JP2021008406A - 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体含有医薬組成物 - Google Patents

改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体含有医薬組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】多量体、分解物、不溶性異物、又は不溶性微粒子の生成を抑制してなる、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる、安定な医薬組成物を提供する。【解決手段】前記医薬組成物は、製薬学的に許容される緩衝剤を含有してなり、ｐＨが５．０〜７．０である。【選択図】なし

Description

本発明は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる、安定な医薬組成物に関する。
インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）は細胞表面糖タンパク質のひとつで、主に細胞外マトリックス（コラーゲン、ラミニンなど）への細胞の接着やイムノグロブリンファミリーのメンバー（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１など）の受容体として機能し、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する接着分子である。それにより、細胞は細胞外マトリックスよりシグナルを受け取り、分化、増殖、細胞死などが誘導される。インテグリンはα鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、異なるα鎖、β鎖が存在し、多様な組み合わせがあり、インテグリンスーパーファミリーは２４種類存在する。インテグリンノックアウトマウスは、全てのサブユニットで致死的あるいは病的で、生命の維持に個々のインテグリンが必要であることが示唆されている。この事から、周辺の環境を細胞に伝え対応を促すインテグリンは、生命現象のあらゆる場面で機能しており、様々な病態に関与していると考えられる。
本出願人により、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体が、病態形成に関与する各種疾患の診断、予防又は治療（例えば、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギーや移植片拒絶反応等の免疫疾患等）に有用であることが公表されている（特許文献１）。
他方、近年様々な抗体等のタンパク質を含む医薬品が開発され、実際に医療の現場に提供されている。これらの医薬品の多くは、静脈内投与や皮下投与等により投薬されるため、医療の現場には、液体製剤、あるいは凍結乾燥製剤等の非経口医薬組成物の形態として提供される。とりわけ、非経口医薬組成物は、直接体内に投与されることを前提とされるため、安定な医薬品製剤であることが望ましい。
抗体等のタンパク質を含有する溶液では、不溶性微粒子の形成等は抑制することが望ましく、また、有効性の観点から、分解物等の形成を抑制することが望ましい。
特許文献１に、本発明で用いられる改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体自体が熱に安定であることが開示されており、特許文献２には、Ｅ２５抗体等を含む医薬組成物が開示されているが、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる、更なる安定な医薬組成物を開発するには、さらに改善の余地がある。
国際公開第２００９／０８８０６４号 国際公報第２００４／０９１６５８号
本発明の目的は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。
詳細には、本発明の目的は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有し、例えば、熱、光等のストレスにより増大する、分解物、又は多量体、の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。また、本発明の別の目的は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有し、例えば、凍結融解、物理的振動等により増大する、不溶性異物、又は不溶性微粒子の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、溶液のｐＨを特定の範囲に調整し、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を製剤化することにより、安定な医薬組成物を調製することができること（後記実施例１等）、また、特定の緩衝剤を添加すること（後記実施例２等）、特定のアミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類を添加すること（後記実施例３等）、非イオン性界面活性剤を添加すること（後記実施例４等）等により、さらに安定な医薬組成物を提供することができること等を知見して、本発明を完成させるに至った。
本発明は、
［１］改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、製薬学的に許容される緩衝剤を含有し、ｐＨが５．０〜７．０である、医薬組成物であって、
該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、並びに
（２）（１）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾により生じた抗体
からなる群から選択される、医薬組成物、
［２］製薬学的に許容される緩衝剤が、酢酸、クエン酸、リン酸、及びヒスチジン又はそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される１種又は２種以上である、［１］の医薬組成物、
［３］製薬学的に許容される緩衝剤が、ヒスチジン又はその製薬学的に許容される塩である、［１］又は［２］のいずれかの医薬組成物、
［４］製薬学的に許容される緩衝剤の濃度が、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである、［１］〜［３］のいずれかの医薬組成物、
［５］更にアミノ酸類、塩類、糖及び糖アルコール類からなる群より選択される１種又は２種以上の医薬品添加物を含む、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物、
［６］アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類が、メチオニン、アルギニン、グリシン、リシン、オルニチン、塩化ナトリウム、スクロース、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール及びマルチトールからなる群より選択される１種又は２種以上である、［５］の医薬組成物、
［７］アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類がアルギニンである、［５］又は［６］のいずれかの医薬組成物、
［８］アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類の濃度が、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜４００ｍｍｏｌ／Ｌである、［５］〜［７］のいずれかの医薬組成物、
［９］更に非イオン性界面活性剤を含む、［１］〜［８］のいずれかの医薬組成物、
［１０］非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０及び／又はポロキサマー１８８である、［９］の医薬組成物、
［１１］非イオン性界面活性剤の濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）である、［９］又は［１０］のいずれかの医薬組成物、
［１２］改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬである、［１］〜［１１］のいずれかの医薬組成物、
［１３］医薬組成物が液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、［１］〜［１２］のいずれかの医薬組成物、
［１４］医薬組成物が液体製剤である、［１］〜［１３］のいずれかの医薬組成物、
［１５］改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、ヒスチジン又はその製薬学的に許容される塩を含有し、ｐＨが５．０〜７．０である、医薬組成物であって
