CN101854951A - Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 - Google Patents
Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101854951A CN101854951A CN200880115935A CN200880115935A CN101854951A CN 101854951 A CN101854951 A CN 101854951A CN 200880115935 A CN200880115935 A CN 200880115935A CN 200880115935 A CN200880115935 A CN 200880115935A CN 101854951 A CN101854951 A CN 101854951A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ser
- leu
- pro
- val
- lys
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
本发明涉及TACI-免疫球蛋白融合蛋白制剂。
Description
发明领域
本发明属于治疗蛋白质制剂领域。更具体说,本发明涉及pH范围为4.5-5.5的TACI-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白制剂。
发明背景
BLyS配体/受体家族
业已鉴定到对于BlyS(B淋巴细胞刺激剂)和APRIL(一种诱导增殖的配体)两种生长因子具有独特结合亲和力的三种受体:TACI(跨膜激活剂和CAML-相互作用子)、BCMA(B细胞成熟抗原)和BAFF-R(B细胞活化因子受体)(Marsters等.,2000;Thompson等.2001)。
TACI和BCMA能结合BLyS与APRIL二者,而BAFF-R看来只能高亲和力结合BLyS(Marsters等.,2000;Thompson等.2001)。因此,BLyS能通过所有这三种受体传导信号,而APRIL看来只能通过TACI和BCMA传导信号。此外,在全身免疫性风湿病患者的血清样品中已鉴定到循环性BLyS与APRIL的异质三聚体复合物(由三个蛋白亚基组成,含有BLyS和APRIL亚基的一个或二个拷贝),并证明其在体外能诱导B细胞增殖(Roschke等,2002)。
BLyS和APRIL是B细胞成熟、增殖和存活的强效刺激剂(Moore等,1999;Schneider等,1999;Do等,2000)。BLyS和APRIL是自身免疫性疾病(特别是涉及B细胞的自身免疫性疾病)持续存在所必需的。经工程改造能高水平表达BLyS的转基因小鼠显示可患免疫细胞疾病,其症状类似于全身性红斑狼疮患者所见(Gross等,2000;Mackay等,1999)。类似地,检测到全身性红斑狼疮病人和其它各种自身免疫性疾病如类风湿关节炎病人血清样品中BLyS/APRIL水平升高(Roschke,2002;Cheema等,2001;Groom等,2002),从而使BLyS和/或APRIL与B细胞介导疾病的关联从动物模型扩展到人类。MS病人外周血单核细胞和T细胞的BLyS和APRIL表达上调(Thangarajh等,2004;Thangarajh等,2005)。在MS病损中发现位于靠近表达BAFF-R免疫细胞的星形细胞中BLyS表达强烈上调(Krumbholz等,2005)。
Atacicept
Atacicept(INN)是一种重组融合蛋白,含有受体TACI(跨膜激活剂和钙调节剂及亲环素-配体(CAML)-相互作用子)的胞外配体结合部分及修饰的人IgG Fc部分。Atacicept的功能是拮抗肿瘤坏死因子(TNF)超家族二成员BLyS(B细胞刺激剂)和APRIL(增殖诱导配体)。已证明BLyS和APRIL是B细胞成熟、发挥功能和存活的重要调节剂。
Atacicept是一种包含人IgG1-Fc与BLyS受体TACI胞外结构域一部分融合而成的313个氨基酸的可溶性糖蛋白,其预计分子量为35.4kDa。该产品的构象为二聚体,预计分子量为73.4kDa。可用重组技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生Atacicept。
Atacicept中的人IgG1-Fc经修饰削弱了其Fc与补体C1q组分结合和与抗体受体相互作用的能力(Tao等,1993;Canfield等,1991)。经检测证实Atacicept的这些Fc效应器功能减弱。
治疗蛋白制剂
TACI-Ig融合蛋白如atacicept是生物制剂,即治疗人类疾病的治疗蛋白,因此可对人类给药。
