CN116077646A - 一种抗冠状病毒s蛋白的抗体制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含抗冠状病毒S蛋白的抗体的制剂，尤其涉及包含抗冠状病毒S蛋白的抗体、缓冲剂、稳定剂和表面活性剂的药物制剂。此外，本发明还涉及这些制剂的疾病治疗或预防用途。

Description

一种抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗体制剂领域。具体而言，本发明涉及包含针对冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的药物制剂，尤其是稳定的液体制剂、冻干制剂和重构的稳定液体制剂，以及用于制备所述药物制剂的方法，以及所述药物制剂的治疗和/或预防用途。

背景技术

药品稳定性是保证药品有效性和安全性的重要指标之一。获得良好的制剂处方是保证药品在货架期内保持其有效性和安全性的关键条件。然而，由于抗体本身及其降解途径的复杂性，目前尚不可能对优化抗体稳定性所需的制剂条件作出预测。尤其是考虑到，不同抗体通常具有十分不同的CDR序列，而这些序列差异会导致不同抗体在溶液中具有不同的稳定性性质。因此，基于对人用抗体在安全性和有效性上的严格要求，有必要针对每个抗体单独进行最佳制剂配方的优化。

2019冠状病毒病(Coronavirus disease 2019，缩写：COVID-19)，是一种由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2型(缩写：SARS-CoV-2)引发的传染病。

尽管一些针对冠状病毒S蛋白的单克隆抗体已经被提出，但在本领域中对于含有足够稳定且适于施用给人受试者的针对冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的新药物制剂仍存在需要。此外，对于这样的抗体制剂，寻找制剂处方的简单和易用性，也是有利的。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1显示了抗体对SARS-CoV-2真病毒致细胞病变效应的抑制作用。上方小图：候选抗体抑制SARS-CoV-2真病毒致细胞病变效应；下方小图：不存在候选抗体时，SARS-CoV-2真病毒的致细胞病变效应。

图2显示了处方确认实验纯度(非还原型CE-SDS法)变化趋势图。

图3显示了处方确认实验电荷变异体-主成分(iCIEF法)变化趋势图。

发明概述

本发明通过提供含有针对冠状病毒S蛋白的单克隆抗体的药物制剂来满足上述需求。本发明的抗体制剂针对多种稳定性影响因素(诸如温度、反复冻融、振荡)，均表现出了优良的稳定性。

在一个方面，本发明提供了一种液体抗体制剂，其包含(i)针对冠状病毒S蛋白的单克隆抗体；(ii)缓冲剂，(iii)稳定剂，和(iv)表面活性剂。优选的，进一步包含螯合剂，更优选地，进一步包括等渗剂。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体包含抗体A和/或抗体B，其中抗体A包含：

-GFTFRDYDII(SEQ ID NO:1)的重链VH CDR1；

-YISRSGSTIYYSDSVRG(SEQ ID NO:2)的重链VH CDR2；

-DFGFEGPRMDV(SEQ ID NO:3)的重链VH CDR3；

-QASQDIKNYLN(SEQ ID NO:4)的轻链VL CDR1；

-DASNLET(SEQ ID NO:5)的轻链VL CDR2；和

-QQFDNLPIT(SEQ ID NO:6)的轻链VL CDR3，

其中抗体B包含，

-GYIFTSYSMH(SEQ ID NO:7)的重链VH CDR1；

-TIKPSDDSTNYAQKFQG(SEQ ID NO:8)的重链VH CDR2；

-EARGYYDRSGYYHPGYFDY(SEQ ID NO:9)的重链VH CDR3；

-TGTSSDVGGYNFVS(SEQ ID NO:10)的轻链VL CDR1；

-EVSDRPS(SEQ ID NO:11)的轻链VL CDR2；和

-FSYTTSTTWV(SEQ ID NO:12)的轻链VL CDR3。

在一个实施方案中，抗冠状病毒S蛋白的抗体A包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中重链可变区包含SEQ ID NO:13的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:14的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体B包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中重链可变区包含SEQ ID NO:15的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列。

-EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRDYDIIWIRQAPGKGLEWVSYI SRSGSTIYYSDSVRGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFGFEGP RMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)；

-DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDA SNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDNLPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:14)；

-QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYSMHWVRQAPGQGLEWM GTIKPSDDSTNYAQKFQGRVSMTRDTSTSTVYMELSSLRYEDTAVYYCAREARG YYDRSGYYHPGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)；

-QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIY EVSDRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFSYTTSTTWVFGGGTK LTVL(SEQ ID NO:16)。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体含有衍生自人IgG1的Fc部分变体。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒根据PCT申请号PCT/CN2021/1173485所述，获得抗冠状病毒S蛋白的抗体P5-22(即本发明抗体A)和P14-44(即本申请抗体B)。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体是在293细胞或CHO细胞中重组表达。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗冠状病毒S蛋白的抗体的总浓度为约1-100mg/ml，优选地为约10-70mg/mL，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、70mg/ml，其中抗体A的浓度约1-50mg/ml，优选地为约15-35mg/mL，例如约15、20、25、30、35mg/ml，其中抗体B的浓度约1-50mg/ml，优选地为约15-35mg/mL，例如约15、20、25、30、35mg/ml。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的缓冲剂的浓度为包含选自组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系，醋酸-醋酸钠缓冲体系，和磷酸盐缓冲体系的缓冲剂，优选地，所述液体抗体制剂中的缓冲剂选自组氨酸、盐酸组氨酸和它们的组合；优选地，所述组氨酸的浓度为约0.074-1.85mg/ml，例如，约0.074、0.37、1.85mg/ml，优选地，所述盐酸组氨酸的浓度为约0.32-8.0mg/ml，例如，约0.32、1.6、8.0mg/ml。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的稳定剂选自多元醇(例如，山梨醇、甘露醇、或其组合)、糖类(例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖、或其组合)、氨基酸(例如盐酸精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸及组合或其盐)、和它们的任意组合。在一个实施方案中，所述稳定剂包含约3.37-84.25mg/ml的盐酸精氨酸，例如，约3.37mg/ml、16.85mg/ml、84.24mg/ml的盐酸精氨酸。

在一个优选实施方案中，本发明的等渗剂为5-125mg/ml的山梨醇，例如，约5mg/ml、25mg/ml、125mg/ml的山梨醇。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的表面活性剂的浓度为约0.1-2.5mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的表面活性剂的浓度为约0.2-0.8mg/ml，例如约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml。

在一个实施方案中，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯类表面活性剂、泊洛沙姆、聚乙二醇。在一个实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯类表面活性剂。在一个具体实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的表面活性剂是聚山梨酯-80。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的螯合剂的浓度为约0.005-0.05mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的螯合剂的浓度为约0.008-0.018mg/ml，例如约0.008、0.009、0.010、0.012、0.014、0.018mg/ml。

在一个实施方案中，所述的螯合剂是羧酸型螯合剂。在一个实施方案中，所述的螯合剂选自依地酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二羟乙基甘氨酸。在一个实施方案中，所述螯合剂选自依地酸二钠。

在一个实施方案中，所述液体制剂的pH值为约5.0-6.0。在一些实施方案中，所述液体制剂的pH值为约5.0-6.0中的任意值，例如约5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0。优选地，所述制剂的pH为5.5±0.2，优选地pH为5.5。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：

