KR102605317B1 - 실온 안정성 동결건조된 단백질 - Google Patents
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Abstract
안정한 동결건조된 치료용 단백질 조성물 및 이의 제조 방법이 제공된다. 특히, 고형 케이크 가소제 및 단백질 안정화제로서의 물의 사용이 기재되어 있다. 또한, 더 큰 분자 실체 및 더 작은 분자 실체를 포함하는 다 성분 안정화제의 포함이 기재되어 있다. 또한 특정 조건에서 후-건조 어닐링을 포함하면 단백질 안정성이 향상된다. 단백질은 25℃에서 24개월 동안 안정한 상태로 유지될 것으로 예측된다.
Description
본 발명은 일반적으로 생체 분자의 약제학적 제형의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 안정한 동결건조된 치료 단백질 제형에 관한 것이다.
항체와 수용체 Fc 융합 단백질과 같은 치료용 거대 분자는 분자를 환자에게 투여하기에 적합할 뿐만 아니라, 장기간 보관시 안정성을 유지하는 방식으로 제형 화되어야 한다. 예를 들어, 액체 용액에 있는 치료용 단백질(예: 항체)은 용액을 적절히 배형화되지 않으면 응집, 화학적 변형 또는 기타 형태의 분해를 일으키기 쉽다. 액체 제형에서의 치료용 단백질의 안정성은 제형에 사용된 부형제의 종류 및 이들에 대한 부형제의 양 및 비율 뿐 만 아니라 가용성 단백질의 농도 및 제조 방법에 의존한다. 치료 단백질 제형을 제조할 때 안정성 이외의 고려 사항도 고려해야 한다. 이러한 고려 사항에는 주어진 제형에 의해 수용될 수 있는 용액의 점도 및 항체의 농도가 포함된다. 따라서, 치료용 단백질을 제제화할 때, 보관 온도에서 시간이 지남에 따라 안정하게 유지되고, 적절한 농도의 항체 또는 다른 치료용 단백질을 함유하며, 제형이 환자에게 편리하게 투여될 수 있게 하는 다른 성질을 보유하는 제형에 도달하기 위해서는 상당한 주의를 기울여야만 한다.
치료용 단백질의 액상 제형은 일반적으로 동결시 또는 냉장시 단백질에 장기간 안정성을 제공하도록 고안되었지만, 종종 실온에서 장기 안정성을 제공하지 못한다. 안정성을 보존하고 단백질의 치료 활성을 유지하는 당 업계에 공지된 한 가지 해결책은 분자를 동결건조하는 것이다. 동결건조(제어된 조건 하에서의 동결건조)는 일반적으로 단백질의 장기 보관에 사용된다. 동결건조된 상태에서 동결건조된 단백질은 응집, 산화 및 다른 변성 과정과 같은 분해에 실질적으로 내성이다 (예를 들어, 미국 특허 제 6,436,897 호 참조). 동결건조는 비교적 오랜 시간 동안 실온에서 비교적 안정한 상태로 유지되는 건조한 "케이크"를 제공한다. 실온 안정성은 특히 전기 및 냉장이 신뢰할 수 없는 곳에서, 전 세계적으로 치료용 단백질을 저장 및 분배하는 데 특히 중요하다.
동결건조보호제(Lyoprotectant, 일명 안정화제), 예컨대, 수크로스 및 트레할로스는 종종 동결건조 공정시 변성에 대해 단백질을 보호하는 프리 동결건조(pre-lyophilization) 조성물에 포함된다. 가소제는 또한 전체 완화 시간을 줄이기 위해 포함될 수 있으며 경우에 따라 단백질의 기본 구조를 보존하는데 도움이 될 수 있다. 가소제에는 소르비톨 및 글리세롤과 같은 당 알코올, 기타 폴리올 및 소량의 물이 포함된다.
5℃에서 동결건조된 단백질의 저장을 최적화하기 위한 연구에서, Chang 등은 단백질 제제의 안정성에 대한 가소제의 효과를 조사했다. 1:1의 슈 크로즈 대 단백질(단백질은 40mg/mL로 예비-동결건조됨)과 추가 가소제를 함유하지 않는 동결건조 케이크에서, 50℃에서 한 달 동안의 응집 속도 상수는 2.4% 수분 함량에서 1.5% 이상이었고 3.3% 수분 함량에서 약 2%인 것으로 기록되었다.(Id. 1451면, 도 4).("Effect of Sorbitol and Residual Moisture on the Stability of Lyophilized Antibodies: Implications for the Mechanism of Protein Stabilization in the Solid State," J. Pharma. Sci. 94(7): 1445-1454, (2005)). 이 실험은 또한 40℃와 25℃에서 실행되었으며, 세 가지 스트레스 조건 중 가장 가혹한 조건 만에 대한 데이터가 제시되었다. Chang 등은 중간 수분 함량에서 최적의 저장 안정성에 대한 문서화된 사례의 희귀 예를 언급하고 잔류 수분 함량은 단순히 최소화해야하는 것보다는 제형 개발 중에 최적화되어야한다고 제안했다.(Id. 1451면; 참고: 또한 Breen et. al., "Effect of Moisture on the Stability of a Lyophilized Humanized Monoclonal Antibody Formulation," Pharma. Res. 18(9):1345-1353 (2001).) 높은 수분 수준은 Chang 등이 인용한 모든 연구에서 제형의 화학적 안정성을 감소시키는 것으로 나타났다. Hsu et al. "Determining the Optimum residual Moisture in Lyophilized Protein Pharmaceuticals," Develop. Biol. Standard 74:255-271 (1991).
이러한 연구 결과 중 어느 것도 시험된 제형의 경우라 할지라도 5℃ 이상의 온도에서 25℃는 말할 것도 없이 장기간 안정성(1년, 2년 또는 3년 이상)을 제시하지 못한다.
생물학적 치료제의 동결건조 제제는 특정 조건 하에서 장기 안정성을 입증했다. Kallmeyer 등의, 제W01998022136A2호는 저농도의 안정한 동결건조된 항체 제제 설명 200 ㎎/㎖ 재구성 후까지(다른 부형제 중 당을 함유[예를 들어, 수크로스, 락토스, 말토스(예를 들면 8 ㎎/㎖ 예비 동결 용액까지)(예: 아르기닌, 라이신, 오르니 틴), 계면활성제(재구성 후 0.05 ~ 0.5 mg/ml[예: 폴리소르베이트 및 폴리 옥시에틸렌-(예: 인산염, 아세테이트, 구연산염) 및/또는 등장제(예: NaC1, 재구성 후 30mM 이하)와 같은 부형제를 포함하는 약제학적 조성물. 칼마이어(Kallmeyer)는 실내 온도(즉, 18-23℃)에서 최대 2년 동안 안정한 상태로 보관할 수 있는 동결건조액을 공개했다. 여기서 안정성은 재구성된 동결건조물에서 미립자 형성이 매우 적음으로 나타났다. 즉, 크기가 10 미크론보다 입자가 작은 6000개 미만 또는 크기가 25 미크론보다 작은 입자가 600개 미만이다.
Dix 등의 W02006104852A2는 적어도 3개월 동안 생물학적 활성을 유지하는 안정한 동결건조된 VEGF-Trap(아플리베르셉트라고도 함) 제형을 기술하고있다. 상기 출원은 5-75 mg/ml 트랩 분자, 5-50 mM 히스티딘 완충액, 0.1-3% 폴리에틸렌 글리콜(PEG; 안정화제), 0.25-3% 글리신(벌킹제로서) 및 0.5-6%의 수크로스(안정화제로서)을 함유하는 예비 동결건조된 용액을 개시하고 있다. 임의로, 동결건조 전 용액은 구연산 완충액(0.05mM) 및/또는 0.003% 내지 0.005% 폴리소르베이트를 함유한다.
동결건조된 단백질 제형 외에도, 건조한 단백질 제형을 제조하기 위해 분무 건조가 또한 사용되었다. Chen 및 Walsh(W0201307506A1)는 2 내지 30 미크론의 직경 범위 및 약 10 내지 12 미크론의 중간 직경, 및 몇몇 경우 약 6 내지 약 7 미크론을 갖는 건식 미분화된 단백질 입자를 개시한다. 이들 입자는 이어서 중합체를 더욱 코팅하여 수성 환경에서 단백질을 더욱 안정화시키고 시간이 지남에 따라 단백질의 장시간 방출을 가능하게 한다. 미세화된 입자가 형성된 전처리된 단백질 용액은 (1) 25mg/ml 단백질 및 0.1% 폴리소르베이트, (2) 25mg/ml 단백질 또는 (3) 50mg/ml 단백질, 10mM 인산염 , 및 2% 수크로스를 함유하였다. 중합체로 코팅된 미세화된 단백질 입자 내에 함유된 단백질은 적어도 14 일 동안 안정한 상태로 유지되는 것으로 나타났다.
단백질 동결건조물의 건조 후 어닐링은 50℃에서 4% 이상의 초기 항체 응집을 생성하는 것으로 밝혀졌으며 응집 속도 상수는 한 달에 약 2% 응집이었다(Wang et al., Wang et al., "The Impact of Thermal Treatment on the Stability of Freeze-Dried Amorphous Pharmaceuticals: II. Aggregation in an IgG1 Fusion Protein," 99(2) J. Pharma. Sci. 683-700 (2010)). 미국 FDA는 초기 응집이 4% 인 제형의 마케팅을 허용할 수 있지만, 시간이 지남에 따라 응집 속도는 시판중인 약제학적 제형에서는 받아들일 수 없을 것이다. 보존 기간 동안 약제학적 제형에는 눈에 보이는 변화가 없어야 한다.
실온에서 장시간 동안 안정한 다목적 건조 단백질 제형이 필요하다. 다용도 건식 단백질 제형은 특히 액체 제형물로서의 용도로의 재구성, 장시간 방출 제형 또는 장치를 제조하기 위한 중합체와의 결합, 및 무수한 다른 경로를 통한 이식 또는 전달에 적용될 수 있다. 본 발명에서, 출원인은 개선된 안정한 단백질 동결건조액 및 이를 제조하는 방법을 개발하였다.
비교적 높은 함량의 잔류 수분은 동결건조 치료용 단백질(일명 "고체 상태"의 치료용 단백질)의 효과적인 가소제 역할을 할 수 있으며, 실온에서 보관하는 동안 적어도 24개월 동안 단백질에 놀라운 안정성을 제공한다. 하나의 양태에서, 0.5 내지 10%의 수분을 갖는 저 이동성 고체 상태의 실온 안정한 동결건조 치료용 단백질 제형이 제공된다. 다른 측면에서, 상기 실온에서 안정한, 동결건조된 치료용 단백질 제형을 제조하는 방법이 제공된다. 특히, 동결건조 케이크에서 2% 초과, 3% 초과, 4% 초과, 5% 초과, 또는 6% 초과이지만, 10% 미만, 8% 미만, 7 미만% 또는 6% 미만은 실온에서 비교적 고온에서 장시간 동안 어닐링을 허용한다. 임의의 작용 메카니즘에 의해 제한되지는 않지만, 동결건조 공정 동안의 잔류 수분 함량은 비교적 고농도의 약제학적 제형, 바람직하게는 50 내지 200 mg/ml, 더욱 더 바람직하게는 100-150 mg/ml에서, 초기 단백질 응집체의 형성을 방지하면서 알파-이완( alpha-relaxation)이 발생하도록 하는 것으로 여겨진다.
제1 양태에서, 안정한 단백질, 부형제, 및 약 0.5% 내지 약 10% 물, 약 3% 내지 약 6% 물, 약 4% 내지 약 7% 물, 약 5 중량% 내지 약 8 중량%의 물, 약 3 중량%, 약 4 중량%, 약 4.5 중량% 또는 약 6 중량%의 물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크가 제공된다. 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 단백질은 17 내지 25℃, 20 내지 25℃ 또는 약 25℃일 수 있는 실온에서 1개월 이상 안정하다. 일반적으로 "안정한"이란 의미는 실온에서 18개월 이내의 저장 기간에 단백질이 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만 또는 극히 적게 분해됨을 의미한다. 단백질에 대한 일반적인 분해 경로는 응집체 및 기타 고 분자량(HMW) 종의 형성에 있다. HMW 종은 크기 배제 크로마토그래피 및 고유 또는 변성된 전기 영동 겔 이동도, 바람직하게는 크기 배제 크로마토그래피와 같은 많은 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 분해는 또한 당해 분야에 공지된 방법으로 측정 할 수 있는, 탈아미드화 잔기, 환원된 이황화물 결합, 가수분해 및 펩티드 단편화와 같은 화학 생성물의 형성을 포함한다.
한 실시 양태에서, 단백질의 약 2% 이하는 약 25℃에서 24개월 저장 후에 분해된다. 분해는 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 고 분자량 종의 퍼센트 변화에 의해 결정된다. 이 방법으로 검출가능한 분해의 하한선은 약 0.5% 분해이며, 분석 변동성은 약 0.2-0.3%이다.
약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 단백질 및 수분 이외에 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, 부형제는 완충액을 포함한다. 그 완충액은 단백질 안정성을 위한 최적의 pH를 유지하는 완충액일 수 있다. 히스티딘은 약 6.0의 pKa를 가지며 pH 4.8과 7.2 사이에서 효과적으로 완충될 수 있는 완충액이다. 일부 실시 양태에서, 부형제는 히스티딘이다. 바람직한 실시 양태에서, 히스티딘은 약 0.34 내지 약 2.04 중량%의 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크에 존재한다.
한 실시 양태에서, 부형제는 안정화제를 포함한다. 안정화제는 폴리올, 당, 아미노산, 염 또는 이들의 임의의 조합과 같은 다양한 분자를 포함한다. 유용한 안정화제의 예로는 소르비톨, 글리세롤, 만니톨, 트레할로스, 수크로스, 아르기닌, 알라닌, 프롤린, 글리신, 염화나트륨 또는 이들의 임의 조합물을 들 수 있다. 일 구체 예에서, 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 19.9% 내지 82.2%를 구성한다.
