TW201818924A - 於室溫穩定之冷凍乾燥蛋白質 - Google Patents
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Abstract
本發明提供穩定的冷凍乾燥治療性蛋白質組合物及其製造方法。具體而言,描述水作為固體餅塑化劑及蛋白質穩定劑之用途。亦描述包含較大分子實體及較小分子實體之多組分穩定劑的納入。此外,在某些條件下的乾燥後退火之納入改善蛋白質穩定性。蛋白質經預測在25℃下保持穩定達24個月。
Description
本發明大體上係關於生物分子之醫藥調配物領域。具體而言,本發明係關於穩定的冷凍乾燥治療性蛋白質調配物。
治療性巨分子(諸如抗體及受體Fc融合蛋白)必須以不僅使得分子適於向患者投與而且在長期儲存期間維持其穩定性之方式調配。例如,液體溶液中之治療性蛋白質(例如抗體)傾向於聚集、化學修飾或其他形式之降解,除非適當地調配溶液。液體調配物中治療性蛋白質之穩定性不僅取決於調配物中使用的賦形劑之種類及彼等賦形劑相對於彼此之量及比例,而且取決於可溶性蛋白質之濃度及製造方法。當製備治療性蛋白質調配物時,亦必須考慮除穩定性之外的因素。彼等考慮因素包括可由給定調配物適應的溶液之黏度及抗體之濃度。因此,當調配治療性蛋白質時,必須非常小心地得到具有以下性質之調配物:在儲存溫度下隨時間推移保持穩定、含有足夠濃度的抗體或其他治療性蛋白質且具有使調配物實現向患者方便地投與之其他性質。
治療性蛋白質之液體調配物通常經設計為來在冷凍或冷藏時向蛋白質提供長期穩定性,但常常未能在室溫下提供長期穩定性。本領域已知的保存蛋白質之穩定性且保持蛋白之治療性活性的一種解決方案為冷凍乾燥該分子。冷凍乾燥(在受控條件下凍結乾燥(freeze-drying))通常用於蛋白質之長期儲存。冷凍乾燥蛋白質在處於凍結乾燥狀態下時實質上能抵抗降解,諸如聚集、氧化及其他退化過程(參見,例如美國專利第6,436,897號)。冷凍乾燥提供乾燥的「餅」,其在 室溫下保持相對穩定達相對較長的時期。室溫穩定性在將治療性蛋白質儲存且分配於世界各地(尤其是不能依靠電力及冷藏之地方)方面尤為重要。
冷凍乾燥保護劑(亦稱為穩定劑)(諸如蔗糖及海藻糖)常常容納在預冷凍乾燥調配物中以在凍結乾燥過程中保護蛋白質免於變性。亦可包括塑化劑以減少總體弛豫時間,且在一些情況下可幫助保持蛋白質之天然結構。塑化劑包括糖醇(如山梨醇及甘油)、其他多元醇及少量的水。
在經設計以優化冷凍乾燥蛋白質在5℃下之儲存的研究中,Chang等研究塑化劑對蛋白質調配物之穩定性的影響。在含有重量比1:1之蔗糖與蛋白質(40mg/mL預冷凍乾燥之蛋白質)且沒有額外塑化劑的冷凍乾燥餅中,在50℃下一個月期間的聚集速率常數據報導在2.4%水含量下超過1.5%,且在3.3%水含量下為約在2%(同上,在1451頁處,圖4)。(「Effect of Sorbitol and Residual Moisture on the Stability of Lyophilized Antibodies:Implications for the Mechanism of Protein Stabilization in the Solid State,」J.Pharma.Sci.94(7):1445-1454,(2005)。實驗亦在40℃及25℃下進行,僅呈現最嚴苛的三種應力條件之資料。Chang等記錄中間水分含量下的最佳儲存穩定性之記錄案例的罕見實例,且表明在調配物開發過程中應優化殘留水分含量,而非簡單地將其最小化。(同上,在第451頁處;亦參見Breen等,「Effect of Moisture on the Stability of a Lyophilized Humanized Monoclonal Antibody Formulation,」Pharma.Res.18(9):1345-1353(2001)。)示於在由Chang等引用的所有研究中顯示高水分水平降低調配物之化學穩定性。Hsu等「Determining the Optimum residual Moisture in Lyophilized Protein Pharmaceuticals,」Develop.Biol.Standard 74:255-271(1991)。)
彼等研究皆未表明高於5℃(更不用說25℃)之溫度下的長期穩定性(超過一年、兩年或三年或更長時間),即使對於所測試之調配物亦然。
生物治療性藥品之冷凍乾燥調配物已經證明在某些條件下的長期穩定性。Kallmeyer等,W01998022136A2描述低濃度的穩定 冷凍乾燥抗體調配物(例如,高達8mg/ml預冷凍乾燥溶液),其除了其他賦形劑之外還含有糖(高達200mg/ml復水後[例如蔗糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖、海藻糖])、胺基酸(1至100mg/ml預冷凍乾燥[例如精胺酸、離胺酸、鳥胺酸])、界面活性劑(0.05至0.5mg/ml復水後[例如聚山梨醇酯及聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物])及視情況緩衝劑(10至20mM復水後[例如磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽])及/或等滲劑(例如NaCl,不多於30mM復水後)。Kallmeyer揭示可在保持穩定時在室溫(亦即18至23℃)下儲存高達兩年的冷凍乾燥物。此處,穩定性藉由復水冷凍乾燥物中之非常低至無顆粒形成(亦即小於6000個大小大於10微米之粒子或小於600個大小大於25微米之粒子)來證明。
Dix等,W02006104852A2描述維持生物活性至少三個月之穩定的冷凍乾燥VEGF-Trap(亦稱阿柏西普(aflibercept))調配物。該申請案揭示含有5至75mg/ml陷阱分子、5至50mM組胺酸緩衝劑、0.1至3%聚乙二醇(PEG;穩定劑)、0.25至3%甘胺酸(作為膨脹劑)及0.5至6%蔗糖(作為穩定劑)之預冷凍乾燥溶液。視情況,預冷凍乾燥溶液含有檸檬酸鹽緩衝劑(0.05mM)及/或0.003%至0.005%聚山梨醇酯。
除了冷凍乾燥蛋白質調配物之外,亦已採用噴霧乾燥來製備乾燥蛋白質調配物。Chen及Walsh(W0201307506A1)揭示直徑範圍為二(2)至30微米、中值直徑為約10至12微米且在一些情況下為約6至約7微米之乾燥微粉化蛋白質粒子。此等粒子隨後可用聚合物塗覆以進一步使蛋白質穩定,並且實現蛋白質隨時間推移在含水環境中之延續釋放。形成微粉化粒子之預加工的蛋白質溶液含有(1)25mg/ml蛋白質及0.1%聚山梨醇酯;(2)25mg/ml蛋白質;或(3)50mg/ml蛋白質、10mM磷酸鹽及2%蔗糖。經聚合物塗覆之微粉化蛋白質粒子內含有的蛋白質經證明保持穩定持續至少14天。
顯示在50℃下蛋白質冷凍乾燥物之乾燥後退火造成大於4%之初始抗體聚集,且聚集速率常數為每月約2%聚集。(參見,Wang等,「The Impact of Thermal Treatment on the Stability of Freeze-Dried Amorphous Pharmaceuticals:II.Aggregation in an IgG1 Fusion Protein,」99(2)J.Pharma.Sci.683-700(2010)。)雖然美國FDA 可能允許初始聚集為4%的調配物之銷售,但隨時間推移的聚集速率對於市售的醫藥調配物將是不可接受的。醫藥調配物在其儲存壽命期間不應存在可見變化。
仍然需要在室溫下在延長的時期內保持穩定之通用的乾燥蛋白質調配物。通用的乾燥蛋白質調配物尤其適於復水,以用作液體調配物、以與聚合物組合來製備延續釋放之調配物或裝置、及以經由眾多其他途徑植入或傳遞。此處,本申請者已開發改良的穩定蛋白質冷凍乾燥物及其製備方法。
相對較高含量之殘留水分可充當冷凍乾燥的治療性蛋白質(亦稱「固態」治療性蛋白質)之有效塑化劑,其提供蛋白質在室溫下儲存時持續至少24個月之驚人穩定性。在一態樣中,提供具有0.5與10百分比之間的水分之呈低遷移率固態的室溫穩定的冷凍乾燥治療性蛋白質調配物。在另一態樣中,提供製備室溫穩定的、冷凍乾燥的治療性蛋白質調配物之方法。具體而言,冷凍乾燥餅中大於2%、大於3%、大於4%、大於5%或大於6%但小於10%、小於8%、小於7%或小於6%之殘留水分水平允許在相對較高的溫度下退火持續室溫下延長的時期。雖然不受任何作用機理限制,但冷凍乾燥過程期間的殘留水含量似乎容許發生α-弛豫,同時防止在相對較高濃度的醫藥調配物(較佳介於50與200mg/ml之間,甚至更佳介於100與150mg/ml之間)下形成初始蛋白質聚集體。
在第一態樣中,提供醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅,其包含穩定的蛋白質、賦形劑及約0.5重量%至約10重量%之水、約3重量%至約6重量%之水、約4重量%至約7重量%之水、約5重量%至約8重量%之水、約3重量%、約4重量%、約4.5重量%或約6重量%之水。醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之蛋白質在室溫下保持穩定至少一個月,該室溫可為17至25℃、20至25℃或約25℃。「穩定」通常意謂小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%或極少至無蛋白質在室溫下儲存18個月內降解。蛋白質之常見降解途徑為形成聚集體及其他高分子量(HMW)種類。HMW種類可藉由許多已知方法(諸 如粒徑篩析層析法及天然或變性電泳凝膠遷移率,較佳藉由粒徑篩析層析法)來偵測。降解亦包括形成諸如去醯胺化殘基之化學產物、經還原之雙硫鍵、水解及肽斷裂及亦可藉由本領域已知方法測量之類似情況。
在一實施例中,小於或等於約2%的蛋白質在約25℃下儲存24個月後降解。降解係藉由如經由粒徑篩析層析法測量之高分子量種類種類之變化百分比來判定。在此方法下的可偵測降解之下限為約0.5%降解,其中約0.2至0.3%為檢定可變性。
除了蛋白質及水分之外,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅亦可包括一或多種賦形劑。在一實施例中,賦形劑包括緩衝劑。該緩衝劑可為維持用於蛋白質穩定性之最佳pH的任何緩衝劑。組胺酸為這種緩衝劑,其具有約6.0之pKa,且能夠在pH 4.8與7.2之間有效緩衝。在一些實施例中,賦形劑為組胺酸。在一較佳的實施例中,組胺酸以約0.34重量%至約2.04重量%存在於醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅中。
在一實施例中,賦形劑包括穩定劑。穩定劑包括各種分子,諸如多元醇、糖、胺基酸、鹽或其任何組合。有用的穩定劑之實例包括山梨醇、甘油、甘露醇、海藻糖、蔗糖、精胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸、氯化鈉或其任何組合。在一實施例中,穩定劑佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約19.9%至約82.2%。
術語「穩定劑」意謂醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅中之並非緩衝劑或蛋白質的至少一種化學實體。在一些實施例中,術語穩定劑意謂一起用於穩定蛋白質或其他巨分子之化學實體之組合(亦即多於一種化學實體)。例如,穩定劑可為蔗糖,或穩定劑可為蔗糖與精胺酸之組合。在一些實施例中,較大分子量化學實體(諸如,例如蔗糖或海藻糖)與較小分子量化學實體(諸如,例如精胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、甘露醇、山梨醇及/或甘油)配對。雖然不希望受理論束縛,但較小化學實體增加遷移率,使蛋白質實現鬆弛為較低能態。
在一實施例中,穩定劑僅為蔗糖,且穩定劑佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約3%至約15%,較佳約5至11%、4至7.5%或5至7.5%,取決於其他穩定劑組分至存在以及蛋白質、水及其 他賦形劑之量。在一實施例中,蛋白質與穩定劑之重量比介於1:1至3:1之間,較佳為1.2:1至2:1,更佳為約1.5:1。