开发这种制剂目的是提供治疗蛋白的有效递送。治疗用蛋白常常遇到的问题是,例如蛋白质的稳定性差(常需要冷藏或冷冻保存),生物利用度差和病人对肠胃道外途径剂型不友好。
在生物技术产品的加工中,通常需要获得高纯度的治疗蛋白水溶液。当配制这些蛋白溶液(如供非肠胃道递送)时,使蛋白质稳定至关重要。因此,必须选择能稳定蛋白质的赋形剂。高纯度蛋白质溶液的稳定性也可能受缓冲液的影响。缓冲液通过其离子强度和pH共同影响蛋白质在溶液中的稳定性。已用于此目的的缓冲液例子有磷酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐和琥珀酸盐缓冲液。
即使在开始储存时治疗蛋白是溶液,所遇到的问题是维持蛋白质溶液稳定防止其在储存时凝聚形成颗粒或沉淀,和防止其降解(如水解、氧化、脱酰胺、被截短或变性)。
温度也可影响溶解性,通常随着温度升高溶解性也升高。然而高于某温度域值时蛋白质会部分去折叠导致溶解性降低或凝聚/沉淀。
为防止凝聚和降解,为获得长期稳定的药物,需要开发含有一种或多种赋形剂的稳定的治疗性蛋白质制剂。
本发明针对这种需要,提供了可用于治疗人类疾病的治疗蛋白,即稳定的、药学上可接受的TACI-免疫球蛋白融合蛋白制剂。
发明概述
本发明依据的基础是开发了稳定的TACI-免疫球蛋白融合蛋白制剂。
第一方面,本发明的制剂包括:
a)TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白,其包含:
i.TACI的胞外结构域或其能结合BLyS和/或APRIL的片段或变体;和
ii.免疫球蛋白的恒定区;和
b)使制剂的pH范围维持在4.5-5.5之间的缓冲液。
第二方面,本发明涉及包含这种制剂的药物组合物。
第三方面,本发明涉及用于治疗或预防自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病的本发明的制剂或药物组合物。
第四方面,本发明涉及制备本发明制剂的方法,该方法包括制备TACI-Ig融合蛋白的液体溶液,并调节该液体溶液的pH至4.5-5.5范围的步骤。
本发明的第五方面涉及制备本发明制剂的方法,该方法包括在灭菌容器中充装预定量所述制剂的步骤。
发明详述
本发明依据的基础是开发了稳定的TACI-免疫球蛋白融合蛋白制剂,此制剂中的TACI-Ig融合蛋白可长期稳定(例如3个月以上、6个月以上、12个月以上、15个月以上或18个月以上)。
按照本发明,所述制剂包括:
a)TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白,其包含:
i.TACI的胞外结构域或其能结合BLyS和/或APRIL的片段或变体;和
ii.免疫球蛋白的恒定区;
b)使制剂的pH范围维持在4.5-5.5之间的缓冲液。
在本发明制剂的一个实施方式中,所述制剂的pH范围为4.7-5.3,更优选4.9-5.1。
所述制剂的pH因此可以是4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在一优选实施方式中,所述制剂的pH是5.5。
本发明制剂所用的缓冲液可以是,例如,磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐或组氨酸缓冲液。所述缓冲液的浓度范围可以是1-59mM,优选5-25mM。例如,本发明制剂中包含的缓冲液浓度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mM。
在本发明制剂的一个优选实施方式中,所述缓冲液是乙酸盐缓冲液。优选是乙酸钠(NaAc)缓冲液。在本发明的一个实施方式中,所述缓冲液是5-25mM,优选8-12mM,更优选约10mM的NaAc缓冲液。
在一个实施方式中,本发明制剂包含赋形剂。合适的赋形剂是,例如甘露醇、山梨醇、甘油或海藻糖。所述制剂中甘露醇或山梨醇的浓度范围可以是(例如)30-80,或40-60,或约50或51mg/ml。所述制剂中甘油的浓度范围可以是(例如)10-30,或优选15-25,或20或21mg/ml。
海藻糖是一种二糖,由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1键连接组成。本发明制剂中的海藻糖,如无水海藻糖,其浓度范围可以是(例如)50-120mg/ml,或优选60-100mg/ml。例如,本发明制剂可包含70、75、80、85、90、95、100、105或110mg/ml的海藻糖。在一个优选实施方式中,所述制剂包含约80mg/ml的无水海藻糖。
虽然本发明的制剂可包含赋形剂或盐,如NaCl、CaCl2、MgCl2,但在本发明内容说明中该制剂优选无盐的。