該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、並びに
（２）（１）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾により生じた抗体
からなる群から選択される、医薬組成物、
［１６］改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、［１］又は［１５］のいずれかの医薬組成物
に関する。
本発明によれば、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる安定な医薬組成物、詳細には、多量体、分解物、不溶性異物、又は不溶性微粒子の生成を抑制してなる、安定な医薬組成物を提供することができる。
実施例１で行った、各種ｐＨの液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のサイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例１で行った、各種ｐＨの液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（分解物の生成量）を示すグラフである。 実施例１で行った、各種ｐＨの液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（不純物（＝多量体＋分解物）の生成量）を示すグラフである。 実施例２で行った、各種緩衝液成分を含有する液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例２で行った、各種緩衝液成分を含有する液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（分解物の生成量）を示すグラフである。 実施例２で行った、各種緩衝液成分を含有する液体製剤を４８時間光暴露した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例３で行った、アミノ酸類としてアルギニンを各種濃度で含有する液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例３で行った、塩類として塩化ナトリウムを各種濃度で含有する液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例３で行った、アミノ酸類としてメチオニンを各種濃度で含有する液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例３で行った、糖又は糖アルコール類としてスクロース又はソルビトールを含有する液体製剤を４０℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例３で行った、アミノ酸類としてアルギニンを各種濃度で含有する液体製剤を４８時間光暴露した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例３で行った、アミノ酸類としてメチオニンを各種濃度で含有する液体製剤を４８時間光暴露した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例４で行った、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート８０を各種濃度で含有する液体製剤を用いて振盪試験を実施した後の不溶性微粒子数を測定した結果を示すグラフである。 実施例４で行った、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート８０を各種濃度で含有する液体製剤を用いて凍結融解ストレス試験を実施した後の不溶性微粒子数を測定した結果を示すグラフである。 実施例６で行った、ヒスチジン、アルギニン、及びポリソルベート８０を含有する各種ｐＨの抗体高濃度液体製剤を２５℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例６で行った、ヒスチジン、アルギニン、及びポリソルベート８０を含有する各種ｐＨの抗体高濃度液体製剤を２５℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（分解物の生成量）を示すグラフである。 実施例６で行った、ヒスチジン、アルギニン、及びポリソルベート８０を含有する各種ｐＨの抗体高濃度液体製剤を２５℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（不純物（＝多量体＋分解物）の生成量）を示すグラフである。 実施例７で行った、各種アミノ酸類、糖または糖アルコール類を含有する抗体高濃度液体製剤を２５℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（多量体の生成量）を示すグラフである。 実施例７で行った、各種アミノ酸類、糖または糖アルコール類を含有する抗体高濃度液体製剤を２５℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（分解物の生成量）を示すグラフである。 実施例７で行った、各種アミノ酸類、糖または糖アルコール類を含有する抗体高濃度液体製剤を２５℃１箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果（不純物（＝多量体＋分解物）の生成量）を示すグラフである。 実施例８で行った、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート８０又はポロキサマー１８８を含有する抗体高濃度液体製剤を用いて振盪試験を実施した後の不溶性微粒子数を測定した結果を示すグラフである。 実施例８で行った、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート８０又はポロキサマー１８８を含有する抗体高濃度液体製剤を用いて凍結融解ストレス試験を実施した後の不溶性微粒子数を測定した結果を示すグラフである。 実施例１０で行った、各種濃度のヒスチジン、アルギニン、及びポロキサマー１８８を含有する抗体高濃度液体製剤を２５℃３箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法および陽イオン交換クロマトグラフ法（ＣＥ−ＨＰＬＣ法）の評価結果を統計解析した結果（多量体の増加量）を示すグラフである。 実施例１０で行った、各種濃度のヒスチジン、アルギニン、及びポロキサマー１８８を含有する抗体高濃度液体製剤を２５℃３箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＣＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果を統計解析した結果（分解物の増加量）を示すグラフである。 実施例１０で行った、各種濃度のヒスチジン、アルギニン、及びポロキサマー１８８を含有する抗体高濃度液体製剤を２５℃３箇月間保存した後のＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＣＥ−ＨＰＬＣ法の評価結果を統計解析した結果（メインピークの減少量）を示すグラフである。
本明細書において「安定」とは、例えば、熱、光、温度、湿度、振盪、及び／又は凍結融解に対して安定であることを意味する。例えば、医薬組成物を所定条件下に保存後、前記医薬組成物中に含まれる、多量体、又は分解物の増加量、あるいはそれらの総量がある特定量以下であることを意味する。また、ある態様として、医薬組成物を所定条件下に保存後、不溶性異物が、目視により観察されないこと、または、不溶性微粒子が後述の光遮断粒子計数法による測定で、特定数以下であることを意味する。
前記「多量体」は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体が集まって生成する複合体である。多量体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、動的光散乱法、光遮断粒子計測法、マイクロフローイメージング法等が含まれ、ある態様としては、ＳＥ−ＨＰＬＣ法である。ＳＥ−ＨＰＬＣ法においては、検出されたピークの面積を自動分析法により測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算する。なお、メインピークとは、活性本体のピークを意味する。ＳＥ−ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が短いピークを合わせて多量体とする。多量体の量（総量）としては、ある態様として１０％以下、別の態様として５％以下、他の態様として３％以下である。また、多量体の量の増加量（特定の条件で特定の期間保存後の多量体量と試験（保存）開始時の多量体量の差分）については、ある態様としては、５％以下、別の態様として２％以下、別の態様として１％以下、他の態様としては０．５％以下である。なお、前記の多量体の量、又はその増加量については、後述の「安定な医薬組成物」の定義に記載した各保存条件と、所望により、任意に組み合わせることができる。