在一實施例中,穩定劑包括與另一種穩定劑組合之蔗糖。與蔗糖組合之彼等其他穩定劑包括精胺酸、山梨醇、甘露醇、甘油及丙胺酸中之任何一或多者。在一實施例中,額外穩定劑包含精胺酸,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約4.83%至約19.3%。在一些實施例中,蔗糖與精胺酸之重量比之範圍為約3.2:1至約3.4:1。在另一實施例中,額外穩定劑包含山梨醇,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約8.07%至約22.4%。在另一實施例中,額外穩定劑包含甘露醇,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約8.07%至約22.4%。在另一實施例中,額外穩定劑包含甘油,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約4.23%至約12.7%。在又一實施例中,額外穩定劑包含丙胺酸,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約4.11%至約12.4%。
在另一實施例中,穩定劑包含海藻糖,其佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約15.8%至約70.2%,視其他穩定劑之存在以及蛋白質、水及其他賦形劑之量而定。
在一實施例中,穩定劑包含與另一種穩定劑結合之海藻糖。與海藻糖組合之彼等其他穩定劑包括精胺酸、山梨醇、甘露醇、甘油及丙胺酸中之任何一或多者。在一實施例中,額外穩定劑包含精胺酸,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約0.81%至約14.3%。在另一實施例中,額外穩定劑包含山梨醇,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約1.35%至約22.4%。在另一實施例中,額外穩定劑包含甘油,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約0.69%至約12.7%。在又一實施例中,額外穩定劑包含丙胺酸,其可佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約0.69%至約12.4%。
在另一實施例中,賦形劑包含界面活性劑。界面活性劑可包含非離子清潔劑,諸如脂肪醯化聚乙氧基化去水山梨醇。在一實施例中,界面活性劑通常包含聚山梨醇酯,或具體地包含聚山梨醇酯80。一些實施例,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅包含約0.21重量%至 約0.96重量%的界面活性劑,諸如聚山梨醇酯80。
在一實施例中,蛋白質為治療性蛋白質。在另一實施例中,治療性蛋白質為抗原結合蛋白。抗原結合蛋白涵蓋不同組的分子,包括抗體、抗體片段、受體、配體、重組分子,該重組分子包括互補決定區、配體及受體域。抗原結合蛋白包括各種其他融合(重組或嵌合)蛋白,諸如包括陷阱分子之受體Fc融合蛋白。在一具體實施例中,蛋白質為治療性抗體,諸如重組類人或人源化單株抗體。抗體包括雜合抗體以及雙特異性抗體。
在一實施例中,蛋白質佔醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之重量的約6.27%至約63.7%。在一些實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅包含約6.27重量%至約18.9重量%之蛋白質。在其他實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅包含約33.4重量%至約63.7重量%之蛋白質。
穩定劑係容納在醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅中以幫助維持蛋白質之穩定性。因此,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅包含特定比率之穩定劑與蛋白質。在一些實施例中,穩定劑與蛋白質之重量比為約0.22:1至約6.6:1。各種實施例包括選自以下之穩定劑與蛋白質比率:0.44:1、0.65:1、0.87:1、1.1:1及1.3:1,全部皆以重量計。
含有醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅。在一些實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅係容納在封閉的小瓶中。封閉物可為塞子。在其他實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅係容納在注射筒中。在仍其他實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅係容納在雙室自動注射器之一個室中。
在一實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅藉由將蛋白質、緩衝劑、非離子界面活性劑及一或多種穩定劑在水中組合以製備預冷凍乾燥之水溶液來製造。接著將溶液凍結乾燥以製備含有不大於10%且不小於0.5%水分之餅。經凍結乾燥(冷凍乾燥)之蛋白質呈「固態」。在一特定實施例中,蛋白質為治療性重組類人或人源化單株抗體。
根據另一態樣,提供用於製造包含治療性蛋白質及不大 於10%水及不小於0.5%水的組合物之方法。
在一實施例中,方法包括在容器中獲得含有蛋白質及賦形劑之含水樣品的步驟。容器尤其可為小瓶、注射筒或雙室自動注射器之室。容器足夠開放以允許水蒸氣脫氣。將含有含水樣品之容器置於室中;自樣品中除去熱量以達到第一溫度,其中冰晶在樣品中形成。將空氣自室中除去以達到第一壓力。接著將熱能添加至樣品以達到第二溫度以容許藉由昇華來自樣品中除去水。在昇華後,殘留的水仍可截留在樣品內,由此需要額外的第二乾燥步驟。該第二乾燥步驟藉由以下方式進行:來向樣品中添加熱能同時維持室中的第一壓力,從而達到第三溫度。在該溫度下,將水自樣品中解吸,以達到不大於10%且不小於0.5%之水分水平。
在一實施例中,在初始冷凍及初級乾燥步驟過程中,熱量以約0.5℃/分鐘之速率自含水樣品中除去。在一實施例中,第一溫度為約-45℃。在另一實施例中,將第一溫度保持約60分鐘。在又一實施例中,含水溶液樣品在5℃下保持約30分鐘,之後達到第一溫度。
在一實施例中,初級乾燥步驟在約-25℃之第二溫度下進行。在一實施例中,第二溫度藉由以約0.5℃/分鐘之速率增加擱架溫度(shelf temperature)來達到。在一實施例中,第二溫度保持約50小時。在一實施例中,初級乾燥過程中之室壓力為約100毫托。
在一實施例中,次級乾燥步驟在約35℃之第三溫度下進行。在一實施例中,加熱之緩變率(ramp rate)為約0.3℃/分鐘。在一實施例中,樣品在第三溫度下保持約6小時。
在次級乾燥之後,在一實施例中,小瓶在室溫約608,000毫托之室壓力下塞住。在一實施例中,室在塞住之前用N2氣體來回填。在一實施例中,將小瓶用經Flurotec®塗覆之4432/50丁基橡膠冷凍乾燥塞來塞住。
在一實施例中,使乾燥的樣品退火以使蛋白質鬆弛成較低能態且改善其總體穩定性。為了使樣品退火,將熱能添加至樣品中以達到第四溫度。在一些實施例中,將樣品在第四溫度下保持至少約24小時、至少約48小時或至少約60小時,以達到蛋白質之最佳有效 弛豫(α及β弛豫)。一旦蛋白質已經達到其最佳弛豫狀態,便將容器封閉。
在一實施例中,第四溫度即退火溫度低於水解吸步驟後樣品之玻璃轉移溫度。在一具體實施例中,退火溫度為約70℃。在另一具體實施例中,退火溫度為約45℃。在一實施例中,樣品在退火溫度下維持約72小時。由於不同蛋白質具有不同的生物物理特徵,在一些實施例中,第四溫度經由調製微差掃描熱量法(MDSC)來判定。此處,量熱計負載有已經透過次級乾燥步驟之冷凍乾燥蛋白質調配物樣品。樣品接著經由玻璃轉移來進行增量加熱,同時監測熱流。判定Tg。樣品接著在各種亞Tg溫度下保持不同時間,以誘導冷凍乾燥餅中的分子之焓弛豫。「弛豫」樣品接著進行DSC或MDSC,且判定由於焓回收而引起的峰面積(根據溫度之熱容量)(參見Luthra等,「Effects of annealing on enthalpy relaxation in lyophilized disaccharide formulations:mathematical modeling of DSC curves,」97(8)J Pharm Sci.3084-99,2008;及可用於在全球資訊網上在tainstruments.com(2016年5月13日訪問)下載之L.Thomas,「Modulated DSC® Paper #5:Measurement of Glass Transitions and Enthalpy Recovery,」TA Instruments Publication TP 010,New Castle DE。將提供最佳焓弛豫之彼等亞Tg溫度及時間選擇用於第四(亦稱退火)溫度及時間,。亦參見W.Q.,「Calorimetric analysis of cryopreservation and freeze-drying formulations,」1257 Methods Mol.Biol.163-79(2015)。
在一實施例中,預冷凍乾燥之水溶液(亦即含水樣品;亦稱為水溶液)包含多種賦形劑,諸如一或多種穩定劑、一或多種緩衝劑及視情況一或多種界面活性劑。
在一實施例中,預冷凍乾燥之水溶液以及復水之冷凍乾燥液體調配物具有有助於維持蛋白質結構及功能之pH。在具體實施例中,液體預冷凍乾燥及復水後之液體調配物具有約6.0±2之pH。認為在約pH 6下緩衝之分子適用於本實施例中。因此,在一實施例中,緩衝劑包含組胺酸。在一具體實施例中,水溶液含有約10mM組胺酸。
在一實施例中,預冷凍乾燥之水溶液含有至少一種穩定 劑。在一些實施例中,穩定劑或穩定劑之組合包括海藻糖、山梨醇、甘油、精胺酸、丙胺酸、甘露醇、蔗糖、脯胺酸、NaCl及甘胺酸中之一或多者。
在一實施例中,穩定劑或穩定劑之組合包括蔗糖。在一具體實施例中,穩定劑包含以約10%(w/v)之濃度於水溶液中之蔗糖。在一種情況下,蔗糖為唯一的穩定劑。在另一種情況下,除了10%蔗糖(w/v)之外,水溶液亦包含約3%±0.1%(w/v)精胺酸作為穩定劑。
在其他實施例中,穩定劑包含蔗糖及至少另一種分子實體。在一些實施例中,水溶液包含約5%蔗糖及另一種穩定劑。在一具體實施例中,水溶液包含5%蔗糖及以下中之任一者:(a)約1.3%±0.1%(w/v)丙胺酸;(b)約1.5%±0.1%(w/v)精胺酸;(c)約1.34%±0.1%(w/v)甘油;(d)約2.66%±0.1%(w/v)甘露醇;及(e)約2.66%±0.1%(w/v)山梨醇。
在一些實施例中,穩定劑包含不同濃度及比例的蔗糖及精胺酸。在一具體實施例中,水溶液包含約7.5%蔗糖及2.3%±0.1%精胺酸。在另一具體實施例中,水溶液包含約12.5%蔗糖及3.9%±0.1%精胺酸。在又一具體實施例中,水溶液包含約15%蔗糖及4.6%±0.1%精胺酸。
在一些實施例中,穩定劑包含海藻糖作為唯一的穩定劑或與另一種穩定劑組合。在一實施例中,穩定劑包含以約10%(w/v)之濃度處於水溶液中之海藻糖。在另一實施例中,水溶液包含約9.09%(w/v)海藻糖及以下中之任一者:0.48%(w/v)山梨醇、0.24%(w/v)甘油、0.28%(w/v)精胺酸及0.24%(w/v)丙胺酸。在另一實施例中,水溶液包含8.33%(w/v)海藻糖及以下中之任一者:0.89%(w/v)山梨醇、0.45%(w/v)甘油、0.51%(w/v)精胺酸及0.43%(w/v)丙胺酸。在另一實施例中,含水樣品包含6.66%(w/v)海藻糖及以下中之任一者:1.77%(w/v)山梨醇、0.9%(w/v)甘油、1.03%(w/v)精胺酸及0.87%(w/v)丙胺酸。在另一實施例中,含水樣品包含5%(w/v)海藻糖及以下中之任一者:2.66%(w/v)山梨醇、1.34%(w/v)甘油、1.54%(w/v)精胺酸及1.3%(w/v)丙胺酸。