在一个实施方式中,本发明的制剂还包含防腐剂,优选采用苯甲醇与苯扎氯铵(洁而灭)的组合作为防腐剂。例如,所述制剂可含有0.15-0.5%的苯甲醇,如0.2%、0.3%或0.4%的苯甲醇,和0.0007%-0.0015%的苯扎氯铵,如0.0008%、0.0009%、0.001%、0.0011%或0.0012%的苯扎氯铵。在一个高度优选的实施方式中,所述制剂含0.3%苯甲醇联合0.001%的苯扎氯铵。
本发明的制剂包含TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白作为治疗活性化合物,即作为活性成分。所述TACI-Ig融合蛋白包含(a)TACI的胞外结构域或其能结合BLyS和/或APRIL的变体或片段;和(b)免疫球蛋白的恒定区。本领域技术人员知道按照本发明制成的TACI-Ig融合蛋白不是抗-TACI抗体。任何抗-TACI抗体不会包含TACI的胞外结构域或其能结合BLyS和/或APRIL的变体或片段,而是针对TACI胞外结构域中的表位。
在本发明的框架中,术语“TACI胞外结构域”也指与TACI胞外结构域(SEQ ID NO:1)具有至少80%或85%,优选至少90%或95%或99%相同性的任何变体。术语“TACI胞外结构域”还包括含有不多于50或40或30或20或10或5或3或2或1个保守性氨基酸替代的变体。任何这种变体能结合BlyS和/或APRIL,和/或任何BlyS-APRIL异质三聚体。优选这类变体也能抑制BlyS和/或APRIL和/或任何BlyS/APRIL异质三聚体的生物学活性。所述BlyS或APRIL的生物学活性是,例如,B细胞增殖。
本发明中,也可采用TACI胞外结构域的片段(活性片段)和变体,只要这些片段能结合BlyS和/或APRIL,和/或BlyS-APRIL异质三聚体。优选这类片段也能抑制或减弱BlyS和/或APRIL和/或BlyS/APRIL异质三聚体的生物学活性。
可按例如以下实施例2所述,来评估任何TACI胞外结构域、TACI-Ig融合蛋白、或其任何变体或片段结合BlyS和/或APRIL和/或BlyS/APRIL异质三聚体的能力。可按例如以下实施例3所述,来评估它们抑制或减弱BlyS、APRIL和/或BlyS/APRIL异质三聚体生物学活性的能力。
在本发明中,TACI胞外结构域的任何这种片段或变体,或TACI-Ig融合蛋白,优选不具有明显低于atacicept(即具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白质)活性的任何生物学活性。
本文所用的术语“免疫球蛋白(Ig)-恒定区”也称为“Fc区”,它衍生自人或动物的免疫球蛋白(Ig),优选IgG。IgG可以是IGg1、IgG2、IgG3或IgG4。Fc区优选包括IgG1的至少CH2、CH3区,较佳为还包括绞链区。
优选Ig的恒定区是人IgG1区。
在一个实施方式中,人IgG1恒定区经修饰降低了其补体依赖的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。
在ADCC中,抗体的Fc区结合于免疫效应细胞如自然杀伤细胞和巨噬细胞表面的Fc受体(FcγR),导致靶细胞被吞噬或溶解。在CDC中,抗体通过在细胞表面触发补体级联反应而杀死靶细胞。根据位于绞链区和CH2结构域上的残基,IgG可结合活化受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb)和抑制受体(FcγRIIb)FcγR,或补体第1组分(C1q)。在IgG2和IgG4中,CH2结构域中的两区域对FcγR和补体C1q结合至关重要,且具有独特序列。例如,将IgG2位置233-236的残基取代为人IgG1(的残基)大大降低了其ADCC和CDC活性(Armour等,1999和Shields等,2001)。按照EU索引位置(Kabat等,1991),可在IgG1的Fc区中引入如下Fc突变:
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S
E333A;K322A
其它Fc突变可以是,例如在选自330、331、234或235位或其结合的EU索引位置上的取代。本发明中,也可在Fc区中引入位于CH2结构域上的EU索引位置297的氨基酸取代,以消除N-连接糖附着的潜在位点。也可用丝氨酸残基取代EU索引位置220的半胱氨酸残基,以去除通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的该半胱氨酸残基。
已制备了适合用于本发明TACI-Ig融合蛋白的特定Fc结构域。
具体说,为产生Fc融合蛋白,制备了6种修饰的人IgG1Fc,命名为Fc-488及Fc4、Fc5、Fc6、Fc7和Fc8。
