질의 농도는 0.025 내지 60mg/ml이고; 충전제의 농도는 0.5 내지 5%이며; 디사카라이드의 농도는 0.5 내지 5%이고; 표면활성제의 농도는 0.001 내지 0.5%이다. 일부 양태에서, NaCl의 농도는 1 내지 200mM NaCl이다. 특정 양태에서, NaCl의 농도는 35mM 미만이다. 특정 양태에서, 약제학적 조성물은 1 내지 4%의 충전제, 0.5 내지 2%의 디사카라이드, 및 0.005 내지 0.02%의 표면활성제를 포함한다. 예시적인 양태에서, 조성물은 2% 충전제, 1% 디사카라이드, 및 0.01% 표면활성제를 포함한다.

본 발명은 또한 제형의 물리적 상태에 관한 것이다. 본 발명은 액제, 동결, 동결건조 및 재구성된 제형을 제공하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 본 발명의 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 당해 방법은, 조성물을 어닐링 단계(annealing step)를 포함하는 과정에 의해 동결건조시킴을 포함한다.

상기 발명의 개요 및 후속되는 상세한 설명은 단지 예 및 설명이며, 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.

도 1은 14회의 동결/해동 주기 후 GP1b-Ig 제형에서 단백질 응집 및 단백질 회수율에 대한 폴리소르베이트-80의 효과를 나타낸다. GP1b-Ig는 20mM 트리스 pH 7.2, 50mM NaCl, 및 0%, 0.005%, 0.01% 또는 0.02% 폴리소르베이트-80 속에서 2mg/mL로 제형화되었다. 각각의 제형의 바이알은 14회 이하의 동결/해동 주기에 적용되며 SEC-HPLC에 의해 고분자량(HMW) 물질 %에 대해 분석되었다. 단백질 회수율은 280 및 214nm에서의 HPLC 검출기 신호에 의해 모니터링되었다. X축은 동결/해동 주기의 수를 나타낸다. Y축은 HMW %를 나타낸다.

본 발명은 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 적어도 부분적으로는, Ig 융합 단백질, 완충제, 디사카라이드, 충전제, 및 표면활성제를 포함하는 조성물이 장기간의 저장 및/또는 하나 이상의 동결/해동 주기에 충분히 안정하다는 발견에 기초한다. 본 발명은 또한 Ig 융합 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

Ig 융합 단백질

본 발명은 면역글로불린(Ig) 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

Ig 융합 단백질은 면역글로불린의 고정 영역으로부터 기원한 (b) Ig 부위에 연결된 (a) 비-Ig 부위를 포함하는 단백질이다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질은 산성인데, 예를 들어, Ig 융합 단백질은 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0 또는 2.5 미만의 등전점(pI)을 갖는다. 예시적인 양태에서, 예를 들어, 산성 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig, GP1b-Ig, IL-13R-Ig 및 IL-21R-Ig이다. 단백질의 등전점은 이의 전체 전하가 0인 pH이다. 목적 단백질의 등전점을 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 단백질의 아미노산 서열을 기초로 한 이론적 계산 및 등전점 포커싱(IEF)에 의한 pI의 직접적인 측정을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다[참조: Skoog, B. and Wichman, A., Trends Anal. Chem. 5:82-83 (1986); Patrickios, CS. and Yamasaki, E.N., Anal. Biochem., 231:82-91 (1995); Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Third Edition, p. 171 (1994)].

일부 양태에서, Ig 융합 단백질은 고도로 산성인데, 예를 들어, Ig 융합 단백질의 pI는 4.0, 3.5, 3.0 또는 2.5 미만이다. 예시적인 양태에서, 고도로 산성인 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig이다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질의 비-Ig 부위는 수용체, 예를 들면, 사이토킨 수용체로부터 기원한다. 예시적인 양태에서, 사이토킨 수용체는 인터루킨 수용체이다. 예시적인 양태에서, 사이토킨 수용체는 IL-13R 및 IL-21R이다. 다른 사이토킨 수용체, 예를 들면, 문헌(참조: Cytokine Reference, vol. 2: Receptors, eds. Oppenheim & Feldman, Academic Press, 2001)에 기술된 사이토킨 수용체를 사용할 수 있다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질은 설페이트화, 포스포릴화 및/또는 글리코실화된 비-Ig 부위를 포함한다. 예시적인 양태에서, 설페이트화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig 및 GP1b-Ig이다. 예시적인 양태에서, 글리코실화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig, GP1b-Ig 및 IL-13R-Ig이다. 일부 양태에서, 글리코실화된 Ig 융합 단백질은 푸코실화 및/또는 시알릴화되어 있다. 예시적인 양태에서, 푸코실화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig 및 GP1b-Ig이다. 예시적인 양태에서, 시알릴화된 Ig 융합 단백질은 PSGL-Ig, GP1b-Ig 및 IL-13R-Ig이다. 단백질의 설페이트화, 포스포릴화 및 글리코실화를 검출하고 분석하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 문헌[참조: Posttranslational Modifications of Proteins: Tools for Functional Proteomics (Methods in Molecular Biology), Christoph Kannicht Ed. (2002)]에 기술되어 있다.

일부 양태에서, Ig 융합 단백질의 Ig 부위는 사람, 쥐 또는 기타 종의 면역 글로불린, 예를 들면, IgG(IgG₁, IgG₄, 또는 다른 IgG 동형)의 Fc 도메인으로부터 기원하며, 천연적으로 존재하는 Ig 서열, 및 이러한 서열의 돌연변이 및 변형의 작용 부위를 포함한다. 각종 Fc 도메인의 서열은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌(참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, eds. Kabat et al., 1991)에서 제공된다. Ig 부위는 특정의 Fc 도메인의 다음 중 하나 또는 모든 부위를 함유할 수 있다: CH1, CH2, CH3, 및 힌지 영역(hinge region). 예를 들어, Fc 도메인은 CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함하나, CH1은 포함하지 않는다.

또한, Ig 융합 단백질은 비-Ig 및 Ig 부위를 결합하는 링커를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 본 발명의 조성물 중 Ig 융합 단백질의 농도는 100mg/ml 미만, 90mg/ml 미만, 80mg/ml 미만, 70mg/ml 미만, 60mg/ml 미만, 50mg/ml 미만, 40mg/ml 미만, 30mg/ml 미만, 20mg/ml 미만, 15mg/ml 미만, 10mg/ml 미만, 또는 5mg/ml 미만이다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물 중 Ig 융합 단백질의 농도는 다음 범위에서 선택된다: 약 0.025 내지 약 60mg/ml, 약 0.025 내지 약 40mg/ml, 약 0.025 내지 약 20mg/ml 또는 약 0.025 내지 약 10mg/ml. 예시적인 양태에서, Ig 융합 단백질의 농도는 약 10mg/ml이다.