本方法之治療性蛋白質可為任何治療性蛋白質,包括較小的肽以及較大的蛋白質。在一實施方案中,本發明之治療性蛋白質大於100千道爾頓或約150千道爾頓或更大。本發明中包括的治療性蛋白質可為經分離之內源性蛋白、異源表現之蛋白及/或重組蛋白,諸如嵌合融合蛋白或內源性多肽之變異體。在一實施例中,治療性蛋白質為抗原結合蛋白。抗原結合蛋白涵蓋結合至另一分子實體之任何蛋白質。例如,抗原結合蛋白包括抗體、雙特異性抗體、抗體片段、ScFv融合蛋白、含互補決定區(CDR)之蛋白質、配體、受體、配體片段、受體片段、包含配體及/或受體域之融合蛋白及受體Fc融合蛋白,包括陷阱分子。
在一實施例中,治療性蛋白質為抗體。在一具體實施例中,治療性抗體為單株抗體。在一更具體的實施例中,治療性蛋白質為在異源細胞株中產生的重組類人或人源化抗體。在另一實施例中,治療性蛋白質為受體Fc融合蛋白。在另一更具體的實施例中,治療性蛋白質為陷阱分子,諸如阿柏西普分子(VEGF陷阱)或利納西普(rilonacept)分子(IL-1陷阱)。
在一些實施例中,水溶液中之抗體濃度低,包括濃度大於零(亦即低至或低於1μg/mL)且小於或等於25mg/mL之範圍。在一低濃度實施例中,抗體濃度為約2mg/mL。
在其他實施例中,水溶液中之抗體濃度中等,包括濃度大於25mg/mL且小於或等於100mg/mL之範圍。在一中等濃度實施例中,抗體濃度為約50mg/mL。
在其他實施例中,水溶液中之抗體濃度高,包括濃度大於100mg/mL且小於或等於200mg/mL之範圍。在一高濃度實施例中,抗體濃度為約150mg/mL。
在仍其他實施例中,水溶液中之抗體濃度超高,包括大於200mg/mL之抗體濃度範圍。在一超高濃度實施例中,抗體濃度為約205mg/mL。
如上所述,但不限於任何作用機理,水可用作冷凍乾燥產品之塑化劑,這驚人地改善蛋白質之穩定性。因此,在一實施例中, 製造的組合物(亦即,穩定的冷凍乾燥調配物)之水分含量為2重量%且10重量%。在另一實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之水分含量為3重量%且6重量%。在另一實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之水分含量為4重量%且6重量%。在一具體實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之水分含量為約6%。在另一具體實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之水分含量為約4.5%。在又一具體實施例中,醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之水分含量為約3%。
在一實施例中,冷凍乾燥蛋白質在室溫下穩定至少24個月。在具體實施例中,約2%的醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅在約25%儲存24個月後降解。不限於任何機理,降解可涉及蛋白質水解、化學修飾、聚集及類似者。聚集為常見的抗體降解形式,且藉由形成高分子量(HMW)種類而得以注意。降解可使用本領域已知的或尚待發明之任何蛋白質分析來判定。在一具體實施例中,抗體之降解藉由由粒徑篩析(SE)層析法測量高分子量(HMW)種類百分比之變化來判定。
圖1及圖2為描繪溫度及水分隨時間推移對蛋白質穩定性之影響的條形圖。X軸描繪以月計之時間及溫度。Y軸描繪蛋白質之較高分子量種類之量的變化百分比。對於各溫度,單獨直方圖表示沿X軸自左至右漸增的水含量百分比(w/w),0%水(空心條)、0.5%水(淺陰影條)、1.5%水(向下交叉影線填充條)、3.0%水(垂直線填充條)、4.5%水(水平線填充條)、6%水(空心菱形填充條)、8%水(方格條)及10%水(暗陰影條)。
在描述本發明之前,應瞭解本發明不限於所述的特定方法及實驗條件,因為此類方法劑條件可以變化。也應瞭解本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的,並且不意欲具有限制性,因為本發明之範疇將僅受限於隨附申請專利範圍。
賦形劑、成分及其他材料之絕對量及相對量可由質量或莫耳來描述。質量單位可表示為克、毫克、微克及類似者)。如「重量/體積」或「w/v」中之術語「重量」意謂「質量」。相對量可表示為重 量百分比(亦即質量百分比),其中百分之一(1)重量比體積(w/v)意謂每100毫升體積1克材料。另外,例如,每一(1)重量份成分「B」一(1)重量份成分「A」意謂,例如對於每一(1)克成分「A」,存在一(1)克成分「B」。另外,例如,百分之一重量(1重量%)的成分「A」意謂,例如對於每100克總重量的粒子,存在一(1)克成分「A」。成分之相對量亦可依據每給定體積莫耳或分子數來表示,例如每升或每其他成分毫莫耳(毫莫耳(mM)),例如每Y莫耳份成分「B」X莫耳份成分「A」意謂,對於每X莫耳「A」,存在Y莫耳「B」
儘管與本文所述的彼等方法及材料類似或等效的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試,但現在描述示範性方法及材料。本文中所提及之所有公開案以全文引用方式併入本文中以進行描述。
賦形劑為與活性藥品物質一起添加在醫藥調配物中之成分。賦形劑幫助穩定醫藥物質及/或增加調配物之體積。術語成分與賦形劑可互換使用。
賦形劑包括用於各種目的之各種物質,該等目的如緩衝、膨脹、增溶、穩定化、塑化及保護藥品物質。保護劑可防止熱應力及/或物理壓力,如攪拌。緩衝劑為本領域眾所周知的。
通常,緩衝劑容納在預冷凍乾燥蛋白質水溶液中以在冷凍乾燥之前及復水之後使蛋白質穩定。緩衝劑可以1mM至100mM之濃度容納在預冷凍乾燥溶液中。在一些特定實施例中,緩衝劑以約10mM容納在預冷凍乾燥溶液中。在某些實施例中,緩衝劑以以下濃度存在於預冷凍乾燥溶液中:5mM±0.75mM至15mM±2.25mM;6mM±0.9mM至14mM±2.1mM;7mM±1.05mM至13mM±1.95mM;8mM±1.2mM至12mM±1.8mM;9mM±1.35mM至11mM±1.65mM;10mM±1.5mM;或約10mM。在某些實施例中,預冷凍乾燥溶液之緩衝系統包含10mM±1.5mM之組胺酸、磷酸鹽及/或乙酸鹽。
在一些實施例中,緩衝劑選自能夠在約3至約9之pH 範圍內或在約3.7至約8.0之pH範圍內的某處緩衝之化學品。例如,預冷凍乾燥溶液可具有以下pH:約3.4、約3.6、約3.8、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、約5.0、約5.2、約5.4、約5.6、約5.8、約6.0、約6.2、約6.4、約6.6、約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8或約8.0。
緩衝劑可為單獨緩衝劑之組合,諸如例如組胺酸及乙酸鹽之組合(his-乙酸鹽緩衝劑)。在一個實施例中,緩衝劑具有約3.5至約6、或約3.7至約5.6之緩衝範圍,諸如由乙酸鹽所緩衝之範圍。在一個實施例中,緩衝劑具有約5.5至約8.5、或約5.8至約8.0之緩衝範圍,諸如由磷酸鹽所緩衝之範圍。在一個實施例中,緩衝劑具有約5.0至約8.0、或約5.5至約7.4之緩衝範圍,諸如由組胺酸所緩衝之範圍。
賦形劑包括穩定劑。如本文中所使用,將穩定劑添加至預冷凍乾燥溶液中以使蛋白質穩定,免於聚集或其他降解。經由在冷凍乾燥過程期間控制玻璃動力學或藉由經由穩定劑與蛋白質之特異性相互作用幫助保存蛋白質之天然結構,可發生穩定化。對於冷凍乾燥過程期間的穩定劑之生物物理學的討論,參見Chang等,「Mechanism of protein stabilization by sugars during freeze-drying and storage:native structure preservation,specific interaction,and/or immobilization in a glassy matrix?」94(7)J.Pharm.Sci.1427-44(2005)。
容納在預冷凍乾燥溶液中之穩定劑包括多元醇、糖、鹽(例如氯化鈉)、胺基酸及類似者。各種單獨穩定劑可單獨用於或與一或多種其他穩定劑組合用於最佳穩定化效果。例如,多元醇可與糖、具有胺基酸之糖、具有胺基酸之多元醇、具有糖之鹽、具有胺基酸之鹽、具有多元醇之鹽及類似者組合。
多元醇為具有多於一個羥基(-OH)之有機分子。多元醇包括單體以及聚合物。糖醇為多元醇糖醇之亞組,其可用作有用的穩定劑,包括甘露醇、木糖醇、山梨醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇及甘油。其他單體多元醇包括乙二醇、丙二醇及季戊四醇。聚合多元醇可為多元醇亞單元之聚酯或聚醚。有用的示範性聚合多元醇包括聚丙二醇、聚乙二醇及聚(四亞甲基醚)二醇。
糖係用作穩定劑(以及膨脹劑)。糖可分類為還原糖或非還原糖。非還原糖包括二糖蔗糖及海藻糖。還原糖包括葡萄糖、麥芽糖及乳糖。通常,非還原糖對於蛋白質冷凍乾燥係較佳的,因為還原糖可經由梅拉德反應(mallard reaction)來還原蛋白質。通常參見,Lavakumar等,「Lyophilization/Freeze Drying-A Review,」3(4)Int.J.Novel Trends in Pharm.Sci.2277-2782(2013)。二糖海藻糖及蔗糖為相對惰性的,且易於在冷凍乾燥期間形成無定形玻璃。單獨的海藻糖或蔗糖或與胺基酸或多元醇組合之海藻糖或蔗糖在本發明之實踐中用作穩定劑。
在一實施例中,海藻糖用作唯一的穩定劑。在其他實施例中,海藻糖與多元醇組合。在一些實施例中,穩定劑為海藻糖及山梨醇、或海藻糖及甘油之組合。在其他實施例中,海藻糖與胺基酸組合。具體地,海藻糖與丙胺酸組合,或海藻糖與精胺酸組合。
在另一實施例中,蔗糖用作唯一的穩定劑。在其他實施例中,蔗糖與多元醇組合。在具體實施例中,穩定劑我蔗糖及甘露醇、蔗糖及山梨醇、或蔗糖及甘油之組合。在其他實施例中,蔗糖與胺基酸組合。具體地,蔗糖與精胺酸組合,或蔗糖與丙胺酸組合。
胺基酸用作穩定劑。甘胺酸為常用的膨脹劑及穩定劑。其他有用的胺基酸包括精胺酸、丙胺酸及脯胺酸。在一些實施例中,精胺酸用作穩定劑。在一些具體實施例中,精胺酸與蔗糖組合,或精胺酸與海藻糖組合。在其他實施例中,丙胺酸用作穩定劑。在一些具體實施例中,丙胺酸與蔗糖組合,或丙胺酸與海藻糖組合。
在一些情況下,一或多種界面活性劑可用作賦形劑。據信界面活性劑藉由減少蛋白質蛋白質疏水相互作用且致使形成高分子量種類(亦即聚集體)來提供額外的穩定性。在一些實施例中,一或多種界面活性劑可容納在含預冷凍乾燥蛋白質之水溶液中。在其他實施例中,一或多種界面活性劑可容納在復水稀釋溶液中。界面活性劑包括降低將其溶解的液體之表面張力及/或降低油與水之間之界面張力的物質。界面活性劑可為離子或非離子的。可容納在預冷凍乾燥溶液或復水後溶液中之示範性非離子界面活性劑包括例如烷基聚(環氧乙烷)、烷 基聚葡糖苷(例如辛基葡糖苷及癸基麥芽糖苷)、脂肪醇(諸如鯨蠟醇及油醇)、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA及椰油醯胺TEA。可容納在預冷凍乾燥水溶液(或復水後溶液)中之具體非離子界面活性劑包括例如聚氧乙烯去水山梨醇酯(亦稱聚山梨醇酯),諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81及聚山梨醇酯85;泊洛沙姆,諸如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407;聚乙-聚丙二醇;或聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20亦稱為TWEEN 20、去水山梨醇單月桂酸酯及聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯。聚山梨醇酯80亦稱為TWEEN 80、去水山梨醇單油酸酯及聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯。