용어 "안정화제"는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크에서 완충액 또는 단백질이 아닌 적어도 하나의 화학 물질을 의미한다. 일부 구체 예에서, 용어 안정화제는 함께 단백질 또는 다른 거대 분자를 안정화시키는 역할을 하는 화학 물질(즉, 하나 이상의 화학 물질)의 조합을 의미한다. 예를 들어, 안정화제는 수크로스일 수 있거나, 안정화제는 수크로스 및 아르기닌의 조합일 수 있다. 일부 구체 예에서, 보다 큰 분자량의 화학적 실체, 예를 들어 수크로스 또는 트레할로오스는 예를 들어, 아르기닌, 프롤린, 알라닌, 글리신, 만니톨, 소르비톨 및/또는 글리세롤과 같은 보다 작은 분자량의 화학적 실체와 쌍을 이룬다. 이론에 묶이기를 바라지는 않지만, 보다 작은 화학 물질은 이동성을 증가시켜, 단백질이 더 낮은 에너지 상태로 이완되도록 한다.
일 구체 예에서, 안정화제는 수크로스이며, 안정화제는 다른 안정화제 성분의 존재 및 단백질, 물 및 다른 부형제의 양에 따라, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 3% 내지 약 15%, 바람직하게는 약 5-11%, 4-7.5% 또는 5-7.5%를 구성한다. 일 실시 형태에서, 단백질 대 안정화제의 중량비는 1 : 1 내지 3 : 1, 바람직하게는 1.2 : 1 내지 2 : 1, 보다 바람직하게는 약 1.5 : 1이다.
일 구체 예에서, 안정화제는 다른 안정화제와 조합된 수크로스를 포함한다. 수크로스와 결합된 다른 안정화제는 아르기닌, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤 및 알라닌 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일 구체 예에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 4.83% 내지 약 19.3%를 구성할 수 있는 아르기닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 수크로스 대 아르기닌의 중량 대 중량의 비는 약 3.2 : 1 내지 약 3.4 : 1이다. 또 다른 실시 양태에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 8.07% 내지 약 22.4%를 구성할 수 있는 소르비톨을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 8.07% 내지 약 22.4%를 구성할 수 있는 만니톨을 포함한다. 다른 구체 예에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 4.23% 내지 약 12.7%를 구성할 수 있는, 글리세롤을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 4.11% 내지 약 12.4%를 구성할 수 있는, 알라닌을 포함한다.
다른 구체 예에서, 안정화제는 다른 안정화제의 존재 및 단백질, 물 및 다른 부형제의 양에 따라, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 15.8% 내지 약 70.2%를 구성하는, 트레할로오스를 포함한다.
일 구체 예에서, 안정화제는 다른 안정화제와 조합된 트레할로오스를 포함한다. 트레할로오스와 결합된 다른 안정화제는 아르기닌, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤 및 알라닌 중 하나 이상을 포함한다. 일 구체 예에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 0.81% 내지 약 14.3%를 구성할 수 있는, 아르기닌을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 1.35% 내지 약 22.4%를 구성할 수 있는 소르비톨을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 0.69% 내지 약 12.7%를 구성할 수 있는 글리세롤을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 추가의 안정화제는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 0.69% 내지 약 12.4%를 구성할 수 있는 알라닌을 포함한다.
다른 실시 예에서, 부형제는 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 지방성 아실화 폴리에톡실레이트화 소르비탄과 같은 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 한 구체 예에서, 계면활성제는 일반적으로 폴리소르베이트 또는 구체적으로 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 약 0.21 중량% 내지 약 0.96 중량%의 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 80을 포함한다.
한 구체 예에서, 단백질은 치료용 단백질이다. 또 다른 실시 양태에서, 치료용 단백질은 항원 - 결합 단백질이다. 항원 - 결합 단백질은 항체, 항체 단편, 수용체, 리간드, 상보성 결정 영역, 리간드 및 수용체 도메인을 포함하는 재조합 분자를 포함하는 다양한 분자 군을 포함한다. 항원 - 결합 단백질은 트랩 분자를 포함하는 수용체 -Fc 융합 단백질과 같은 다양한 다른 융합(재조합 또는 키메라) 단백질을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 단백질은 재조합 인간-유사 또는 인간화 모노클로날 항체와 같은 치료용 항체이다. 항체는 하이브리드 항체뿐만 아니라 이중 특이성 항체도 포함한다.
한 실시 양태에서, 단백질은 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 중량의 약 6.27% 내지 약 63.7%를 나타낸다. 일부 구체 예에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 약 6.27 중량% 내지 약 18.9 중량%의 단백질을 포함한다. 다른 구체 예에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 약 33.4 중량% 내지 약 63.7 중량%의 단백질을 포함한다.
안정화제는 단백질의 안정성을 유지하는데 도움이 되는 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크에 포함된다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 특정 비율의 안정화제와 단백질을 포함한다. 일부 구체 예에서, 안정화제 대 단백질의 비는 중량 기준으로 약 0.22 : 1 내지 약 6.6 : 1이다. 다양한 구체 예는 0.44 : 1, 0.65 : 1, 0.87 : 1, 1.1 : 1 및 1.3 : 1의 중량 비로 선택된 안정화제 대 단백질 비율을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크가 함유되어 있다. 일부 구체 예에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 밀폐된 약병에 함유된다. 밀봉부는 마개가 될 수 있다. 다른 구체 예에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 주사기 배럴에 담겨있다. 또 다른 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 이중 챔버 자동 주입기의 한 챔버에 수용된다.
한 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크는 단백질, 완충액, 비이온성 계면활성제 및 하나 이상의 안정화제를 물에 배합하여 예비 동결건조된 수용액을 제조함으로써 제조된다. 이후에, 용액을 동결건조하여 수분을 10% 이하, 0.5% 이상 함유하는 케이크를 제조한다. 동결-건조된(동결건조된) 단백질은 "고체 상태"에 있다. 특정 구현 예에서, 단백질은 재조합 인간-유사 또는 인간화 모노클로날 항체이다.
또 다른 양태에 따르면, 치료용 단백질 및 10% 이하의 물 및 0.5% 이상의 물을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
한 구체 예에서, 상기 공정은 용기에서 단백질 및 부형제를 함유하는 수성 시료를 얻는 단계를 포함한다. 상기 용기는 특히 바이알, 주사기 배럴 또는 이중 챔버 자동 주입기의 챔버일 수 있다. 용기는 수증기의 가스 배출을 허용할 수 있도록 충분히 열려 있다. 수성 시료를 담고있는 용기를 챔버에 넣고; 열을 시료로부터 제거하여 제1 온도를 달성하며, 여기서 얼음 크리스탈이 시료 속에 형성된다. 제 1 압력을 얻기 위해 챔버로부터 공기가 제거된다. 그런 다음 열에너지를 시료에 가하여 승화로 시료에서 물을 제거 할 수 있는 제2 온도를 달성한다. 잔류 수분은 승화 후에 시료 내에 포획된 상태로 유지 될 수 있으며, 따라서 추가의 제2 건조 단계가 필요하다. 제2 건조 단계는 챔버내 제1 압력을 유지하면서 열 에너지를 시료에 가하여, 제3 온도를 달성함으로써 달성된다. 그 온도에서, 시료로부터 수분이 탈착되어 10% 이하 및 0.5% 이상의 수분 수준을 얻는다.
일 실시 예에서, 초기 동결 및 1 차 건조 단계 동안, 열은 약 0.5℃/분의 속도로 수성 시료로부터 제거된다. 일 실시 예에서, 제1 온도는 약 -45℃이다. 또 다른 실시 양태에서, 제1 온도는 약 60 분 동안 유지된다. 또 다른 구현 예에서, 수성 시료는 제1 온도를 달성하기 전에 약 30 분 동안 5℃에서 유지된다.
일 실시 예에서, 1차 건조 단계는 약 -25℃의 제2 온도에서 수행된다. 일 실시 예에서, 제2 온도는 약 0.5℃/분의 속도로 선반 온도를 증가시킴으로써 달성된다. 일 실시 예에서, 제2 온도는 약 50 시간 동안 유지된다. 일 실시 예에서, 1차 건조 동안의 챔버 압력은 약 100 mTorr이다.
일 구체 예에서, 2 차 건조 단계는 약 35℃의 제3 온도에서 수행된다. 일 실시 예에서, 가열을 위한 램프 속도는 분당 약 0.3℃이다. 일 실시 예에서, 시료는 약 6 시간 동안 제3 온도에서 유지된다.
2 차 건조 후, 일 실시 예에서, 바이알은 약 608,000 mTorr의 챔버 압력에서 마개가 채워진다. 일 실시 예에서, 챔버는 마개를 채우기에 앞서 N2 가스로 다시 채워진다. 일 실시 예에서, 바이알은 Flurotec® 코팅된 4,432/50 부틸 고무 동결건조 마개로 채워진다.
일 실시 예에서, 건조된 시료를 어닐링하여 단백질을 보다 낮은 에너지 상태로 이완시키고 그 전체 안정성을 개선시킨다. 시료를 어닐링하기 위해, 열 에너지를 시료에 추가하여 제4 온도를 달성한다. 일부 구체 예에서, 시료는 단백질의 최적 유효 이완(알파 및 베타 이완)을 달성하기 위해 적어도 약 24 시간, 적어도 약 48 시간 또는 적어도 약 60 시간 동안 제4 온도에서 유지된다. 일단 단백질이 이의 최적의 이완 상태에 도달하면, 용기를 닫는다.
일 실시 예에서, 제4 온도, 즉, 어닐링 온도는 수분 제거 단계 후의 시료의 유리 전이 온도보다 낮다. 특정 실시 양태에서, 어닐링 온도는 약 70℃이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 어닐링 온도는 약 45℃이다. 일 실시 예에서, 시료는 약 72 시간 동안 어닐링 온도에서 유지된다. 상이한 단백질은 별개의 생물학적 특성을 가지기 때문에, 일부 구체 예에서 제 4 온도는 변조된 시차 주사 열량계(MDSC)를 통해 결정된다. 여기서, 열량계는 2차 건조 단계를 거친 동결건조된 단백질 제형 시료로 채워진다. 열 흐름을 모니터링하면서 시료를 유리 전이를 통해 시료를 증분 가열에 적용한다. Tg가 결정된다. 그런 다음 동결건조 케이크에서 분자의 엔탈피 이완을 유도하기 위해 다양한 시간 동안 다양한 하위 Tg 온도에서 시료를 보관한다. 그런 다음 "이완된"시료를 DSC 또는 MDSC에 적용하여 엔탈피 회수로 인한 피크 면적(온도의 함수로서의 열용량)을 결정한다(참고: Luthra et al., "Effects of annealing on enthalpy relaxation in lyophilized disaccharide formulations: mathematical modeling of DSC curves," 97(8) J Pharm Sci. 3084-99, 2008; 및 L. Thomas, "Modulated DSC® Paper #5: Measurement of Glass Transitions and Enthalpy Recovery," TA Instruments Publication TP 010, New Castle DE, available for download on the world wide web at tainstruments.com (accessed May 13, 2016). 최적의 엔탈피 이완을 제공하는 서브 Tg 온도 및 시간은 제4(일명 어닐링) 온도 및 시간에 대해 선택된다. 또한 W.Q., "Calorimetric analysis of cryopreservation and freeze-drying formulations," 1257 Methods Mol. Biol. 163-79 (2015)를 참고한다.
한 구체 예에서, 예비 동결건조된 수용액(즉, 수성 시료; 즉, 수용액)은 하나 이상의 안정화제, 하나 이상의 완충액 및 임의로 하나 이상의 계면활성제와 같은, 다수의 부형제를 포함한다.
일 구현 예에서, 예비-동결건조된 수용액 뿐만 아니라 재구성된 동결건조된 액체 제형은 단백질 구조 및 기능의 유지를 돕는 pH를 갖는다. 특정 실시 양태에서, 액체 예비-동결건조 및 재구성 후 액체 제형은 약 6.0 ± 2의 pH를 갖는다. 이 실시 양태에서 pH 6 부근에서 완충되는 분자가 유용하다고 여겨진다. 따라서, 일 구체 예에서, 완충액은 히스티딘을 포함한다. 특정 구체 예에서, 수용액은 약 10 mM 히스티딘을 함유한다.
일 구현 예에서, 예비-동결건조된 수용액은 하나 이상의 안정화제를 함유한다. 일부 구체 예에서, 안정화제 또는 안정화제의 조합은 트레할로오스, 소르비톨, 글리세롤, 아르기닌, 알라닌, 만니톨, 수크로스, 프롤린, NaCl 및 글리신 중 하나 이상을 포함한다.
일 구체 예에서, 안정화제 또는 안정화제의 조합은 수크로스를 포함한다. 특정 구체 예에서, 안정화제는 수용액 속에서 약 10%(w/v) 농도의 수크로스를 포함한다. 한 경우, 수크로스가 유일한 안정화제이다. 또 다른 경우에, 수용액은 안정화제로서 10% 수크로스(w/v) 이외에 약 3% ± 0.1%(w/v) 아르기닌을 포함한다.
다른 구체 예에서, 안정화제는 수크로스 및 적어도 하나의 다른 분자 실체를 포함한다. 일부 구체 예에서, 수용액은 약 5% 수크로스 및 다른 하나의 안정화제를 포함한다. 특정 구체 예에서, 수용액은 5% 수크로스 및 (a) 약 1.3% ± 0.1%(w/v) 알라닌, (b) 약 1.5% ± 0.1%(w/v) 아르기닌, (c) 약 1.34% ± 0.1%(w/v) 글리세롤, (d) 약 2.66% ± 0.1%(w/v) 만니톨, 및 (e) 약 2.66% ± 0.1%(w/v)의 소르비톨 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구체 예에서, 안정화제는 수크로스 및 아르기닌을 다양한 농도 및 비율로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 수용액은 약 7.5% 수크로스 및 2.3% ± 0.1% 아르기닌을 포함한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 수용액은 약 12.5% 수크로스 및 3.9% ± 0.1% 아르기닌을 포함한다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 수용액은 약 15% 수크로스 및 4.6% ± 0.1% 아르기닌을 포함한다.