완충제

본 발명의 조성물은, 부분적으로 pH를 바람직한 범위로 유지시키기 위해 제공되는 완충제를 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트 및 아민 완충제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 포스페이트 완충제는, 예를 들면, 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트일 수 있다. 아민 완충제는 예를 들면, 히스티딘, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄("트리스"), 또는 디에탄올아민일 수 있다.

본 발명의 조성물 중 완충제의 농도는 다음 범위에서 선택될 수 있다: 약 1 내지 약 1000mM, 약 1 내지 약 200mM, 약 1 내지 약 100mM, 약 1 내지 약 50mM, 약 1 내지 약 40mM, 약 1 내지 약 30mM, 약 1 내지 약 20mM 또는 약 1 내지 약 10mM. 예시적인 양태에서, 조성물 중 완충제의 농도는 약 10mM이다.

본 발명의 조성물의 pH는 다음 범위에서 선택될 수 있다: 4 내지 10, 5 내지 9, 바람직하게는, 6 내지 8. 환자 불만족도는 주사된 조성물의 pH를 생리학적 수준에 근접하게 조정함으로써 최소화시킬 수 있다. 이를 위해서는, 약제학적 조성물의 pH가 약 5.8 내지 약 8.4, 또는 보다 바람직하게는 약 6.2 내지 약 7.4인 것이 바람직하다. 이러한 범위 내외의 통상의 pH 조정은 폴리펩타이드 또는 조성물의 다른 성분들의 가용성 또는 안정성을 증진시키기 위해 필수적일 수 있다.

디사카라이드

본 발명의 조성물은 또한 디사카라이드를 포함한다. 바람직하게는, 디사카라이드는 비-환원 당, 예를 들면, 슈크로즈 또는 트레할로즈이다. 특정의 양태에서, 조성물내 디사카라이드의 농도는 다음 범위에서 선택된다: 0.5 내지 5%, 0.5 내지 4%, 0.5 내지 3%, 0.5 내지 2.5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1.5%, 0.5 내지 1 %, 1 내지 1.5%, 1.5 내지 2%, 2 내지 2.5%, 2.5 내지 3%, 3 내지 4%, 4 내지 5%, 또는 5% 이상. 특정 양태에서, 조성물 중 디사카라이드의 농도는 약 0.5 내지 5%, 예를 들면, 약 0.5 내지 2.0%이다. 예시적인 양태에서, 디사카라이드의 농도는 0.9 또는 1.0%이다.

하나의 측면에서, 디사카라이드는 동결동안 단백질을 안정화시키기 위해 제공된다. 동결동안의 보호는 디사카라이드의 절대 농도에 의존할 수 있으며[참조: Carpenter et al., Pharmaceutical Research 14:969-975 (1997)], 5% 초과의 농도가 안정성을 극대화시키는데 필수적일 수 있다.

하나의 측면에서, 디사카라이드는 건조 동안 단백질을 안정화시킨다. 건조동안 보호는 디사카라이드 및 단백질간의 최종 질량비에 의존할 수 있다[참조: Carpenter et al., Pharmaceutical Research 14:969-975 (1997)]. 따라서, 일부 양태에서, 디사카라이드의 농도는 디사카라이드 대 단백질의 바람직한 질량비, 통상적으로 1:1 이상을 달성하기 위해 선택된다. 일부 양태에서, 안정성은 디사카라이드:단백질 질량비가 약 5:1일 때 최적화된다. 다른 양태에서, 디사카라이드:단백질 질량비는 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1 또는 1000:1 보다 크다.

디사카라이드는 동결보호제(lyoprotectant) 또는 동결방지제(cryoprotectant)로서 작용할 수 있다. "동결보호제"는 동결 및 후속적인 저장시 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정성을 방지하거나 또는 감소시키는 물질을 포함한다. 하나의 측면에서, 동결보호제는 단백질내 화학적 또는 물리적 불안정성을 방지하거나 또는 감소시키는데, 이는, 물이 건조 과정 동안에 조성물로부터 제거되기 때문이다. 추가의 측면에서, 동결보호제는 수소 결합을 통해 단백질의 적절한 형태를 유지하는데 도움을 줌으로써 단백질을 안정화시킨다.

"동결방지제"는 제조, 동결, 저장, 취급, 분포, 재구성 또는 사용동안 동결된 단백질의 안정성을 제공하는 물질을 포함한다. 특정 측면에서, "동결방지제"는 동결 과정에 의해 유발된 스트레스로부터 단백질을 보호하는 물질을 포함한다. 동결방지제는 동결보호제 효과를 가질 수 있다.

충전제

본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 다음의 충전제를 포함한다: 글리신 및 만니톨. 충전제는 동결건조된 케이크의 질량 및 물리적 구조에 기여하기 위해 제공된다. 하나의 측면에서, 충전제는 우아한 케이크의 제형에 기여한다. 보다 상세하게, 충전제는 심미적으로 허용되거나, 단일형의 또는 기계적으로 강한 케이크의 형성을 증진시킨다. 충전제는 또한 개방 공극 구조의 형성 및 재구성의 용이성 및 속도를 증진시킨다. 충전제는 또한 케이크 붕괴, 공융 용융 또는 잔류 수분의 보유를 감소시키거나 또는 방지한다. 다른 측면에서, 충전제는 스트레스(예를 들면, 물리적 및 화학적 스트레스)에 대해 단백질을 보호하는데 도움을 주며 단백질 활성을 유지하는데 도움을 준다.

특정 양태에서, 조성물중 충전제의 농도는 다음 범위에서 선택된다: 0.5 내지 1%, 1 내지 1.5%, 1.5 내지 2%, 2 내지 2.5%, 2.5 내지 3%, 3 내지 3.5%, 3.5 내지 4%, 4 내지 4.5%, 4.5 내지 5%, 5% 이상, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 4%, 0.5 내지 3%, 0.5 내지 2.5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1.5%, 또는 0.5 내지 1%. 특정 양태에서, 조성물 중 충전제의 농도는 0.5 내지 5%, 예를 들면, 0.5 내지 3%, 심지어 보다 상세하게는 1.8 내지 2%이다.