包含在預冷凍乾燥溶液或復水溶液中之界面活性劑之量可根據冷凍乾燥調配物所要的具體特性及目的而變化。在某些實施例中,預冷凍乾燥溶液或復水溶液可含有約0.001%(w/v)至約0.5%(w/v)界面活性劑(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)。例如,預冷凍乾燥可含有約0.001%;約0.0015%;約0.002%;約0.0025%;約0.003%;約0.0035%;約0.004%;約0.0045%;約0.005%;約0.0055%;約0.006%;約0.0065%;約0.007%;約0.0075%;約0.008%;約0.0085%;約0.009%;約0.0095%;約0.01%;約0.015%;約0.016%;約0.017%;約0.018%;約0.019%;約0.02%;約0.021%;約0.022%;約0.023%;約0.024%;約0.025%;約0.026%;約0.027%;約0.028%;約0.029%;約0.03%;約0.031%;約0.032%;約0.033%;約0.034%;約0.035%;約0.036%;約0.037%;約0.038%;約0.039%;約0.04%;約0.041%;約0.042%;約0.043%;約0.044%;約0.045%;約0.046%;約0.047%;約0.048%;約0.049%;約0.05%;約0.051%;約0.052%;約0.053%;約0.054%;約0.055%;約0.056%;約0.057%;約0.058%;約0.059%;約0.06%;約0.061%;約0.062%;約0.063%;約0.064%;約0.065%;約0.066%;約0.067%;約0.068%;約0.069%;約0.07%;約0.071%;約0.072%;約0.073%;約0.074%;約0.075%;約0.076%;約0.077%;約0.078%;約0.079%;約0.08%;約0.081%;約0.082%;約0.083%;約0.084%;約0.085%;約0.086%;約0.087%;約0.088%;約0.089%;約0.09%; 約0.091%;約0.092%;約0.093%;約0.094%;約0.095%;約0.096%;約0.097%;約0.098%;約0.099%;約0.10%;約0.15%;約0.20%;約0.25%;約0.30%;約0.35%;約0.40%;約0.45%;或約0.50%界面活性劑(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)。
一或多種塑化劑容納在冷凍乾燥蛋白質組合物中。塑化劑通常用於增加系統之流動性或撓性。認為增加的流動性為塑化劑增加系統之自由體積且降低玻璃轉移溫度之結果。塑化劑之添加修飾冷凍乾燥餅內之α-弛豫及β-弛豫兩者。α-弛豫亦稱為初級或玻璃弛豫,且為總體弛豫過程。β-弛豫為與蛋白質聚合物主鏈運動相關之更局部的過程,其可由較小的分子(亦即塑化劑)更好地修飾。兩種弛豫過程皆降低系統之總體能量,尤其在β-弛豫的情況下被認為影響蛋白質穩定性。在蛋白質生物物理學領域中通常已知,塑化劑降低β-弛豫時間且可伴隨地降低蛋白質穩定性(參見,例如Cicerone及Douglas,「β-Relaxation governs protein stability in sugar-glass matrices,」Soft Matter 8:2983-2991,2012)。
本發明亦在一態樣中提供冷凍乾燥蛋白質調配物實施例,其含有以特定比率與一或多種塑化劑組合之一或多種糖,以產生在保存或增強蛋白質穩定性時提供足夠的餅撓性及α-弛豫之「穩定劑」。在一些實施例中,穩定劑包含約19:1至約1:1之糖與塑化劑之重量比重量(亦即質量比質量)比。在一些實施例中,穩定劑包含以下之糖與塑化劑之重量比:約19:1、或18:1、約17:1、約16:1、約15:1、約14:1、約13:1、約12:1、約11:1、約10:1、約9:1、約8:1、約7:1、約6:1、約5:1、約4:1、約3:1、約2:1或約1:1。
有用的塑化劑包括多元醇(諸如山梨醇、甘油(甘油(glycerin))、甘露醇及木糖醇)、胺基酸(諸如甘胺酸、精胺酸、脯胺酸及丙胺酸)及鹽(諸如NaCl)。有趣的是,水亦可用作塑化劑。然而,水通常為不利的,因為其為化學反應物及導致遷移率及Tg降低之塑化劑。遷移率增加與系統內反應性及水解性增加相關。反應性及水解增加侵蝕蛋白質穩定性。參見,Terakita等,「The Influence of Water on the Stability of Lyophilized Formulations with Inositol and Mannitol as Excipients,」57(5)Chem.Pharm.Bull.459-463(2009)。
如上所述,與水組合之甘露醇、甘油、山梨醇及甘胺酸在一些實施例中用作塑化劑。不受理論束縛,據信此等分子在特定調配物實施例中減少β-弛豫時間,同時亦增加蛋白質穩定性。
在一些具體實施例中,糖蔗糖或海藻糖與塑化劑山梨醇係以如下重量比組合:約4:1、約3.9:1、約3.8:1、約3.7:1、約3.6:1、約3.5:1、約3.4:1、約3.3:1、約3.2:1、約3.1:1、約3:1、約2.9:1、約2.8:1、約2.7:1、約2.6:1、約2.5:1、約2.4:1、約2.3:1、約2.2:1、約2.1:1、約2:1、約2:1、約1.9:1、約1.8:1、約1.7:1、約1.6:1、約1.5:1、約1.4:1、約1.3:1、約1.2:1、約1.1:1或約1:1。在其他具體實施例中,糖蔗糖或海藻糖與塑化劑精胺酸係以如下重量比組合:約33:1、約32:1、約31:1、約30:1、約29:1、約28:1、約27:1、約26:1、約25:1、約24:1、約23:1、約22:1、約21:1、約20:1、約19:1、約18:1、約17:1、約16:1、約15:1、約14:1、約13:1、約12:1、約11:1、約10:1、約9:1、約8:1、約7:1、約6:1、約5:1、約4.5:1、約4:1、約3.5:1或約3:1。
本發明在一態樣中亦提供,水用作冷凍乾燥組合物中之穩定化塑化劑,並且幫助降低室溫下儲存的冷凍乾燥組合物中之蛋白質聚集速率。在室溫下有效地使冷凍乾燥餅中之蛋白質穩定所需的水分量隨著蛋白質含量增加而增加,且隨著蛋白質含量減少而減少。因此,來源於含有50mg/mL蛋白質之預冷凍乾燥溶液的冷凍乾燥組合物可能比來源於含有150mg/mL蛋白質之預冷凍乾燥溶液的冷凍乾燥組合物需要更低的水分含量。此外,有效地使冷凍乾燥餅中之蛋白質穩定所需的最佳水分量隨儲存溫度而變化。例如,中間的水分量有利於蛋白質冷凍乾燥物在室溫下長期儲存。在較高儲存溫度(例如,37℃)下,需要較少水分。
例如,圖1描繪水分對25℃、37℃或50℃下儲存的示範性抗體冷凍乾燥調配物之穩定性的影響。此處,預冷凍乾燥調配物含有150mg/mL IgG、5%蔗糖及1.54%精胺酸。最終的冷凍乾燥餅含有0%、0.5%、1.5%、3.0%、4.5%、6%、8%或10%之水分(w/w)。如圖1所示,較高的儲存溫度在2至3個月內導致蛋白質穩定性較低。 有趣的是,與在37℃或50℃下相比,在室溫下,傳達最大穩定性之最佳水分量較高。在此特定的實例中,室溫下蛋白質穩定性之最佳水分含量為約4.5%(w/w)及約1.5%至約3%,以在50℃下儲存2個月。較長期的穩定性資料如圖2所示,其描繪分別在25℃及37℃下儲存12個月及6個月的示範性抗體冷凍乾燥調配物。如圖2所示,在所測試之兩種溫度下,3.0%至4.5%(w/w)之水分含量傳達最佳穩定性,且4.5%之水分含量提供在室溫(25℃)條件下12個月時之最大穩定性。
在一個實施例中,本發明提供包含1.5%至8%水(w/w)的在室溫(25℃)下保持穩定至少12個月之穩定冷凍乾燥蛋白質(例如,抗體)調配物,其中穩定性係指12個月儲存週期內高分子量種類之增加小於2%。在另一個實施例中,本發明提供包含3.0%至4.5%水(w/w)的在室溫(25℃)下保持穩定至少12個月之穩定冷凍乾燥蛋白質(例如,抗體)調配物,其中穩定性係指12個月儲存週期內高分子量種類之增加小於1.5%。
在一些實施例中,冷凍乾燥組合物含有0.5重量%水、0.6重量%水、0.7重量%水、0.8重量%水、0.9重量%水、1重量%水、1.5重量%水、2重量%水、2.5重量%水、3重量%水、3.5重量%水、4重量%水、4.5重量%水、5重量%水、5.5重量%水、6重量%水、6.5重量%水、7重量%水、7.5重量%水、8重量%水、8.5重量%水、9重量%水或9.5重量%水但不大於10重量%水。然而,超最佳的水量可能增加蛋白質不穩定性。因此,在一些實施例中,冷凍乾燥組合物含有10重量%水、9.5重量%水、9重量%水、8.5重量%水、8重量%水、7.5重量%水、7重量%水、6.5重量%水、6重量%水、5.5重量%水、5重量%水、4.5重量%水、4重量%水、3.5重量%水、3重量%水、2.5重量%水、2重量%水、1.5重量%水、1重量%水、0.9重量%水、0.8重量%水、0.7重量%水、0.6重量%水但不小於0.5重量%水。
習語「水分含量」可與「水含量」互換使用。然而,「水分含量」用於描述冷凍乾燥餅之水含量,而「水含量」用於描述水溶 液、凝膠、其他液體、氣體、冰或固體形式的調配物(諸如冷凍乾燥餅、噴霧乾燥粒子及類似者)中之水量。在一些實施例中,冷凍乾燥組合物之水分含量係介於0.5重量%與10%之間、介於1重量%與10重量%之間、介於2重量%與10重量%之間、介於3重量%與10重量%之間、介於4重量%與10重量%之間、介於5重量%與10重量%之間、介於6重量%與10重量%之間、介於7重量%與10重量%之間、介於8重量%與10重量%之間、介於9重量%與10重量%之間、介於0.5重量%與9重量%之間、介於0.5重量%與8重量%之間、介於0.5重量%與7重量%之間、介於0.5重量%與6重量%之間、介於0.5重量%與5重量%之間、介於0.5重量%與4重量%之間、介於0.5重量%與3重量%之間、介於0.5重量%與2重量%之間、介於0.5重量%與1重量%之間、介於1重量%與2重量%之間、介於1.5重量%與2.5重量%之間、介於2重量%與3重量%之間、介於2.5重量%與3.5重量%之間、介於3重量%與4重量%之間、介於3.5重量%與4.5重量%之間、介於4重量%與5重量%之間、介於4.5重量%與5.5重量%之間、介於5重量%與6重量%之間、介於5.5重量%與6.5重量%之間、介於6重量%與7重量%之間、介於6.5重量%與7.5重量%之間、介於7重量%與8重量%之間、介於7.5重量%與8.5重量%之間、介於8重量%與9重量%之間、介於8.5重量%與9.5重量%之間、介於9重量%與10重量%之間、介於9.5重量%與10重量%之間、或約1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%或8重量%。在一些實施例中,冷凍乾燥組合物之水分含量係介於3重量%與6重量%之間;介於3.1重量%與5.9重量%之間、介於3.2重量%與5.8重量%之間、介於3.3重量%與5.7重量%之間、介於3.4重量%與5.6重量%之間、介於3.5重量%與5.5重量%之間、介於3.6重量%與5.4重量%之間、介於3.7重量%與5.3重量%之間、介於3.8重量%與5.2重量%之間、介於3.9重量%與5.1重量%之間、介於4重量%與5重量%之間、介於4.1重量%與4.9重量%之間、介於4.2重量%與4.8重量%之間、介於4.3重量%與4.7重量%之間、介於4.4重量%與4.6重量%之間、或約4.5重量%。在一些實施例中,冷凍乾燥組合物之水分含量係介於2重量%與4 重量%之間;介於2.1重量%與3.9重量%之間、介於2.2重量%與3.8重量%之間、介於2.3重量%與3.7重量%之間、介於2.4重量%與3.6重量%之間、介於2.5重量%與3.5重量%之間、介於2.6重量%與3.4重量%之間、介於2.7重量%與3.3重量%之間、介於2.8重量%與3.2重量%之間、介於2.9重量%與3.1重量%之間、或約3重量%。
在一些實施例中,冷凍乾燥餅中之水含量重量百分比為約3%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5%、約5.1%、約5.2%、約5.3%、約5.4%、約5.5%、約5.6%、約5.7%、約5.8%、約5.9%、約6%、約6.1%、約6.2%、約6.3%、約6.4%、約6.5%、約6.6%、約6.7%、約6.8%、約6.9%、約7%、約7.1%、約7.2%、約7.3%、約7.4%、約7.5%、約7.6%、約7.7%、約7.8%、約7.9%或約8%。在一些實施例中,冷凍乾燥餅之水含量超過3重量%但小於10重量%。