(i)约10-100mg/ml的抗冠状病毒S蛋白的抗体；

(ii)约0.074-1.85mg/ml的组氨酸，约0.32-8.0mg/ml盐酸组氨酸；

(iii)约5-125mg/ml的山梨醇；

(iv)约0.1-2.5mg/ml聚山梨酯80；和

(v)任选地，约3.37-84.25mg/ml的盐酸精氨酸，

其中所述液体制剂的pH为约5.0-6.0，例如，约5.5；

或者，所述液体抗体制剂包含：

约25mg/ml的抗冠状病毒S蛋白的抗体A，约25mg/ml的抗冠状病毒S蛋白的抗体B，约0.37mg/ml组氨酸，约1.6mg/ml盐酸组氨酸，约25.00mg/ml山梨醇，约16.85mg/ml盐酸精氨酸，约0.50mg/ml聚山梨酯80，pH约5.5。

本发明的液体制剂可以长期稳定储存，例如至少24个月或更长时间。在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以在约-80℃至约45℃，例如-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、约25℃、约35℃、约38℃、约40℃、约42℃或约45℃的条件下，储存至少10天、至少20天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，至少36个月，或更长时间，且是稳定的。

在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以稳定储存至少24个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在至少40℃是稳定的。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约2℃-8℃保持稳定至少3个月，优选至少12个月，更优选至少24个月。在一个实施方案中，本发明的液体制剂在室温或例如约25℃保持稳定至少2个月，优选至少3个月，更优选至少6个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约40℃保持稳定至少2周、优选至少1个月。

在一个实施方案中，可以通过检测制剂的外观、可见异物、蛋白含量、纯度、和/或电荷变异体的变化，来指示制剂的稳定性。在一个实施方案中，可以在高温胁迫的强制实验中，例如在40℃±2℃储存至少1周、2周或优选地1个月后，或在加速实验中，例如在25℃±2℃储存至少1个月或2个月后，或在长期实验中，例如在5℃±3℃储存至少2个月或3个月后，或在振荡实验中(例如在室温、避光650r/min条件下振荡5天)，和/或在冻融实验中(例如，在-30℃/室温反复冻融6次)，检测本发明液体制剂的稳定性。在一个实施方案中，相对于初始值，例如储存第0天的初始值、或振荡或冻融实验前的初始值，检测本发明液体制剂的稳定性。

在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过目视检查本发明液体制剂的稳定性，其中本发明液体制剂在外观上保持为澄明至微乳光，为无色至微黄色液体，且无异物。在一个实施方案中，在澄明度检测仪下目视检查，制剂中无可见异物存在。在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定蛋白含量变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中例如通过紫外分光光度(UV)法，相对于初始值，蛋白含量变化率不超过20％，优选不超过10％，例如7-8％，更优选不超过5％，2％或1％。在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定本发明液体制剂的纯度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)，相对于初始值，单体纯度的变化值(或主峰变化值)不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、例如变化值不超过2％，优选不超过1％。在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过测定本发明液体制剂的纯度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过非还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)法，相对于初始值，单体纯度的变化值(或主峰变化值)下降不超过10％，例如不超过5％、4％、3％,2％或1％。在一个实施方案中，在储存后，或在在振荡实验后，或在冻融实验后，通过阳离子交换高效液相色谱法(CEX-HPLC)，检测本发明液体制剂的稳定性，其中相对于初始值，抗体的电荷变异体(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过50％，例如不超过40％、30％、20％、10％、5％，和/或主成分的变化值不超过20％,15％,10％,8％,5％。在一个实施方案中，在储存后，或在振荡实验后，或在冻融实验后，通过直接ELISA法，检测本发明液体制剂的稳定性，其中相对于初始值，抗体的相对结合活性为70-130％，例如，70,80,90,93,95,98,100,103,105,108,110,115,120,125,130％,优选90-110％。

在一个实施方案中，本发明液体制剂在储存后，例如在25℃储存至少2个月后，或在40℃±2℃储存1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：相对于储存第0天的初始值，

(i)通过SEC-HPLC法测量，主峰变化值小于1％，和/或制剂具有大于96％的纯度，优选大于97％、98％的纯度；

(ii)通过非还原型CE-SDS法测量，主峰变化值小于2％，和/或制剂具有大于96％的纯度，优选大于97％、98％的纯度；

(iii)通过CEX-HPLC法测量，制剂中的抗冠状病毒S蛋白抗体的各组分(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过40％和/或主成分的变化值不超过20％，

例如在40℃±2℃储存1个月后变化值总和不超过约40％(例如，不超过35％，30％，25％,20％,15％,10％)或主成分变化值不超过20％(例如，不超过15％,12％,10％,8％)，或

例如在25℃储存2个月后变化值总和不超过约20％(例如，不超过15％，14％,13％,12％)或主成分变化值不超过约15％(例如，不超过10％，8％,7％,6％,5％)；

(iv)通过ELISA法测量，制剂中抗冠状病毒S蛋白的抗体的相对结合活性为70％-130％，例如，90,93,95,98,100,103,105,108,110,115,120％，例如90％-110％；

在优选的实施方案中，本发明液体制剂在振荡和/或反复冻融下是稳定的。

优选地，该制剂在振荡下或在反复冻融下是稳定的，例如，在室温避光650r/min条件下振荡5天或在-30℃/室温反复冻融6次后，具有如下特征之一或多项：

(i)通过SEC-HPLC法测量，主峰变化值小于1％，和/或制剂具有大于96％的纯度，优选大于97％、98％、99％的纯度；

(ii)通过非还原型CE-SDS法测量，主峰变化值小于1％，和/或制剂具有大于96％的纯度，优选大于97％、98％的纯度；

(iii)通过CEX-HPLC法测量，制剂中抗冠状病毒S蛋白的抗体的各组分(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过2％；

(iv)通过ELISA法测量，制剂中抗冠状病毒S蛋白的抗体的相对结合活性为70％-130％，例如，90％-110％；

在一个方面中，本发明的液体制剂为药物制剂，优选为注射剂，更优选为皮下注射剂或静脉内注射剂。在一个实施方案中，所述液体制剂为静脉输注剂。

另一方面，本发明提供了ー种固体抗体制剂，其是通过将本发明的液体抗体制剂经固化处理而获得的。所述固化处理是通过例如结晶法、喷雾干燥法或冷冻干燥法实施的。在一个优选的实施方案中，所述固体抗体制剂例如是冻干粉针剂形式。固体抗体制剂可在使用前，通过重构于适当的溶媒中，形成本发明的重构制剂。所述重构制剂也是一种本发明的液体抗体制剂。在一个实施方案中，所述适当的溶媒选自注射用水、注射用有机溶剂，包括但不限于注射用油、乙醇、丙二醇等，或其组合。

在一个方面，本发明提供了一种递送装置，其包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂。在一个实施方案中，本发明的递送装置以包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的预填装注射器形式提供，例如用于静脉内、皮下、皮内或者肌内注射、静脉内输注。

在又一方面，本发明提供本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，例如，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。

本发明的其它实施方案将通过参阅此后的详细说明而清楚明了。

发明详述

在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。

如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“针对冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗冠状病毒S蛋白的抗体”、“抗S蛋白抗体”、“冠状病毒S蛋白抗体”、“S蛋白抗体”或“结合S蛋白的抗体”在本文中可互换地使用，是指这样的本发明的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋白(例如，2019-n CoVS蛋白、SARS-CoV S蛋白)，由此所述抗体可以用作靶向冠状病毒S蛋白的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。

本发明的抗体和抗原结合片段以高亲和力特异性结合冠状病毒S蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体是阻断抗体或中和抗体，其中抗体可以结合冠状病毒S蛋白，并阻断冠状病毒S蛋白与ACE2的结合。在一些实施方案中，该阻断抗体或中和抗体可以用于预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染的个体。