표면활성제

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 또한 표면활성제를 포함한다. 하나의 측면에서, 표면활성제는 계면(예를 들면, 공기/용액 계면 또는 용액/표면 계면)에서 유발된 스트레스로부터 단백질을 보호한다. 하나의 양태에서, 표면활성제는 응집을 방지하거나 또는 감소시킨다. 표면활성제는 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트-20 또는 폴리소르베이트-80과 같은 세제, 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체를 포함한다. 각종 표면활성제가 문헌(예를 들면, 미국 특허 제6,685,940호, 컬럼 16, 10 내지 35행)에 공지되어 있다. 예시적인 양태에서, 표면활성제는 야채-기원 폴리소르베이트-80이다.

특정 양태에서, 조성물 중 표면활성제의 농도는 0.001 내지 0.5%, 0.001 내지 0.2%, 0.001 내지 0.1%, 0.001 내지 0.05%, 0.001 내지 0.01%, 또는 0.001 내지 0.005%이다. 예시적 양태에서, 조성물 중 표면활성제의 농도는 0.005 내지 0.01%이다.

기타 성분들

조성물은 또한 추가의 약제학적으로 허용되는 성분들을 포함할 수 있다. 적합한 추가의 성분들은 추가의 강직성 조절제 및 당해 분야에 공지된 기타 부형제를 포함한다.

강직성 조절제는 조성물의 삼투압에 기여하는 물질이다. 사람 혈청의 삼투압은 약 300±50mOsM/kg이다. 단백질 안정성을 유지하고 환자 불만도를 최소화시키기 위해서, 일반적으로 약제학적 조성물이 등장성, 예를 들면, 사람 혈청과 대략적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 조성물의 삼투압은 바람직하게는 180 내지 420mOsM/kg이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는, 조성물의 삼투압이 특정 조건이 요구되는 한 보다 높거나 또는 낮을 수 있음을 이해할 것이다. 다양한 강직성 조절제가 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허원 제20030180287호의 0047 단락). 완충제, 디사카라이드, 충전제 및 표면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 조성물의 다른 성분들도 또한 조성물의 삼투압에 기여할 수 있다.

부형제는 화학 첨가제, 공-용질 및 공-용매를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 부형제는 단백질의 안정성에 기여하나, 부형제가 또한 조성물의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성에 기여할 수 있음은 이해되어야 한다. 각종 부형제가 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 미국 특허원 제20030180287호의 0048 내지 0049 단락).

일부 양태에서, 조성물은 또한 염화나트륨을 포함한다. 특정 양태에서, 조성물을 1 내지 200mM, 또는 50mM 미만, 40mM 미만, 35mM 미만, 30mM 미만, 25mM 미만, 20mM 미만, 15mM 미만, 10mM 미만, 또는 5mM 미만의 NaCl을 포함한다. 특정 조건하에서, NaCl은 동결건조동안 장애를 유발할 수 있거나 또는 재구성된 동결건조물에 있어서 단백광(opalescence)의 외형을 초래할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 조성물은 NaCl을 포함하지 않는다.

조성물의 특정 성분들은 당해 분야에 공지된 대체물로 상호교환될 수 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은, 또한 화학적 상용성, pH, 강직성 및 안정성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 이유로 인하여, 특정 성분들의 혼입이 기타 성분들의 사용, 농도, 또는 약제학적 조성물의 제조 방법을 제외시킬 것으로 이해할 것이다.

본 발명의 조성물은 아르기닌 또는 이의 염, 또는 시스테인 또는 이의 염을 0.5mM 이하, 0.1mM, 0.01mM, 또는 검출가능하지 않은 수준으로 함유하거나, 또는 전혀 함유하지 않는다. 이들 화합물은 조성물을 제조하는데 가해지지 않거나, 또는 조성물 중에 이러한 한계 이상으로 검출될 수 없다. 이들 제한은 폴리펩타이드내에 존재하는 아르기닌 및/또는 시스테인과는 대조적으로 유리 아미노산 및 이들의 염에만 적용된다.

예시적 양태

일부 양태에서, 약제학적 조성물은 필수적으로 Ig 융합 단백질, 완충제, 디사카라이드, 충전제, 및 표면활성제로 이루어진다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 Ig 융합 단백질, 완충제, 디사카라이드, 충전제 및 표면활성제를 포함한다.

하나의 예시적인 양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 Ig 융합 단백질, 1mM 내지 1M의 완충제, 0.5 내지 5%의 디사카라이드, 0.5 내지 5%의 충전제 및 0.001 내지 0.5%의 표면활성제를 포함한다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 Ig 융합 단백질, 1mM 내지 1M의 완충제, 0.5 내지 5%의 디사카라이드, 0.5 내지 5%의 충전제, 0.001 내지 0.5%의 표면활성제, 및 1 내지 200mM의 NaCl을 포함한다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 Ig 융합 단백질, 1mM 내지 1M의 완충제, 0.5 내지 5%의 디사카라이드, 0.5 내지 5%의 충전제, 0.001 내지 0.5%의 표면활성제, 35mM 미만의 NaCl을 포함한다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 Ig 융합 단백질, 1mM 내지 1M의 완충제, 0.5 내지 5%의 디사카라이드, 0.5 내지 5%의 충전제, 및 0.001 내지 0.5%의 표면활성제를 포함하며, NaCl을 포함하지 않는다.

하나의 예시적인 양태에서, 약제학적 조성물은 0.025 내지 20mg/ml의 Ig 융합 단백질, 5 내지 30mM의 완충제, 0.5 내지 2%의 디사카라이드, 1.5 내지 2.5%의 충전제 및 0.001 내지 0.02%의 표면활성제를 포함한다.

추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약 10mg/ml의 Ig 융합 단백질, 약 10mM의 완충제, 약 1.8 내지 약 2%의 충전제, 약 0.9 내지 약 1%의 디사카라이드 및 약 0.005 내지 약 0.01%의 표면활성제를 포함한다.

추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약 10mg/ml의 Ig 융합 단백질, 약 10mM의 완충제, 약 1.8 내지 약 2%의 글리신, 약 0.9 내지 약 1%의 디사카라이드 및 약 0.005 내지 약 0.01%의 표면활성제를 포함한다.

추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 약 10mg/ml의 Ig 융합 단백질, 약 10mM의 완충제, 약 1.8 내지 약 2%의 만니톨, 약 0.9 내지 약 1%의 디사카라이드, 약 0.005 내지 약 0.01%의 표면활성제, 및 35mM 미만의 NaCl을 포함한다.