利用野生型人免疫球蛋白γ1恒定区作模板,设计和构建了便于克隆含人γ1Fc区融合蛋白的Fc-488(具有SEQ ID NO:4的DNA序列和SEQ ID NO:5的氨基酸序列)。应注意由于用丝氨酸取代通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸,可能导致半胱氨酸残基不配对而产生有害作用。在编码EU索引位置218的密码子中引入一种其它改变,以引入BgIII限制性酶识别位点而有利于后面的DNA操作。通过PCR引物将这些改变引入编码的PCR产物中。由于已安置了BgIII位点,为了完成(引入)Fc绞链区,将编码EU索引位置216和217的密码子掺入融合蛋白的伴侣序列中。Fc4、Fc5和Fc6包含突变,通过减弱FcγR结合和补体C1g结合而减弱Fc介导的效应器功能。Fc4含有同样的氨基酸取代,它们被引入Fc-488中。引入其它氨基酸取代,以减弱潜在的Fc介导的效应器功能。具体说,引入三个氨基酸取代以减弱FcγRI结合,这些取代是在EU索引位置234、235和237的取代。已显示这些位置的取代减弱了与FcγRI的结合(Duncan等,1988)。这些氨基酸取代可能也减弱了与FcγR11a的结合以及与FcγRIII的结合(Sondermann等,2000;Wines等,2000)。
几个研究小组报导了EU索引位置330和331的氨基酸与补体C1q结合及后续补体的固定有关(Canfield和Morrison,1991;Tao等,1993)。在Fc4的这些位置引入氨基酸取代减弱了其补体固定功能。Fc4的CH3区与相应野生型多肽的CH3区相同,除了终止密码之外。当用不良的大肠杆菌菌株培养克隆的DNA时,将该终止密码子从TGA改变成TAA以消除潜在的有害甲基化位点。
在Fc5中,EU索引位置218的精氨酸残基突变回赖氨酸,因为在含这种特定Fc的融合蛋白中没有采用BgIII克隆方案。Fc5序列的其余部分与以上描述的Fc4相匹配。
Fc6与Fc5相同,除了羧基末端赖氨酸密码子已消除外。成熟免疫球蛋白C-末端的赖氨酸通常从翻译后成熟免疫球蛋白去除然后从B细胞分泌出来,或在血清循环时去除。结果,循环抗体通常没有C-末端赖氨酸残基。与以上的Fc4和Fc5相同,Fc6序列中的终止密码子改变成TAA。
Fc7与野生型γ1Fc相同,除了CH2结构域中EU索引位置297上有氨基酸取代外。EU索引位置297天冬酰胺是N-连接的糖附着点。由于糖结构可能产生批间差异,N-连接糖在重组表达的蛋白中引入了潜在的变异源。在一个消除这种潜在变异的尝试中,使297天冬酰胺突变为谷氨酰胺残基以防止该残基位置附着N-连接糖。残基297处的糖也参与Fc与FcIII的结合(Sondermann等,Nature 406:267(2000))。因此,通常去除该糖应减弱含Fc7重组融合蛋白与FcγR的结合。如上所述,将Fc7序列中的终止密码子突变为TAA。
Fc8与SEQ ID NO:4所示的野生型免疫球蛋白γ1区相同,除了EU索引位置220的半胱氨酸被丝氨酸残基取代外。此突变消除了通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸残基。
任何这些特定Fc区在形成TACI-Ig融合蛋白的应用均落入本发明范围。
TACI-Ig的免疫球蛋白恒定区优选包含具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽,或其与SEQ ID NO:2所示Ig恒定区至少有80%或85%,优选至少90%或95%或99%相同的变体;或含有少于50或40或30或20或10或5或3或2个保守性氨基酸取代的变体,只要这不影响TACI-Ig融合蛋白的整体生物学活性,此种TACI-Ig蛋白的免疫原性不会显著高于atacicept(SEQ ID NO:3)。
在本发明说明书中,术语“相同性”表示通过序列比较所确定的两条或多条多肽序列之间的关系。相同性通常指两条多肽序列作全长序列比较时,它们的氨基酸与氨基酸分别精确对应。
对于无精确对应的序列而言,可确定其为“0%相同”。通常排列对比所比较的二条序列,得到序列之间的最大相关性。这可包括在一条或二条序列中插入“空格”以提高对比程度。比较每条序列的全长(所谓总体对比)可确定相同性%,这特别适合长度相同或非常相似的序列,或比较较短、长度限定的的序列(所谓局部对比),这较适合长度不相等的序列。
比较两条或多条序列相同性的方法是本领域熟知的。例如,可采用在9.1版威斯康新序列分析包中的这种程序(Devereux J等,1984),例如BESTFIT和GAP程序,来测定两条多聚核苷酸之间的相同性%和两条多肽序列之间的相同性%。BESTFIT采用Smith和Waterman(1981)的“局部同源性”算法,寻找二条序列之间相似性的最佳单一区域。测定序列相同性的其它程序也是本领域已知的,例如,BLAST家族程序(Altschul S F等,1990;Altschul S F等,1997,可通过NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov进入)和FASTA(Pearson W R,1990)。