冷凍乾燥餅之水含量可藉由本領域已知的任何一或多種方法來判定。彼等方法包括重量測定法,包括重量測定法、氣相層析法、近紅外光譜法、電量測定法和卡耳費雪法或相對濕度感測器法。此等方法中之一些係綜述於J.K.Townes,「Moisture content in proteins:its effects and measurement,」705 J.Chromatography A 115-127,1995;及Malik等,「Analytical Options for the Measurement of Residual Moisture Content in Lyophilized Biological Materials,」Am.Pharma.Rev.August 01,2010;及其中所引用之參考文獻中。例如,可使用乾燥失重(LOD)法(重量測定),在該方法中將冷凍乾燥餅稱重、進行額外加熱以完全驅除所有水及其他揮發物,且接著再次稱重。質量損失係歸因於起始材料內含有之水(及其他揮發物)。判定水含量之另一種方法為卡耳費雪法(體積測定或電量測定),其藉由測量SO2由I2之氧化開判定H2O之量,其中一莫耳I2為每莫耳H2O消耗物。近紅外光譜測量透過含有蛋白質之玻璃小瓶(玻璃表面)的1100nm至2500nm之反射率以判定水分含量,而不破壞樣品。參見,United States Pharmacopeia,第XXIII修訂版,USP Convention,Rockville,MD 1995,第1801至1802頁;及Savage 等,「Determination of Adequate Moisture Content for Efficient Dry-Heat Viral Inactivation in Lyophilized Factor VIII by Loss on Drying and by Near Infrared Spectroscopy,」26 Biologicals 119-124,1998。
含有蛋白質及穩定劑之冷凍乾燥組合物形成固體基質,亦稱為「餅」或「冷凍乾燥餅」。「醫藥學上可接受之餅」(可與「醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅」互換使用)為無定形的(玻璃狀,非結晶),且具有美學上之雅觀。醫藥學上可接受之餅不應顯示收縮、裂化、部分或總體塌陷、回熔或變色。紅色、黑色、褐色、黃色或其他著色餅為變色的且為不可接受的。理想的餅為機械上強健的且耐處理期間之破壞、為多孔及類海綿的、具有均勻紋理、且形成單一實體、且顏色為均勻白色。餅應均勻地附接至小瓶之壁,且未顯示脫離或其他收縮跡象。參見,Carpenter等,「Rational design of stable lyophilized protein formulations:Some practical advice,」Pharmaceutical Research,14(8):969-975,1997。
餅應無由於冷凍問題引起的目視缺陷,包括類煙囪結構;表面區域上之乾燥泡沫;餅表面上之結皮或上釉;及水平分層或環形成。餅亦應無由於乾燥問題引起的目視缺陷,包括:收縮,其中餅體積小於冷凍基質,且壁脫落之跡象明顯;裂化,其中餅顯示乾燥基質之裂縫,且餅不形成單一實體;不同程度的餅結構損失,諸如餅之總體或部分塌陷;回熔,其中餅在下部區域含有溶解材料之環;部分回熔,其中僅餅基部中之小區域含有溶解的材料;及褐變,其為由於包括經歷梅拉德反應之還原糖引起的餅之黃色或褐色變色。回熔係特別有問題的,因為其可能導致減緩溶解時間、蛋白質聚集、降解及效力損失。參見,2016年7月8日自http://www.fda.gov/ICECI/Inspec-tions/InspectionGuides/ucm074909.htm最後訪問之FDA,「Guide to Inspections of Lyophilization of Parenterals(7/93).Finished product inspection.Last update 2009,」2009。
術語「蛋白質」意謂具有經由醯胺鍵共價鍵聯的多於約 50個胺基酸之任何胺基酸聚合物。蛋白質含有一或多個胺基酸聚合物鏈,其在本領域中通常稱為「多肽」。蛋白質可含有一個或多個多肽以形成單一功能化生物分子。「多肽」通常含有超過50個胺基酸,而「肽」通常含有50個胺基酸或更少。蛋白質可含有一或多種共價及非共價修飾。雙硫橋(亦即介於半胱胺酸殘基之間以形成胱胺酸)可能存在於一些蛋白質中。此等共價鍵聯可處於單個多肽鏈內或介於兩個單獨多肽鏈之間。例如,雙硫橋對於胰島素、免疫球蛋白、魚精蛋白及類似者之適當結構及功能至關重要。關於最近對雙硫鍵形成之綜述,參見Oka及Bulleid,「Forming disulfides in the endoplasmic reticulum,」1833(11)Biochim Biophys Acta 2425-9(2013)。
除雙硫鍵形成之外,蛋白質亦可進行其他轉譯後修飾。彼等修飾包括脂化(例如,豆蔻醯化、棕櫚醯化、法呢醯化(farnesoylation)、香葉基香葉醯化及糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨形成)、烷基化(例如甲基化)、醯化、醯胺化、糖基化(例如在精胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、羥基賴胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及/或色胺酸處添加糖基)及磷酸化(亦即將磷酸基添加至絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及/或組胺酸)。關於最近關於真核生物中產生之蛋白質之轉譯後修飾的綜述,參見Mowen及David,「Unconventional post-translational modifications in immunological signaling,」15(6)Nat Immunol 512-20(2014);以及Blixt及Westerlind,「Arraying the post-translational glycoproteome(PTG),」18 Curr Opin Chem Biol.62-9(2014)。
免疫球蛋白(亦稱「抗體」)為具有多個多肽鏈及大量轉譯後修飾的蛋白質之實例。正則免疫球蛋白蛋白質(例如,IgG)包含四條多肽鏈,兩條輕鏈及兩條重鏈。各輕鏈經由胱胺酸雙硫鍵鍵聯至一條重鏈,且兩條重鏈經由兩個胱胺酸雙硫鍵相互鏈接。哺乳動物系統中產生的免疫球蛋白亦可在各種殘基處(例如,在天冬醯胺殘基處)用各種多糖來糖基化,且可能因種類而異,這可影響治療性抗體之抗原性(參見,Butler及Spearman,「The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering」,30 Curr Opin Biotech 107-112(2014))。
如本文所使用,「蛋白質」包括治療性蛋白質、用於研究或療法之重組蛋白、陷阱蛋白質及其他受體Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗體、單株抗體、人抗體、雙特異性抗體、抗體片段、奈米抗體、重組抗體嵌合體、細胞介素、趨化介素、肽激素及類似者。蛋白質可使用基於重組細胞的生產系統(諸如昆蟲桿狀病毒系統、酵母系統(例如畢赤酵母屬(Pichia sp.)))、哺乳動物系統(例如CHO細胞及CHO衍生物,如CHO-K1細胞)來產生。關於最新討論治療性蛋白質及其生產之綜述,參見Ghaderi等,「Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-human sialylation,」28 Biotechnol Genet Eng Rev.147-75(2012)。
一些含重組Fc的蛋白質含有在生物系統中具有同源結合配偶體之受體或受體片段、配體或配體片段。「受體Fc融合蛋白」係指含有融合至免疫球蛋白Fc域之可溶性受體的重組分子。一些受體Fc融合蛋白可含有多種不同受體之配體結合域。彼等受體Fc融合蛋白係稱為「陷阱」或「陷阱分子」。Rilonocept及阿柏西普分別為拮抗IL1R之銷售的陷阱之實例(參見美國專利第7,927,583號)及VEGF(參見美國專利第7,087,411號)。其他含重組Fc的蛋白質包括含有融合至Fc域之肽的彼等重組蛋白,例如Centocor的MIMETIBODYTM技術。含重組Fc的蛋白質係描述於C.Huang,「Receptor-Fc fusion therapeutics,traps,and MIMETIBODY technology,」20(6)Curr.Opin.Biotechnol.692-9(2009)中。
「Fc融合蛋白」包含兩種或兩種以上蛋白質中之一部分或全部,其中之一為免疫球蛋白分子的未以其天然狀態融合之Fc部分。例如,Fc融合蛋白為陷阱,諸如IL-1陷阱(例如,利納西普,其含有與融合至hIgG1之Fc的IL-1R1胞外區融合的IL-1RAcP配體結合區;參見美國專利第6,927,004號,其以全文引用方式併入本文中)或VEGF陷阱(例如,阿柏西普,其含有與融合至hIgG1之Fc的VEGF受體Flkl之Ig域3融合的VEGF受體Flt1之Ig域2;參見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號,其以全文引用方式併入本文中)。
在一些實施例中,蛋白質以大於40mg/mL之濃度包括 在預冷凍乾燥水溶液中。在一些實施例中,預冷凍乾燥水溶液包含以下濃度之蛋白質:約50mg/mL至約250mg/mL;約100mg/mL至約200mg/mL;約125mg/mL至約175mg/mL。在一些實施例中,預冷凍乾燥水溶液包含以下濃度之蛋白質:約45mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約65mg/mL、約70mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約90mg/mL、約95mg/mL、約100mg/mL、約105mg/mL、約110mg/mL、約115mg/mL、約120mg/mL、約125mg/mL、約130mg/mL、約135mg/mL、約140mg/mL、約145mg/mL、約150mg/mL、約155mg/mL、約160mg/mL、約165mg/mL、約170mg/mL、約175mg/mL、約180mg/mL、約185mg/mL、約190mg/mL、約195mg/mL或約200mg/mL。
在一些實施例中,含有治療性蛋白質之預冷凍乾燥水溶液係容納在容器中。將凍結乾燥過程施用於通風容器中之溶液,隨後將該通風容器封閉以容納凍結乾燥之組合物。術語容器在本文中極其寬泛地應用。容器例如可為能夠含有2mL至多達4升或更多之散裝容器(諸如瓶子、罐或小罐)、安瓿、小瓶(玻璃或塑膠)、注射器(玻璃或塑膠)、筒或自動注射器。小瓶可小至0.2mL或更小,或大至100mL。示範性小瓶可由透明玻璃或琥珀色玻璃、I型硼矽玻璃、II型鈉矽玻璃或III型鈉矽玻璃製成。瓶子可用塞子、帽、翻帽或螺旋帽封閉。SCHOTT®型管狀玻璃尤其可用於冷凍乾燥應用。
隨著生物藥品及注射藥品之患者自投與之出現,自動注射器已經成為更重要的藥品產品容器。冷凍乾燥藥品之自我投與需要患者用無菌注射用水或其他無菌溶劑復水冷凍乾燥餅。為了幫助確保無菌復水、體積控制、易於處理及總體簡化,可使用雙室或多室預充式注射器。雙室自動注射器或其他預填充注射器在一個室中含有冷凍乾燥藥品,且在另一個室中含有預測量之量的稀釋劑或液體醫藥組合物。示範性雙室注射器係描述於2006年11月21日授權之US 6,149,626 A及2011年6月14日授權的US 7,959,600 B2。