일부 구체 예에서, 안정화제는 단독 안정화제로서 또는 다른 안정화제와 조합된 트레할로오스를 포함한다. 일 구체 예에서, 안정화제는 수용액에서 약 10%(w/v)의 농도로 트레할로오스를 포함한다. 다른 구체 예에서, 수용액은 트레할로오스 약 9.09%(w/v), 및 소르비톨 0.48%(w/v), 글리세롤 0.24%(w/v), 아르기닌 0.28%(w/v), 및 알라닌 0.24%(w/v) 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 수용액은 8.33%(w/v) 트레할로스, 및 0.89%(w/v) 소르비톨, 0.45%(w/v) 글리세롤, 0.51%(w/v) 아르기닌 및 0.43%(w/v) 알라닌 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 수성 시료는 트레할로오스 6.66%(w/v), 및 소르비톨 1.77%(w/v), 글리세롤 0.9%(w/v), 아르기닌 1.03%(w/v), 및 알라닌 0.87%(w/v) 중 어느 하나를 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 수성 시료는 트레할로오스 5%(w/v), 및 소르비톨 2.66%(w/v), 글리세롤 1.34%(w/v), 아르기닌 1.54%(w/v) 및 알라닌 1.3%(w/v) 중 어느 하나를 포함한다.
이 과정의 치료용 단백질은 작은 단백질뿐만 아니라 더 큰 단백질을 포함하여, 어떤 치료용 단백질이 될 수 있다. 일 구현 예에서, 본 발명의 치료용 단백질은 100 킬로 달톤 이상, 또는 약 150 킬로 달톤 이상이다. 본 발명에 포함된 치료용 단백질은 분리된 내인성 단백질, 이종성 발현된 단백질, 및/또는 재조합 단백질, 예컨대 키메라 융합 단백질 또는 내인성 폴리펩티드의 변이체일 수 있다. 한 실시 양태에서, 치료용 단백질은 항원-결합 단백질이다. 항원-결합 단백질은 다른 분자 실체에 결합하는 임의의 단백질을 포함한다. 예를 들어 항원-결합 단백질은 항체, 이중 특이적 항체, 항체 단편, ScFv 융합 단백질, 상보적 결정 영역(CDR)-함유 단백질, 리간드, 수용체, 리간드 단편, 수용체 단편, 리간드 및/또는 수용체 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 트랩 분자를 포함하는 수용체-Fc-융합 단백질을 포함한다.
하나의 실시 양태에서, 치료용 단백질은 항체이다. 특정 실시 양태에서, 치료용 항체는 모노클로날 항체이다. 보다 구체적인 양태에서, 치료용 단백질은 이종 세포주에서 생산된 재조합 인간-유사 또는 인간화 항체이다. 또 다른 실시 양태에서, 치료용 단백질은 수용체-Fc-융합 단백질이다. 또 다른 보다 구체적인 구체 예에서, 치료용 단백질은 아피베르셉트 분자(VEGF 트랩) 또는 릴로나셉트 분자(IL-1 트랩)와 같은 트랩 분자이다.
일부 구체 예에서, 수용액 중의 항체 농도는 낮으며, 0보다 큰 농도(즉, 1㎍/mL 이하) 및 25mg/mL 이하인 농도 범위를 포함한다. 하나의 저 농도 구현 예에서, 항체 농도는 약 2 mg/mL이다.
다른 실시 양태에서, 수용액 중의 항체 농도는 중간이고, 이는 25 mg/mL 초과 및 100 mg/mL 이하의 농도 범위를 포함한다. 하나의 중간 농도 실시 양태에서, 항체 농도는 약 50 mg/mL이다.
다른 구체 예에서, 수용액 중의 항체 농도는 높으며, 이는 100 mg/mL 초과 및 200 mg/mL 이하의 농도 범위를 포함한다. 하나의 고농도 구현 예에서, 항체 농도는 약 150 mg/mL이다.
또 다른 실시 양태에서, 수용액 중의 항체 농도는 초 고농도이며, 이는 200 mg/mL 초과의 항체 농도 범위를 포함한다. 하나의 초 고농도 구현 예에서, 항체 농도는 약 205 mg/mL이다.
상기한 바와 같이, 작용 메카니즘에 한정되지 않고, 물은 동결건조된 제품의 가소제로서의 역할을 할 수 있으며, 이는 놀랍게도 단백질의 안정성을 향상시킨다. 따라서, 일 구체 예에서, 제조된 조성물(즉, 안정한 동결건조 제형)의 수분 함량은 2 중량% 이상 및 10 중량% 이하이다. 또 다른 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 수분 함량은 3 중량% 이상 및 6 중량% 이하이다. 또 다른 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 수분 함량은 4 중량% 이상 및 6 중량% 이하이다. 하나의 특정 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 수분 함량은 약 6%이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 수분 함량은 약 4.5%이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 수분 함량은 약 3%이다.
한 실시 양태에서, 동결건조된 단백질은 실온에서 24개월 이상 동안 안정하다. 특정 실시 양태에서, 약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크의 약 2% 이하가 25℃에서 24개월 저장 후 분해된다. 임의의 메카니즘에 제한되지 않고, 분해는 단백질 분해, 화학적 변형, 응집 등을 수반 할 수 있다. 응집은 항체 분해의 일반적인 형태이며 고 분자량(HMW) 종의 형성에 의해 주목된다. 분해는 당 업계에 공지된 또는 아직 발명되지 않은 임의의 단백질 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항체의 분해는 크기 배제(SE) 크로마토그래피에 의한 고 분자량(HMW) 종의 변화를 측정함으로써 결정된다.
도 1과 2는 시간 경과에 따른 단백질 안정성에 대한 온도와 습기의 영향을 보여주는 막대 그래프이다. X 축은 월 단위의 시간 및 온도로 나타낸다. Y- 축은 단백질의 고 분자량 종의 양에 있어서 변화 퍼센트를 나타낸다. 각 온도에 대해, 개별 막대그래프는 X 축을 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 증가하는 물의 함량 퍼센트(w/w), 0%의 물(열린 막대), 0.5%의 물(밝은 색조의 막대), 1.5%의 물(하향 크로스 해치로 채워진 막대), 3.0%의 물(수직선 채워진 막대), 4.5% 물(가로줄 채워진 막대), 6% 물(열린 다이아몬드 채워진 막대), 8% 물(바둑판 모양의 막대) 및 10% 물(어두운 음영 막대)를 나타낸다.
본 방법이 기술되기 전에, 이러한 방법 및 조건이 변할 수 있으므로, 본 발명은 기술된 특정한 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구현예 만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되므로, 제한하려는 의도는 아니라는 것을 이해해야 한다.
부형제, 성분 및 기타 물질의 절대량 및 상대량은 질량, 또는 몰로 기술 할 수 있다. 질량의 단위는 그램, 밀리그램, 마이크로그램 등으로 표현될 수 있다. "중량/부피"또는 "w/v"와 같은 용어 "중량"은 "질량"을 의미한다. 상대량은 중량 퍼센트(즉, 질량 퍼센트) 로 표현 될 수 있으며, 여기서 용적에 대한 1 중량%(w/v)는 용적 100 밀리리터당 1 그램의 물질을 의미한다. 또한, 예를 들어, 성분 "B" 1 중량부당 성분 "A" 1 중량부는 예를 들면, 성분 "A"의 모든 1 그램에 대해 성분 "B" 1 그램이 존재함을 의미한다. 또한 예를 들어, 성분 "A"의 1 중량 퍼센트(1%)는 예를 들면, 입자의 총 질량의 모든 100 그램에 대해, 성분 "A" 1 그램이 존재함을 의미한다. 성분의 상대량은 주어진 용적당 분자의 몰 또는 수의 측면, 예를 들어, 리터당 밀리몰(밀리몰(mM)), 또는 다른 성분당 밀리몰로 나타낼 수 있는데, 예를 들면, 성분 "B" Y몰 부 당 성분 "A" X 몰 부는 모든 "A"의 X 몰에 대해 "B"의 Y 몰이 존재함을 의미한다.
본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료는 이제 설명된다. 여기에 언급된 모든 간행물은 그 전체를 설명하기 위해 본원에 참고 문헌으로 포함된다.
부형제
부형제는 약제학적 제형의 활성 약제 물질과 함께 첨가되는 성분이다. 부형제는 약물 물질을 안정화시키고/시키거나 제형의 부피를 증가시키는 데 도움이 된다. 성분이라는 용어는 부형제와 상호교환적으로 사용된다.
부형제는 완충제, 부피 조절제, 가용화제, 안정화제, 가소제 및 약물 물질 보호와 같은 다양한 목적을 위한 다양한 물질을 포함한다. 보호제는 열 스트레스 및/또는 교반과 같은 물리적 스트레스로부터 보호한다. 완충액은 당 업계에 잘 알려져 있다.
일반적으로, 동결건조 전 및 재구성 후 단백질을 안정화시키기 위해 완충액을 예비-동결건조 단백질 수용액에 포함시킨다. 완충액은 1 mM 내지 100 mM 농도로 예비-동결건조 용액에 포함될 수 있다. 일부 특정 실시 양태에서, 완충액은 약 10 mM에서 예비-동결건조 용액에 포함된다. 특정 구현 예에서, 완충액은 5 mM ± 0.75 mM 내지 15 mM ± 2.25 mM; 6 mM ± 0.9 mM 내지 14 mM ± 2.1 mM; 7 mM ± 1.05 mM 내지 13 mM ± 1.95 mM; 8 mM ± 1.2 mM 내지 12 mM ± 1.8 mM; 9 mM ± 1.35 mM 내지 11 mM ± 1.65 mM; 10 mM ± 1.5 mM; 또는 약 10 mM의 농도로 예비 동결건조 용액에 존재한다. 특정 구체 예에서, 예비-동결건조 용액의 완충 시스템은 10 mM ± 1.5 mM의 히스티딘, 포스페이트 및/또는 아세테이트를 포함한다.
일부 구체 예에서, 완충액은 약 3 내지 약 9의 pH 범위 내 또는 약 3.7 내지 약 8.0의 pH 범위 내에서 완충될 수 있는 화학 물질로부터 선택된다. 예를 들어, 예비-동결건조된 용액은 pH가 약 3.4, 약 3.6, 약 3.8, 약 4.0, 약 4.2, 약 4.4, 약 4.6, 약 4.8, 약 5.0, 약 5.2, 약 5.4, 약 5.6, 약 5.8, 약 6.0, 약 6.2, 약 6.4, 약 6.6, 약 6.8, 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.6, 약 7.8 또는 약 8.0일 수 있다.
완충액은 예를 들어, 히스티딘 및 아세테이트(히스-아세테이트 완충액)의 조합과 같은 개별 완충액의 조합일 수 있다. 일 구체 예에서, 완충액은 약 3.5 내지 약 6, 또는 약 3.7 내지 약 5.6, 예를 들어 아세테이트에 의해 완충되는 범위의 완충 범위를 갖는다. 하나의 구현 예에서, 완충액은 약 5.5 내지 약 8.5, 또는 약 5.8 내지 약 8.0의 완충 범위, 예를 들어 인산염에 의해 완충된 범위를 갖는다. 일 구체 예에서, 완충액은 히스티딘에 의해 완충되는 범위와 같이 약 5.0 내지 약 8.0 또는 약 5.5 내지 약 7.4의 완충 범위를 갖는다.
부형제에는 안정화제가 포함되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 안정화제는 예비-동결건조된 용액에 첨가되어 응집 또는 다른 분해에 대해 단백질을 안정화시킨다. 안정화는 동결건조 공정동안 유리 역학(glass dynamics)을 제어하거나 안정화제와 단백질의 특이적 상호 작용을 통해 단백질의 고유 구조를 보존하는 것을 도움으로써 발생할 수 있다. 동결건조 동안 안정화제의 생물물리학에 대한 논의는 Chang et al., "Mechanism of protein stabilization by sugars during freeze-drying and storage: native structure preservation, specific interaction, and/or immobilization in a glassy matrix?" 94(7) J. Pharm. Sci. 1427-44 (2005)를 참고한다.
예비-동결건조 용액에 포함시키기 위한 안정화제는 폴리올, 당, 염(예, 염화나트륨), 아미노산 등을 포함한다. 최적의 안정화 효과를 위해 다양한 개별 안정화제를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 안정화제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리올은 당, 당과 아미노산, 폴리올과 아미노산, 염과 당, 염과 아미노산, 염과 폴리올 등과 결합될 수 있다.
폴리올은 하나 이상의 히드록실기(-OH)를 갖는 유기 분자이다. 폴리올은 단량체뿐만 아니라 중합체를 포함한다. 당 알콜은 폴리올의 하위 그룹이다. 유용한 안정화제로 사용될 수 있는 당 알콜은 만니톨, 자일리톨, 소르비톨, 이소말트, 에리스리톨, 말티톨 및 글리세롤을 포함한다. 다른 단량체 폴리올은 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 펜타에리트리톨을 포함한다. 중합체 폴리올은 폴리올 서브유닛의 폴리에스테르 또는 폴리에테르 일 수 있다. 유용한 예시적인 중합체 폴리올은 폴리 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리(테트라메틸렌 에테르)글리콜을 포함한다.
당류는 안정화제(벌킹제 뿐만 아니라)로 사용된다. 당류는 환원당 또는 비-환원당으로 분류할 수 있다. 비-환원 당은 이당류인 수크로스 및 트레할로스를 포함한다. 환원 당은 포도당, 말토즈 및 유당을 포함한다. 일반적으로, 환원 당은 말라드 반응(mallard reaction) 을 통해 단백질을 감소시킬 수 있기 때문에, 비-환원 당이 단백질 동결건조에 바람직하다. 일반적으로 Lavakumar et al., "Lyophilization/Freeze Drying - A Review," 3(4) Int. J. Novel Trends in Pharm. Sci. 2277-2782 (2013)를 참고한다. 이당류 인 트레할로오스 및 수크로스는 비교적 불활성이며 동결건조 중에 비정질 유리를 형성하는 경향이 있다. 트레할로오스 또는 수크로스는 단독으로 또는 아미노산 또는 폴리올과 조합하여, 본 발명의 실시에서 안정화제로서 사용된다.