在本文中，术语“抗体”以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体和抗体的抗原结合片段。

术语“抗体制剂”指一种制备物，所述制备物处于允许作为活性成分的抗体的生物活性可以有效发挥的形式，并且不含有对于待施用该制剂的受试者而言具有不可接受毒性的其它组分。这类抗体制剂通常是无菌的。通常，抗体制剂中包含可药用赋形剂。“可药用”赋形剂是可以合理地施用至受试哺乳动物以便制剂中所用活性成分的有效剂量可以递送至受试者的试剂。赋形剂的浓度与施用模式相适应，例如可以是注射可接受的。

术语“抗体制剂”在本文中也简称为“本发明的抗体制剂”，意指包含抗冠状病毒S蛋白的抗体作为活性成分并包含可药用赋形剂的制备物。将抗冠状病毒S蛋白的抗体与可药用赋形剂组合后，作为活性成分的抗冠状病毒S蛋白的抗体适于治疗性或预防性施与人类或非人类动物。本发明的抗体制剂可以例如制备成水性形式的液体制剂，例如，即用预填装式注射器，或者制备成冻干制剂，在即将使用前通过溶解和/或悬浮于生理可接受的溶液中进行重构(即，复溶)。在一些实施方案中，抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂是液体制剂形式。

“稳定的”抗体制剂是指，制剂中的抗体在储存于特定条件下之后、或在振荡后、或在反复冻融后保有可接受程度的物理稳定性和/或化学稳定性。尽管抗体制剂中所含的抗体在储存、振荡或反复冻融之后可能不会100％维持其化学结构，但通常如果维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，则认为抗体制剂是“稳定的”。在一些具体的实施方案中，本发明的抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂在制造、制备、运输和长期储存过程中表现出低至检测不到的抗体聚集或降解或化学修饰，从而极少或甚至是没有抗冠状病毒S蛋白的抗体的生物活性损失，表现出高度稳定性。在一些实施方案中，本发明的抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂在储存、振荡和/或反复冻融后，基本上保留其物理和化学稳定性。优选地，本发明液体制剂可以在室温或在40℃稳定至少2周，和/或在25℃稳定至少2个月，和/或在2-8℃稳定至少24个月。优选地，本发明液体制剂可以在室温避光650r/min振荡5天后和/或在-30℃/室温反复冻融1-6次后是稳定的。

本领域已知多种分析技术可以用于测定蛋白质的稳定性，参见例如Peptide andProtein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可以在选定的温度和选定的储存时间测量稳定性。例如，可以基于预期的制剂货架期来选择储存时间。备选地，可以使用加速稳定性试验。在一些实施方案中，通过对抗体制剂进行各种胁迫测试来进行稳定性测试。这些测试可以代表调配的抗体制剂在制造、储存或运输期间可能遭遇到的极端条件，也可以代表在非制造、储存或运输期间可能使抗体制剂中的抗体的不稳定性加速的条件。例如，可以将经调配的抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂充填至玻璃小瓶中以检验在高温胁迫下的抗体稳定性。再例如，可以将经调配的抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂充填至玻璃小瓶中并在室温避光650r/min条件下振荡5天后，检查抗体的稳定性。再例如，将将经调配的抗冠状病毒S蛋白的抗体制剂充填至玻璃小瓶中并在-30℃/室温反复冻融1-6次后，检查抗体的稳定性。在一个实施方案中，在-30℃以下冻存1天后室温解冻，为一个冻融循环。

经一段储存时间后、或经振荡一段时间后或经反复冻融多次后，制剂不显示聚集、沉淀、混浊和/或变性；或显示非常少的聚集、沉淀、混浊和/或变性，则可以认为抗体在制剂中“保持其物理稳定性”。由于制剂中抗体的聚集可以潜在地导致患者增加的免疫反应，从而导致安全性问题。因此，需要使在制剂中的抗体聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用于测定制剂中的可见聚集物。SEC-HPLC可以用于测定制剂中的可溶性聚集物。此外，可以通过目视检查制剂的外观、颜色和/或澄清度、或者通过非还原型CE-SDS法测定制剂的纯度，来指示制剂的稳定性。在一个实施方案中，通过测定在特定温度下储存特定时间之后或在振荡后或在反复冻融后制剂中的抗体单体的百分比来测量制剂的稳定性，其中制剂中的抗体单体的百分比越高，则制剂的稳定性越高。

“可接受程度的”物理稳定性可以表示，于特定温度下储存特定时间之后，振荡后或反复冻融后，在制剂中检测到至少约90％的抗冠状病毒S蛋白的抗体单体。在一些实施方案中，在特定温度储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久后，可接受程度的物理稳定性表示至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗冠状病毒S蛋白的抗体单体。当评估物理稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为约-80℃至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约40℃、约42℃或约45℃。例如，若储存于约40℃±2℃1个月或4周之后，检测到至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗冠状病毒S蛋白的抗体单体，则药物制剂视为是稳定的。若储存于约25℃2个月之后，检测到至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗冠状病毒S蛋白的抗体单体，则药物制剂视为是稳定的。若储存于约5℃9个月之后，检测到至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗冠状病毒S蛋白的抗体单体，则药物制剂视为是稳定的。

经一段储存时间后、或经振荡一段时间后或经反复冻融多次后，如果制剂中的抗体不显示显著的化学改变，则可以认为抗体在制剂中“保持其化学稳定性”。大多数化学不稳定性源自于形成了抗体的共价修饰形式(例如，抗体的电荷变异体)。例如由天冬氨酸异构化、N和C末端修饰，可以形成碱性变异体；由脱酰胺化、唾液酸化和糖化，可以产生酸性变异体。化学稳定性可以通过检测和/或定量抗体的化学改变形式来评估。例如，可以通过阳离子交换色谱(CEX)或成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)检测制剂中抗体的电荷变异体。在一个实施方案中，通过测定在特定温度下储存特定时间之后或经振荡后或反复冻融多次后制剂中抗体的电荷变异体百分比变化值来测量制剂的稳定性，其中该变化值越小，则制剂的稳定性越高。

“可接受程度”的化学稳定性可以表示于特定温度下储存特定时间之后、或经振荡一段时间后或经反复冻融多次后，制剂中电荷变异体(例如主成分或酸性组分或碱性组分)的百分比变化值不超过40％，例如不超过30％、不超过20％；或电荷变异体(主成分、酸性组分和碱性组分)的百分比变化值总和不超过60％，例如不超过50％、不超过30％。在一些实施方案中，在特定温度储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久后，可接受程度的化学稳定性可以表现为主成分电荷变异体的百分比变化值不超过约50％、40％、30％、20％、或15％；或电荷变异体的百分比变化值总和不超过约60％、50％、或30％。当评估化学稳定性时，储存药物制剂的温度可为约-80℃至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃或约45℃。例如，若在储存于5℃24个月之后，主成分电荷变异体的百分比变化值少于约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于25℃2个月后，主成分电荷变异体的百分比变化值少于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于40℃1个月之后，主成分电荷变异体的百分比变化值少于约50％、40％、30％、20％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、5％或4％，则药物制剂亦可被视为是稳定的。