前記「分解物」は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の一部が脱離して生成する断片体である。分解物を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、ＳＥ−ＨＰＬＣ法、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が含まれ、ある態様としては、ＳＥ−ＨＰＬＣ法である。ＳＥ−ＨＰＬＣ法による分解物の測定方法は、前記したＳＥ−ＨＰＬＣ法による多量体の測定と同様にして行う。なお、ＳＥ−ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が長いピークを合わせて分解物とする。分解物の量（総量）としては、ある態様として１０％以下、別の態様として５％以下、他の態様として３％以下である。また、分解物の量の増加量（特定の条件で特定の期間保存後の多量体量と試験（保存）開始時の分解物量の差分）については、ある態様としては、１０％以下、別の態様として５％以下、他の態様として３％以下である。なお、前記の分解物の量、又はその増加量については、後述の「安定な医薬組成物」の定義に記載した各保存条件と、所望により、任意に組み合わせることができる。
前記「電荷類縁体」は、陽イオン交換クロマトグラフ法、又はイメージングキャピラリー等電点電気泳動法による分析で主成分として認められる類縁体である。電荷類縁体を測定する方法としては、特に制限されないが、例えば、陽イオン交換クロマトグラフ法（ＣＥ−ＨＰＬＣ法）、イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ｉｃＩＥＦ法）等が含まれ、ある態様としては、ＣＥ−ＨＰＬＣ法、又はｉｃＩＥＦ法である。ＣＥ−ＨＰＬＣ法及びｉｃＩＥＦ法は、前記したＳＥ−ＨＰＬＣ法と同様にしてピークの百分率（％）を計算する。
前記「不溶性異物」は、日本薬局方の注射剤の不溶性異物検査法に従い、目視により確認することができる。
前記「不溶性微粒子」は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体や医薬品添加物等が集まって生成する不溶性の複合体である。不溶性微粒子の数は光遮断粒子計数法により、不溶性微粒子の数が特定数以下であると規定できる。ある態様としては、１．２μｍ以上の不溶性微粒子の数が１０００個／ｍＬ以下である。
「安定な医薬組成物」とは、冷蔵温度（２℃〜８℃）で例えば、３箇月間、ある態様として６箇月間、別の態様として１年間、他の態様として２年間；又は室温（２２℃〜２８℃）で、ある態様として２週間、別の態様として１箇月間、他の態様として３箇月間、さらに別の態様として６箇月間、さらに他の態様として１年間；又は加速条件（３７℃〜４３℃）で、ある態様として２週間、別の態様として４週間；又はＤ６５ランプ１０００ｌｕｘ照射下で４８時間保存後、多量体、又は分解物の増加量、あるいはそれらの総量がある特定量以下である医薬組成物を意味する。
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のポリペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、通常、同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つ存在し、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、ドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）に位置するドメインは、そのアミノ酸配列が同一個体内でも多様性を有する、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＬと表される。
抗体の抗原結合部位は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって構成され、抗原への結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や抗体と各種細胞との結合といった抗体自体の生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域のアミノ酸配列によっている。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの短い超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域は相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよばれている。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、その配列は比較的一定である。
抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾等が挙げられ、種々の抗体において、重鎖Ｃ末端のリジンが欠失することや重鎖Ｎ末端のグルタミンの大部分がピログルタミン酸への修飾を受けることが知られている（Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447）。また、このような翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことも当該分野で知られている（Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39）。
本発明の医薬組成物は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体として、以下の（１）及び／又は（２）のヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体（国際公開第２００９／０８８０６４号）、
（２）（１）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾により生じた抗体。
１つの実施形態において、前記（２）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾は、重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端のピログルタミル化である。１つの実施形態において、前記（２）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、
配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、あるいは、
配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号３のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体
である。
１つの実施形態において、前記（２）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾は、重鎖のＣ末端のリジンの欠失である。１つの実施形態において、前記（２）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、配列番号１のアミノ酸番号４５０のリジンが欠失した重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体である。
１つの実施形態において、前記（２）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾は、重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端のピログルタミル化、且つ、重鎖のＣ末端のリジンの欠失である。１つの実施形態において、前記（２）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、
配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾され、配列番号１のアミノ酸番号４５０のリジンが欠失した重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、