한 실시 양태에서, 트레할로오스가 유일한 안정화제로서 사용된다. 다른 구체예에서, 트레할로오스는 폴리올과 조합된다. 일부 구체 예에서, 안정화제는 트레할로스 및 소르비톨, 또는 트레할로스 및 글리세롤의 배합물이다. 다른 구체 예에서, 트레할로오스는 아미노산과 결합된다. 구체적으로, 트레할로오스는 알라닌과 결합되거나 트레할로오스는 아르기닌과 결합된다.
다른 구체 예에서, 수크로스가 유일한 안정화제로서 사용된다. 다른 구체 예에서, 수크로스는 폴리올과 조합된다. 특정 구체 예에서, 안정화제는 수크로스 및 만니톨, 수크로스 및 소르비톨, 또는 수크로스 및 글리세롤의 조합물이다. 다른 구체 예에서, 수크로스는 아미노산과 결합된다. 특히, 수크로스는 아르기닌과 결합되거나 수크로스는 알라닌과 결합된다.
아미노산은 안정화제로 사용된다. 글리신은 일반적으로 사용되는 벌크 제와 안정화제이다. 다른 유용한 아미노산은 아르기닌, 알라닌 및 프롤린을 포함한다. 일부 구체 예에서, 아르기닌은 안정화제로서 사용된다. 일부 특정 실시 양태에서, 아르기닌은 수크로스와 조합되거나, 또는 아르기닌은 트레할로오스와 조합된다. 다른 실시 양태에서, 알라닌은 안정화제로서 사용된다. 일부 특정 실시 양태에서, 알라닌은 수크로스와 결합되거나, 알라닌은 트레할로오스와 결합된다.
일부 경우에, 하나 이상의 계면활성제가 부형제로서 사용될 수 있다. 계면활성제는 단백질-단백질 소수성 상호작용 및 결과적으로 고 분자량 종(즉, 응집체)의 형성을 감소시킴으로써 추가적인 안정성을 제공하는 것으로 여겨진다. 일부 구체 예에서, 1 종 이상의 계면활성제(들)는 동결건조 전 단백질 함유 수용액에 포함될 수 있다. 다른 구체 예에서, 하나 이상의 계면활성제(들)가 재구성 희석제 용액에 포함될 수 있다. 계면활성제는 그것이 용해되는 유체의 표면 장력을 감소시키고/시키거나 오일과 물 사이의 계면 장력을 감소시키는 물질을 포함한다. 계면활성제는 이온성 또는 비이온성 일 수 있다. 예비-동결건조 용액 또는 재구성 후 용액에 포함될 수 있는 예시적인 비이온성 계면활성제는 예를 들어, 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 알킬 폴리 글루코시드(예: 옥틸 글루코시드 및 데실 말토시드), 세틸 알코올 및 올레일 알코올 등의 지방 알코올, 코카미드 MEA, 코카미드 DEA 및 코카미드 TEA를 포함한다. 예비-동결 수용액(또는 후 재구성된 용액)에 포함될 수 있는 특정 비이온성 계면활성제는 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(일명, 폴리소르베이트) , 예를 들면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 28, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81 및 폴리소르베이트 85; 폴록사머 188, 폴록사머 407과 같은 폴록사머; 폴리에틸렌-폴리 프로필렌 글리콜; 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 폴리소르베이트 20은 TWEEN 20, 소르비탄 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트로도 알려져 있다. 폴리소르베이트 80은 TWEEN 80, 소르비탄 모노 올레에이트 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트로서 알려져 있다.
예비-동결건조 용액 또는 재구성 용액 내에 함유된 계면활성제의 양은 동결건조 제형의 바람직한 구체적인 특성 및 목적에 따라 달라질 수 있다. 특정 구현 예에서, 예비-동결건조 용액 또는 재구성 용액은 약 0.001%(w/v) 내지 약 0.5%(w/v)의 계면활성제(예, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 예비-동결건조는 약 0.001%; 약 0.0015%; 약 0.002%; 약 0.0025%; 약 0.003%; 약 0.0035%; 약 0.004%; 약 0.0045%; 약 0.005%; 약 0.0055%; 약 0.006%; 약 0.0065%; 약 0.007%; 약 0.0075%; 약 0.008%; 약 0.0085%; 약 0.009%; 약 0.0095%; 약 0.01%; 약 0.015%; 약 0.016%; 약 0.017%; 약 0.018%; 약 0.019%; 약 0.02%; 약 0.021%; 약 0.022%; 약 0.023%; 약 0.024%; 약 0.025%; 약 0.026%; 약 0.027%; 약 0.028%; 약 0.029%; 약 0.03%; 약 0.031%; 약 0.032%; 약 0.033%; 약 0.034%; 약 0.035%; 약 0.036%; 약 0.037%; 약 0.038%; 약 0.039%; 약 0.04%; 약 0.041%; 약 0.042%; 약 0.043%; 약 0.044%; 약 0.045%; 약 0.046%; 약 0.047%; 약 0.048%; 약 0.049%; 약 0.05%; 약 0.051%; 약 0.052%; 약 0.053%; 약 0.054%; 약 0.055%; 약 0.056%; 약 0.057%; 약 0.058%; 약 0.059%; 약 0.06%; 약 0.061%; 약 0.062%; 약 0.063%; 약 0.064%; 약 0.065%; 약 0.066%; 약 0.067%; 약 0.068%; 약 0.069%; 약 0.07%; 약 0.071%; 약 0.072%; 약 0.073%; 약 0.074%; 약 0.075%; 약 0.076%; 약 0.077%; 약 0.078%; 약 0.079%; 약 0.08%; 약 0.081%; 약 0.082%; 약 0.083%; 약 0.084%; 약 0.085%; 약 0.086%; 약 0.087%; 약 0.088%; 약 0.089%; 약 0.09%; 약 0.091%; 약 0.092%; 약 0.093%; 약 0.094%; 약 0.095%; 약 0.096%; 약 0.097%; 약 0.098%; 약 0.099%; 약 0.10%; 약 0.15%; 약 0.20%; 약 0.25%; 약 0.30%; 약 0.35%; 약 0.40%; 약 0.45%; 또는 약 0.50%의 계면활성제(예: 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80)를 함유할 수 있다.
하나 이상의 가소제가 동결건조된 단백질 조성물에 포함된다. 가소제는 일반적으로 시스템의 유동성 또는 유연성을 높이기 위해 사용된다. 증가된 유동성은 가소제가 시스템의 자유 부피를 증가시키고 유리 전이 온도를 낮춘 결과로 생각된다. 가소제의 첨가는 동결건조 케이크 내의 알파-이완 및 베타-이완 둘 다를 변형시킨다. 알파-이완은 일차 또는 유리 이완으로도 알려져 있으며 전체적인 이완 과정이다. 베타 이완은 더 작은 분자(즉: 가소제)로 더 잘 변형 될 수 있는 단백질 중합체 골격 운동과 관련된 보다 로컬 프로세스이다. 두 완화 과정 모두 시스템의 전반적인 에너지를 감소시키고, 특히 베타-이완의 경우 단백질 안정성에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 가소제가 베타-이완 시간을 감소시키고 단백질 안정성을 동시에 감소시킬 수 있음은 단백질 생물리학 분야에 일반적으로 알려져 있다(참고: 예컨대, Cicerone and Douglas, "β-Relaxation governs protein stability in sugar-glass matrices," Soft Matter 8: 2983-2991, 2012).
본 발명은 또한 하나의 양태로서 단백질 안정성을 보존하거나 증진시키면서, 케이크에 충분한 가요성 및 알파-완화를 제공하는 "안정화제"를 생성하기 위한 특정 비율로 하나 이상의 가소제와 결합된 하나 이상의 당을 함유하는 동결건조된 단백질 제형 양태를 제공한다. 일부 구체 예에서, 안정화제는 약 19 : 1 내지 약 1 : 1의 당 대 가소제의 중량 대 중량(즉, 질량 대 질량)의 비율을 포함한다. 일부 구체 예에서, 안정화제는 당 대 가소제의 중량 대 중량 비가 약 19 : 1, 약 18 : 1, 약 17 : 1, 약 16 : 1, 약 15 : 1, 약 14 : 1, 약 13 : 1, 약 12 : 1, 약 11 : 1, 약 10 : 1, 약 9 : 1, 약 8 : 1, 약 7 : 1, 약 6 : 1, 약 5 : 1, 약 4 : 3 : 1, 약 2 : 1, 또는 약 1 : 1이다.
유용한 가소제는 소르비톨, 글리세롤(글리세린), 만니톨 및 자일리톨과 같은 폴리올, 글리신, 아르기닌, 프롤린 및 알라닌과 같은 아미노산, 및 NaCl과 같은 염을 포함한다. 흥미롭게도, 물은 가소제로도 작용할 수 있다. 그러나, 물은 일반적으로 증가된 이동성과 감소된 Tg를 야기하는 화학 반응물 및 가소제 둘 다이기 때문에 일반적으로 선호되지 않는다. 증가된 이동성은 시스템 내에서 증가된 반응성 및 가수 분해와 상호관련이 있다. 증가된 반응성 및 가수 분해는 단백질 안정성을 침식한다. Terakita et al., "The Influence of Water on the Stability of Lyophilized Formulations with Inositol and Mannitol as Excipients," 57(5) Chem. Pharm. Bull. 459-463 (2009)를 참고한다.
전술한 바와 같이, 물과 조합된 만니톨, 글리세롤, 소르비톨 및 글리신은 일부 구체 예에서 가소제로서 사용된다. 이론에 얽매이지 않고, 특히 제형 실시 양태의 이들 분자는 베타-이완 시간을 감소시키는 한편 단백질 안정성을 증가시키는 것으로 여겨진다.
일부 특정 구체 예에서, 당 수크로스 또는 트레할로오스는 약 4 : 1, 약 3.9 : 1, 약 3.8 : 1, 약 3.7 : 1, 약 3.6 : 1, 약 3.5 : 1, 약 3.4 : 1, 약 3.3 : 1, 약 3.2 : 1, 약 3.1 : 1, 약 3 : 1, 약 2.9 : 1, 약 2.8 : 1, 약 2.7 : 1, 약 2.6 : 약 2.4 : 1, 약 2.3 : 1, 약 2.2 : 1, 약 2.1 : 1, 약 2 : 1, 약 2 : 1, 약 1.9 : 1, 약 1.8 : 1, 약 1.7 : 약 1.6 : 1, 약 1.5 : 1, 약 1.4 : 1, 약 1.3 : 1, 약 1.2 : 1, 약 1.1 : 1 또는 약 1 : 1 의 중량 대 중량비로 가소제인 소르비톨과 배합된다. 다른 특정 실시 예에서, 당 수크로스 또는 트레할로스는 약 33 : 1, 약 32 : 1, 약 31 : 1, 약 30 : 1, 약 29 : 1 약 28 : 1, 약 27 : 1, 약 26 : 1, 약 25 : 1, 약 24 : 1, 약 23 : 1, 약 22 : 1, 약 21 : 1, 약 20 : 1, 약 19 : 1 약 18 : 1, 약 17 : 1, 약 16 : 1, 약 15 : 1, 약 14 : 1, 약 13 : 1, 약 12 : 1, 약 11 : 1, 약 10 : 1, 약 9 : 1 약 8 : 1, 약 7 : 1, 약 6 : 1, 약 5 : 1, 약 4.5 : 1, 약 4 : 1, 약 3.5 : 1 또는 약 3 : 1의 중량 대 중량비로 가소제인 아르기닌과 조합된다.
또한, 본 발명은 물이 동결건조된 조성물에서 안정화 가소제로서 작용하고 실온에서 저장되는 동결건조된 조성물에서 단백질 응집 속도를 감소시키는 것을 돕는 일면을 제공한다. 실온에서 동결건조 케이크에서 단백질을 효과적으로 안정화 시키는데 필요한 수분의 양은 단백질 함량이 증가함에 따라 증가하고, 단백질 함량이 감소함에 따라 감소한다. 따라서, 50 mg/mL의 단백질을 함유하는 예비-동결건조 용액으로부터 유도된 동결건조된 조성물은 150 mg/mL의 단백질을 함유하는 예비-동결건조 용액으로부터 유도된 동결건조된 조성물보다 낮은 수분 함량을 필요로 할 수 있다. 또한 동결건조 케이크에서 단백질을 효과적으로 안정화시키는 데 필요한 최적의 수분량은 보관 온도에 따라 달라진다. 예를 들어, 중간 정도의 수분은 실온에서 단백질 동결건조물의 장기 저장에 유리한다. 더 높은 보관 온도(예: 37℃)에서는 습기가 거의 필요하지 않다.
예를 들어, 도 1은 25℃, 37℃ 또는 50℃에서 저장되는 예시적인 항체 동결건조 제형의 안정성에 대한 수분의 영향을 나타낸다. 여기서, 예비-동결건조된 제형은 150 mg/mL의 IgG, 5% 수크로스 및 1.54% 아르기닌을 함유하였다. 최종 동결건조 케이크는 0%, 0.5%, 1.5%, 3.0%, 4.5%, 6%, 8% 또는 10%의 수분(w/w)을 함유 하였다. 도 1에서 보듯이 저장 온도가 높을수록 2 ~ 3개월에 걸쳐 단백질 안정성이 낮아졌다. 흥미롭게도 최대 안정성을 전달하는 최적의 수분량은 실내 온도가 37℃ 또는 50℃보다 높았다. 이 특정 예에서, 실온에서 단백질 안정성을 위한 최적의 수분 함량은 약 4.5%(w/w)이고, 50℃에서 2개월 동안 저장시 약 1.5% 내지 약 3%이다. 장기간 안정성 데이터는 도 2에 예시되어 있으며, 이는 예시적인 항체 동결건조 제형이 각각 25 ℃ 및 37℃에서 12개월 및 6개월 동안 저장되었음을 나타낸다. 도 2에서 알 수 있듯이, 3.0%에서 4.5%(w/w)의 수분 함량이 시험한 온도 둘 다에서 가장 우수한 안정성을 전달하였고, 4.5%의 수분 함량은 실온(25℃) 조건 하에서 12개월째에 최대 안정성을 제공하였다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 실온(25℃)에서 12개월 이상 동안 안정한 1.5% 내지 8%의 물(w/w)을 포함하는 안정한 동결건조된 단백질(예: 항체) 제형을 제공하며, 여기서 안정성은 12개월 저장 기간 동안 고 분자량 종의 2% 미만의 증가를 의미한다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 실온(25℃)에서 12개월 이상 동안 안정한 3.0% 내지 4.5% 물(w/w)을 포함하는 안정한 동결건조된 단백질(예: 항체) 제형을 제공하며, 여기서 안정성은 12개월 저장 기간에 걸쳐 고 분자량 종의 1.5% 미만의 증가를 의미한다.