术语“冻干制剂”是指通过液体制剂的冷冻干燥处理得到或能够得到的组合物。优选地，其为具有少于5％、优选少于3％水含量的固体组合物。

术语“重构制剂”是指将固体制剂(例如冻干制剂)溶解和/或悬浮于生理可接受的溶液中得到的液体制剂。

文中使用的术语“室温”是指15℃至30℃、优选20℃至27℃、更优选25℃的温度。

I.抗体制剂

本发明提供稳定的液体抗体制剂，其包含(i)抗冠状病毒S蛋白抗体，(ii)缓冲剂，(iii)稳定剂，和(iv)表面活性剂，所述抗体制剂的pH为约5.0-6.0。在一个优选方案中，本发明的液体抗体制剂是注射制剂形式。

(i)抗冠状病毒S蛋白的抗体

“抗冠状病毒S蛋白的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合冠状病毒S蛋白(例如，2019-n CoV S蛋白、SARS-CoV S蛋白)，由此所述抗体可以用作靶向冠状病毒S蛋白的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体包含抗体A和/或抗体B，其中抗体A包含：

-GFTFRDYDII(SEQ ID NO:1)的重链VH CDR1；

-YISRSGSTIYYSDSVRG(SEQ ID NO:2)的重链VH CDR2；

-DFGFEGPRMDV(SEQ ID NO:3)的重链VH CDR3；

-QASQDIKNYLN(SEQ ID NO:4)的轻链VL CDR1；

-DASNLET(SEQ ID NO:5)的轻链VL CDR2；和

-QQFDNLPIT(SEQ ID NO:6)的轻链VL CDR3，

其中抗体B包含，

-GYIFTSYSMH(SEQ ID NO:7)的重链VH CDR1；

-TIKPSDDSTNYAQKFQG(SEQ ID NO:8)的重链VH CDR2；

-EARGYYDRSGYYHPGYFDY(SEQ ID NO:9)的重链VH CDR3；

-TGTSSDVGGYNFVS(SEQ ID NO:10)的轻链VL CDR1；

-EVSDRPS(SEQ ID NO:11)的轻链VL CDR2；和

-FSYTTSTTWV(SEQ ID NO:12)的轻链VL CDR3。

在一个实施方案中，抗冠状病毒S蛋白的抗体A包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中重链可变区包含SEQ ID NO:13的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:14的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体B包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中重链可变区包含SEQ ID NO:15的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有至少90％,95％,98％或99％同一性的序列。

-EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRDYDIIWIRQAPGKGLEWVSYI SRSGSTIYYSDSVRGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDFGFEGP RMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)；

-DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDA SNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDNLPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:14)；

-QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYSMHWVRQAPGQGLEWM GTIKPSDDSTNYAQKFQGRVSMTRDTSTSTVYMELSSLRYEDTAVYYCAREARG YYDRSGYYHPGYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)；

-QSVLTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIY EVSDRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFSYTTSTTWVFGGGTK LTVL(SEQ ID NO:16)。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体含有衍生自人IgG1的Fc部分变体。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒根据PCT申请号PCT/CN2021/1173485所述，获得抗冠状病毒S蛋白的抗体P5-22(即本发明抗体A)和P14-44(即本申请抗体B)。

在一个实施方案中，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体是在293细胞或CHO细胞中重组表达。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的抗冠状病毒S蛋白的抗体的总浓度为约1-100mg/ml，优选地为约10-70mg/mL，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、70mg/ml，其中抗体A的浓度约1-50mg/ml，优选地为约15-35mg/mL，例如约15、20、25、30、35mg/ml，其中抗体B的浓度约1-50mg/ml，优选地为约15-35mg/mL，例如约15、20、25、30、35mg/ml。

(ii)缓冲剂

缓冲剂是可以将溶液的pH维持在可接受范围的试剂。在一些实施方案中，用于本发明制剂中的缓冲剂可以将本发明制剂的pH控制在大约5.0-6.0的pH范围，例如约5.0-5.5的pH。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体制剂具有约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、或5.8的pH。例如，本发明的抗体制剂具有pH为5.5±0.2，优选地pH为5.5。

在一些实施方案中，本发明制剂包含选自以下的缓冲体系：组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系，醋酸-醋酸钠缓冲体系，磷酸盐缓冲体系，优选组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系。

在一些实施方案中，用于本发明制剂中的缓冲剂为组氨酸缓冲剂，尤其是由组氨酸和盐酸组氨酸组成的缓冲体系。在一些实施方案中，所述组氨酸的浓度为约0.074-1.85mg/ml，例如，约0.074、0.37、1.85mg/ml，所述盐酸组氨酸的浓度为约0.32-8.0mg/ml，例如，约0.32、1.6、8.0mg/ml。

(iii)稳定剂

用于本发明的合适的稳定剂可以选自糖、多元醇和氨基酸及其组合。对于作为稳定剂的糖包括但不限于蔗糖，海藻糖、麦芽糖及组合。对于作为稳定剂的多元醇包括但不限于山梨醇、甘露醇、或其组合。对于作为稳定剂的氨基酸包括但不限于精氨酸、盐酸精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸及组合。

例如，在一些实施方案中，在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的稳定剂选自多元醇(例如，山梨醇、甘露醇、或其组合)、糖类(例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖、或其组合)、氨基酸(例如盐酸精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸及组合或其盐)、和它们的任意组合。在一个实施方案中，所述稳定剂包含约3.37-84.25mg/ml的盐酸精氨酸，例如，约3.37mg/ml、16.85mg/ml、84.24mg/ml的盐酸精氨酸。

在一个优选实施方案中，本发明的等渗剂为5-125mg/ml的山梨醇，例如，约5mg/ml、25mg/ml、125mg/ml的山梨醇。

(iv)表面活性剂

如本文所使用的，术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即，它们由相反的溶解性倾向的基团所组成，通常是油溶性的烃链和水溶性的离子基团。

在一个实施方案中，本发明的液体制剂中的表面活性剂是非离子型表面活性剂，例如，烷基聚(环氧乙烯)。可包括在本发明制剂中的特定非离子型表面活性剂包括，例如聚山梨酯，诸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；泊洛沙姆等。在一个优选实施方案中，本发明的液体制剂中包含聚山梨酯-80作为表面活性剂。

在一些实施方案中，可以用于本发明液体制剂中的表面活性剂包括但不限于，聚山梨酯类表面活性剂(例如聚山梨酯80，聚山梨酯20)、泊洛沙姆和聚乙二醇。

本发明抗体制剂中所含的表面活性剂的量可随制剂的特定目的特性、特定环境、和使用制剂的特定目的而改变。在优选的一些实施方案中，制剂可含有约0.2-0.8mg/ml，例如约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml的表面活性剂，尤其是聚山梨酯-80，优选地约0.5mg/ml的聚山梨酯-80。

(v)螯合剂

如本文所使用的，术语“螯合剂”是指能与中心原子形成螯合物，由于螯合物的生成而是配合物的稳定性大大增加。

在一个实施方案中，本发明的液体制剂中的螯合物是羧酸型螯合剂。在一个实施方案中，所述的螯合剂选自依地酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二羟乙基甘氨酸。在一个实施方案中，所述螯合剂选自依地酸二钠。

在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的螯合剂的浓度为约0.005-0.05mg/ml。在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂中的螯合剂的浓度为约0.008-0.018mg/ml，例如约0.008、0.009、0.010、0.012、0.014、0.018mg/ml。

(vi)其它赋形剂

本发明的抗体液体制剂中任选地包含其它赋形剂。所述其它赋形剂包括，例如，抗微生物剂、抗静电剂、抗氧化剂、螯合剂、明胶等等。这些和另外已知的药物赋形剂和/或适用于本发明制剂的添加剂是本领域公知的，例如，列出于“The Handbook ofPharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人编，American PharmaceuticalsAssociation(2003)；和Remington:the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro编，Lippincott Williams&Wilkins(2005)”。