하나의 예시적인 양태에서, 약제학적 조성물은 10mg/ml의 PSGL-Ig, 10mM의 히스티딘, 260mM의 글리신, 10mM의 NaCl, 1%의 슈크로즈 및 0.005%의 폴리소르베이트-80을 포함한다.

하나의 예시적인 양태에서, 약제학적 조성물은 10mg/ml의 GP1b-Ig, 10mM의 히스티딘, 1.8%의 글리신, 25mM의 NaCl, 0.9%의 슈크로즈 및 0.01%의 폴리소르베이트-80을 포함한다.

하나의 예시적인 양태에서, 약제학적 조성물은 10mg/ml의 IL-13R-Ig, 10mM의 트리스, 2%의 만니톨, 40mM의 NaCl, 1%의 슈크로즈 및 0.01%의 폴리소르베이트-80을 포함한다.

조성물의 물리적 상태

액체, 동결된 액체, 동결건조된, 및 재구성된 제형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종의 물리적 상태가 본 발명의 약제학적 조성물에 적합하다. 재구성된 제형은 액체, 통상적으로 주사용 수(WFI) 속에 재현탁된 동결건조된 조성물을 포함한다. 동결건조된 조성물의 경우, 농도 및 삼투압은, 비록 이들 값이 교호적으로 재구성된 조성물을 언급한다고 해도, 예비-동결건조된 액체 조성물의 값을 언급한다. 동결건조된 액체 조성물의 경우, 농도 및 삼투압은 통상적으로 동결건조전의 액체 조성물을 말한다.

약제학적 조성물을 제조하는 방법

당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하기에 적합한 각종 방법을 알 것이다. 당해 분야의 숙련가들은, 또한 일부 성분들이 적합하지 않은 특정 제조 방법 또는 순서를 이루는 방식으로 상호작용할 수 있음을 이해할 것이다.

하나의 양태에서, 조성물은 정제된 단백질을 표면활성제를 제외한 조성물의 나머지 성분들 모두를 포함하는 용액으로 교환한 후, 표면활성제를 바람직한 농도로 가함에 의해 제조한다.

하나의 양태에서, 조성물은 어닐링 단계, 예를 들면, 조성물을 잠재적으로 결정성인 성분들의 결정화를 촉진시키기 위한 규정된 기간 동안 최종 동결 온도 이상의 온도에서 조성물을 유지시킴을 포함하는 과정에 의해 동결건조시킨다. 하나의 측면에서, 어닐링은, 케이크 구조 또는 단백질 안정성을 증진시킬 수 있는, 충전제의 완전한 또는 보다 완벽한 결정화를 허용한다. 또한, 충전제의 결정화는 무정형 상의 T_g'를 증가시킬 수 있으며, 이는 주요 건조를 보다 높은 온도에서 수행하고, 다시 개선된 케이크 품질 또는 안정성을 수득하도록 함으로써 보다 효율적인 건조를 촉진시킬 수 있다[참조: Wang, International Journal of Pharmaceutics 203:1-60 (2000)]. 또한, 충전제를 완전하게 결정화시키는데 있어서의 실패는 주요 건조 동안 결정화를 허용할 수 있으며, 이는 바이알 파손을 초래할 수 있다[참조: Tang and Pikal, Pharmaceutical Research 21:191-200 (2004), 또는 crystallization during storage, which can destabilize the protein (Carpenter, et al., Pharmaceutical Research 14:969-975 (1997)].

예시적인 양태에서, 약제학적 조성물은 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 동결건조된다: 조성물을 -4O℃ 미만에서 동결시키는 단계; -5℃ 내지 -4O℃의 온도에서 충전제의 결정화를 촉진시키는데 충분한 기간 동안 어닐링시키는 단계; 온도를 -35℃ 이하로 강하시키는 단계; 진공을 확립하는 단계; 및 조성물을 -20℃ 내지 +3O℃에서 건조시키는 단계.

안정성

하나의 측면에서, 본 발명은 안정한 약제학적 조성물에 관한 것이다. "안정한" 조성물은, 단백질이 필수적으로 저장 또는 사용 동안 특정의 물리적 및 화학적 특성을 보유하는 조성물이다. 하나의 측면에서, "저장 또는 사용"은 하나 이상의 동결/해동 주기를 포함한다. 단백질 안정성 및/또는 불안정성에 대한 각종 분석은 실시예에 기술되어 있으며 다른 적합한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 문헌[참조: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 , Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)]에서 고찰된다. 이러한 분석들은 고 분자량 물질(예: 응집체)의 적량화, 저 분자량 물질(예: 분해물)의 적량화, 단백질 농도의 적량화, 단백질 활성의 적량화, 및 해독 후 아미노산 변형의 적량화를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 저장 또는 사용시 바람직하게는 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5 % 미만의 응집체(고 분자량) 또는 분해물(저 분자량)을 함유한다. 유사하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 저장 또는 사용시 바람직하게는 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 단백질 활성을 보유한다.

일부 양태에서, 조성물은 특정 온도(예를 들면, -8O℃ 내지 4O℃, -4O℃ 내지 4O℃, 약 2O℃에서) 특정 기간(예를 들면, 1, 4, 7, 12 또는 24주; 또는 1, 2, 3, 4, 6, 7.5, 9 또는 12개월; 또는 그 이상) 동안 안정하다.

일부 양태에서, 조성물은 특정 수의 동결/해동 주기(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 또는 그 이상) 후에도 안정하다.

하나의 측면에서, 약제학적 조성물은 조성물의 제조, 동결, 건조, 저장, 선적, 재구성, 동결/해동 주기, 및 최종 사용자에 의한 재구성 후 저장을 포함할 수 있는 어떠한 또는 모든 제조, 선적 및 취급 단계를 통한 안정한 단백질이다.

이온 강도, pH, 온도, 동결/해동 주기, 전단력, 동결, 건조, 교반 및 재구성을 포함하는, 각종 인자들이 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 불안정성은 물리적 분해(예를 들면, 변성, 응집 또는 침전) 또는 화학적 분해(예를 들면, 탈아미드화, 산화 또는 가수분해)에 의해 유발될 수 있다.