일부 구현 양태에서, 동결건조된 조성물은 0.5 중량% 이상의 물, 0.6 중량% 이상의 물, 0.7 중량% 이상의 물, 0.8 중량%의 물, 0.9 중량% 이상의 물, 1 중량% 이상의 물, 1.5 중량% 이상의 물, 2 중량% 이상의 물, 2.5 중량% 이상의 물, 3 중량% 이상의 물, 3.5 중량% 이상의 물, 4 중량% 이상의 물, 4.5 중량% 이상의 물, 5 중량% 이상의 물, 5.5 중량% 이상의 물, 6 중량% 이상의 물, 6.5 중량% 이상의 물, 7 중량% 이상의 물, 7.5 중량% 이상의 물, 8 중량% 이상의 물, 8.5 중량% 이상의 물, 0 9 중량% 이상의 물, 또는 9.5 중량%의 물, 그러나 10 중량% 이하의 물을 함유한다. 그러나 최적의 양의 물은 단백질의 불안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 구체 예에서, 동결건조된 조성물은 10 중량% 이하의 물, 9.5 중량% 이하의 물, 9 중량% 이하의 물, 8.5 중량% 이하의 물, 8 중량% 이하의 물, 7.5 중량% 이하의 물, 7중량% 이하의 물, 6.5 중량% 이하의 물, 6 중량% 이하의 물, 5.5 중량% 이하의 물, 5 중량% 이하의 물, 4.5 중량% 이하의 물, 4 중량% 이하의 물, 3.5 중량% 이하의 물, 3 중량% 이하의 물, 2.5 중량% 이하의 물, 2 중량% 이하의 물, 1.5 중량% 이하의 물, 1 중량% 이하의 물, 0.9 중량% 이하의 물, 0.8 중량% 이하의 물, 0.7 중량% 이하의 물, 0.6 중량% 이하의 물, 그러나 0.5 중량% 이상의 물을 함유한다.
"수분 함량"이라는 문구는 "물 함량"과 호환하여 사용할 수 있다. 그러나 "수분 함량"은 동결건조 케이크의 물 함량을 나타내는 데 사용되는 반면, "물 함량"은 수용액, 겔, 다른 액체, 기체, 얼음 또는 동결건조 케이크, 분무 건조된 입자와 같은 제형의 고체 형태 속의 물의 양을 설명하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 수분 함량은 0.5중량% 내지 10 중량%, 1중량% 내지 10 중량%, 2중량% 내지 10 중량%, 3중량% 내지 10 중량%, 4중량% 내지 10 중량%, 5중량% 내지 10 중량%, 6중량% 내지 10 중량%, 7중량% 내지 10 중량%, 8중량% 내지 10 중량%, 9중량% 내지 10 중량%, 0.5중량% 내지 9중량%, 0.5중량% 내지 8중량%, 0.5중량% 내지 7중량%, 0.5중량% 내지 6중량%, 0.5중량% 내지 5중량%, 0.5중량% 내지 4중량%, 0.5중량% 내지 3중량%, 0.5중량% 내지 2중량%, 0.5중량% 내지 1중량%, 1중량% 내지 2중량%, 1.5중량% 내지 2.5중량%, 2중량% 내지 3중량%, 2.5중량% 내지 3.5중량%, 3중량% 내지 4중량%, 3.5중량% 내지 4.5중량%, 4중량% 내지 5중량%, 4.5중량% 내지 5.5중량%, 5중량% 내지 6중량%, 5.5중량% 내지 6.5중량%, 6중량% 내지 7중량%, 6.5중량% 내지 7.5중량%, 7중량% 내지 8중량%, 7.5중량% 내지 8.5중량%, 8중량% 내지 9중량%, 8.5중량% 내지 9.5중량%, 9중량% 내지 10 중량%, 9.5중량% 내지 10 중량%, 또는 약 1중량%, 2중량%, 3중량%, 4중량%, 5중량%, 6중량%, 7중량% 또는 8중량%이다. 일부 구체 예에서, 동결건조된 조성물의 수분 함량은 3중량% 내지 6중량%; 3.1중량% 내지 5.9중량%, 3.2중량% 내지 5.8중량%, 3.3중량% 내지 5.7중량%, 3.4중량% 내지 5.6중량%, 3.5중량% 내지 5.5중량%, 3.6중량% 내지 5.4중량%, 3.7중량% 내지 5.3중량%, 3.8중량% 내지 5.2중량%, 3.9중량% 내지 5.1중량%, 4중량% 내지 5중량%, 4.1중량% 내지 4.9중량%, 4.2중량% 내지 4.8중량%, 4.3중량% 내지 4.7중량%, 4.4중량% 내지 4.6중량%, 또는 약 4.5중량%이다. 일부 구체 예에서, 동결건조된 조성물의 수분 함량은 2중량% 내지 4중량%; 2.1중량% 내지 3.9중량%, 2.2중량% 내지 3.8중량%, 2.3중량% 내지 3.7중량%, 2.4중량% 내지 3.6중량%, 2.5중량% 내지 3.5중량%, 2.6중량% 내지 3.4중량%, 2.7중량% 내지 3.3중량%, 2.8중량% 내지 3.2중량%, 2.9중량% 내지 3.1중량%, 또는 약 3중량%이다.
일부 실시 양태에서, 동결건조 케이크에서의 중량% 로의 수분 함량은 약 3중량%, 약 3.1중량%, 약 3.2중량%, 약 3.3중량%, 약 3.4중량%, 약 3.5중량%, 약 3.6중량%, 약 3.7중량%, 약 3.8% , 약 3.9중량%, 약 4중량%, 약 4.1중량%, 약 4.2중량%, 약 4.3중량%, 약 4.4중량%, 약 4.5중량%, 약 4.6중량%, 약 4.7중량%, 약 4.8중량%, 약 4.9중량%, 약 5중량%, 약 5.1중량%, 약 5.2중량%, 약 5.3중량%, 약 5.4중량%, 약 5.5중량%, 약 5.6중량%, 약 5.7중량%, 약 5.8중량중량%, 약 5.9중량%, 약 6중량%, 약 6.1중량%, 약 6.2중량%, 약 6.3중량%, 약 6.4중량%, 약 6.5중량%, 약 6.6중량%, 약 6.7중량%, 약 6.8중량%, 약 6.9중량%, 약 7중량%, 약 7.1중량%, 약 7.2중량%, 약 7.3중량%, 약 7.4중량%, 약 7.5중량%, 약 7.6중량%, 약 7.7중량%, 약 7.8중량%, 약 7.9% 또는 약 8%이다. 일부 구체 예에서, 동결건조 케이크의 수분 함량은 3 중량% 이상 그러나 10 중량% 미만이다.
동결건조 케이크의 수분 함량은 당 업계에 공지된 임의의 하나 이상의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법에는 열 중량 측정, 가스 크로마토그래피, 근적외선 분광법, 전기량 법, 칼 피셔(Karl Fischer) 법 또는 상대 습도 센서 법을 포함하는 중량 측정법이 포함된다. 이러한 방법 중 일부는 J. K. Townes, "Moisture content in proteins: its effects and measurement," 705 J. Chromatography A 115-127, 1995; and Malik et al., "Analytical Options for the Measurement of Residual Moisture Content in Lyophilized Biological Materials," Am. Pharma. Rev. August 01, 2010; 및 그 안에 인용된 참고 문헌을 포함한다. 예를 들어, LOD(건조시 손실: Loss on Drying) 방법(중량 측정법)을 사용하여 동결건조 케이크를 칭량하고, 추가 가열을 통해 모든 물 및 기타 휘발성 물질을 완전히 제거한 다음, 다시 무게를 측정할 수 있다. 질량 손실은 출발 물질 내에 함유된 물(및 다른 휘발성 물질)에 기인한다. 수분 함량을 결정하는 또 다른 방법은 카알 피셔 법(용적 또는 전기량)이며, 이는 I2에 의한 SO2의 산화를 측정함으로써, H2O의 양을 결정하며, 여기서 I2의 1 몰은 H2O의 몰 당 소비자이다. 근적외선 분광법은 시료를 파괴하지 않고 수분 함량을 결정하기 위해 단백질을 함유한 유리 바이알(유리 표면)을 통해 1100 nm에서 2500 nm까지 반사율을 측정한다. 참조: United States Pharmacopeia, XXIII Revision, USP Convention, Rockville, MD 1995, pp. 1801-1802; 및 Savage et. al., "Determination of Adequate Moisture Content for Efficient Dry-Heat Viral Inactivation in Lyophilized Factor VIII by Loss on Drying and by Near Infrared Spectroscopy," 26 Biologicals 119-124, 1998.
동결건조 케이크
단백질 및 안정화제를 함유하는 동결건조된 조성물은 "케이크" 또는 "동결건조 케이크"로도 알려진 고체 매트릭스를 형성한다. "약제학적으로 허용되는 케이크"( "약제학적으로 허용되는 동결건조 케이크"와 호환 가능하게 사용됨)는 비결정질(유리질, 결정질이 아님)이며 심미적으로 우아한 외관을 갖는다. 약제학적으로 허용되는 케이크는 수축, 균열, 부분적 또는 전체 붕괴, 용융 되돌림(melt back) 또는 변색을 보여서는 안된다. 적색, 흑색, 갈색, 황색 또는 다른 색조의 케이크는 변색되어 허용되지 않는다. 이상적인 케이크는 기계적으로 강하며 취급시 파손되거나, 다공성 및 스폰지 같은, 균일한 조직감 및 단일 실체를 형성하고 균일하게 백색이다. 케이크는 유리 병의 벽에 균일하게 부착되어야 하며 박리 또는 기타 수축의 징후가 보이지 않아야 한다. Carpenter et al., "Rational design of stable lyophilized protein formulations: Some practical advice," Pharmaceutical Research, 14(8): 969-975, 1997를 참고한다.
케이크는 굴뚝과 같은 구조; 상부 표면 영역에 건조된 폼; 케이크 표면에 껍질을 벗기거나 윤이 나기; 및 수평 층화 또는 링 형성을 포함하여 동결 문제로 인한 시각적 결함이 없어야 한다. 케이크는 수축(여기서 케이크 부피는 동결된 매트릭스보다 작고 벽 분리의 징후가 명백하다); 크래킹(여기서 케이크는 건조한 매트릭스에 균열을 보여주며 케이크는 단일 실체를 형성하지 않는다); 케이크의 전체 또는 부분적 붕괴와 같은, 케이크 구조 손실의 상이한 정도; 용융 백(여기서 케이크는 하부 영역에 용해된 물질의 고리를 함유한다); 부분 용융 백(여기서 케이크의 기저부에 있은 작은 영역 만이 용해된 물질을 포함한다); 및 메일라아드 반응(Maillard reaction)을 겪는 환원 당의 혼입으로 인한 케이크의 황색 또는 갈색으로의 변색인, 브라우닝(browning)을 포함하는 건조 문제로 인한 시각적 결함이 없어야 한다. 용융 백은 느린 용출 시간, 단백질 응집, 분해 및 효력 상실로 이어질 수 있기 때문에 특히 문제가 된다. FDA, "Guide to Inspections of Lyophilization of Parenterals (7/93). Finished product inspection. Last update 2009," 2009, last accessed 7/8/2016 from http://www.fda.gov/ICECI/Inspec-tions/InspectionGuides/ucm074909.htm을 참고한다.
단백질 의약품
용어 "단백질"은 아미드 결합을 통해 공유 결합된 약 50개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 의미한다. 단백질은 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 함유하며, 일반적으로 "폴리펩타이드"로서 당 업계에 공지되어 있다. 단백질은 단일 작용성 생체 분자를 형성하기 위해 하나 또는 다수의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 50개 이상의 아미노산을 함유하는 반면, "펩타이드"는 일반적으로 50개 이하의 아미노산을 함유한다. 단백질은 하나 이상의 공유 결합 및 비공유 결합을 포함할 수 있다. 디설파이드 브릿지(즉, (시스틴을 형성하기 위한 시스테인 잔기 사이)가 일부 단백질 속에 존재할 수 있다. 이들 공유 결합은 단일 폴리펩타이드 사슬 내 또는 2 개의 개별 폴리펩타이드 사슬 사이에 존재할 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 브릿지는 인슐린, 면역글로불린, 프로타민 등의 적절한 구조 및 기능에 필수적이다. 최근의 이황화 결합 형성에 관한 검토는 Oka and Bulleid, "Forming disulfides in the endoplasmic reticulum," 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9 (2013)를 참고한다.
이황화 결합 형성 외에, 단백질은 다른 번역 후 변형을 겪을 수도 있다. 이러한 변형은 지질화(예를 들어, 미리스토일화, 팔미토일화, 파르네소일화, 게라닐게라닐화 및 글리코실포스파티딜리노시톨(GPI) 앵커 형성), 알킬화(예를 들어, 메틸화), 아실화, 아미드화, 글리코실화(예를 들면, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시라이신, 세린, 트레오닌, 티로신 및/또는 트립토판에서 글리코실 그룹의 첨가), 및 인산화(즉, 세린, 트레오닌, 티로신 및/또는 히스티딘에 대한 인산기의 첨가)를 포함한다. 진핵 생물에서 생산된 단백질의 번역 후 변형에 대한 최근의 검토를 위해, Mowen and David, "Unconventional post-translational modifications in immunological signaling," 15(6) Nat Immunol 512-20 (2014); and Blixt and Westerlind, "Arraying the post-translational glycoproteome (PTG)," 18 Curr Opin Chem Biol. 62-9 (2014)를 참고한다..