II.制剂的制备

本发明提供了包含抗冠状病毒S蛋白的抗体的稳定制剂。在本发明制剂中使用的抗冠状病毒S蛋白的抗体可以使用本领域已知的用于生产抗体的技术进行制备。例如，可以重组制备抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体在293细胞或CHO细胞中重组制备。

抗体作为药物的活性成分的应用现在已经很广泛。用于将治疗性抗体纯化至药用级的技术是本领域公知的。例如，Tugcu等(Maximizing productivity of chromatographysteps for purification of monoclonal antibodies,Biotechnology andBioengineering 99(2008)599–613.)描述在蛋白A捕获步骤后使用离子交换色谱(阴离子IEX和/或阳离子CEX色谱)的单克隆抗体三柱纯化方法。Kelley等(Weak partitioningchromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 101(2008)553–566)描述了两柱纯化法，其中在蛋白A亲和色谱后使用弱分配阴离子交换树脂。

一般，重组产生的单克隆抗体可以利用常规的纯化方法纯化，以提供具有足够的可重复性和适度纯度的药物物质用于抗体制剂的配制。例如，在抗体从重组表达细胞分泌至培养基中后，可以使用商业可得的蛋白浓缩过滤器例如Amicon的超滤装置，浓缩来自该表达系统的上清液。之后，可以使用例如色谱、透析和亲和纯化等方式进行抗体的纯化。蛋白A适应于作为亲和配体用于纯化IgG1、IgG2和IgG4型抗体。也可以使用其它抗体纯化方法，例如离子交换色谱。在获得足够纯度的抗体后，可以按照本领域已知的方法，制备包含抗体的制剂。

例如，可以采用如下步骤进行制备：(1)在发酵结束后将发酵液离心澄清去除细胞等杂质以获得上清；(2)使用亲和层析(例如对IgG1、IgG2和IgG4型抗体具有特异亲和力的蛋白A柱)捕获抗体；(3)进行病毒灭活；(4)精制纯化(一般可以采用CEX阳离子交换层析)，以去除蛋白中的杂质；(5)病毒过滤(使病毒滴度降低例如4log10以上)；(6)超滤/渗滤(可以用于将蛋白置换于利于其稳定的制剂缓冲液中并浓缩至合适的浓度供注射用)。参见例如，B.Minow,P.Rogge,K.Thompson,BioProcess International,Vol.10,No.6,2012,pp.48–57。

III.制剂的分析方法

生物制品稳定性研究一般包括实际贮存条件下的实时稳定性研究(长期稳定性研究)、加速稳定性研究和强制条件试验研究。稳定性研究应根据研究目的和产品自身特性对研究条件进行摸索和优化；针对各种影响因素(如温度、反复冻融、振动等)，制定长期、加速和/或强制条件试验等稳定性研究方案。加速和强制条件试验有利于了解产品在短期偏离保存条件和极端情况下产品的稳定性情况，并为有效期和保存条件的确定提供支持性数据。

在抗体制剂的储存、振荡或反复冻融过程中，抗体可能会发生聚集、降解或化学修饰，导致抗体异质性(包括大小异质性和电荷异质性)以及聚集物和片段等，从而影响抗体制剂的质量。因此，有必要进行抗体制剂稳定性的监测。

在本领域中已知多种方法可以用于检测抗体制剂的稳定性。例如，可以通过还原型CE-SDS、非还原型CE-SDS和SEC-HPLC等方法，分析抗体制剂的纯度和评估抗体的聚集水平；可以通过毛细管等电聚焦电泳(cIEF)、成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)和离子交换色谱(IEX)等，分析抗体制剂中的电荷变异体。此外，可以通过目视检测制剂外观，快速地判断制剂的稳定性。此外，可以使用紫外分光光度法(UV法)或反向超高效液相色谱法(RP-UHPLC法)检测制剂中的蛋白质含量变化。

非还原型CE-SDS法是一种以毛细管为分离通道进行的抗体纯度测定方法。在CE-SDS中，蛋白迁移由SDS结合引起的表面电荷来驱动，而该表面电荷与蛋白质的分子量成正比。由于所有的SDS-蛋白质复合物都具有相似的质量-电荷比，故可以在毛细管的分子筛凝胶基质中，实现基于分子的大小或流体动力学半径的电泳分离。该方法已经被广泛地用于监测变性的完整抗体的纯度。一般，在非还原型CE-SDS法中，供试样品与SDS样品缓冲液和碘乙酰胺混合。之后，混合物可以于68-72℃孵育约10-15分钟，冷却至室温后离心的上清液用于分析。采用紫外检测器检测蛋白的迁移，获得电泳谱图。抗体制剂纯度可以计算为IgG主峰的峰面积占所有峰面积之和的百分比。关于CE-SDS法的进一步描述，可以参见例如Richard R.等,Application of CE SDS gel in development of biopharmaceuticalantibody-based products,Electrophoresis,2008,29,3612-3620。

体积排阻高效液相色谱法，即SEC-HPLC法，是用于抗体标准和质控的另一重要方法。该方法主要依据分子的尺寸大小或流体动力学半径差异来进行分子的分离。通过SEC-HPLC，抗体可以分离出三种主要形式：高分子量形式(HMMS)、主峰(主要是抗体单体)、和低分子量形式(LMMS)。抗体纯度可以计算为色谱图上主峰面积占所有峰面积之和的百分比。通过SEC-HPLC法，可以测量制剂产品中抗体单体的百分数，给出可溶性聚集物和剪切物的含量信息。关于SEC-HPLC法的进一步描述，可以参见例如，J.Pharm.Scien.,83:1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11:485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15:1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14:1133-1140(1986)。此外，也可以参见例如，R.Yang等，Highresolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusionultra-high performance liquid chromatography(SE-UHPLC),Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis(2015),http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032；和Alexandre Goyon等,Protocols for the analyticalcharacterization of therapeutic monoclonal antibodies.I–Non-denaturingchromatographic techniques,Journal of Chromatography，http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010。

可以通过阳离子交换高效液相色谱法(CEX-HPLC)测定抗体制剂中抗体的电荷变异体。在该测定法中，以比主峰(或主成分)的保留时间更早从CEX-HPLC柱洗脱出的峰被标记为“酸性峰”(或酸性组分)，而那些以比主峰的保留时间更晚从CEX-HPLC柱洗脱出的峰被标记为“碱性峰”(或碱性组分)。

加速稳定性研究可以用于检查产品的稳定性性质，有利于筛选稳定药物制剂形式。例如，可以将制剂样品放置于升高的温度，例如约40℃±2℃、25℃±2℃条件下进行加速稳定性研究。此外，可以进行振荡实验或反复冻融实验来检测产品的稳定性性质。例如，在室温避光650r/min振荡1-5天，进行振荡实验。例如，可以将在-30℃以下冻存产品一天后室温融化作为一个冻融循环，进行反复冻融实验，其中可以实施1-6次反复冻融循环。产品稳定性的检测指标可以包括外观、可见异物、蛋白含量、纯度(SEC-HPLC法、非还原型CE-SDS法)和电荷变异体(iCIEF法、CEX-HPLC法)。此外，可以检测抗体的功效或生物活性。本领域技术人员已知多种方法可以用于定量抗体与抗原的特异性结合，例如免疫测定试验，ELISA等。

IV.制剂的用途

本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，例如，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。

本发明也提供了本发明的制剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于向哺乳动物递送抗冠状病毒S蛋白的抗体。本发明还提供了本发明的制剂用于治疗或预防一种或多种上述疾病和病症的方法。优选地，哺乳动物是人。