실시예 1: PSGL-Ig 제형

A. PSGL-Ig 배경

P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)은 사람 백혈구상에서 P-셀렉틴에 대해 주요 고 친화성 수용체이다. PSGL-Ig는 미국 특허 제5,827,817호에 기술된 바와 같이, 돌연변이된 사람 IgG1 Fc 도메인에 연결된 가용성 PSGL를 포함하는 융합 단백질이다. PSGL-Ig의 등전점 포커싱(IEF)은 대략 3의 pI 주변에서 밀집된 pH 범위 2.8 내지 3.3내 주요 밴드를 나타낸다. PSGL-Ig의 해독 후 변형은 설페이트화 및 글리코실화를 포함한다. PSGL-Ig의 글리코실화는 O-결합된 및 N-결합된 글리칸을 포함한다. PSGL-Ig에서 O-결합된 글리칸은 시알릴화된 및/또는 푸코실화된 구조를 포함한다. PSGL의 해독 후 변형 및 이의 생물학적 의미에 대한 고찰은 문헌[참조: Liu et al., Journal of Biological Chemistry 273: 7078-7087 (1998)]을 참조한다.

B. PSGL-Ig 제형의 최적화

PSGL-Ig를 QAE 컬럼위에서 정제하고 PBS-CMF 또는 "His/Suc/Gly" (10mM 히스티딘, 260mM 글리신, 1% 슈크로즈)중 약 25㎍/ml에서 제형화하였다. 샘플을 폴리소르베이트-80의 부재하에, 동결/해동 주기 전에 0.005%로 가해진 폴리소르베이트-80의 존재하에 또는 동결/해동 후에 그러나 HMW 측정(PBS-CMF 경우에만) 전에 0.005%로 가해진 폴리소르베이트-80의 존재하에 가공하였다. 샘플을 동결/해동의 20주기에 적용시켰다. 고 분자량(HMW) 물질 %를 크기 배출 크로마토그래피(SEC)-HPLC에 의해 동결/해동 주기 전 및 후에 측정하였다. 표 1에 나타내는 바와 같이, 폴리소르베이트-80은 PBS-CMF 및 His/Suc/Gly 둘다에서, 그러나 동결/해동 주기 전에 가해지는 경우에만 HMW의 축적을 현저히 감소시켰다.

PSGL-Ig 안정성에 대한 완충제 및 pH의 기여를 측정하기 위하여, PSGL-Ig를 단지 15mM 완충제(추가의 부형제의 부재하에) 중 약 50㎍/ml에서 제형화하였다. 5가지의 완충제(석시네이트, 시트레이트, 히스티딘, 포스페이트 및 트리스)를 총 7가지의 pH에서 시험하였다(참조: 표 2). 샘플을 동결/해동의 5회 주기에 적용시켰다. HMW %를 SEC-HPLC에 의해 해동/동결 주기 전 및 후에 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 시트레이트 및 히스티딘은 동결/해동 후 HMW 퍼센트에 있어서 최소의 변화를 가져왔으나, 트리스, 포스페이트 및 석시네이트는 HMW에 있어서 보다 높은 증가 퍼센트를 가져왔다.

C. PSGL-Ig 제형의 장기간 안정성

정제된 PSGL-Ig를 1% 슈크로즈, 260mM 글리신, 10mM NaCl 및 10mM 히스티딘, pH 6.5-6.6내로 5mg/mL에서 교환하였다. 폴리소르베이트-80을 0.005%의 최종 농도로 가하였다. 1ml의 분취량을 제I형 유리 2ml들이 튜브 바이알에 충전시키고 마개를 막았다. 샘플을 동결건조시키고 5℃, 25℃, 또는 4O℃에서 저장하거나, 또는 -80℃에서 동결된 액체로 저장하였다. 단백질 안정성을 HMW 제형, 하이포설페이트화도(degree of hyposulfation), 상대적 결합 단위(RBU)로 측정한 생물학적 활성, 및 N-말단 글루타민의 파이로-글루탐산으로의 폐환도에 의해 평가하였다. 0 시각 샘플은 동결건조 전 및 후 제형으로 이루어졌다. 샘플을 또한 상기 나열한 온도에서 3 또는 7.5개월 저장 후 분석하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 동결건조되고 동결된 액체 제형은 시험 조건하에서 안정하다.

실시예 2: GP1b-Ig 제형

A. GP1b-Ig 배경

GP1b-알파는 혈소판에 의해 발현된 수용체이다. GP1b-알파에 대한 주요 리간드는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor: VWF)이다. GP1b-Ig는 PCT 공보 제WO 02/063003호에 기술된 것으로서, 불활성화된 사람 IgG1 Fc의 225개 아미노산에 연결된 GP1b-알파의 가용성 N-말단 290개 아미노산 리간드-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. GP1b-Ig의 VWF-결합 도메인은 이의 VWF 결합 친화성을 증진시키는 2개의 작용-획득 돌연변이(gain-of-function mutation)인, M239V 및 G233V를 포함한다. GP1b-Ig의 등전점 포커싱(IEF)은 대략 5의 pI 주변에 밀집된 4.1 내지 5.6의 pH 범위내에서 우세한 밴드를 나타낸다. GP1b-Ig의 해독 후 변형은 N-결합된 글리코실화를 포함한다. GP1b-Ig에서 N-결합된 글리칸은 시알릴화 및/또는 푸코실화된 구조를 포함한다.

B. GP1b-Ig 제형의 최적화

GP1b-Ig 안정성에 대한 폴리소르베이트-80의 효과는 2ml들이 폴리프로필렌 바이알 속에서 평가하였다. GP1b-Ig를 20mM 트리스 pH 7.2, 50mM NaCl 및 변화하는 농도의 폴리소르베이트-80(0%, 0.005%, 0.01%, 또는 0.02%) 속에서 2mg/ml로 제형화하였다. 바이알은 액체 질소를 1분 동안 침지시켜 동결시키고 얼음이 존재하지 않을 때까지 20℃의 수욕에서 항온처리하여 해동시켰다. 샘플을 14회의 동결/해동 주기에, 각각의 다른 주기 후 분석을 위해 제거된 분취량과 함께 적용시켰다. HMW 퍼센트를 SEC-HPLC로 측정하였다. 단백질 회수율은 280nm의 흡광도 시그날에서 단백질 피크의 영역을 통합하여 평가하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 폴리소르베이트-80의 첨가는 HMW 축적을 현저히 감소시켰다.