本发明优选的氨基酸取代是被称作“保守性”的取代。TACI-Ig融合蛋白的TACI胞外结构域或免疫球蛋白恒定区部分的保守性氨基酸取代,包括理化性质充分相似的同组内的同义氨基酸(相互取代),同组内成员之间的取代将保存该分子的生物学功能(Grantham,1974)。已知也可在上述序列中制造插入和缺失而不会改变其功能,具体说,如果插入或缺失只涉及少数氨基酸,如50以下、或30个以下、20个以下、或优选10个以下、或5个以下氨基酸残基,并且不去除或置换对功能构象至为关键的氨基酸,如半胱氨酸残基。这样的缺失和/或插入所产生的蛋白质和变体可用于治疗复发性MS,只要其生物学活性不显著低于atacicept(具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白)的生物学活性。
已公布的国际专利申请WO 00/40716和WO 02/094852公开了TACI的胞外结构域及TACI胞外结构域与其配体BlyS和APRIL相互作用的特异性片段。
如WO 00/40716所公开的那样,TACI的胞外结构域包含2个富含半胱氨酸(Cys)的重复序列,这是TACI受体所属肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的特征。WO 00/40716中也制备了一种能与BlyS结合的TACI修剪变体,命名为BR42x2,它只包含第2种较不保守的富含Cys重复序列。因此,在本发明框架内,TACI的胞外结构域片段优选至少包含对应于该第2种富含Cys重复序列的SEQ ID NO:1的71-104氨基酸残基或由这些残基组成,更优选TACI-Ig融合蛋白还包含对应于第一种富含Cys重复序列的SEQ ID NO:1的34-66氨基酸残基。
在本发明另一实施方式中,所述能结合和抑制BlyS和/或APRIL活性的TACI的胞外结构域片段自身包含SEQ ID NO:1的30-110氨基酸残基或由这些残基组成。
在本发明的还有一个实施方式中,所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDNO:3序列的多肽或由其组成,或与之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30个或20个或15个或10个或5个或3个或2个保守性氨基酸取代的变体,这种变体能结合BlyS和/或APRIL。
在本发明的还有另一个实施方式中,所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDNO:8序列的多肽或由其组成,或与之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30个或20个或15个或10个或5个或3个或2个保守性氨基酸取代的变体,这种变体能结合BlyS和/或APRIL。
在本发明的还有一个实施方式中,所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDNO:10序列的多肽或由其组成,或与之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30个或20个或15个或10个或5个或3个或2个保守性氨基酸取代的变体,这种变体能结合BlyS和/或APRIL。
在本发明的还有一个实施方式中,所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDNO:12序列的多肽或由其组成,或与之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30个或20个或15个或10个或5个或3个或2个保守性氨基酸取代的变体,这种变体能结合BlyS和/或APRIL。
在本发明的还有一个实施方式中,所述TACI-Ig融合蛋白包含SEQ IDNO:14序列的多肽或由其组成,或与之有至少90%或95%或98%或99%相同性或少于30个或20个或15个或10个或5个或3个或2个保守性氨基酸取代的变体,这种变体能结合BlyS和/或APRIL。
在本发明的另一个实施方式中,所述制剂包含浓度范围20mg/ml-180mg/ml,例如浓度为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175mg/ml的TACI-Ig融合蛋白。
在本发明另一实施方式中,所述制剂是液体(如水溶液)剂型。