可以以多种途径将本发明的抗体制剂施用于受试者或患者。例如，施用可以通过输注或通过注射器进行。因此，在一个方面，本发明提供了一种递送装置(例如注射器)，其包含本发明的抗体制剂(例如，预填装注射器)。患者将接受有效量的抗冠状病毒S蛋白的抗体作为主要活性成分，即足以治疗、改善或预防目的疾病或病症的量。

治疗效果可包括减少生理症状。用于任何特定受试者的抗体的最佳有效量和浓度将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况和/或性别、疾病的性质和程度、特定抗体的活性，身体对其清除率，并且也包括与所述抗体制剂组合施用的任何可能的其它治疗。对于具体的情况，所递送的有效量可以在临床医师的判断范围内来确定。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。

缩略词描述

缩略词	全称
		CE-SDS	十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳
CEX-HPLC	阳离子交换高效液相色谱
		ELISA	酶联免疫吸附测定
SEC-HPLC	体积排阻高效液相色谱
		HPLC-FLD	高效液相色谱-荧光检测
iCIEF	成像毛细管等电聚焦电泳
		RP-UHPLC	反向超高效液相色谱

实施例

抗冠状病毒S蛋白的抗体P5-22(即本发明抗体A)和P14-44(即本申请抗体B)，是信达生物制药(苏州)有限公司自主研发的抗体，在PCT申请号PCT/CN2021/1173485中公开。

为了开发出适用于该全人源抗体的长期稳定储存且简单易用的注射剂制剂处方，通过40℃强制和25℃加速稳定性实验，考察了不同pH值、不同稳定剂及表面活性剂的含量对于该抗体蛋白质量的影响，最终筛选出有利于其稳定的制剂处方。整个研究过程中所用的材料和方法如下：

材料和方法

1.1.本发明的制剂研究中使用的材料

注：N/A表示不适用。

1.2.本发明的制剂研究中使用的仪器设备

1.3.制剂稳定性的检测项目和检测方法

整个研究过程中检测项目主要包括：(1)检测外观以及是否存在可见异物；(2)通过紫外法(UV法)或反向超高效液相色谱法(PR-UHPLC)测定制剂中的蛋白质含量；(3)通过体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)测定抗体制剂的纯度，表示为主峰的面积占所有峰面积之和的百分数；(4)通过非还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳(非还原型CE-SDS)测定抗体制剂的纯度，表示为主峰的面积占所有峰面积之和的百分数；(5)通过CEX-HPLC法或iCIEF法测定抗体制剂中电荷变异体，表示为主成分、酸性组分和碱性组分的百分数；(6)通过直接ELISA法测定抗体制剂中相对结合活性；(7)通过HPLC-FLD测定抗体制剂中聚山梨酯80含量。

可见异物检测

按照国家药典委员会，中华人民共和国药典(2015年版，四部通则0904“可见异物检查法”，北京：中国医药科技出版社.2015)中所记载的方法，采用澄明度检测仪(天津天大天发生产，型号YB-2)和不溶性微粒检测仪(天津天大天发生产，型号GWJ-8)，检查样品中的可见异物。

蛋白含量测定

使用紫外分光光度计(日本岛津生产，型号UV-1800)或多通道微量分光光度计(美国Thermo生产，型号Nanodrop 8000)，测定样品中的蛋白质含量。

纯度(SEC-HPLC法)

使用体积排阻色谱柱分离，流动相为磷酸盐缓冲液(称取3.12g二水合磷酸二氢钠，8.77g氯化钠和34.84g精氨酸，超纯水溶解后用盐酸调节pH至6.8并定容至1000ml)，色谱柱保护液为0.05％(w/v)NaN₃，进样量50μl，流速0.5ml/分钟，采集时间30分钟，柱温25℃，检测波长280nm。取待测样品用超纯水稀释至2mg/ml，作为供试品溶液。取制剂缓冲液用上述相同处理方式稀释后做为空白溶液。取空白溶液、供试品溶液各50μl注入液相色谱仪，开始检测。

纯度(非还原型CE-SDS法)

采用毛细管凝胶电泳法检测。毛细管为无涂层毛细管，内径50μm，总长30.2cm，有效长度20.2cm。电泳前分别使用0.1mol/L氢氧化钠、0.1mol/L盐酸、超纯水、电泳胶70psi冲洗毛细管柱。将待测样品用适量超纯水稀释至2.0mg/ml，取以上稀释后的样品50μl于1.5ml离心管中，分别向其中加入45μl pH 6.5的样品缓冲液(称取一水柠檬酸0.32g，十二水合磷酸氢二钠2.45g，溶于45ml超纯水中，定容至50ml，制得柠檬酸-磷酸盐缓冲液，精密量取该缓冲液200μl，加10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液80μl，加水至1ml，混匀，即得)、1μl内标(10kDa蛋白质，5mg/mL)(Beckman Coulter，货号：390953)和5μl 250mmol/L NEM溶液(称取N-乙基顺丁稀二酰亚胺62mg，溶于2ml超纯水中)，充分混匀后70±2℃加热10±2分钟，冷却至室温后转移至样品瓶作为供试品溶液。取与供试品相同体积的制剂缓冲液，按上述方法同样操作，制得空白溶液。样品进样条件：-5kV 20秒；分离电压：-15kV 35分钟。毛细管柱温控制在25℃，检测波长为220nm。

电荷变异体(CEX-HPLC法)

采用阳离子交换色谱法(CEX-HPLC法)检测。使用MabPac SCX-10强阳离子交换色谱柱分离，流动相A为10mmol/L磷酸盐缓冲液(称取NaH2PO4·2H2O0.51g，Na2HPO4·12H2O2.40g溶解于800ml超纯水中，定容到1000ml，使用Φ0.22μm滤膜过滤)，流动相B为10mmol/L磷酸盐+200mmol/L氯化钠缓冲液(称取NaH2PO4·2H2O 0.51g，Na2HPO4·12H2O 2.40g，NaCl 11.69g溶解于800ml超纯水中，定容到1000ml，使用Φ0.22μm滤膜过滤)。用超纯水将样品稀释至2.0mg/ml，作为供试品溶液。取制剂缓冲液用上述相同处理方式稀释后作为空白溶液。取空白溶液、供试品溶液各50μl注入液相色谱仪，流动相流速1.0ml/min，采集时间35分钟，柱温35℃，检测波长280nm，样品盘温度10℃。进样分析，根据面积归一化法，计算主成分、酸性组分及碱性组分含量。

聚山梨酯80含量(HPLC-FLD法)

采用荧光检测色谱法(HPLC-FLD法)检测。使用0.15mol/L氯化钠，0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0，5％乙腈，5.0μmol/L N-苯基-1-萘胺，15ppm 23聚氧乙烯脂肪醇醚，等度洗脱，流速：1.5ml/min；采集时间：3分钟；压力上限：100bar；进样量：10μl；柱温：30℃；检测波长：激发光350nm、发射光420nm。根据标准曲线法，计算聚山梨酯80含量。

实施例1.制备和纯化抗冠状病毒S蛋白的抗体

根据PCT申请号PCT/CN2021/1173485所述，获得抗冠状病毒S蛋白的抗体P5-22(即本发明抗体A)和P14-44(即本申请抗体B)。PCT申请号PCT/CN2021/1173485在此整体并入本文作为参考。