면역글로불린(일명 "항체")은 다중 폴리펩티드 사슬과 광범위한 번역 후 변형을 갖는 단백질의 예이다. 정식 면역글로불린 단백질(예, IgG)은 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 시스틴 디설파이드 결합을 통해 하나의 중쇄에 연결되고, 두 중쇄는 두 개의 시스틴 디설파이드 결합을 통해 서로 결합된다. 포유류 시스템에서 생산된 면역글로불린은 다양한 폴리사카라이드와 함께 다양한 잔기(예: 아스파라긴 잔기)에서 글리코실화되며 , 종에 따라 다르므로, 치료 항체의 항원성에 영향을 미칠 수 있다(참고: Butler and Spearman, "The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering", 30 Curr Opin Biotech 107-112 (2014)).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "단백질"은 치료용 단백질, 연구 또는 치료에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론 항체, 인간 항체, 이중 특이성 항체, 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩타이드 호르몬 등을 포함한다. 단백질은 곤충 바쿨로 바이러스 시스템, 효모 시스템(예: 피키아 종(Pichia sp.)), 포유 동물 시스템(예: CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)과 같은 재조합 세포 기반 생산 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 치료용 단백질과 그 생산에 관한 최근의 리뷰는 Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012)를 참고한다.
일부 재조합 Fc- 함유 단백질은 생물학적 시스템에서 동족 결합 파트너를 갖는 수용체 또는 수용체 단편, 리간드 또는 리간드 단편을 함유한다. "수용체 Fc- 융합 단백질"은 면역 글로불린 Fc 도메인에 융합된 가용성 수용체를 함유하는 재조합 분자를 지칭한다. 일부 수용체 Fc-융합 단백질은 다수의 상이한 수용체의 리간드 결합 도메인을 함유할 수 있다. 이러한 수용체 Fc-융합 단백질은 "트랩"또는 "트랩 분자"로 알려져 있다. 릴로노셉트 및 아플리베르셉트 는 IL1R(미국 특허 제 7,927,583 호 참조) 및 VEGF(미국 특허 제 7,087,411 호 참조)에 각각 길항하는 시판되는 트랩의 예이다. 다른 재조합 Fc-함유 단백질은 Fc 도메인에 융합된 펩타이드를 함유하는 재조합 단백질, 예를 들어 Centocor's MIMETIBODYTM 기술을 포함한다. 재조합 Fc-함유 단백질은 C. Huang, "Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY technology," 20(6) Curr. Opin. Biotechnol. 692-9 (2009)에 기술되어 있다.
"Fc 융합 단백질"은 2 개 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하며, 그 중 하나는 면역글로블린 분자의 Fc 부분이며, 자연 상태에서 융합되지 않는다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1 의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트; 이의 전체가 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,927,004호), 또는 hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유하는 아플리베르셉트; 예를 들어, 서열 번호 1; 미국 특허 제 7,087,411호 및 제 7,279,159호 참조, 이의 전체는 본원에 참고로 인용됨)이다.
일부 구체 예에서, 단백질은 40 mg/mL 초과의 농도로 예비 동결건조된 수용액에 포함된다. 일부 구체 예에서, 예비-동결건조된 수용액은 단백질을 약 50 mg/mL 내지 약 250 mg/mL; 약 100 mg/mL 내지 약 200 mg/mL; 약 125 mg/mL 내지 약 175 mg/mL의 농도의 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 예비-동결건조된 수용액은 약 45 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 105 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 115 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 125 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 135 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 145 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 155 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 165 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 175 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 185 mg/mL, 약 190 mg/mL, 약 195 mg/mL 또는 약 200 mg/mL의 농도로 포함한다.
용기
일부 구체 예에서, 치료용 단백질을 함유하는 예비-동결건조된 수용액은 용기에 담겨있다. 동결-건조 공정은 환기된 용기 내의 용액에 적용되며, 그 후 동결-건조된 조성물을 함유하도록 폐쇄된다. 용기라는 용어는 본 명세서에서 매우 광범위하게 적용된다. 용기는 예를 들어 2 mL 내지 4 리터 또는 그 이상을 함유할 수 있는 병, 자(jar) 또는 캐니스터(canister)와 같은 벌크 용기, 앰플, 바이알(유리 또는 플라스틱), 주사기(유리 또는 플라스틱), 카트리지 , 또는 자동주사기일 수 있다. 바이 알은 0.2 mL 이하로 작거나 100 mL만큼 클 수 있다. 예시 바이알은 투명 유리 또는 호박색 유리, I 형 붕규산 유리, II 형 소다-규산염 유리 또는 III 형 소다-규산염 유리로 만들 수 있다. 바이알은 스토퍼(stopper), 캡(cap), 플립 캡(flip cap) 또는 스크류 캡(screw cap)으로 닫을 수 있다. SCHOTT®- 스타일 관 유리는 동결건조 적용에 특히 유용하다.
생물 의약품의 진전과 주사가능한 약물의 환자 자가 투여로 인하여, 자가 주사기는 의약품의 보다 중요한 용기가 되었다. 동결건조된 약물 제품의 자가 투여는 환자가 주사용 멸균 수 또는 다른 무균 용매로 동결건조 케이크를 재구성할 것을 요구한다. 멸균 재구성, 부피 조절, 취급 용이성 및 전반적인 단순화를 보장하기 위해, 이중 또는 다중-챔버 미리 채워진 주사기를 사용할 수 있다. 이중-챔버 자동 주사기 또는 다른 미리 채워진 주사기는 하나의 챔버에서 동결건조 약물을 함유하고 다른 챔버에서 희석액 또는 액체 약학 조성물의 사전 측정된 양을 함유한다. 예시적인 이중 챔버 분사기는 2006년 11월 21일에 승인된 미국 특허 제 6,149,626A호, 2011 년 6월 14일 승인된 미국 특허 제 7,959,600 B2호에 개시되어 있다.
단백질 안정성
단백질의 동결건조된 형태는 몇 가지 장점을 제공하는데, 그 중 하나는 시간 경과, 특히 실온에서 적어도 18개월 동안 단백질의 안정성을 유지하는 것이다. "실내 온도"는 일반적인 작업 환경의 온도를 나타낸다. 실내 온도는 10 - 40℃, 17 - 27℃, 20 - 24℃, 25℃ ± 3℃, 25℃ ± 2℃, 25℃ ± 1℃, 또는 약 25℃이다. "실내 온도"라는 문구는 "주위 온도"라는 문구와 상호 교환하여 사용할 수 있다. 실내 온도는 약국, 병원 및 창고에서 경험할 수 있는 15°~ 30°사이의 "일시적인 편차(편이)"가 있는 20℃~25℃의 일반적인 작업 환경의 온도를 나타내는, "제어된 실내 온도"를 포함한다. "통제된 실내 온도"는 25℃ 이하의 계산된 평균 운동 온도를 포함한다(참고: The Pharmacopeia of the United States of America, Thirty-Third Revision and the National Formulary, Twenty-Eighth Edition, USP 33-NF 28 Reissue, General Notices and Requirements, "Applying to Standards, Tests, Assays, and Other Specifications of the United States Pharmacopeia", §10.30 Storage Temperature and Humidity, May 1, 2010, available at http://www.usp.org/sites/default/files/usp_pdf/ EN/USPNF/USP33-NF28-ReissueGeneralNotices.pdf, last accessed July 8, 2016).
용어 "안정성"은 관련 환경 또는 특정 조건에서 저장 후 단백질의 수용 가능한 정도의 물리적 구조(열역학 및 콜로이드 안정성), 화학 구조(동역학 안정성) 또는 생물학적 기능(기능적 안정성)의 유지를 의미한다 . 단백질은 일정 시간 동안 저장 후 물리적 구조, 화학 구조 또는 생물학적 기능의 100%를 유지하지 않더라도 안정적일 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 단백질은 최대 24개월 동안 실온에서 보관한 후에 고 분자량 형태로 존재하는 단백질 집단이 2% 이하일 때 안정한 것으로 간주된다. 일부 실시 양태에서, 단백질의 동결건조된 또는 달리 고체인 형태는 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1.0%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2% 또는 약 0.1% 이하의 단백질이 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 13개월, 약 14개월, 약 15개월, 약 16개월, 약 17개월, 약 18개월, 약 19개월, 약 20개월, 약 21개월, 약 22개월, 약 23개월, 약 24개월, 약 36개월 또는 18개월 이상 동안 실온에 저장 후 고 분자량 형태로 존재하는 경우 안정한 것으로 고려된다.
여기에서, 고 분자량 종에서의 퍼센트 변화가 실온에서 저장의 첫 달 동안 약 0.5% 초과, 약 0.6% 초과, 약 0.7% 초과, 약 0.8% 초과, 또는 약 0.9% 초과인 경우, 동결건조된 또는 다른 고체 형태의 단백질은 실온에서 "불안정"한 것으로 고려된다. 따라서, 실온에서의 저장 1개월 동안 0.5% 이하의 고 분자량 종의 퍼센트 증가를 갖는 단백질의 동결건조된 또는 다른 고체 형태는 안정한 것으로 간주 될 수 있다.
[00044] 안정성은 정해진 온도에서 또는 환자로의 전달 후에 정의된 시간 동안 저장 후 제형 속에 유지되는 천연 분자의 비율을 결정함으로써, 특히, 측정할 수 있다. 그 고유 형태(예를 들어, 고 분자량 및 저 분자량 종을 포함하여, 총 단백질에 대한 천연 종의 일부)를 보유하는 단백질의 백분율은 특히 크기 배제 크로마토그래피(예: 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 [SE-HPLC])에 의해 측정할 수 있다. 동결건조된 단백질의 경우, 케이크를 먼저 가용화시킨 다음 단백질을 시험한다. 천연 단백질은 응집되지 않거나 분해되지 않는 단백질을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 단백질의 천연 형태를 정의된 온도에서 정의된 시간 동안 저장 후 동결건조 케이크에서 검출할 수 있다. 동결건조 케이크의 단백질의 80% 이상은 천연 형태이어야 하며, 90% 이상이 바람직하다. 안정도를 측정한 후 정의된 시간은 적어도 14일, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 13개월, 적어도 14개월, 적어도 15개월, 적어도 16개월, 적어도 17개월, 적어도 18개월, 적어도 19개월, 적어도 20개월, 적어도 21개월, 적어도 22개월, 적어도 23개월, 적어도 24개월 이상일 수 있다. 안정성 평가의 경우 시료가 유지될 수 있는 온도는 약 -80°C 내지 약 50°C의 임의의 온도, 예를 들면, 약 -80°C, 약 -30°C, 약 -20°C, 약 0°C, 약 4°-8°C, 약 5°C, 약 25°C 또는 다른 실온, 약 35°C, 약 37°C 또는 다른 생리학적 온도, 약 45°C 또는 약 50°C에서의 저장일 수 있다.
안정성은 특히 정해진 온도로 정의된 시간량 이후 동결건조 케이크 내의 응집체(즉, 고 분자량 종, 일명 HMW 종)를 형성하는 단백질의 비율을 결정함으로써 측정할 수 있으며, 여기서 안정성은 형성된 고 분자량(HMW) 종 퍼센트에 대해 역 비례한다. 단백질의 HMW 종의 백분율은 특히 상기 한 바와 같이 가용화 후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 동결건조된 단백질 조성물은 또한 실온에서 3개월 후 단백질의 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만이 HMW 형태로 검출되는 경우 안정한 것으로 고려될 수 있다.
안정성은 규정된 온도에서 규정된 시간 후에 동결건조 케이크내에서 분해되거나 그렇지 않으면 저 분자량(LMW) 종으로 발견되는 단백질의 백분율을 측정함으로써 측정될 수 있으며, 여기서 안정성은 가용화된 동결건조 케이크에서 검출되는 LMW 종의 퍼센트에 대해 역 비례한다. 단백질의 LMW 종의 퍼센트는 상술한 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 단백질 동결건조 케이크는 또한 실온에서 3개월 후 처음 분자의 약 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만이 LMW 형태로 검출되는 경우 안정한 것으로 고려될 수 있다.
동결건조된 단백질의 안정성, 예를 들어, 열 안정성을 결정하기 위한 시차 주사 열량계(DSC), 기계적 안정성을 결정하는 조절된 교반 및 용액 혼탁도를 결정하기 위한 약 350 nm 또는 약 405 nm에서의 흡광도와 같은 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제형은 약 5℃ 내지 약 25℃에서 6개월 또는 그 이상의 저장 후, 제형의 OD405의 변화가 0시에 제형의 OD405로부터 약 0.05 미만(예를 들어, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01 이하)인 경우 안정한 것으로 고려될 수 있다.