配列番号１のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾され、配列番号１のアミノ酸番号４５０のリジンが欠失した重鎖及び配列番号３のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、
配列番号１のアミノ酸番号４５０のリジンが欠失した重鎖及び配列番号３のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体
である。
本発明に用いられる改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖定常領域としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、又はＩｇγ４の定常領域、軽鎖定常領域としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得る。好ましくは、本発明に用いられる改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、重鎖定常領域として、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明に用いられる改良型抗ヒトα９インテグリン抗体は、軽鎖定常領域として、ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む。好ましくは、本発明に用いられる改良型抗ヒトα９インテグリン抗体は、ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域及びヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む。
本発明には、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体として、以下の宿主細胞を培養することで生産される該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する医薬組成物も含まれる：
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明に用いられる改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、本明細書に開示される改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者に容易に作製され得る。本発明に用いられる改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の作製方法としては、国際公開第２００９／０８８０６４号に開示された方法が挙げられる。
一単位医薬組成物（製剤）中の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の量としては、例えば、１ｍｇ〜１０００ｍｇが挙げられ、ある態様として１ｍｇ〜５００ｍｇ、別の態様として１ｍｇ〜３０ｍｇ、他の態様として１０ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに別の態様として１００ｍｇ〜２５０ｍｇ、さらに他の態様として５０ｍｇ〜２５０ｍｇ、また別の態様として１００ｍｇ〜２００ｍｇである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
医薬組成物が固体状態（例えば、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤など）の場合、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の量としては、例えば、１ｍｇ〜１０００ｍｇが挙げられ、ある態様として１ｍｇ〜５００ｍｇ、別の態様として１ｍｇ〜３０ｍｇ、他の態様として１０ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに別の態様として１００ｍｇ〜２５０ｍｇ、さらに他の態様として５０ｍｇ〜２５０ｍｇ、また別の態様として１００ｍｇ〜２００ｍｇである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
医薬組成物を用時溶解する場合、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の濃度としては、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬが挙げられ、ある態様として１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ、別の態様として１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、他の態様として１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、さらに別の態様として１００ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、さらに他の態様として５０ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、また別の態様として１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
医薬組成物が溶液状態（液体製剤）の場合、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の濃度としては、例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬが挙げられ、ある態様として１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ、別の態様として１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、他の態様として１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、さらに別の態様として１００ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、さらに他の態様として５０ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、また別の態様として１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
用量としては、例えば、１ｍｇ〜１０００ｍｇが挙げられ、ある態様として１ｍｇ〜５００ｍｇ、別の態様として１ｍｇ〜３０ｍｇ、他の態様として１０ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに別の態様として１００ｍｇ〜２５０ｍｇ、さらに他の態様として５０ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、また別の態様として１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
適応症としては、インテグリンが関与する各種疾患の予防及び／又は治療、例えば、関節リウマチ等の自己免疫疾患、アレルギーや移植片拒絶反応等の免疫疾患等を挙げることができる。
本発明に用いられる「製薬学的に許容される緩衝剤」としては、製薬学的に許容され、溶液状態において、所望のｐＨ範囲内で緩衝能を有し、又は安定化効果を有するものであれば、特に制限されない。
具体的には、次のｐＨ範囲内で緩衝能を有するものである。例えば、５．０〜７．０、ある態様として５．５〜６．５、別の態様として５．６〜６．２、他の態様として６．０、更に他の態様として、５．８である。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
緩衝剤成分としては、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、及びヒスチジン又はそれらの製薬学的に許容される塩等を挙げることができる。別の態様としては、ヒスチジン又はそれらの製薬学的に許容される塩等であり、他の態様としては、ヒスチジンである。
ヒスチジンは緩衝剤成分としてのみならず、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定性に影響を及ぼさない、又は安定性を向上させる機能を有する。
緩衝剤成分は、１種又は２種以上適宜適量使用することができる。