GP1b-Ig 안정성에 있어서 글리신의 효과를 유사한 방식으로 평가하였다. GP1b-Ig를 10mM 히스티딘 pH 6.5, 25mM NaCl, 0.9% 슈크로즈, 0.01% 폴리소르베이트-80 및 변화하는 농도의 글리신(0%, 1.0%, 1.8%, 2.0%, 또는 4.0% w/v) 속에서 5mg/ml으로 제형화하였다. 바이알은 액체 질소 속에 1분 동안 침지시켜 동결시키고 얼음이 존재하지 않을 때까지 2O℃ 수욕 속에서 항온처리하여 해동시켰다. 샘플을 10회의 동결/해동 주기에 적용했고, 매 다른 주기 후 분석을 위해 분취량을 제거하였다. HMW %는 SEC-HPLC로 측정하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 1.8% 글리신의 첨가는 6, 8 또는 10회의 동결/해동 주기 후 HMW 축적을 최소화시켰다.

GP1b-Ig 안정성에 있어서 pH의 효과를 유사한 방식으로 평가하였다. Gp1b-Ig를 20mM 나트륨 포스페이트중 1mg/ml에서 변화하는 pH 수준(5.0, 6.0, 7.0 또는 8.0)으로 제형화하였다. 바이알은 액체 질소 속에 1분 동안 침지시켜 동결시키고 얼음이 잔류하지 않을 때까지 2O℃ 수 욕 속에서 항온처리하여 해동시켰다. 샘플을 10회의 동결/해동 주기에 적용했고, 매 다른 주기 후 분석을 위해 분취량을 제거하였다. HMW %를 SEC-HPLC로 측정하고 단백질 회수를 280 및 214nm에서 HPLC 검출기 시그날로 모니터링하였다. 10주기 후, pH 5.0 및 6.0에서의 샘플은 혼탁해졌으며, 이는, 가용성 단백질의 회수가 감소됨을 나타낸다. 표 5에 나타낸 바와 같이, pH 5.0 또는 6.0에서의 제형은 증가된 HMW 축적 및 감소된 단백질 회수를 가져온다.

GP1b-Ig 안정성에 대한 단백질 농도의 효과는, 반이 10mM 히스티딘 pH 6.5, 1.8% 글리신, 25mM NaCl, 0.9% 슈크로즈 및 0.01% 폴리소르베이트-80 중 0.25, 10 또는 19mg/ml GP1b-Ig로 충전되어 있는 20ml들이의 병 속에서 평가하였다. 병은 액체 질소 속에 10분 동안 침지시켜 동결시키고 25℃ 수 욕 속에서 15 내지 20분 동안 항온처리하여 해동시켰다. 샘플을 10회의 동결/해동 주기에 적용했고, 0, 1, 2, 4, 6, 8 및 10주기 후 분석을 위해 분취량을 제거하였다. 분석 전에, 모든 샘플내 단백질 농도를 다른 동일한 제형 속에서 0.25mg/ml로 희석시켜 표준화하였다. HMW %는 SEC-HPLC로 측정하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, GP1b-Ig는 당해 제형에서 광범위한 농도 범위에 걸쳐 안정하다.

C. GP1b-Ig 제형의 장기간 안정성

정제된 GP1b-Ig를 -80℃에서 사용을 위해 해동시킬 때까지 저장하였다. 단백질 농도는 A280에 의해 19mg/ml인 것으로 평가되었다. GP1b-Ig를 적절한 스톡 용액 속에서 희석시킴에 의해 10mM 히스티딘 pH 6.5, 1.8% 글리신, 25mM NaCl, 0.9% 슈크로즈 및 0.01% 폴리소르베이트-80 중 10mg/ml로 제형화하였다. 수득되는 제형을 0.2㎛ 여과기를 통해 여과하고 유리 바이알 내로 분산시켰다. 바이알을 강철 트래이에 두고 동결건조시켰다. 동결건조는 표 7에 요약한 주기 매개변수에 따라 수행하였다.

주기가 완료되면, 동결건조 챔버를 무수 질소로 다시 채운 후, 마개를 열어 감압시키고 나머지 진공을 해제하였다. 바이알을 즉시 클림핑하고, 표지하여 2 내지 8℃, 25℃ 또는 4O℃에서 저장하였다.

각각의 시점(0, 1, 2, 3, 4, 6, 9 및 12개월)에서, 하나 이상의 동결건조 바이알을 개방시켰다. 생성물 케이크를 외관에 대해 평가하고 잔류 수분을 카를-피셔 적정(Karl-Fisher titration)으로 측정하였다. 이후에, 케이크를 1ml의 주사용 수(WFI)로 재구성시키고, 외관 및 재구성 시간을 모니터링하였다. 재구성 후, pH를, 전극을 400μl의 제형을 함유하는 2ml들이의 동결 바이알내로 침지하여 측정하였다. 수득되는 용액을 3 x 200μl 분취량으로 나누고, 이들 중 2개를 -8O℃에서 동결시키고, 이들 중 하나는 분석을 위해 표지하고 2 내지 8℃에서 유지시켰다.

재구성된 GP1b-Ig 제형을 동일한 용액 속에서 10배 희석하여 이론적으로 1mg/ml 용액을 수득하였다. 실제 단백질 농도는 UV-투명 96-웰 플레이트를 사용하여 UV 광도계로 측정하였다. 단백질 농도는 다음 식으로 계산하였다:

농도(mg/ml) = 희석 인자 x (A280-A320)/(1.1)

생물학적 활성은 사람의 혈장 기원한 VWF에 대한 GP1b-Ig의 결합도로 평가하였다. 측정된 단백질 농도를 사용하여 특이 활성(단위/㎍)을 계산하였다.

HMW 축적율을 SEC-HPLC로 측정하고 전체 물질의 백분율로서 나타내었다.

저 분자량 물질(LMW)의 축적율을 역상(RP)-HPLC로 모니터링하여 전체 물질의 퍼센트로 나타내었다.

설페이트화된 동형의 분포는 음이온-교환 크로마토그래피(AEX)로 측정하였다.

표 8 내지 10에 나타낸 바와 같이, 당해 검정은, 이러한 GP1b-Ig 제형이 9개월 이상 동안 시험한 조건하에서 안정함을 입증한다. 표 8은 2 내지 8℃에서 저장 후 수득한 결과를 나타낸다. 표 9는 25℃에서 저장 후 수득된 결과를 나타낸다. 표 10은 4O℃에서 저장 후 수득된 결과를 나타낸다.