蛋白質之冷凍乾燥形式提供若干優點,其中之一為維持蛋白質隨時間推移(尤其是在室溫下至少18個月)之穩定性。「室溫」係指通常的工作環境之溫度。室溫包括處於10至40℃、17至27℃、20至24℃、25℃±3℃、25℃±2℃、25℃±1℃之範圍內的溫度或約25℃。習語「室溫」可與習語「環境溫度」互換使用。室溫涵蓋「受控室溫」,其指示20℃至25℃之通常的工作環境溫度,該溫度具有可能在藥房、醫院及倉庫中經歷之介於15°與30°之間的暫態偏差(偏移)。「受控室溫」包括不大於25°之經計算之平均動力學溫度(參見,The Pharmacopeia of the United States of America,第三十三修正版及the National Formulary,第二十八版,USP 33-NF 28 Reissue,General Notices and Requirements,「Applying to Standards,Tests,Assays,and Other Specifications of the United States Pharmacopeia」,第10.30款Storage Temperature and Humidity,May 1,2010,其可在http://www.usp.org/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/USP33-NF28-ReissueGeneralNotices.pdf(2016年7月8日最後訪問)獲得)。
術語「穩定性」係指在相關環境中或在某些條件下儲存後的蛋白質之可接受程度的物理結構(熱力學及膠體穩定性)、化學結構(動力學穩定性)或生物功能(功能穩定性)之保留。蛋白質即使在儲存一定量的時間後不維持其100%物理結構、化學結構或生物學功能,其亦可為穩定的。此處,例如,當在室溫下儲存長達24個月後,不多於2%的蛋白質群體以高分子量形式存在時,將冷凍乾燥蛋白質認為是穩定的。在一些實施例中,當在室溫下儲存長達約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約13個月、約14個月、約15個月、約16個月、約17個月、約18個月、約19個月、約20個月、約21個月、約22個月、約23個月、約24個月、約36個月或大於18個月後,約3%、約2.9%、約2.8%、約2.7%、約2.6%、約2.5%、約2.4%、約2.3%、約2.2%、約2.1%、約2%、約1.9%、約1.8%、約1.7%、約 1.6%、約1.5%、約1.4%、約1.3%、約1.2%、約1.1%、約1.0%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、或約0.1%或更少的蛋白質為高分子量形式時,將冷凍乾燥或其他固定形式的蛋白質視為穩定的。
此處,若高分子量種類在室溫下儲存的第一個月期間之變化百分比大於約0.5%、大於約0.6%、大於約0.7%、大於約0.8%或大於約0.9%,則將冷凍乾燥或其他固體形式的蛋白質認為是室溫下「不穩定的」。因此,可將高分子量種類在室溫下儲存的第一個月期間之增加百分比0.5%之冷凍乾燥或其他固體形式的蛋白質視為穩定的。
穩定性尤其可藉由判定保持在調配物中之天然分子在確定量的溫度下儲存確定量的時間後或在傳遞至患者後之百分比來測量。保留其天然形式的蛋白質之百分比(例如,天然種類相對於總蛋白質(包括高分子量及低分子量種類)之部分)尤其可藉由粒徑篩析層析法(例如粒徑篩析高效液相層析法[SE-HPLC])來判定。在冷凍乾燥蛋白質之情況下,首先使餅增溶,且接著對蛋白質進行測試。天然蛋白質包括未聚合或以其他方式降解之蛋白質。在某些實施例中,至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%或100%天然形式蛋白質可在確定的溫度下儲存確定量的時間後的冷凍乾燥餅中偵測到。冷凍乾燥餅中之大於80%的蛋白質應為其天然形式,且較佳超過90%。測定穩定性之確定量的時間可為至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、至少18個月、至少19個月、至少20個月、至少21個月、至少22個月、至少23個月、至少24個月或更長時間。可在評估穩定性時保持樣品之溫度可為約-80℃至約50℃之任何溫度,例如在約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4°至8℃、約5℃、約25℃或其他室溫、約35℃、約37℃或其他生理溫度、約45℃或約50℃下之儲存。
穩定性尤其可藉由判定在確定溫度下儲存確定量的時間之後的冷凍乾燥餅內形成聚集體(亦即,高分子量種類,亦稱HMW種類)的蛋白質之百分比來判定,其中穩定性與形成的高分子量(HMW)種類成反比。如上所述,蛋白質中之HMW種類之百分比尤其可在增溶後藉由粒徑篩析層析法來判定。若在室溫下三個月後偵測到小於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或0.1%的蛋白質處於HMW形式,則亦可將冷凍乾燥蛋白質組合物視為穩定的。
穩定性可藉由判定在確定溫度下在確定量的時間後在冷凍乾燥餅中降解或以其他方式發現作為低分子量(LMW)種類的蛋白質之百分比來判定,其中穩定性與在增溶的冷凍乾燥餅中偵測到之LMW種類百分比成反比。如上所述,蛋白質中之LMW種類之百分比可藉由粒徑篩析層析法來判定。若在室溫下三個月後偵測到小於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%的第一蛋白質處於LMW形式,則亦可將蛋白質冷凍乾燥餅視為穩定的。
其他方法可用於評估冷凍乾燥蛋白質之穩定性,該等方法係諸如判定熱穩定性之微差掃描熱量法(DSC)、判定機械穩定性之受控攪拌、及判定溶液濁度之約350nm或約405nm下的吸光度。例如,若在約5℃至約25℃下儲存6個月或更久後,調配物之OD405與調配物在零時之OD405相比變化小於約0.05(例如,0.04、0.03、0.02、0.01或更小),則本發明之調配物可被視為穩定的。
穩定性亦可藉由測量抗體或其他蛋白質與其標靶之生物活性、生理活性或結合親和力來評估。例如,若在例如5℃、25℃、37℃、45℃、50℃等下儲存確定量的時間(例如,長達1個月、12個月、18個月、24個月等)後,冷凍乾燥調配物中所含的抗體以作為該冷凍乾燥及儲存之前的抗體結合親和力之至少50%、95%或更多的親和力結合至其含同源表位的抗原,則可將冷凍乾燥抗體視為穩定的。結合親和力可藉由例如ELISA或電漿子共振來判定。生物活性可藉由抗體、可溶性受體或配體活性檢定諸如例如使表現同源結合配偶體之細胞與 包含抗體、可溶性受體或配體之復水調配物接觸來判定。抗體、可溶性受體或配體與這種細胞之結合可諸如例如經由FACS分析來直接測量。當在室溫下儲存至少18個月後,蛋白質之生物或生理比活性(亦即,效力)為其初始(T0)效力之至少50%時,可將蛋白質認為是「穩定的」。穩定的蛋白質在室溫下儲存長達12個月、長達13個月、長達14個月、長達15個月、長達16個月、長達17個月、長達18個月、長達19個月、長達20個月、長達21個月、長達22個月、長達23個月或長達24個月之後保留至少51%效力、至少52%效力、至少53%效力、至少54%效力、至少55%效力、至少56%效力、至少57%效力、至少58%效力、至少59%效力、至少60%效力、至少61%效力、至少62%效力、至少63%效力、至少64%效力、至少65%效力、至少66%效力、至少67%效力、至少68%效力、至少69%效力、至少70%效力、至少71%效力、至少72%效力、至少73%效力、至少74%效力、至少75%效力、至少76%效力、至少77%效力、至少78%效力、至少79%效力、至少80%效力、至少81%效力、至少82%效力、至少83%效力、至少84%效力、至少85%效力、至少86%效力、至少87%效力、至少88%效力、至少89%效力、至少90%效力、至少91%效力、至少92%效力、至少93%效力、至少94%效力、至少95%效力、至少96%效力、至少97%效力、至少98%效力或至少99%效力。
在室溫下儲存延長的時期(諸如長達18個月)後,「穩定」蛋白質之結構或比活性經歷極少變化或無變化。結構變化包括蛋白質之聚集體或其他高分子量形式之形成、蛋白質之降解(諸如肽鍵之水解)及化學降解(諸如去醯胺化、去唾液酸化及類似形式)。例如,常見的抗體降解形式為聚集體之形成,其包括可逆二聚體及三聚體、以及更穩定且可逆性較小的四聚體及更高級多聚體。「不可逆聚集體」為在冷凍乾燥餅復水後不容易溶解或解離的聚集體之子集。「穩定」蛋白質在室溫下儲存長達7個月、長達8個月、長達9個月、長達10個月、長達11個月、長達12個月、長達13個月、長達14個月、長達15個月、長達16個月、長達17個月、長達18個月、長達19個月、長達20個月、長達21個月、長達22個月、長達23個月或長達24個 月時間經歷小於15%、小於14%、小於13%、小於12%、小於11%、小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%或小於0.5%之高分子量種類形成的增加。偵測高分子量種類之方法可具有0.2至0.3%之偵測可變性。
蛋白質聚集或其他的高分子量種類形成之溫度依賴性速率遵循阿瑞尼斯或經改良之阿瑞尼斯動力學(略彎曲的阿瑞尼斯圖)(參見,例如Chakroun等,「Mapping the Aggregation Kinetics of a Therapeutic Antibody Fragment,」Mol.Pharmaceut.13:307-319(2016))。因此,給定調配物之高分子量種類在給定溫度下隨時間推移的聚集速率及變化百分比可基於時間之平方根關係及阿瑞尼斯或經改良之阿瑞尼斯動力學來預測。例如,將冷凍乾燥樣品在密封的玻璃小瓶中在給定溫度(例如,5℃、25℃、37℃、50℃)下培育。將等分試樣以規則的時間間隔取出,除去不溶性聚集體,且接著進行SE-HPLC。觀察到的聚集速率是由時間依賴性主峰對HMW峰面積資料之線性擬合來直接判定。對高分子量種類之變化百分比的推測則藉由將時間速率之平方根定律及阿瑞尼斯動力學應用於資料來進行。例如,在不同溫度下觀察到的速率常數則擬合至阿瑞尼斯方程式:ln k=ln A-(E/RT),其中E為活化能(以cal/mol計),R為通用氣體常數(1.987cal/mol/K),T為絕對溫度(以克耳文計),且ln A為包括諸如碰撞頻率之因素的溫度常數。k值係由阿瑞尼斯擬合來推算以預測高分子量種類在給定溫度(例如25℃)下隨時間推移(例如24個月)之變化。
通常,冷凍乾燥蛋白質及治療性抗體或其他抗原結合蛋白之方法尤其為本領域熟知的。簡言之,在一實施例中,如上所述,冷凍乾燥係以含有藥物物質及賦形劑之預冷凍乾燥水溶液開始。將預冷凍乾燥水溶液置於敞開的容器(例如小瓶)中,且將敞開之容器置於冷凍乾燥室中的擱架上。冷凍乾燥過程包含三個基本步驟:(1)冷凍,伴有可選的退火循環;(2)初級乾燥;及(3)次級乾燥,伴有可選的乾燥後退火步驟。第一步驟為冷凍。此處,降低擱架溫度以冷卻小瓶中之調配物。冰晶在調配物內形成,且調配物之其餘部分變得更濃且更黏。 經濃縮之其餘部分固化形成無定形、結晶或組合的結晶/無定形狀態。在一實施例中,其餘部分以無定形玻璃狀態固化。
在一些冷凍乾燥方案中,冷凍組合物經受退火以增強結晶。將固體其餘部分保持在高於最終冷凍溫度之溫度下一定時期,以使一些組分(諸如膨脹劑,如甘露醇及甘胺酸)結晶。
接著藉由昇華來除去冰。將冷凍乾燥室之壓力(例如,40至400托)及擱架溫度(-30℃至+10℃)調節至低於水之三相點。將溫度維持在低於無定形其餘部分之玻璃轉移溫度(Tg),以防止餅結構塌陷。
在初級乾燥步驟之後,一些水仍可截留在基質內。在次級乾燥步驟期間,剩餘的水經由解吸過程來除去。此處,升高擱架溫度以加速解吸,且達到冷凍乾燥產物之最佳水分含量。在一實施例中,最終水分含量不小於約0.5%且不大於約10%。在另一實施例中,最終水分含量不小於約3%且不大於約6%。在一具體實施例中,水分含量大於3%但小於4%。在另一具體實施例中,水分含量為約3%。在另一具體實施例中,水分含量為約3.5%。在另一具體實施例中,水分含量為約4%。在另一具體實施例中,水分含量為約4.5%。在又一具體實施例中,水分含量為約6%。
在一實施例中,在次級乾燥步驟之後對冷凍乾燥產品(「冷凍乾燥餅」)進行退火步驟。乾燥後退火亦稱為物理老化或結構弛豫。這種乾燥後退火步驟促進無定形基質向平衡玻璃狀態之弛豫(α-弛豫),增加儲存溫度下之結構弛豫時間,減少玻璃狀態之遷移率,且可能將蛋白質降低至更穩定的能態,從而優化蛋白質穩定性。此處,退火步驟簡單地加速分子遷移率,以允許玻璃狀態之熵之總體降低及蛋白質之旋轉形式。