안정성은 또한 항체 또는 다른 단백질의 생물학적 활성, 생리학적 활성 또는 이의 표적에 대한 결합 친화도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 항체는, 예를 들어 정의된 시간 양(예를 들면, 1개월, 12개월, 18개월, 24개월 등 까지) 동안 5℃, 25℃, 37℃, 45℃, 50℃ 등에서 저장 후, 동결건조 제형 내에 함유된 항체가 상기 동결건조 및 보관 전에 항체의 결합 친화도의 적어도 50%, 95% 또는 그 이상의 친화력으로 이의 동족체 에피토프-함유 항원에 결합하는 경우, 안정한 것으로 고려될 수 있다. 결합 친화력은 예를 들어 ELISA 또는 플라스몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들어, 동족체 결합 파트너를 발현하는 세포를 항체, 가용성 수용체 또는 리간드를 포함하는 재구성된 제형과 접촉시키는 것과 같은, 항체, 가용성 수용체 또는 리간드 활성 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체, 가용성 수용체 또는 리간드의 이러한 세포에 대한 결합은 예를 들어, FACS 분석을 통해서와 같이 직접적으로 측정될 수 있다. 단백질은 단백질의 생물학적 또는 생리학적 특이적 활성(즉, 효능)이 적어도 18개월 동안 실온에서 보관한 후 초기(T0) 역가의 50% 이상일 때 "안정한"것으로 간주될 수 있다. 안정한 단백질은 실온에서 최대 12개월, 최대 13개월, 최대 14개월, 최대 15개월, 최대 16개월, 최대 17개월, 최대 18개월, 최대 19개월, 최대 20개월, 최대 21개월, 최대 22개월, 최대 23개월 또는 실온에서 최대 24개월 저장 후 적어도 51% 효능, 적어도 52% 효능, 적어도 53% 효능, 적어도 54% 효능, 적어도 55% 효능, 적어도 56% 효능, 적어도 57% 효능, 적어도 58% 효능, 적어도 59% 효능, 적어도 60% 효능, 적어도 61% 효능, 적어도 62% 효능, 적어도 63% 효능, 적어도 64% 효능, 적어도 65% 효능, 적어도 66% 효능, 적어도 67% 효능, 적어도 68% 효능, 적어도 69% 효능, 적어도 70% 효능, 적어도 71% 효능, 적어도 72% 효능, 적어도 73% 효능, 적어도 74% 효능, 적어도 75% 효능, 적어도 76% 효능, 적어도 77% 효능, 적어도 78% 효능, 적어도 79% 효능, 적어도 80% 효능, 적어도 81% 효능, 적어도 82% 효능, 적어도 83% 효능, 적어도 84% 효능, 적어도 85% 효능, 적어도 86% 효능, 적어도 87% 효능, 적어도 88% 효능, 적어도 89% 효능, 적어도 90% 효능, 적어도 91% 효능, 적어도 92% 효능, 적어도 93% 효능, 적어도 94% 효능, 적어도 95% 효능, 적어도 96% 효능, 적어도 97% 효능, 적어도 98% 효능, 또는 적어도 99% 효능을 보유한다.
"안정한"단백질은 장기간 동안, 예를 들어 최대 18개월 동안 실온에서 보관한 후에 구조 또는 비활동에 거의 또는 전혀 변화를 겪지 않는다. 구조의 변화는 응집체 또는 단백질의 다른 고 분자량 형태의 형성, 펩타이드 결합의 가수분해와 같은 단백질 분해 및 탈아미드화, 시아알릴화와 같은 화학적 분해를 포함한다. 예를 들어, 항체 분해의 일반적인 형태는 가역성 이량체 및 삼량체뿐만 아니라, 보다 안정하고 덜 가역적인 사량체 및 고차원 다합체를 포함하는 응집체의 형성이다. "비가역성 응집체"는 동결건조 케이크를 재구성할 때 쉽게 용해시키지 않거나 결합하지 않는 응집체의 하위 집합이다. "안정한"단백질은 실온에서 최대 7개월, 최대 8개월, 최대 9개월, 최대 10개월, 최대 11개월, 최대 12개월, 최대 13개월, 최대 14개월, 최대 15개월 최대 16개월, 최대 17개월, 최대 18개월, 최대 19개월, 최대 20개월, 최대 21개월, 최대 22개월, 최대 23개월 또는 최대 24개월 동안 저장 동안 실온에서 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만의 고 분자량 종의 형성을 증가시킨다. 고 분자량 종을 검출하는 방법은 0.2 내지 0.3%의 검출 변동성을 가질 수 있다.
온도 의존적인 단백질 응집 또는 고 분자량 종의 다른 형성은 아레니우스(Arrhenius) 또는 변형된 아레니우스 동역학(약간 곡선화 아레니우스 플롯)을 따른다(예를 들어, Chakroun et al., "Mapping the Aggregation Kinetics of a Therapeutic Antibody Fragment," Mol. Pharmaceut. 13: 307-319 (2016) 참고). 따라서 시간에 따른 주어진 제형에 대한 주어진 온도에서의 고 분자량 종의 응집 속도 및 퍼센트 변화는 제곱근의 시간 관계 및 아레니우스 또는 변형된 아레니우스 동력학에 기초하여 예측될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 시료는 밀폐된 유리 바이알에서 주어진 온도(예: 5℃, 25℃, 37℃, 50℃)에서 항온처리된다. 일정한 간격으로 분취하고, 불용성 응집체를 제거한 다음, SE-HPLC를 수행한다. 관찰된 응집 속도는 시간 의존 주 피크 대 HMW 피크 면적 데이터의 선형 맞춤으로부터 직접 결정된다. 그런 다음 고 분자량 종에서 퍼센트 변화의 예측은 시간 율 법칙과 아레니우스 동력학의 제곱근을 데이터에 적용함으로써 이루어진다. 예를 들어, 다양한 온도에서 관측된 속도 상수는 아레니우스 방정식: lnk = lnA - (E/RT)(여기서 E는 활성화 에너지(cal/mol), R은 우주의 기체 상수(1.987 cal/mol/K), T는 절대 온도(켈빈(Kelvin) 단위)이며, lnA는 충돌 빈도 같은 요인을 포함하는 온도 상수이다)에 대해 조정된다. k의 값은 주어진 온도(예: 25℃)에서 시간 경과(예: 24개월) 에 따른 고 분자량 종의 변화를 예측하기 위해 아레니우스 피트(Arrhenius fit)에서 외삽된다.
동결건조
일반적으로 단백질 및 치료 항체 또는 다른 항원 - 결합 단백질을 동결건조시키는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 간략히, 일 실시 형태에서, 동결건조는 전술한 바와 같이, 약물 물질 및 부형제를 함유하는 예비-동결건조된 수용액으로 시작한다. 예비-동결건조된 수용액을 개방 용기(예: 바이알)에 넣고 개방 용기를 선반 위의 동결건조 챔버에 넣는다. 동결건조 공정은 3가지 기본 단계로 구성된다: (1) 선택적인 어닐링 사이클을 갖는 동결, (2) 1차 건조 및 (3) 2차 건조와 함께, 임의의 후-건조 어닐링 단계. 첫 번째 단계는 동결이다. 여기서, 선반 온도를 낮추어 제형을 바이알 내에서 냉각시킨다. 제형 내에 얼음 결정이 형성되고 제형의 나머지는 보다 농축되고 점성이 된다. 농축된 잔류물은 고형화되어 무정형, 결정질, 또는 조합된 결정질/비정질 상태를 형성한다. 일 실시 예에서, 나머지는 비결정질 유리 상태로 응고된다.
일부 동결건조 프로토콜에서, 동결된 조성물은 어닐링을 거쳐 결정화를 강화시킨다. 고체 잔류물은 만니톨 및 글리신과 같은 벌크제와 같은, 일부 성분을 결정화하기 위해 일정 기간 동안 최종 동결 온도보다 높은 온도로 유지된다.
얼음은 승화에 의해 제거된다. 동결건조 챔버(예: 40-400 Torr)의 압력과 선반 온도(-30℃ - +10℃)는 물의 삼중점 이하로 조정된다. 온도는 케이크 구조의 붕괴를 방지하기 위한 비정질 나머지에 대한 유리 전이 온도(Tg) 이하로 유지된다.
일부 물은 1차 건조 단계 후에 매트릭스 내에 갇히게 될 수 있다. 나머지 물은 2차 건조 단계 동안 탈착 과정을 통해 제거된다. 여기서, 선반 온도는 탈착을 촉진하고 건조물에서 최적 수분 함량을 달성하기 위해 증가한다. 일 실시 예에서, 최종 수분 함량은 약 0.5% 이상 약 10% 이하이다. 또 다른 실시 양태에서, 최종 수분 함량은 약 3% 이상 약 6% 이하이다. 특정 실시 양태에서, 수분 함량은 3% 초과 4% 미만이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 수분 함량은 약 3%이다. 다른 구체 예에서, 수분 함량은 약 3.5%이다. 다른 구체 예에서, 수분 함량은 약 4% 이다. 다른 구체 예에서, 수분 함량은 약 4.5% 이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 수분 함량은 약 6%이다.
일 구현 예에서, 동결건조된 생성물("동결건조 케이크")은 2차 건조 단계 후에 어닐링 단계를 거친다. 후-건조 어닐링은 물리적 노화 또는 구조적 이완이라고도 한다. 이러한 후 건조 어닐링 단계는 평형 유리 상태(알파 - 이완)로의 비정질 매트릭스의 이완을 촉진하고, 저장 온도에서 구조적 이완 시간을 증가시켜, 유리 상태에서의 이동성을 감소시키며, 단백질을보다 안정한 에너지 상태로 낮추게 함으로써, 단백질 안정성을 최적화한다. 여기서, 어닐링 단계는 유리 상태의 엔트로피 및 단백질의 회전 형태의 전반적인 감소를 허용하기 위해 분자 운동성을 간단히 촉진시킨다.
어닐링 단계 후에, 유리의 무작위 열역학 분자 상태의 수가 최소화되고 유리 평형이 최대화된다. 일부 구체 예에서, 어닐링 온도는 생성물의 Tg 미만이다. 일부 구체 예에서, 어닐링 온도는 25℃ 내지 약 90℃, 25℃ 내지 약 80℃, 25℃ 내지 약 75℃, 약 from 약 25℃ 내지 약 70℃, 35℃ 내지 약 70℃, 40℃ 내지 약 70℃, 30℃ 내지 약 55℃, 50℃ 내지 약 60℃, 55℃ 내지 약 65℃, 60℃ 내지 약 70℃, 65℃ 내지 약 75℃, 70℃ 내지 약 80℃, 또는 75℃ 내지 약 85℃이다. 일부 구체 예에서, 어닐링 온도는 약 90℃, 약 80℃, 약 79℃, 약 78℃, 약 77℃, 약 76℃, 약 75℃, 약 74℃, 약 73℃ 약 72℃, 약 71℃, 약 70℃, 약 69℃, 약 68℃, 약 67℃, 약 66℃, 약 65℃, 약 64℃, 약 63℃ 약 62℃, 약 61℃, 약 60℃, 약 59℃, 약 58℃, 약 57℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 56℃, 약 55℃ 약 54℃, 약 53℃, 약 52℃, 약 51℃, 약 50℃, 약 49℃, 약 48℃, 약 47℃, 약 46℃, 약 45℃ 약 44℃, 약 43℃, 약 42℃, 약 41℃, 약 40℃, 약 39℃, 약 38℃, 약 37℃, 약 36℃, 약 35℃ 약 34℃, 약 33℃, 약 32℃, 약 31℃, 약 30℃, 약 29℃, 약 28℃, 약 27℃, 약 26℃, 또는 25℃이다. 특정 실시 양태에서, 어닐링 온도는 25℃ 이상이다. 또 다른 특정 실시 양태에서, 어닐링 온도는 50℃ 이상이다.
동결건조 케이크는 DSC 또는 등온 열량계로부터의 엔테라피 회복에 의해 정의된 바와 같은 케이크 구조의 이완을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 어닐링 온도에서 유지된다. 일부 구체 예에서, 어닐링 온도는 약 12시간 내지 약 2주간, 약 12시간 내지 1주간, 약 12시간 내지 약 수 일간, 약 18시간 내지 약 72시간 동안, 약 24시간 동안 약 36시간, 약 30시간 내지 약 42시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 약 42시간 내지 약 54시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 54시간 내지 약 66시간 동안 약 60시간 내지 약 72시간, 약 66시간 내지 약 78시간, 또는 약 72시간 내지 약 84시간 동안 수행될 수 있다. 일부 실시 예에서, 어닐링 온도는 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간, 약 30시간, 약 31시간, 약 32시간, 약 33시간, 약 34시간 약 40시간, 약 35시간, 약 36시간, 약 37시간, 약 38시간, 약 39시간, 약 40시간, 약 41시간, 약 42시간, 약 43시간, 약 44시간, 약 45시간, 약 47시간, 약 48시간, 약 49시간, 약 50시간, 약 51시간, 약 52시간, 약 53시간, 약 54시간, 약 55시간, 약 56시간, 약 57시간, 약 58시간, 약 59시간 약 60시간, 약 61시간, 약 62시간, 약 63시간, 약 64시간, 약 65시간, 약 66시간, 약 67시간, 약 68시간, 약 69시간, 약 70시간 약 71시간, 약 72시간, 약 73시간, 약 74시간, 약 75시간, 약 76시간, 약 77시간, 약 78시간, 약 79시간, 약 80시간, 약 81시간, 약 82시간, 약 83시간 또는 약 84시간이다.
특정 구체 예에서, 어닐링 온도는 50℃ 이상이며, 이는 약 72시간 동안 유지된다. 다른 특정 실시 양태에서, 어닐링 온도는 약 25℃이며, 이는 약 72시간 동안 유지된다.
일 실시 예에서, 어닐링 조건은 시차 주사 열량계에서 후-건조 어닐링 단계를 수행함으로써 실험적으로 결정된다. 온도 곡선의 흡열 영역은 일반적으로 어닐링 효과 직후에 발생하여, 실무자가 어닐링 온도를 선택할 수 있게 한다. Sartor et al., "Calorimetric Studies of the Kinetic Unfreezing of Molecular Motions in Hydrated Lysozyme, Hemoglobin, and Myoglobin," 66 Biophysical J. 249-258 (1994)를 참고한다.
다음의 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 본 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 발명의 범위를 제한하려고 의도하지 않는다. 사용된 숫자(예로, 양, 온도 등)의 측면에서 정확성을 보장하려고 노력을 하였지만 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다
실시예 1 : 동결건조 절차
항체 및 부형제(본원에 기술된 바와 같음)를 함유하는 수성 예비-동결건조 용액을 타입 I 보로 실리케이트 유리 바이알에 로딩하였다. 충전된 바이알을 LYOSTAR 3 동결건조기(SP Scientific, Warminster, PA)에 넣었다. 챔버를 닫고 선반 온도를 5℃로 낮춘다. 시료는 동결되기 전에 30분 동안 5℃에서 유지되었다. 동결의 상승 속도는 0.5℃/분이었다. 선반 온도는 -45℃에서 60분 동안 유지되었다.