실시예 3: IL-13R-Ig 제형

A. IL-13R-Ig 배경

IL-13R은 인터루킨-13(IL-13)에 대한 주요 수용체이다. IL-13R-Ig는 미국 특허 제6,268,480호에 기술된 바와 같이, 스페이서 서열 및 사람 IgG1의 힌지 CH2 CH3 영역에 연결된 IL-13Rα2의 가용성의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. IL-13R-Ig의 등전점 포커싱(IEF)은 대략 4.3의 pI 주변에서 밀집된, 3.8 내지 4.7의 pH 범위내에서 주요 밴드를 나타낸다. IL-13R-Ig의 해독 후 변형은 N-연결된 글리코실화를 포함한다. IL-13R-Ig내 N-결합된 글리칸은 시알릴화된 구조를 포함한다.

B. IL-13R-Ig 제형의 최적화

IL-13R-Ig를 4개의 상이한 제형으로 10mg/ml에서 제형화하였다: 10mM NaPO₄, 0.01% 폴리소르베이트-80, 1% 슈크로즈 및 2% 만니톨, pH 7.4; 10mM NaPO₄, 0.01% 폴리소르베이트-80, 0.9% 슈크로즈 및 1.8% 글리신, pH 7.4; 10mM 트리스, 0.01% 폴리소르베이트-80, 1% 슈크로즈 및 2% 만니톨, pH 7.4; 또는 10mM 트리스, 0.01% 폴리소르베이트-80, 0.9% 슈크로즈 및 1.8% 글리신, pH 7.4. 동결건조시킨 바이알을 12주 이하로 4℃, 25℃ 및 4O℃에서 저장하였다. 매 시점에서, 각각의 제형 및 온도 조합의 하나 이상의 바이알을 재구성하고 단백질 회수(A280 또는 SEC에 의해), HMW 축적(SEC-HPLC에 의해), 또는 생물학적 활성(IL-13-의존성 세포주의 증식 억제에 대한 분석시 IC₅₀에 의해)에 대해 분석하였다. 표 11은 저장 12주 후 각각의 제형 및 온도에 대해 A280에 의해 평가된 것으로서, 단백질 회수율(%)을 나타낸다. 표 12는, 저장 12주 후 각각의 제형 및 온도에 대해 SEC로 평가한 것으로서, 단백질 회수율(%)을 나타낸다. 표 13은 각각의 제형의 조합(상기 나열된 4개 제형의), 온도(4℃, 25℃, 또는 4O℃) 및 저장 시간(0, 1개월, 7주 또는 12주), 및 동결건조 후 출발 물질에 대해 SEC-HPLC로 평가한 것으로서 HMW 축적율(%)을 나타낸다. 표 14는 4주(2 내지 8℃ 또는 25℃에서), 7주(2 내지 8℃ 또는 25℃에서), 또는 12주(2 내지 8℃, 25℃ 또는 4O℃에서) 후 각각의 제형에 대한, 및 동결건조 후 출발 물질에 대한 IC₅₀ 데이타를 나타낸다.

C. IL-13R-Ig 제형의 장기간 안정성

정제된 IL-13R을 1% 슈크로즈, 2% 만니톨, 40mM NaCl, 0.01% 폴리소르베이트-80 및 10mM 트리스 pH 7.4 중 10mg/ml로 제형화하였다. 5ml들이 튜브 바이알에 1ml의 각각의 제형을 충전시키고 Lyo-Star^TM 발색 건조기 속에서 동결건조시켰다. 동결건조시킨 바이알을 2 내지 8℃, 25℃, 또는 4O℃에서 24주 이하 동안 저장하면서, 샘플을 0, 4, 7, 12 및 24주째에 분석하였다. 샘플을 외관(재구성 전 및 후), pH, 단백질 농도(A280에 의해), HMW(SEC-HPLC에 의해) 및 생활성(IC₅₀)에 대해 분석하였다. 표 15 내지 17에 나타낸 바와 같이, IL-13R-Ig 제형은 24주 이상 동안 시험한 조건하에서 안정하다. 표 15는 2 내지 8℃에서 저장 후 수득된 결과를 나타낸다. 표 16은 25℃에서 저장 후 수득된 결과를 나타낸다. 표 17은 40℃에서 저장 후 수득된 결과를 나타낸다.

2 내지 8℃에서 IL-13R-Ig 제형의 안정성

	외관(재구성 전)	외관(재구성 후)	pH	단백질 농도	HMW %	IC₅₀
명세	명백하게 가시적인 입상 물질, 습도 및 용기/폐쇄 결함이 본질적으로 존재하지 않는 백색 케이크	명백하게 가시적인 입상 물질이 본질적으로 존재하지 않는 용액	6.9-7.9	보고 결과 (표적: 10mg/ml)	≤10% HMW	≤2200pM
초기	명세 충족	명세 충족	7.37	10.58	4.76%	411pM
4주째	명세 충족	명세 충족	7.36	10.33	5.34%	471pM
7주째	명세 충족	명세 충족	7.38	9.48	4.18%	429pM
12주째	명세 충족	명세 충족	7.38	9.96	3.19%	467pM
24주째	명세 충족	명세 충족	7.42	10.0	4.03%	890 +/- 239pM (10회 반복)

25℃에서 IL-13R-Ig 제형의 안정성

	외관(재구성 전)	외관(재구성 후)	pH	단백질 농도	HMW %	IC₅₀
명세	명백하게 가시적인 입상 물질, 습도 및 용기/폐쇄 결함이 본질적으로 존재하지 않는 백색 케이크	명백하게 가시적인 입상 물질이 본질적으로 존재하지 않는 용액	6.9-7.9	보고 결과 (표적: 10mg/ml)	≤10% HMW	≤2200pM
초기	명세 충족	명세 충족	7.37	10.58	4.76%	411pM
4주째	명세 충족	명세 충족	7.36	11.09	5.81%	445pM
7주째	명세 충족	명세 충족	7.40	9.26	4.43%	336pM
12주째	명세 충족	명세 충족	7.42	10.2	3.37%	261pM
24주째	명세 충족	명세 충족	7.37	10.09	4.21%	966 +/- 314pM (4회 반복)