緩衝剤の濃度は、ｐＨを所望のｐＨ範囲内に調整できる量であれば、特に制限されない。緩衝剤の濃度は、例えば、注射用水により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合、例えば、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、別の態様として、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、他の態様として、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
本発明に用いられるアミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類としては、製薬学的に許容され、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定性に影響を及ぼさない、又は安定性を向上させるものであれば、特に制限されない。
アミノ酸類としては、例えば、メチオニン、アルギニン、グリシン、リシン、オルニチン等を挙げることができる。ある態様としては、メチオニン、アルギニン、グリシンであり、別の態様としてはアルギニンである。
塩類としては、例えば、塩化ナトリウム等を挙げることができる。
糖又は糖アルコール類としては、例えば、スクロース、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール等を挙げることができる。ある態様として、スクロース、ソルビトールであり、別の態様として、ソルビトールである。
アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類としては、ある態様として、アルギニン、メチオニン、ソルビトール、スクロース、塩化ナトリウムであり、別の態様として、アルギニンである。
アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類は、１種又は２種以上適宜使用することができる。
なお、アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定性に影響を及ぼさない、又は安定性を向上させる範囲内において、医薬組成物中に含まれる。
アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類の量は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定性に影響を及ぼさない、又は安定性を向上させる量であれば、特に制限されない。
例えば、溶媒により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合の濃度として、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜４００ｍｍｏｌ／Ｌ、ある態様として、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、別の態様として、１００ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、また他の態様として、１００ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
本発明に用いられる非イオン性界面活性剤としては、製薬学的に許容され、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定化作用を有するものであれば、特に制限されない。
具体的には、前記非イオン性界面活性剤は、例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、及びモノパルミチン酸ソルビタンなどのソルビタン脂肪酸エステル；モノカプリル酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、及びモノステアリン酸グリセロールなどのグリセリン脂肪酸エステル；モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、及びモノリノール酸デカグリセリルなどのポリグリセロール脂肪酸エステル；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びトリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール及びテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル；モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリルなどのポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ジステアリン酸ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテルなどのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、及びポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油）などのポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビトールミツロウなどのポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリンなどのポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えば、ポリオキシエチレンオクタデカンアミドなどの６〜１８のHydrophilic-Lipophilic Balance（ＨＬＢ）を有する界面活性剤を含む。
非イオン性界面活性剤は、１種又は２種以上適宜使用することができる。
ある態様として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルであり、別の態様として、ポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、又は８５、ならびにプルロニック型界面活性剤であり、他の態様として、ポリソルベート２０及び８０、又はポロキサマー（ポロキサマー１８８）、他の態様として、ポリソルベート８０であり、更に他の態様としては、ポロキサマー（ポロキサマー１８８）である。
なお、非イオン性界面活性剤は、不溶性異物か不溶性微粒子等の形成を抑制する作用を有しており、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を安定化する範囲内及び／又は安定化に影響を及ぼさない範囲内において、医薬組成物中に含まれる。
非イオン性界面活性剤の量は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定化作用を有する量であれば、特に制限されない。
例えば、注射用水により溶解され溶液状態（液体製剤）の場合、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）、ある態様として０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）、別の態様として０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）であり、更に別の態様として０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０３％（ｗ／ｖ）である。なお、前記の上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
本発明の医薬組成物は、溶液を容器に充填して、液体製剤として、また、溶液を凍結乾燥法や噴霧乾燥法により、凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤等の非経口医薬組成物として、提供することができる。好適には、液体製剤である。
本発明の医薬組成物には、所望により、懸濁剤、溶解補助剤、保存剤、吸着防止剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の医薬品添加物を適宜添加することができる。
懸濁剤としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
吸着防止剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、あるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
各種医薬品添加物は、本発明の所望の効果を達成できる量の範囲で、適宜適量使用することができる。