1차 건조는 약 100 mTorr의 진공 설정 점 및 약 -25℃의 선반 온도에서 수행되었으며, 이는 약 0.5℃/분의 가열을 위한 램프 속도로 약 50시간 동안 달성되었다.
2차 건조는 약 0.3℃/분의 가열을 위한 램프 속도로 달성된 35℃에서 수행되었다. 2차 건조는 약 6 시간 동안 진행되었다.
2차 건조 후, 챔버를 약 0.8 기압(약 608,000 mTorr)의 압력으로 질소 가스로 재충전시키고, Flurotec® 코팅된 4432/50 부틸 고무 동결건조 스토퍼로 바이알을 마개처리하였다.
실시예 2 : 수분 함량 대 단백질 안정성
물 분자는 동결건조 제품에서 가소제 및 안정화제로서 역할을 할 수 있다. 물은 작은 크기와 다른 물 분자 및 다른 분자(예: 단백질 분자)와 수소 결합을 형성하는 능력으로 인하여 가소제로 자체로 작용한다. 안정화제/가소제로서 물을 사용하는 이점은 안정화제(물) 대 단백질의 비율이 재구성된 제형의 긴장도에 영향을 주지 않으면 서 증가될 수 있다는 것이다. 습기 함유량은 동결건조 공정의 설계를 통해 조정할 수 있다. 동결건조 케이크의 수분 함량은 Computrac® Vapor Pro® 수분 분석기(Arizona Instrument LLC, Chandler, AZ)로 측정했다.
재조합 단클론 항체(mAb1, mAb2, mAb3)는 EESYR® 세포에서 생성되고(2010년 8월 10일 허여된 미국 특허 제 7,771,997 B2 참조), 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 0.1% 폴리소르베이트 80, 5% 수크로스 및 1.54% 아르기닌(예비-동결건조된 액제 제형 중 모두 %w/v) 에서 150 mg/mL의 농도로 제형화되었다. 액상 제형물은 특정한 수준의 수분 함량(% w/w)으로 상기 기술된 바와 같이 동결건조되었고 특정 시간 동안 50℃, 37℃ 또는 25℃에서 보관되었다. 저장 후, 동결건조된 제형을 물로 재구성하고 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 수행하였다. 고 분자량(HMW) 종을 검출하고, 적분하고 T = 0에서 대조군과 비교하였다. 전체 단백질의 일부인 HMW 종의 변화율을 계산하여 표 1에 나타내었다. 동결건조된 150 mg/mL mAb1은 25℃에서 보관했을 때 수분 함량이 약 4.5%로 가장 안정했다.
수분 함량이 3 ~ 10% 인 단클론 항체(mAb1)의 동결건조 제형은 25℃에서 24개월 동안 보관 후 ≤ ~2.0%까지 분해될 것으로 예측되었다. 아레니우스 동역학 알고리즘을 측정된 분해율에 적용하고 시간 율 법의 제곱근에 기반한 예측을 최소 24개월 동안 실시했다. 각 수분 함량에 대한 HMW 종의 퍼센트 변화는 표 2에 보고되어 있다. 예비- 동결건조된 수성 제형은 150 mg/mL mAb1, 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 0.1% 폴리소르베이트 80, 5% 수크로스, 1.54% 아르기닌이었다.
실시예 3 : 후-건조 어닐링의 효과
동결건조된 약물을 어닐링함으로써 단백질 안정성이 개선되었다. 동결건조된 제형을 유리 전이 온도 이하로 어닐링하는 것은 비정질 분자를 보다 낮은 에너지 상태로 이완시켜 보다 안정한 생성물을 생성시키는 것으로 가정된다. 동결건조된 제형을 70℃에서 72시간 동안 어닐링함으로써, 10% 수크로스 및 3.08% 아르기닌으로 동결건조된 150 mg/mL mAb1에 대한% HMW의 관찰된 증가가 더 낮았다(예비-동결 제형: 150 mg/mL mAb1, 10 mM 히스티딘 , pH 6.0, 0.1% 폴리소르베이트 80, 10% 수크로스, 3.08% 아르기닌). 항체의 % HMW 종의 변화는 25℃, 37℃ 및 50℃에서 6개월 동안 보관된 어닐링 및 어닐링되지 않는 제형에 대해 표 3에 보고된다.
[표 1]
[표 2]
아레니우스 동역학 알고리즘은 측정된 분해율에 적용되었으며, 시간 비율 법의 제곱근을 기반으로 한 예측은 37℃에서 보관된 어닐링된 시료 대 어닐링되지 않은 시료에 대해 적어도 24개월 동안 수행했다. 어닐링은 24개월 후 어닐링되지않은 시료보다 약 20% 적은 HMW 종을 부여하는 것으로 예상되었다(즉, 5.76% 대 6.05% △% HMW).
[표 3]
실시예 4: 개별 부형제가 안정성에 미치는 영향
당, 폴리올, 염 및 아미노산을 포함한 특정 안정화제를 동결건조 항체를 안정화시키는 개별 능력에 대해 평가하였다. 동결건조된 150mg/mL mAb1은 수크로스로 제형화할 때 가장 안정했다(표 4 참조). 수크로스 제형의 Tg는 실온 보관을 위해 충분히 높고(~ 110℃), 경우에 따라 가소제를 첨가를 위한 충분한 관용도를 제공한다.
실시 예 5 : 트레할로오스 조합이 안정성에 미치는 영향
트레할로오스 또는 수크로스를 소르비톨 또는 만니톨과 같은 가소제와 혼합하면 놀랍게도 보다 안정한 실온 제형이 제조되었다. 소르비톨과 트레할로스의 조합은 트레할로오스 단독보다 동결건조된 150 mg/mL mAb1을 안정화시켰다. 염기 예비-동결건조 제형은 150 mg/mL mAb1, 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 0.1% 폴리소르베이트 80이었고, 동결건조 전에 트레할로오스 및 소르비톨의 다양한 조합물을 첨가하였다. 트레할로오스 및/또는 소르비톨과 함께 동결건조된 단백질의 안정성은 표 5에서 △% HMW로 표로 작성되었다.
[표 4]
[표 5]
실시예 6 : 수크로스 조합이 안정성에 미치는 영향
만니톨과 수크로스의 조합은 수크로스 단독보다 동결건조된150 mg/mL의 mAb1을 안정화시켰다. 염기 예비-동결건조된 제형은 150 mg/mL mAb1, 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 0.1% 폴리소르베이트 80이었고, 동결건조 전에 수크로스 및 만니톨의 다양한 조합물을 첨가하였다. 수크로스 및/또는 만니톨과 함께 조합된 동결건조된 단백질의 안정성을 표 6에서 △% HMW로 표로 작성하였다. 만니톨과 수크로스의 조합은 수크로스 단독보다 동결건조된 150 mg/mL mAb1을 안정화시켰다.
[표 6]
수크로스를 폴리올 및 아미노산과 혼합하여 동결건조된 항체를 안정화시키는 능력을 평가 하였다. 150 mg/mL mAb1을 수크로스(Suc)와 소르비톨(Sor), 글리세롤(Gly), 아르기닌(Arg) 및 알라닌(Ala) 중 어느 하나와 서로 다른 비율로 혼합했다. HMW 종의 변화는 다양한 저장 시간에서 25℃와 5℃로 평가되었다. 결과(*?*% HMW)는 표 7에 제시되어 있다. 25℃에서 보관했을 때, 시험된 부형제 조합 중 어느 것도 수크로스 단독보다 동결건조된 150 mg/mL mAb1을 안정화시키지 못했다. 놀랍게도, 소르비톨과 수크로스의 조합은 5℃에서 120개월 동안 보관했을 때 수크로스 단독에 비해 안정성을 향상시킬 것으로 예측되었으며 수크로스 단독보다 더 안정했다.
실시 예 7: 수크로스 및 아르기닌의 조합이 약물의 안정성에 미치는 영향
동결건조된 150 mg/mL mAb1 및 동결건조된 150 mg/mL mAb2는 10% 수크로스 및 3.08% 아르기닌으로 제형화 될 때 비교할 수 있는 안정성을 갖는다. % HMW 종의 변화는 25℃, 37℃ 및 50℃에서 1개월 저장시 계산되었다. 동결건조된 150mg/mL mAb1 및 동결건조된 150mg/mL mAb2는 10% 수크로스 및 3.08% 아르기닌으로 제형화할 때 25℃에서 24개월 이상 비교 안정성을 갖는 것으로 예측되었다(시간 율 법 및 아레니우스 동력학의 제곱근을 기준으로 함). △% HMW 분석의 결과는 표 8에 제시되어 있다.
[표 7]
[표 8]
실시 예 8 : 안정화제가 약물 생성물 안정성에 미치는 영향
수크로스 및 아르기닌의 조합을 항체로 다양한 중량 비율로 배합하였고, △% HMW는 50℃ 및 25℃에서 다양한 시간에 측정 하였다. 단백질 대비 ≥ 0.87 : 1의 안정화제를 함유한 동결건조된 150 mg/mL 항체 제형은 25℃ 보관 24개월 후 1% 이하로 분해되는 것으로 예측된다(시간 율 법 및 아레니우스 동력학의 제곱근을 기준으로 함). 결과는 표 9에 나열되어 있다.
[표 9]
[표 10]
실시예 9: 예비-동결건조된 액체 제형에서의 저 단백질 농도에 대한 동결건조된 단백질에 대한 부형제의 안정화 효과
당, 폴리올, 염 및 아미노산을 포함한 특정 안정화제를 동결건조 항체를 안정화시키는 개별 능력에 대해 평가하였다. 동결건조된 2 mg/mL mAb3는 수크로스, 트레할로오스 또는 아르기닌이 안정화제로 포함되었을 때 눈에 띄는 분해를 나타내지 않았다. 결과를 표 10에 나타내었다. 글리세롤도 시험되었지만, 동결건조 후에 상당한 분해가 관찰되었다.
트레할로오스는 동결건조된 항체를 안정화시키는 능력을 평가하기 위해 폴리올 및 아미노산과 결합되었다. 2 mg/mL의 mAb3을 트레할로오스(Tre)와 소르비톨(Sor), 글리세롤(Gly), 아르기닌(Arg) 및 알라닌(Ala) 중 어느 하나와 다른 비율로 혼합했다. HMW 종의 변화는 25℃에서 다양한 저장 시간으로 평가되었다. 결과(△% HMW)는 표 11에 제시되어 있다. 25℃ 보관 3개월 후에 시험된 2 mg/mL mAb3 동결건조 제형 중 어느 것에서도 상당한 분해가 관찰되지 않았다
[표 11]
Claims (84)
- 예비-동결건조된 제형으로부터 제조된 동결건조 케이크로서,
(a) 항체;
(b) 상기 예비-동결건조된 제형의 중량의 4% 내지 7.5%의 수크로스, 및 3.2 : 1 내지 3.4 : 1의 수크로스 대 아르기닌의 중량 대 중량 비의 아르기닌을 포함하는, 안정화제;
(c) 완충액; 및
(d) 상기 동결건조 케이크의 3.5 중량% 내지 6 중량%의 수분 함량을 포함하며,
상기 동결건조 케이크는 붕괴되지 않고,
(i) 실온에서 2개월 동안 보관된 상기 동결건조 케이크에서 응집된 항체의 양의 증가가 0.6중량% 미만이거나,
(ii) 실온에서 18개월 또는 24개월 동안 보관된 상기 동결건조 케이크에서 응집된 항체의 양의 증가가 2중량% 미만이거나,
(iii) 상기 응집된 항체가 크기 배제 크로마토그래피 또는 전기영동에 의해 검출되거나, 또는
(iv) 상기 (i) 내지 (iii)의 조합인, 동결건조 케이크. - 제1항에 있어서, 상기 동결건조 케이크가
(a) 황색, 갈색, 흑색 및 적색을 포함하지 않거나,
(b) 용융되지 않고, 밀도 변화가 없거나,
(c) 25℃ 이상의 유리 전이 온도를 포함하거나, 또는
(d) 상기 (a) 내지 (c)의 조합인, 동결건조 케이크. - 제2항에 있어서, 3.5 중량%, 4 중량%, 4.5 중량%, 5 중량%, 5.5 중량%, 또는 6 중량%의 수분 함량을 포함하는, 동결건조 케이크.
- 제1항에 있어서, 상기 완충액이 히스티딘이고 상기 동결건조 케이크의 0.34 내지 2.04 중량%로 존재하는, 동결건조 케이크.
- 제1항에 있어서, 폴리올, 당, 아미노산, 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안정화제를 추가로 포함하고, 이때 (i) 상기 폴리올이 소르비톨, 글리세롤, 만니톨 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; (ii) 상기 당이 트레할로오스이고; (iii) 상기 아미노산이 알라닌, 프롤린, 글리신 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; (iv) 상기 염이 염화나트륨인, 동결건조 케이크.
- 제1항에 있어서, 상기 안정화제가 19 중량% 내지 83 중량%로 존재하는 하나 이상의 폴리올을 포함하는, 동결건조 케이크.
- 제5항에 있어서, 상기 안정화제가 만니톨을 추가로 포함하고, 상기 만니톨이 8 중량% 내지 23 중량%로 존재하는, 동결건조 케이크.
- 제5항에 있어서, 상기 안정화제가 소르비톨을 추가로 포함하고, 상기 소르비톨이 1.3 중량% 내지 23 중량%로 존재하는, 동결건조 케이크.
- 제1항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하고, 이때 (a) 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG 3350 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, (b) 상기 계면활성제가 0.02 중량% 내지 1 중량%로 존재하거나, 또는 (c) 상기 (a)와 (b)의 조합인, 동결건조 케이크.
- 제1항에 있어서, 상기 항체가 6 중량% 내지 64 중량%, 6 중량% 내지 19 중량%, 또는 33 중량% 내지 64 중량%로 존재하는, 동결건조 케이크.
- 제1항에 있어서, 상기 동결건조 케이크가 바이알 내에 함유되며, 이때 상기 바이알이 I 형 붕규산 유리를 포함하고, 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅된 부틸 고무 마개로 밀폐되어있는, 동결건조 케이크.
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