40℃에서 IL-13R-Ig 제형의 안정성

	외관(재구성 전)	외관(재구성 후)	pH	단백질 농도	HMW%	IC₅₀
명세	명백하게 가시적인 입상 물질, 습도 및 용기/폐쇄 결함이 본질적으로 존재하지 않는 백색 케이크	명백하게 가시적인 입상 물질이 본질적으로 존재하지 않는 용액	6.9-7.9	보고 결과 (표적: 10mg/ml)	≤10% HMW	≤2200pM
초기	명세 충족	명세 충족	7.37	10.58	4.76%	411pM
4주째	명세 충족	명세 충족	7.37	10.81	6.02%	측정 안됨
7주째	명세 충족	명세 충족	7.40	10.24	4.88%	측정 안됨
12주째	명세 충족	명세 충족	7.39	9.60	3.65%	469pM
24주째	명세 충족	명세 충족	7.4	10.44	4.85%	823 +/- 299pM (10회 반복)

명세서내 양태들은 본 발명의 양태를 예시한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 당해 분야의 숙련가는, 많은 다른 양태들이 본 발명에 포함됨을 용이하게 인지한다. 본 기술내에서 인용된 모든 공보 및 특허들은 이의 전문이 참조로 인용된다. 참조로 인용된 문헌이 본 명세서에 반대되거나, 또는 일치하지 않는 정도까지, 본 명세서는 특정의 이러한 문헌을 대신할 것이다. 본원의 어떠한 문헌의 인용도, 이러한 문헌이 본 발명의 선행 분야로 허용되는 것은 아니다. 달리 제시하지 않는 한, 모든 백분율은 중량/중량의 양을 말한다.

Claims

a) 등전점(pI)이 6 미만인 면역글로불린(Ig) 융합 단백질,

b) 글리신,

c) 디사카라이드,

d) 표면활성제 및

e) 완충제를 포함하고, 0.5 내지 5%의 글리신, 0.5 내지 5%의 디사카라이드, 0.001 내지 0.5%의 표면활성제를 함유하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 1 내지 200mM NaCl 농도의 NaCl을 추가로 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물 중 Ig 융합물의 농도가 0.025 내지 60mg/ml인 조성물.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질의 pI가 4 미만인 조성물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 수용체로부터 기원한 비-Ig 부위를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 설페이트화, 포스포릴화 또는 글리코실화된 비-Ig 부위를 포함하는 조성물.
제6항에 있어서, 글리코실화된 비-Ig 부위가 시알릴화 또는 푸코실화된 조성물.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 IL-13R-Ig 또는 IL-21R-Ig인 조성물.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 P-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL)-Ig 또는 GP1b Ig인 조성물.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 디사카라이드가 슈크로즈 또는 트레할로즈인 조성물.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 표면활성제가 폴리소르베이트인 조성물.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물중 완충제 농도가 5 내지 30mM인 조성물.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 완충제가 히스티딘 완충제, 트리스 완충제 또는 포스페이트 완충제인 조성물.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 NaCl을 함유하지 않는 조성물.
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동결건조된 조성물.
제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 -80℃ 내지 +40℃에서 1주 이상 동안 안정한 조성물.
제15항에 있어서, 조성물이 재구성된 조성물.
a) pI가 6 미만인 Ig 융합 단백질,

b) 만니톨,

c) 디사카라이드,

d) 표면활성제 및

e) 완충제를 포함하고, 0.5 내지 5%의 만니톨, 0.5 내지 5%의 디사카라이드, 0.001 내지 0.5%의 표면활성제 및 35mM 미만의 NaCl을 함유하는 약제학적 조성물.
제18항에 있어서, Ig 융합물의 농도가 0.025 내지 60mg/ml인 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, Ig 융합 단백질의 pI가 4 미만인 조성물.
제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 수용체로부터 기원한 비-Ig 부위를 포함하는 조성물.
제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 설페이트화, 포스포릴화 또는 글리코실화된 비-Ig 부위를 포함하는 조성물.
제22항에 있어서, 글리코실화된 비-Ig 부위가 시알릴화되거나 또는 푸코실화된 조성물.
제18항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 IL-13R-Ig 또는 IL-21-R-Ig인 조성물.
제18항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, Ig 융합 단백질이 PSGL-Ig 또는 GP1b Ig인 조성물.
제18항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 디사카라이드가 슈크로즈 또는 트레할로즈인 조성물.
제18항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 표면활성제가 폴리소르베이트인 조성물.
제18항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 완충제 농도가 5 내지 30mM인 조성물.
제18항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 완충제가 히스티딘 완충제, 트리스 완충제 또는 포스페이트 완충제인 조성물.
제18항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 NaCl을 함유하지 않는 조성물.
제18항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동결건조된 조성물.
제18항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 -80℃ 내지 +40℃에서 1주 이상 동안 안정한 조성물.
제31항에 있어서, 조성물이 재구성된 조성물.
본질적으로 0.025 내지 60mg/ml의 산성 Ig 융합 단백질, 1 내지 4%의 글리신, 0.5 내지 2%의 디사카라이드, 0.005 내지 0.02%의 표면활성제, 1 내지 40mM의 완충제, 및 임의로 1 내지 200mM의 NaCl로 이루어진 약제학적 조성물.
본질적으로 0.025 내지 60mg/ml의 PSGL-Ig 또는 IL-13R-Ig 이외의 산성 Ig 융합 단백질, 1 내지 4%의 만니톨, 0.5 내지 2%의 디사카라이드, 0.005 내지 0.02%의 표면활성제, 1 내지 40mM의 완충제, 및 임의로 1 내지 200mM의 NaCl로 이루어진 약제학적 조성물.
본질적으로 0.025 내지 60mg/ml의 산성 Ig 융합 단백질, 1 내지 4%의 만니톨, 0.5 내지 2%의 디사카라이드, 0.005 내지 0.02%의 표면활성제, 및 1 내지 40mM의 완충제로 이루어진 약제학적 조성물.
제1항, 제18항 또는 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 어닐링 단계를 포함하는 공정에 의해 동결건조된 조성물.
어닐링 단계가 조성물을 규정된 기간 동안 최종 동결 온도 이상의 온도에서 유지시킴으로써 충전제의 결정화를 촉진시키는, 제37항의 조성물의 제조방법.
제38항에 있어서,

a) 조성물을 -40℃ 이하로 동결시키는 단계;

b) 조성물을 -5℃ 내지 -40℃ 범위에서 선택된 온도로 조성물 중 글리신 또는 만니톨의 결정화를 촉진시키기에 충분한 기간 동안 상승시키는 단계;

c) 조성물의 온도를 -35℃ 이하로 강하시키는 단계;

d) 진공을 확립시키는 단계; 및

e) 조성물을 -20℃ 내지 +30℃ 범위에서 선택된 온도에서 건조시키는 단계를 포함하는 방법.