本発明の医薬組成物の製造方法は、自体公知の製造方法により、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、製薬学的に許容される緩衝剤を含有し、好ましくはアミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類、及び／又は非イオン性界面活性剤を更に含有し、ｐＨを５．０〜７．０に調整する方法を含む。
また、本発明の医薬組成物の製造方法は、自体公知の製造方法により、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、ヒスチジン又はその製薬学的に許容される塩を含有し、ｐＨを５．０〜７．０に調整する方法を含む。
本発明の医薬組成物を充填する容器は、使用目的に応じて選択することができる。例えば、バイアル、アンプル、注射器のような規定容量の形状のもの、瓶のような大容量の形状のものを含む。ある態様として注射器（ディスポーザブル注射器を含む）を含む。該注射器に予め溶液を充填して、プレフィルドシリンジ液体製剤として提供することにより、医療現場において、溶解操作等の操作が不要となり、迅速な対応が可能となる。
容器の材質については、ガラス、プラスチック等が挙げられる。また、容器内の表面処理としては、シリカコート処理、シリコーンコート処理、サルファー処理、各種低アルカリ処理等が施されてもよい。
以下、参考例、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定解釈されるものではない。
《参考例：改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の作製》
本実施例で用いた改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１に、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号４に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。
国際公開第２００９／０８８０６４号に従い、該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖が挿入されたＡＧ−γ１（ＷＯ９４／２０６３２）及び該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖が挿入されたＡＧ−κ（ＷＯ９４／２０６３２）を構築し、これらを連結した発現プラスミドを作製した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて該発現プラスミドを発現させ、プロテインＡカラムを用いて培養上清から精製抗体を取得した。なお、精製した抗ヒトα９インテグリン抗体のアミノ酸修飾を分析した結果、その大部分において重鎖Ｎ末端のピログルタミル化及び重鎖Ｃ末端側のリジンの欠失が生じていた。
《実施例１：至適ｐＨ選定による安定化効果》
参考例で製造した改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように、表１に示す緩衝液で希釈調製した処方液（試料Ｎｏ．Ａ−１〜Ａ−６）を、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓を行い、正置状態で４０℃１箇月間の保存を実施した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
サイズ排除クロマトグラフ法（ＳＥ−ＨＰＬＣ法）による評価結果を図１〜図３に示す。
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（５μｍ；７．８ｍｍ×３００ｍｍ、東ソー製）を接続し、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／３００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ６．８）の組成の移動相を０．５ｍＬ／分の流速で流した。測定サンプルの濃度は１０ｍｇ／ｍＬとし、注入量４００μｇの条件にて分析した。カラム温度は２５℃に設定し、ＵＶ測定の波長は２８０ｎｍを用いた。
ＳＥ−ＨＰＬＣ測定で検出されたピークの面積を測定し、メインピークを含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算した。なお、メインピークとは、活性本体ピークを意味する。
ＳＥ−ＨＰＬＣのメインピークより保持時間が短いピークを合わせて多量体、保持時間が長いピークを合わせて分解物とした。多量体および分解物の総和を不純物とした。
本改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体はｐＨ５．０〜７．０付近で製剤化することで、多量体、分解物の生成が抑制されることが示された。
《実施例２：緩衝剤成分の選定による安定化効果》
表２に、参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１０ｍｇ／ｍＬ、緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ６．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸（ｐＨ６．０）、又は２０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン（ｐＨ６．０））を含む処方（試料Ｎｏ．Ｂ−１〜Ｂ−３）を示す。なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。当該緩衝液で希釈調製した処方液をそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓を行い、正置状態で４０℃１箇月間、及びＤ６５ランプ１０００ｌｕｘ・４８時間の保存を実施した。なお、Ｄ６５ランプで保存したサンプルは対照サンプルとして、遮光（アルミ箔でラップ）したサンプルも保存し、安定性を評価した。
改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の安定性（多量体量、分解物量）を評価した。結果を図４〜図６に示す。
多量体量、分解物量はＳＥ−ＨＰＬＣ法により、実施例１と同様にして分析した。
４０℃１箇月間及びＤ６５ランプ照射下で保存したサンプルの中では、ヒスチジンが最も多量体の生成を抑制した。また、クエン酸及びリン酸を含むサンプルはいずれも安定であった。
《実施例３：アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類の選定による安定化効果》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸を２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）含む処方に、添加剤無しあるいはアルギニン（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、又は２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、又は２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、メチオニン（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、又は１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、ソルビトール（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、又はスクロース（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。処方液をそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつガラスバイアル（３ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓を行い、正置状態で４０℃１箇月間の保存を実施した。
また、アルギニン、又はメチオニンを含むサンプルについては、Ｄ６５ランプ１０００ｌｕｘ・４８時間の保存を実施した。なお、Ｄ６５ランプで保存したサンプルは対照サンプルとして、アルミ箔でラップしたサンプルも保存し、安定性を評価した。
多量体量はＳＥ−ＨＰＬＣ法により、実施例１と同様にして分析した。
結果を図７〜図１２に示す。
検討したアルギニン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、メチオニン、ソルビトール、又はスクロースは、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を４０℃保存条件において安定化させるか、又は安定性に影響を及ぼさなかった。