在退火步驟之後,使玻璃之隨機熱力學分子狀態之數目最小化且使玻璃平衡最大化。在一些實施例中,退火溫度低於產物之Tg。在一些實施例中,退火溫度為25℃至約90℃、25℃至約80℃、25℃至約75℃、25℃至約70℃、35℃至約70℃、40℃至約70℃、30℃至約55℃、50℃至約60℃、55℃至約65℃、60℃至約70℃、65℃至 約75℃、70℃至約80℃或75℃至約85℃。在一些實施例中,退火溫度為約90℃、約80℃、約79℃、約78℃、約77℃約76℃、約75℃、約74℃、約73℃、約72℃、約71℃、約70℃、約69℃、約68℃、約67℃、約66℃、約65℃、約64℃、約63℃、約62℃、約61℃、約60℃、約59℃、約58℃、約57℃、約56℃、約57℃、約56℃、約55℃、約54℃、約53℃、約52℃、約51℃、約50℃、約49℃、約48℃、約47℃、約46℃、約45℃、約44℃、約43℃、約42℃、約41℃、約40℃、約39℃、約38℃、約37℃、約36℃、約35℃、約34℃、約33℃、約32℃、約31℃、約30℃、約29℃、約28℃、約27℃、約26℃或25℃。在具體實施例中,退火溫度高於25℃。在另一具體實施例中,退火溫度高於50℃。
冷凍乾燥餅在退火溫度下保持足以實現餅結構之弛豫的一定時期,該餅結構之弛豫係如藉由自DSC或等溫熱量法之entherapy回收所定義。在一些實施例中,退火溫度保持約12小時至約兩週、約12小時至一週、約12小時至約數天、約18小時至約72小時、約24小時至約36小時、約30小時至約42小時、約36小時至約48小時、約42小時至約54小時、約48小時至約60小時、約54小時至約66小時、約60小時至約72小時、約66小時至約78小時、或約72小時至約84小時。在一些實施例中,退火溫度保持約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約37小時、約38小時、約39小時、約40小時、約41小時、約42小時、約43小時、約44小時、約45小時、約46小時、約47小時、約48小時、約49小時、約50小時、約51小時、約52小時、約53小時、約54小時、約55小時、約56小時、約57小時、約58小時、約59小時、約60小時、約61小時、約62小時、約63小時、約64小時、約65小時、約66小時、約67小時、約68小時、約69小時、約70小時、約71小時、約72小時、約73小時、 約74小時、約75小時、約76小時、約77小時、約78小時、約79小時、約80小時、約81小時、約82小時、約83小時或約84小時。
在一具體實施例中,退火溫度高於50℃,保持約72小時。在另一具體實施例中,退火溫度為約25℃,保持約72小時。
在一實施例中,退火條件藉由在微差掃描熱量計中進行乾燥後退火步驟來以實驗方式判定。溫度曲線之吸熱區域通常在退火效果之後立即出現,使從業者實現選擇退火溫度。參見,Sartor等,「Calorimetric Studies of the Kinetic Unfreezing of Molecular Motions in Hydrated Lysozyme,Hemoglobin,and Myoglobin,」66 Biophysical J.249-258(1994)。實例
提出以下實例以便向一般技藝人士提供如何製備及使用本發明之方法及組合物的描述,且不意欲限制本發明之範圍。已努力確保關於所用數值(例如量、大小等)之準確性,但應慮及一些實驗誤差及偏差。
將包含抗體及賦形劑(如本文所述)之含水預冷凍乾燥溶液裝載至I型硼矽玻璃小瓶中。將負載的小瓶置於LYOSTAR 3冷凍乾燥機(SP Scientific,Warminster,PA)中。將室封閉,且將擱架溫度降至5℃。將樣品保持在5℃下30分鐘,之後進行冷凍。冷凍之緩變率為0.5℃/min。將擱架溫度保持在-45℃下60分鐘。
在約100毫托之真空設定點及約-25℃之擱架溫度下進行初級乾燥,該擱架溫度係以約0.5℃/min之加熱緩變率持續約50小時達到。
在35℃下進行次級乾燥,以約0.3℃/min之加熱緩變率達到此溫度。進行次級乾燥約6小時。
次級乾燥後,將室用氮氣回填至約0.8個大氣壓(約608,000毫托)之壓力,且用經Flurotec®塗覆之4432/50丁基橡膠冷凍乾燥塞來塞住小瓶。
水分子可在冷凍乾燥產物中用作塑化劑及穩定劑。水由 於其小尺寸及與其他水分子及其他分子(諸如蛋白質分子)形成氫鍵之能力而使其自身作為塑化劑。使用水作為穩定劑/塑化劑之優點我可增加穩定劑(水)與蛋白質之比率,而不影響復水調配物之張力。可經由冷凍乾燥過程之設計來調節水分含量。藉由Computrac® Vapor Pro®水分判定儀(Arizona Instrument LLC,Chandler,AZ)判定冷凍乾燥餅之水分含量。
使重組單株抗體(mAb1、mAb2、mAb3)在EESYR®細胞中產生(參見,2010年8月10日發佈之美國專利第7,771,997 B2號),且以150mg/mL之濃度在10mM組胺酸、pH 6.0、0.1%聚山梨醇酯80、5%蔗糖及1.54%精胺酸(所有w/v%,於預冷凍乾燥液體調配物中)中調配。如上所述將液體調配物冷凍乾燥至特定程度的水分含量(w/w%),且在50℃、37℃或25℃下儲存具體時間。儲存後,將冷凍乾燥調配物用水復水,且進行粒徑篩析高壓液相層析法(SE-HPLC)。對高分子量(HMW)種類進行偵測、整合且與T=0下的對照進行比較。將HMW種類之變化百分比計算作為總蛋白質之一部分,且報告在表1中。冷凍乾燥的150mg/mL mAb1在約4.5%水分含量的情況下在25℃下儲存時最為穩定。
預測具有3-10%水分含量的mAb1之冷凍乾燥調配物在25℃儲存24個月後降解約2.0%。將阿瑞尼斯動力學演算法應用於測量到的降解速率,且將基於時間速率之平方根定律的推測進行至少24個月。將各水分含量點的HMW種類之變化百分比報告在表2中。預冷凍乾燥之含水調配物為150mg/mL mAb1、10mM組胺酸、pH 6.0、0.1%聚山梨醇酯80、5%蔗糖、1.54%精胺酸。
藉由使冷凍乾燥藥物產品退火來改良蛋白質穩定性。假設使冷凍乾燥調配物退火至低於玻璃轉移溫度,以將無定形分子鬆弛至較低能態,產生更穩定的產物。在70℃下使冷凍乾燥調配物退火72小時導致用10%蔗糖及3.08%精胺酸冷凍乾燥的150mg/mL mAb1(預冷凍乾燥調配物:150mg/mL mAb1、10mM組胺酸、pH 6.0、0.1%聚山梨醇酯80、10%蔗糖、3.08%精胺酸)的HMW%之觀察到的增加較 低。將在25℃、37℃及50℃下儲存6個月的退火及未退火的調配物之抗體的HMW種類百分比變化報告在表3中。
對於在37℃下儲存的退火樣品與未退火樣品,將阿瑞尼斯動力學演算法應用於測量到的降解速率,且將基於時間速率平方根定律的推測進行至少24個月。推測退火在24個月時使HMW種類 比在未退火樣品中小約20%(亦即5.76%對6.05%△%HMW)。
評估包含糖、多元醇、鹽及胺基酸之特定穩定劑單獨使冷凍乾燥抗體穩定之能力。當用蔗糖調配時,冷凍乾燥的150mg/mL mAb1為最穩定的(參見表4)。蔗糖調配物之Tg對於室溫儲存足夠高(約110℃),且提供足夠界限以便添加塑化劑(若需要)。
將海藻糖或蔗糖與塑化劑(諸如山梨醇或甘露醇)組合驚人地產生更穩定的室溫調配物。與單獨的海藻糖相比,山梨醇與海藻糖之組合使冷凍乾燥的150mg/mL mAb1更穩定。基礎預冷凍乾燥之調配物為在冷凍乾燥前添加海藻糖與山梨醇之各種組合的150mg/mL mAb1、10mM組胺酸、pH 6.0、0.1%聚山梨醇酯80。與海藻糖及/或山梨醇組合的冷凍乾燥蛋白質之穩定性在表5中列為△%HMW。
與單獨的蔗糖相比,甘露醇與蔗糖之組合使冷凍乾燥的150mg/mL mAb1更穩定。基礎預冷凍乾燥之調配物為在冷凍乾燥前添加蔗糖與甘露醇之各種組合的150mg/mL mAb1、10mM組胺酸、pH 6.0、0.1%聚山梨醇酯80。與蔗糖及/或甘露醇組合的冷凍乾燥蛋白質之穩定性在表6中列為△%HMW。與單獨的蔗糖相比,甘露醇與蔗糖之組合使冷凍乾燥的150mg/mL mAb1更穩定。
將蔗糖與多元醇及胺基酸組合以評估使冷凍乾燥抗體 穩定之能力。以不同比例將150mg/mL mAb1與蔗糖(Suc)及以下中之任一者組合:山梨醇(Sor)、甘油(Gly)、精胺酸(Arg)及丙胺酸(Ala)。在25℃及5℃下在各種儲存時間時評估HMW種類之變化。結果(△%HMW)呈現於表7中。當在25℃下儲存時,與單獨的蔗糖相比,測試的賦形劑組合中沒有一種使冷凍乾燥的150mg/mL mAb1更穩定。驚人地,預測山梨醇與蔗糖之組合在改良5℃下儲存120個月時的穩定性上優於單獨的蔗糖,且比單獨的蔗糖更穩定。
當用10%蔗糖及3.08%精胺酸調配時,冷凍乾燥的150mg/mL mAb1及冷凍乾燥的150mg/mL mAb2具有相當的穩定性。在25℃、37℃及50℃下儲存1個月時計算出HMW種類%之變化。預測冷凍乾燥的150mg/mL mAb1及冷凍乾燥的150mg/mL mAb2(基於時間速率之平方根定律及阿瑞尼斯動力學)在25℃下在24個月及超過24個月時在用10%蔗糖及3.08%精胺酸調配時具有相當的穩定性。△%HMW分析之結果呈現於表8中。
將蔗糖及精胺酸之組合與抗體以不同的重量比調配,且在50℃和25℃下在不同時間時判定△%HMW。預測具有0.87:1穩定劑比蛋白質之冷凍乾燥的150mg/mL抗體調配物(基於時間速率平方根定律及阿瑞尼斯動力學)在25℃下儲存24個月後降解1%。結果列舉於表9中。
*基於時間速率平方根定律及阿瑞尼斯動力學的推測。
評估包含糖、多元醇、鹽及胺基酸之特定穩定劑單獨使冷凍乾燥抗體穩定之能力。當將蔗糖、海藻糖或精胺酸納入作為穩定劑時,冷凍乾燥的2mg/mL mAb3未顯示明顯的降解。結果描繪於表10中。亦測試甘油,但在冷凍乾燥之後觀察到顯著降解。
將海藻糖與多元醇及胺基酸組合以評估使冷凍乾燥抗體穩定之能力。以不同比例將2mg/mL mAb3與海藻糖(Tre)及以下中之任一者組合:山梨醇(Sor)、甘油(Gly)、精胺酸(Arg)及丙胺酸(Ala)。在25℃下在各種儲存時間時評估HMW種類之變化。結果(△%HMW)呈現於表11中。在25℃儲存3個月之後測試的任何2mg/mL mAb3冷凍乾燥調配物中未觀察到明顯的降解
Claims (84)
- 一種冷凍乾燥餅,其包含:(a)蛋白質,其中小於0.5%之該蛋白質在室溫下2個月後聚集;(b)穩定劑;(c)緩衝劑;及(d)不小於2重量%之水及不大於10重量%之水,其中該冷凍乾燥餅未塌陷且未變色,且其中該冷凍乾燥餅容納於小瓶內。
- 如申請專利範圍第1項之冷凍乾燥餅,其中該冷凍乾燥餅不含黃色、褐色、黑色及紅色。
- 如申請專利範圍第1或2項之冷凍乾燥餅,其中該冷凍乾燥餅未熔化,未收縮,且不包括密度變化。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該冷凍乾燥餅包含高於25℃之玻璃轉移溫度。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之冷凍乾燥餅,其包含約3重量%至約7重量%之水或約5重量%至約8重量%之水。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項之冷凍乾燥餅,其包含約3重量%、約3.5重量%、約4重量%、約4.5重量%、約5重量%、約5.5重量%、約6重量%或約6.5重量%之水。
- 如申請專利範圍第1至6項中任一項之冷凍乾燥餅,其中在室溫下儲存約18個月的該冷凍乾燥餅中聚集蛋白質之量的增加小於2%。
- 如申請專利範圍第1至7項中任一項之冷凍乾燥餅,其中在室溫下儲存約24個月的該冷凍乾燥餅中聚集蛋白質之量的增加小於2%。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該聚集蛋白質藉由粒徑篩析層析法或電泳來偵測。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該緩衝劑包含組胺酸。
- 如申請專利範圍第10項之冷凍乾燥餅,其中該組胺酸以0.34重量%至約2.04重量%存在。
- 如申請專利範圍第1至11項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該穩定 劑係選自由以下組成之群組:多元醇、糖、胺基酸、鹽及其組合。