简言之，抗体在CHO细胞中重组表达并通过过滤、层析、病毒灭活、过滤等工艺进行纯化。用于以下活性成分验证及工艺筛选确认。

实施例2.假型SARS-CoV-2病毒的中和实验

制备了实施例1中的抗体A和抗体B，以及作为对照的同种型人IgG1抗体。购买了表达SARS-CoV-2S蛋白的假病毒(Genscript，目录号C628AFE090，1.5X108IFU/mL)。配制了DMEM细胞培养基，其包含89％ DMEM高糖培养基、10％FBS和1％ GLUTAMAX。

实验中使用的试剂信息如下表所示。

实验中使用的材料信息如下表所示。

SARS-CoV-2假病毒的中和实验方法如下。

溶液配制：取冻存的Bio-Glo Luciferase Assay System，于4℃避光融化，在生物安全柜中避光将Bio-Glo Luciferase Assay System里的溶液与粉末混合，10mL每管分装于11mL离心管中避光保存于-40℃冰箱。

准备细胞：取培养好的HEK293/ACE2细胞(Genescript R10232004)消化，以密度为6.67×104个细胞/mL重悬于DMEM细胞培养基中，在白底96孔板中每孔加入150uL细胞悬液，每孔细胞为1×104个，加上盖子在二氧化碳培养箱培养8-10h。

稀释抗体：用DMEM细胞培养基稀释抗体，从120nM按3:1梯度稀释(或者，从40nM按3:1梯度稀释)，稀释后体积为50uL。

与假病毒培养：37℃水浴融化Pseudovirus(S envelop)假病毒；向稀释好的抗体中每孔加入10uL假病毒，冰上孵育1h；将经孵育的抗体与假病毒的混合体系依次各50uL加至白底96孔板中培养的细胞，使得抗体终浓度为30nM开始按3:1梯度稀释(或者，从10nM按3:1梯度稀释)；将白底96孔板放回二氧化碳培养箱中继续培养48h。

检测：48h后，取出一支分装冻存的Bio-Glo Luciferase Assay System，于4℃避光融化。从培养箱中取出培养48h的白底96孔板，小心吸去100uL培养基，加入Bio-GloLuciferase Reagent溶液100ul/孔，迅速使用酶标仪检测。结果显示，候选抗体分子P5-22以0.008285nM的IC50、P14-44以0.2680nM的IC50阻断假病毒与HEK293/ACE2细胞的结合，初步表明所述抗体分子在细胞水平上对假病毒S蛋白与细胞表面受体ACE2的结合有很强的阻断作用。

实施例3、SARS-CoV-2真病毒中和实验

实验病毒株：SARS-CoV-2真病毒为自江苏省新型冠状病毒感染的肺炎临床病例分离的毒株

细胞系：VERO-E6细胞属于绿猴肾细胞系，天然表达ACE2。绿猴ACE2与人ACE2非常保守，序列同源性达到95％。本实施例选择用VERO-E6细胞系代替表达人ACE2的细胞系进行实验。

实验方法：

用SARS-CoV-2真病毒感染VERO-E6细胞。感染5天后，用Karber法计算50％组织培养物(在本实施例中为细胞)感染剂量(TCID50)。

采用微量病毒抑制实验方法进行中和抗体活性验证。使用固定量病毒(100TCID50)与不同稀释度的等体积抗体混合后，感染长成单层的VERO-E6细胞，每个抗体稀释度做复孔检测。实验同时设正常细胞对照。

接种后逐日观察细胞有无CPE(cytopathic effect)(病毒致细胞病变效应)，连续观察3-5天。CPE结果见图1。

由图1可见，在足量的本发明抗体的存在下，细胞100％免受病毒所致的CPE。在无抗体存在下，仅加入病毒的对照组呈现100％ CPE。

使用实施例1中的抗体分子，第四天对SARS-CoV-2真病毒的中和结果显示，候选抗体分子P5-22以0.006571μg/mL的EC50、P14-44以0.7081μg/mL的EC50中和SARS-CoV-2真病毒对VERO-E6细胞的感染，表明了所述抗体分子在细胞水平上对SARS-CoV-2真病毒S蛋白与细胞表面受体ACE2的结合有很强的阻断作用。

同样地，将抗体分子P5-22和抗体分子P14-44(1:1摩尔比)组合后，进行了真病毒的中和实验，结果表明该组合以0.009883μg/mL的EC50中和SARS-CoV-2真病毒对VERO-E6细胞的感染，表明了本发明的抗体组合也能够很强地在细胞水平上阻断SARS-CoV-2真病毒S蛋白与细胞表面受体ACE2的结合。抗体组合提供了防止病毒突变可能对一种抗体阻断的逃逸。

实施例4.处方确定实验

4.1实验方案.

初步拟定处方，进行处方确认研究，详细处方信息见表1。将抗体A和抗体B超滤置换至处方溶液中。置换完成后，将蛋白含量调整至约50mg/ml，加入聚山梨酯80，过滤后为原液。取抗体A原液和抗体B原液以体积比1：1混合制备抗体制剂。分装至西林瓶中，加塞、轧盖，进行40℃±2℃强制稳定性考察，于0天、7天、14天和28天取样，检测外观、蛋白含量、纯度、电荷变异体、聚山梨酯80含量和相对结合活性。

表1.处方信息表

4.2判断标准

根据对产品性质的认识、检测仪器的精密度以及检测方法的准确度，设定了样品的检测项目以及各项检测结果与初始值相比未发生变化的判断标准，具体见表2。

表2产品质量未发生变化的判断标准

检测项目	未发生变化标准
		外观(观察法)	澄明至微乳光，无色至微黄色液体，无异物
蛋白含量(UV法或RP-UHPLC法)	变化率≤10％
		纯度(SEC-HPLC法)	主峰纯度变化值≤1％
纯度(非还原型CE-SDS法)	主峰纯度变化值≤2％
		电荷变异体(iCIEF法)	主成分及酸碱各组分变化值≤2％
聚山梨酯80含量(HPLC-FLD法)	应为0.3～0.7mg/ml
		相对结合活性(ELISA法)	应为70～130％

4.3实验结果

处方确认实验结果详见表3，纯度(非还原型CE-SDS法)和电荷变异体(iCIEF法)变化趋势见图2和图3。

在40℃±2℃条件下放置4周，所有样品外观均合格；蛋白含量、相对结合活性均未发生明显变化；纯度(SEC-HPLC法)≥99.0％；纯度(非还原型CE-SDS法)均明显下降，但整体趋势一致，且均≥93.0％；各处方电荷变异体均发生明显变化，但整体变化趋势一致。综上结果表明抗体A和抗体B相容性良好，所选择的处方能够满足稳定性要求。

表3.处方确认实验结果

①注：抗体制剂含量检测方法为RP-UHPLC法，抗体A原液和抗体B原液蛋白含量检测方法为UV法。

②“N/A”表示不适用。

综合上述实验结果，确定抗体制剂处方为：50.0mg/ml抗体(25.0mg/ml抗体A和25.0mg/ml抗体B)，0.37mg/ml组氨酸，1.60mg/ml盐酸组氨酸，16.85mg/ml盐酸精氨酸，25.00mg/ml山梨醇，0.01mg/ml依地酸二钠，0.5mg/ml聚山梨酯80，pH 5.5。

以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

Claims (18)