アルギニンとメチオニンについては、光に対しても安定化効果を示した。
《実施例４：非イオン性界面活性剤の添加による安定化効果》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１０ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）、アルギニンを１４０ｍｍｏｌ／Ｌ含む処方に、非イオン性界面活性剤であるポリソルベート８０を０、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、又は０．１ｗ／ｖ％でそれぞれ添加した。なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。処方液をそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、４．４ｍＬずつガラスバイアル（１０ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓を行い、振盪、凍結融解ストレスに対する物理的安定性を評価した。
振盪試験は、水平に置いたガラスバイアルを１５０ｒｐｍで２４時間振盪した。
凍結融解ストレス試験は、サンプルを正置状態で−８０℃の冷凍庫内に保存し凍結させた後、サンプルを冷凍庫から取り出し、５℃の冷蔵庫内に正置状態で保存し、融解させた。この凍結融解サイクルを３回繰り返すことにより行った。
光遮蔽粒子計数法による評価結果を図１３及び図１４に示す。
光遮蔽粒子計数法は、液中パーティクルカウンター（ＨＩＡＣラボ型液中パーティクルカウンター）を用いて測定した。測定サンプルの濃度は１０ｍｇ／ｍＬとし、７５Ｔｏｒｒ、２５℃にて２時間静置条件にて脱気した後、注入量０．２ｍＬの条件にて分析した。
光遮蔽粒子計数法で検出された粒子径１．２μｍ以上の不溶性微粒子数を測定し、１ｍＬ換算値として計算した。
改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は非イオン性界面活性剤ポリソルベート８０含有製剤中において凍結融解、振盪による不溶性微粒子の生成が抑制されることが示された。
《実施例５：ヒスチジン、アルギニン、ポリソルベート８０を含む処方の安定性評価検討》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１０ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ、アルギニンを１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０を０．０２ｗ／ｖ％含む処方液を、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、４．４ｍＬずつガラスバイアル（１０ｍＬ容量）に充填し、ゴム栓で打栓を行い、振盪、凍結融解、光、−２０℃、５℃及び２５℃保存時における安定性をＳＥ−ＨＰＬＣ法、陽イオン交換クロマトグラフ法（ＣＥ−ＨＰＬＣ法）、光遮蔽粒子計数法で評価した。
振盪、凍結融解ストレス試験は実施例４と同様にして行った。
光安定性試験は実施例２と同様にして行った。
−２０℃、５℃及び２５℃保存時における安定性試験は実施例１と同様にして行った。
なお、所定のｐＨ（ｐＨ６．０）となるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして、光遮蔽粒子計数法は実施例４と同様にして測定した。
ＣＥ−ＨＰＬＣ測定は、ＨＰＬＣシステムに、ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ−１０カラム（１０μｍ；４ｍｍ×２５０ｍｍ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を接続し、移動相Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｐＨ６．０、移動相Ｂ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ／５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ６．０の組成の移動相を０．５ｍＬ／分の流速で表３に示すグラジエント条件にて流した。測定サンプルの濃度は１ｍｇ／ｍＬとし、注入量１０μｇの条件にて分析した。カラム温度は４０℃に設定し、ＵＶ測定の波長は２８０ｎｍを用いた。
ＣＥ−ＨＰＬＣ測定で検出されたピークの面積を測定し、ピーク１（メインピーク）を含む全ピーク面積の総和で除することにより、百分率（％）として計算した。なお、メインピークとは、活性本体が示す最大面積のピークを意味する。
ＣＥ−ＨＰＬＣで検出されるピークの内、保存中の変動が大きいピークを特定しピーク２、ピーク３とした。
結果を表４及び表５に示す。
当該処方は安定であった。
《実施例６：ヒスチジン、アルギニン、ポリソルベート８０を含む高濃度液体製剤の安定性評価検討》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１００ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ、アルギニンを１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポリソルベート８０を０．０２ｗ／ｖ％含む処方において、ｐＨを５．０、５．５、６．０の３水準に調節した。処方液をそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、０．４ｍＬあるいは０．３ｍＬずつマイクロチューブに充填した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
２５℃１箇月間保存時における安定性をＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして測定した。
結果を図１５〜図１７に示す。
いずれのｐＨにおいても安定であった。
《実施例７：アミノ酸類、糖又は糖アルコール類の選定による高濃度液体製剤の安定化効果》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１００ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）含む処方に、メチオニンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ、ソルビトールを２８０ｍｍｏｌ／Ｌ、スクロースを２８０ｍｍｏｌ／Ｌ、又はアルギニンを１４０ｍｍｏｌ／Ｌ添加したサンプルをそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、０．４ｍＬあるいは０．３ｍＬずつマイクロチューブに充填した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
２５℃１箇月間保存時における安定性をＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして測定した。
結果を図１８〜図２０に示す。
いずれの医薬品添加物を含む製剤も、安定であった。
《実施例８：非イオン性界面活性剤の添加による高濃度液体製剤の安定化効果》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１００ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンを２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．０）、アルギニンを１４０ｍｍｏｌ／Ｌ含む処方に、非イオン性界面活性剤である、ポリソルベート８０又はポロキサマー１８８を０．０２ｗ／ｖ％を添加した処方液をそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．２ｍＬずつ３ｍＬのガラスバイアルに充填した。なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
振盪、凍結融解ストレスに対する物理的安定性を評価した。
振盪試験および凍結融解ストレス試験は、実施例４と同様にして実施した。
光遮蔽粒子計数法による評価結果を図２１及び図２２に示す。
光遮蔽粒子計数法は、実施例１と同様にして測定した。
ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８ともに不溶性微粒子の生成を抑制した。