- 如申請專利範圍第12項之冷凍乾燥餅,其中(i)該多元醇係選自由以下組成之群組:山梨醇、甘油、甘露醇及其組合;(ii)該糖係選自由以下組成之群組:海藻糖、蔗糖及其組合;(iii)該胺基酸係選自由以下組成之群組:精胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸、氯化鈉及其組合;且(iv)該鹽為氯化鈉。
- 如申請專利範圍第1至13項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑以約19重量%至約83重量%存在。
- 如申請專利範圍第1至14項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑包含蔗糖。
- 如申請專利範圍第14項之冷凍乾燥餅,其中該蔗糖以約15重量%至約71重量%存在。
- 如申請專利範圍第15或16項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑進一步包含精胺酸。
- 如申請專利範圍第17項之冷凍乾燥餅,其中該精胺酸以約4重量%至約20重量%存在。
- 如申請專利範圍第14或15項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑進一步包含甘露糖。
- 如申請專利範圍第19項之冷凍乾燥餅,其中該甘露糖以8重量%至約23重量%存在。
- 如申請專利範圍第1至14項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑包含海藻糖。
- 如申請專利範圍第21項之冷凍乾燥餅,其中該海藻糖以約15重量%至約70重量%存在。
- 如申請專利範圍第21或22項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑進一步包含精胺酸。
- 如申請專利範圍第23項之冷凍乾燥餅,其中該精胺酸以約0.8重量%至約15重量%精胺酸存在。
- 如申請專利範圍第21或22項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑進一步包含山梨醇。
- 如申請專利範圍第25項之冷凍乾燥餅,其中該山梨醇以約1.3重量%至約23重量%山梨醇存在。
- 如申請專利範圍第1至26項中任一項之冷凍乾燥餅,其進一步包含界面活性劑。
- 如申請專利範圍第27項之冷凍乾燥餅,其中該界面活性劑係選自由以下組成之群組:聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、聚乙二醇(PEG)、PEG 3350及其組合。
- 如申請專利範圍第27或28項之冷凍乾燥餅,其中該界面活性劑以約0.02重量%至約1重量%存在。
- 如申請專利範圍第1至29項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該蛋白質以約6重量%至約64重量%存在。
- 如申請專利範圍第30項之冷凍乾燥餅,其包含約6重量%至約19重量%蛋白質。
- 如申請專利範圍第31項之冷凍乾燥餅,其包含約33重量%至約64重量%蛋白質。
- 如申請專利範圍第1至32項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該蛋白質為抗原結合蛋白。
- 如申請專利範圍第33項之冷凍乾燥餅,其中該抗原結合蛋白係選自由以下組成之群組:抗體、抗體片段及受體Fc融合蛋白。
- 如申請專利範圍第1至34項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該小瓶包括I型硼矽玻璃,且用經聚四氟乙烯塗覆之丁基橡膠塞封閉。
- 一種冷凍乾燥餅,其包含:(a)蛋白質,其中小於1%之該蛋白質在室溫下一個月後降解;(b)穩定劑,其比率為約0.2重量份穩定劑比1重量份蛋白質(0.2:1)至約1.5重量份穩定劑比1重量份蛋白質(1.5:1);及(c)水,其濃度不小於3重量%且不大於10重量%,其中該冷凍乾燥餅均勻地附著於容器之壁上,且無變色。
- 如申請專利範圍第36項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑與蛋白質之重量比係選自由以下組成之群組:約0.22:1、0.44:1、0.65:1、0.87:1、1.1:1、1.3:1。
- 如申請專利範圍第36或37項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑係選自由以下組成之群組:非還原糖、糖醇、胺基酸及其組合。
- 如申請專利範圍第37項之冷凍乾燥餅,其中該非還原糖包含蔗糖或海藻糖;該糖醇係選自由以下組成之群組:山梨醇、甘露醇及甘油;且該胺基酸係選自由以下組成之群組:精胺酸、丙胺酸、脯胺酸及甘胺酸。
- 如申請專利範圍第35至38項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑包含蔗糖。
- 如申請專利範圍第39項之冷凍乾燥餅,其進一步包含精胺酸。
- 如申請專利範圍第40項之冷凍乾燥餅,其中蔗糖與精胺酸之重量比為約3.2:1至約3.4:1。
- 如申請專利範圍第39項之冷凍乾燥餅,其進一步包含甘露醇。
- 如申請專利範圍第42項之冷凍乾燥餅,其中蔗糖與甘露醇之重量比為約1.8:1至約2:1。
- 如申請專利範圍第35至38項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該穩定劑包含海藻糖。
- 如申請專利範圍第44項之冷凍乾燥餅,其進一步包含精胺酸。
- 如申請專利範圍第40項之冷凍乾燥餅,其中海藻糖與精胺酸之重量比為約3.2:1至約3.4:1。
- 如申請專利範圍第44項之冷凍乾燥餅,其進一步包含山梨醇。
- 如申請專利範圍第42項之冷凍乾燥餅,其中海藻糖與山梨醇之重量比為約1:1至約2:1。
- 如申請專利範圍第35至48項中任一項之冷凍乾燥餅,其中降解的蛋白質包含該蛋白質之二聚體、該蛋白質之三聚體、該蛋白質之四聚體、該蛋白質之更高級多聚體(higher order multimer)、經化學修飾之蛋白質及其組合。
- 如申請專利範圍第35至49項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該蛋白質係選自由以下組成之群組:抗體、抗體片段及受體Fc融合蛋白。
- 如申請專利範圍第35至50項中任一項之冷凍乾燥餅,其進一步包含緩衝劑。
- 如申請專利範圍第51項之冷凍乾燥餅,其中該緩衝劑係選自由以下組成之群組:檸檬酸鹽、磷酸鹽、組胺酸、琥珀酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽及其組合。
- 如申請專利範圍第51或52項之冷凍乾燥餅,其中該緩衝劑進一步包含組胺酸。
- 如申請專利範圍第35至53項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該變色係選自由以下組成之群組:紅色、黃色、褐色、黑色及其組合。
- 如申請專利範圍第35至53項中任一項之冷凍乾燥餅,其中該容器為小瓶或注射器。
- 如申請專利範圍第55項之冷凍乾燥餅,其中該小瓶包括I型硼矽玻璃及經聚四氟乙烯塗覆之丁基橡膠塞。
- 一種製備醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅的方法,該方法包括:(a)乾燥步驟,其將水自包含蛋白質、穩定劑及水之樣品中除去,以獲得包含介於2重量%與10重量%之間的水分含量的醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅;(b)在低於該醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅之玻璃轉移溫度的溫度下加熱該冷凍乾燥餅;及(c)在室溫下儲存該醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅,其中該蛋白質在兩個月後具有小於0.5%的降解。
- 如申請專利範圍第57項之方法,其中低於玻璃轉移溫度之該溫度係藉由在步驟(a)之後且在步驟(b)之前對該樣品進行微差掃描熱量法來判定。
- 如申請專利範圍第57或58項之方法,其中低於玻璃轉移溫度之該溫度介於約25℃與約90℃之間。
- 如申請專利範圍第57至59項中任一項之方法,其中低於玻璃轉移溫度之該溫度維持約72小時。
- 如申請專利範圍第57至60項中任一項之方法,其中該蛋白質係選自由以下組成之群組:抗體、抗體片段及受體Fc融合蛋白。
- 如申請專利範圍第57至61項中任一項之方法,其中該蛋白質以約50mg/mL至約200mg/mL之濃度存在於該樣品中。
- 如申請專利範圍第57至62項中任一項之方法,其中該樣品進一步包含緩衝劑。
- 如申請專利範圍第63至80中任一項之方法,其中該緩衝劑包含組胺酸。
- 如申請專利範圍第57至64項中任一項之方法,其中該穩定劑係選自由以下組成之群組:海藻糖、山梨醇、甘油、精胺酸、丙胺酸、甘露醇、蔗糖、脯胺酸、NaCl、甘胺酸或其組合。
- 如申請專利範圍第57至65項中任一項之方法,其中該穩定劑包含蔗糖。
- 如申請專利範圍第66項之方法,其中該蔗糖以小於約10%重量比體積(w/v)之濃度存在於該樣品中。
- 如申請專利範圍第67項之方法,其中該樣品進一步包含3%±0.1%的精胺酸。
- 如申請專利範圍第66項之方法,其中該蔗糖以約5%(w/v)之濃度存在於該樣品中。
- 如申請專利範圍第69項之方法,其中該樣品進一步包含(i)約1.3%±0.1%(w/v)丙胺酸;(ii)約1.5%±0.1%(w/v)精胺酸;(iii)約1.34%±0.1%(w/v)甘油;(iv)約2.66%±0.1%(w/v)甘露醇;或(v)約2.66%±0.1%(w/v)山梨醇。
- 如申請專利範圍第57至66項中任一項之方法,其中該穩定劑包含(i)約7.5%(w/v)蔗糖及2.3%±0.1%(w/v)精胺酸;(ii)約12.5%(w/v)蔗糖及3.9%±0.1%(w/v)精胺酸;(iii)或約15%(w/v)蔗糖及4.6%±0.1%(w/v)精胺酸。
- 如申請專利範圍第57至65項中任一項之方法,其中該穩定劑包含海藻糖。
- 如申請專利範圍第72項之方法,其中該海藻糖以小於約10%(w/v)之濃度存在於該樣品中。
- 如申請專利範圍第72項之方法,其中該海藻糖以約9.09%(w/v)海藻糖之濃度存在於該樣品中,且該樣品進一步包含0.48%(w/v)山梨醇;0.24%(w/v)甘油;0.28%(w/v)精胺酸;或0.24%(w/v)丙胺酸。
- 如申請專利範圍第72項之方法,其中該海藻糖以約8.33%(w/v)海藻糖之濃度存在於該樣品中,且該樣品進一步包含0.89%(w/v)山梨醇;0.45%(w/v)甘油;0.51%(w/v)精胺酸;或0.43%(w/v)丙胺酸。
- 如申請專利範圍第72項之方法,其中該海藻糖以約6.66%(w/v)海藻糖之濃度存在於該樣品中,且該樣品進一步包含0.1.77%(w/v)山梨醇;0.9%(w/v)甘油;1.03%(w/v)精胺酸;或0.87%(w/v)丙胺酸。
- 如申請專利範圍第72項之方法,其中該海藻糖以約5%(w/v)海藻糖之濃度存在於該樣品中,且該樣品進一步包含2.66%(w/v)山梨醇;1.34%(w/v)甘油;1.54%(w/v)精胺酸;或1.3%(w/v)丙胺酸。
- 如申請專利範圍第57至78項中任一項之方法,其中該水分含量不小於3重量%且不大於8重量%。
- 如申請專利範圍第78項之方法,其中該水分含量為約3重量%、約3.5重量%、約4重量%、約4.5重量%、約5重量%、約5.5重量%或約6重量%。
- 如申請專利範圍第57至80項中任一項之方法,其中該醫藥學上接受之冷凍乾燥餅在室溫下儲存至少18個月。
- 如申請專利範圍第81項之方法,其中該醫藥學上可接受之冷凍乾燥餅在室溫下儲存至少24個月。
- 如申請專利範圍第82項之方法,其中小於或等於約2%之該蛋白質在該至少18個月期間降解。
- 如申請專利範圍第83項之方法,其中該蛋白質之降解藉由經由粒徑篩析層析法測量高分子量種類百分比之變化來判定。
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