1.一种液体抗体制剂，包含

（i）抗冠状病毒S蛋白的抗体；

（ii）缓冲剂，

（iii）稳定剂，和

（iv）表面活性剂，

其中所述抗冠状病毒S蛋白的抗体包含抗体A和/或抗体B，其中抗体A包含：

- GFTFRDYDII (SEQ ID NO:1)的重链VH CDR1；

- YISRSGSTIYYSDSVRG (SEQ ID NO:2)的重链VH CDR2；

- DFGFEGPRMDV (SEQ ID NO:3)的重链VH CDR3；

- QASQDIKNYLN (SEQ ID NO:4)的轻链VL CDR1；

- DASNLET (SEQ ID NO:5)的轻链VL CDR2；和

- QQFDNLPIT (SEQ ID NO:6)的轻链VL CDR3，

其中抗体B包含，

- GYIFTSYSMH (SEQ ID NO:7)的重链VH CDR1；

- TIKPSDDSTNYAQKFQG (SEQ ID NO:8)的重链VH CDR2；

- EARGYYDRSGYYHPGYFDY (SEQ ID NO:9)的重链VH CDR3；

- TGTSSDVGGYNFVS (SEQ ID NO:10)的轻链VL CDR1；

- EVSDRPS (SEQ ID NO:11)的轻链VL CDR2；和

- FSYTTSTTWV (SEQ ID NO:12)的轻链VL CDR3，

优选地，所述液体抗体制剂的pH约为5.0-6.0，例如，pH为5.5±0.2，优选地pH为5.5。

2.根据权利要求1的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂中的抗冠状病毒S蛋白的抗体的总浓度为约1-100 mg/ml，优选地为约10-70 mg/mL，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、70 mg/ml，其中抗体A的浓度约1-50 mg/ml，优选地为约15-35mg/mL，例如约15、20、25、30、35mg/ml，其中抗体B的浓度约1-50 mg/ml，优选地为约15-35mg/mL，例如约15、20、25、30、35mg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的液体抗体制剂，特征在于，

所述液体抗体制剂包含选自组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系，醋酸-醋酸钠缓冲体系，和磷酸盐缓冲体系的缓冲剂，

优选地，所述液体抗体制剂中的缓冲剂选自组氨酸、盐酸组氨酸和它们的组合；

优选地，所述组氨酸的浓度为约0.074-1.85mg/ml，例如，约0.074、0.37、1.85mg/ml，

优选地，所述盐酸组氨酸的浓度为约0.32-8.0 mg/ml，例如，约0.32、1.6、8.0 mg/ml。

4.根据权利要求1-3 中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述稳定剂选自多元醇（例如，山梨醇、甘露醇及其组合）、糖类（例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖及其组合）、氨基酸(例如精氨酸、盐酸精氨酸 甲硫氨酸 甘氨酸 脯氨酸及组合)、和它们的任意组合，

例如，所述稳定剂包含选自以下之一或多项：

-选自山梨醇、甘露醇、或其组合的多元醇；

-选自蔗糖、海藻糖、麦芽糖、或其组合的糖类；

-选自盐酸精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸及组合的氨基酸。

5.根据权利要求1-4中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述稳定剂选自约3.37-84.25mg/ml的盐酸精氨酸，例如，约3.37 mg/ml、16.85 mg/ml、84.24 mg/ml的盐酸精氨酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的液体抗体制剂，还包括等渗剂，所述等渗剂为5-125mg/ml的山梨醇，例如，约5 mg/ml 、25 mg/ml、125 mg/ml的山梨醇。

7.根据权利要求1-6中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体抗体制剂中的表面活性剂选自聚山梨酯类表面活性剂、泊洛沙姆、聚乙二醇或其组合，优选为聚山梨酯-80，所述表面活性剂的浓度为约0.1-2.5mg/ml，例如约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml。

8.根据权利要求1-7中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于进一步包含螯合剂，所述螯合剂选自依地酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二羟乙基甘氨酸，优选地，所述螯合剂选自依地酸二钠；优选地，螯合剂为约0.005-0.05 mg/ml，例如，约0.008、0.009、0.010、0.012、0.014、0.018 mg/ml依地酸二钠。

9.根据权利要求1-8中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗冠状病毒S蛋白的抗体A包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 13的序列或与其具有至少90%, 95%, 98%或99%同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO: 14的序列或与其具有至少90%, 95%, 98%或99%同一性的序列，所述抗冠状病毒S蛋白的抗体B包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中重链可变区包含SEQ ID NO: 15的序列或与其具有至少90%, 95%, 98%或99%同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO: 16的序列或与其具有至少90%, 95%, 98%或99%同一性的序列。

10.根据权利要求1-9中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗冠状病毒S蛋白的抗体含有衍生自人IgG1的Fc部分变体。

11.根据权利要求1-10中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述抗冠状病毒S蛋白的抗体在293细胞或CHO细胞中重组表达。

12.根据权利要求1-11中任何一项所述的液体抗体制剂，特征在于所述液体制剂为注射剂，优选用于皮下注射或静脉内注射，或者为输注剂，例如用于静脉内输注。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的液体抗体制剂，其包含：

（i）约10-100 mg/ml的抗冠状病毒S蛋白的抗体；

（ii）约0.074-1.85 mg/ml的组氨酸，约0.32-8.0 mg/ml盐酸组氨酸；

（iii）约5-125 mg/ml的山梨醇；

（iv）约0.1-2.5 mg/ml聚山梨酯80；和

（v）任选地，约3.37-84.25 mg/ml的盐酸精氨酸，

其中所述液体制剂的pH为约5.0-6.0，例如，约5.5；

或者，所述液体抗体制剂包含

约50mg/ml的抗冠状病毒S蛋白的抗体，约0.37 mg/ml组氨酸，约1.6 mg/ml盐酸组氨酸，约25.00 mg/ml山梨醇，约16.85 mg/ml盐酸精氨酸，约0.50 mg/ml聚山梨酯80，pH 约5.5 。

14.根据权利要求1-13中任何一项所述的液体抗体制剂，其特征在于，该制剂在储存后，例如在25℃储存至少2个月后，或在40℃±2℃储存1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：

(i) 通过SEC-HPLC法测量，主峰变化值小于1%，和/或制剂具有大于96%的纯度，优选大于97%、98%的纯度；

(ii) 通过非还原型CE-SDS法测量，主峰变化值小于2%，和/或制剂具有大于96%的纯度，优选大于97%、98%的纯度；

(iii) 通过CEX-HPLC法测量，相对于储存第0天的初始值，制剂中抗冠状病毒S蛋白的各组分（主成分、酸性组分和碱性组分）的变化值总和不超过40%和/或主成分的变化值不超过20%，例如在40℃±2℃储存1个月后变化值总和不超过约40%(例如不超过30%)或主成分变化值不超过约20%(例如不超过15%)，或在25℃储存2个月后变化值总和不超过约20%(例如约15%)或主成分变化值不超过约15%(例如不超过约10%)；

(iv) 通过ELISA法测量，相对于储存第0天的初始值，制剂中抗冠状病毒S蛋白的相对结合活性为70％-130％，例如，90％-110％；

更优选地，该制剂在振荡和/或反复冻融下是稳定的。

15.ー种固体抗体制剂，其通过固化权利要求1-14中任何一项所述的液体抗体制剂而获得，所述固体抗体制剂例如是冻干粉针剂形式。

16.递送装置，其包含权利要求1-14中任何一项的液体抗体制剂或权利要求15的固体抗体制剂。

17.预填装注射器，其包含权利要求1-14中任何一项的液体抗体制剂或权利要求15的固体抗体制剂，用于静脉内注射或者肌内注射。

18.根据权利要求1-14中任何一项的液体抗体制剂或权利要求15的固体抗体制剂的用途，用于制备预防和/或治疗冠状病毒感染的药物，例如，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。

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