《実施例９：ヒスチジン、アルギニン、ポロキサマー１８８を含む高濃度液体製剤の安定性評価検討》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジンを９０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ５．８）、アルギニンを２４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ポロキサマー１８８を０．０２ｗ／ｖ％含む処方において、処方液をそれぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつ３ｍＬのガラスバイアルに充填し、ゴム栓で打栓した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
５℃、２５℃３箇月間保存時における安定性をＳＥ−ＨＰＬＣ法で評価した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして測定した。
粘度測定は、落球式粘度計（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ製）にキャピラリー（内径１．２ｍｍ、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ製）を接続し、金属製ボール（直径１．０ｍｍ、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ製）を落球させることで測定した。キャピラリー温度は２０℃、測定角度は７０°、密度は１．０００００ｇ／ｃｍ３に設定し密度測定を行った。
結果を表６に示す。
いずれの抗体濃度においても当該処方は安定であった。
《実施例１０：ヒスチジン、アルギニン、ポロキサマー１８８を含む高濃度液体製剤の安定性評価検討》
参考例で得た改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含む、表７に示す処方液を、それぞれ、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過後、１．３ｍＬずつ３ｍＬのガラスバイアルに充填し、ゴム栓で打栓した。
なお、所定のｐＨとなるよう、必要に応じてｐＨ調節剤として、緩衝液調製時に塩酸及び／又は水酸化ナトリウムを添加した。
２５℃３箇月間保存時における安定性をＳＥ−ＨＰＬＣ法及びＣＥ−ＨＰＬＣ法で評価した。
統計解析はＪＭＰ−１１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．製）を用いて解析を行った。
ＳＥ−ＨＰＬＣ法は実施例１と同様にして測定し、多量体量および分解物量を測定した。ＣＥ−ＨＰＬＣ法は実施例５と同様にして測定し、メインピークの量を測定した。
結果を図２３〜図２５に示す。実線は得られたデータに基づいた統計解析により予測される値を、実線の上下の点線は統計解析により予測される値の幅を表す。
当該処方は抗体濃度２００ｍｇ／ｍＬにおいて、いずれのヒスチジン濃度、アルギニン濃度においても安定であった。
本発明によれば、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる、安定な医薬組成物、詳細には、多量体、分解物、不溶性異物、不溶性微粒子の生成を抑制してなる、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体を含有してなる、安定な医薬組成物を提供することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
配列表の配列番号１で表されるアミノ配列は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖である。
同配列番号２で表される塩基配列は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の重鎖遺伝子である。
同配列番号３で表されるアミノ配列は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖である。
同配列番号４で表される塩基配列は、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の軽鎖遺伝子である。

Claims (16)

  1. 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、製薬学的に許容される緩衝剤を含有し、ｐＨが５．０〜７．０である、医薬組成物であって、
    該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、
    （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、並びに
    （２）（１）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾により生じた抗体
    からなる群から選択される、医薬組成物。
  2. 製薬学的に許容される緩衝剤が、酢酸、クエン酸、リン酸、及びヒスチジン又はそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 製薬学的に許容される緩衝剤が、ヒスチジン又はその製薬学的に許容される塩である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  4. 製薬学的に許容される緩衝剤の濃度が、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 更にアミノ酸類、塩類、糖及び糖アルコール類からなる群より選択される１種又は２種以上の医薬品添加物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類が、メチオニン、アルギニン、グリシン、リシン、オルニチン、塩化ナトリウム、スクロース、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、イノシトール、ズルシトール、アラビトール、イソマルト、ラクチトール及びマルチトールからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類がアルギニンである、請求項５又は６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. アミノ酸類、塩類、糖又は糖アルコール類の濃度が、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜４００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 更に非イオン性界面活性剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート８０及び／又はポロキサマー１８８である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 非イオン性界面活性剤の濃度が、０．００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）である、請求項９又は１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 医薬組成物が液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 医薬組成物が液体製剤である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、ヒスチジン又はその製薬学的に許容される塩を含有し、ｐＨが５．０〜７．０である、医薬組成物であって
    該改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体は、
    （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体、並びに
    （２）（１）の改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾により生じた抗体
    からなる群から選択される、医薬組成物。
  16. 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体の翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、請求項１又は１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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