在本发明的还有一个实施方式中,所述制剂是多剂量给药制剂。多剂量制剂中优选包含防腐剂。如上所述,在一个优选的实施方式中,所述制剂包含苯甲醇(如0.3%)和苯扎氯铵(如0.001%)。
可每天、每隔一天,优选每周二次或每周一次给予TACI-Ig融合蛋白制剂。给予TACI-Ig优选推注给药,每周一次。或者,也可每隔一周或每月一次给予所述制剂。
本发明的制剂可以是例如静脉内、皮下或肌肉内途径给药。在本发明的一个实施方式中,所述制剂是用于皮下给药的。
本发明的制剂用于治疗疾病,优选治疗人类疾病。因此,在一实施方式中,将本发明制剂制备成药物组合物。
包含TACI-Ig融合蛋白的制剂或药物组合物优选用于治疗自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病,或制备治疗自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病的医疗用药。
本发明所述的自身免疫性疾病包括但不限于:全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、类风湿关节炎、多发性硬皮症或视神经炎。
淋巴增殖性疾病是一种淋巴系统细胞过度增殖的疾病。B细胞恶变是例如淋巴增殖性疾病。B细胞恶变疾病包括但不限于:白血病和淋巴瘤,例如,急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、髓母细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞白血病、单核细胞红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
本发明也涉及生产或制备本发明制剂的方法,包括制备(例如混合)组分(a)-(c)的步骤,优选在液体溶液(如水溶液)中。
本发明还涉及生产或制备本发明制剂的方法,包括在灭菌容器中放置预定量的所述制剂。预定量可以是例如0.5-5ml,优选1-2ml。
在本发明的一个实施方式中,所述容器选自玻璃小瓶或预装填针筒。玻璃小瓶例如可用无涂层瓶塞或涂层瓶塞密封。瓶塞可以是例如橡皮塞或溴丁基橡胶塞。针筒,如预装填针筒可以用橡皮内芯或用涂层内芯塞住。涂层可以是例如无油硅酮涂层。
预装填针筒可以有不同容量,如0.5、1、1.5或2ml。优选1ml针筒。针筒的装填容量优选1或1.2ml。预装填针筒可用塑料制成,或优选为玻璃针筒。合适的玻璃针筒为例如Becton Dickinson制造的1mL玻璃针筒27G1/2 RNG W 7974/50G。预装填针筒优选用涂层塞子(如FluroTec公司制造的W4023/50G)和无涂层塞子(如West Pharmaceutical公司制造的W4023/50G)塞住。按照本发明,预装填针筒优选包含TACI-Ig融合蛋白含量范围在20-160mg,例如20、25、50、75、100、125或150mg的药物。如以下实施例4所示,包含乙酸钠缓冲液和海藻糖的pH5.0的TACI-Ig融合蛋白制剂保持在5-25℃可长期稳定,例如达18个月。
除非另外指明,本申请说明书所指定的各种范围的数值都表示为近似值,正如所述范围内的最低值与最高值前面都有“大约”这个词。以这种方式,可采用在所述范围之上或之下的轻微变更以达到与范围内的数值基本上相同的结果。还有,所公开的范围是连续范围,包括所引用的最低值与最高值之间的每一个值,以及可能形成的任何范围。
在本发明中,本发明的制剂或药物组合物可包含除TACI-Ig融合蛋白以外的其它活性成分,或与其它活性成分联合给药。例如,可存在皮质类固醇,特别是甲基氢化泼尼松,还有干扰素-β、克拉曲滨、米托蒽醌、乙酸格拉默、那他珠单抗、利妥昔单抗、特立氟胺、fingolimod、laquinimod或BG-12(一种口服延胡索酸盐)。这种联合治疗可以同时、分开或相继进行。
现已全面公开了本发明,本领域技术人员会明白,采用范围广泛的同等参数、浓度和条件,不背离本发明的思路和范围,无需过多实验而可获得同样的结果。
虽然结合具体实施例描述了本发明,但应明白可以作进一步改进。本申请旨在其所附权利要求范围中覆盖按照本发明原理对本发明所作的任何变更、应用和改编,包括属于本发明所属领域的已知或常规实践、可适用于上述基本特征而与本说明书公开偏离的内容。
本文引用的所有参考文献,包括杂志文章或摘要,公开或未公开的美国或外国专利申请,颁发的美国或外国专利及其它任何参考文献,整体纳入本说明书作为参考,包括引用参考文献中的所有数据、图表和文本。此外,本说明书所引用参考文献中的参考文献内容也纳入本说明书作参考。
参考已知的方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法,不意味以任何方式承认本发明的任何方面内容、描述或实施方式在向各方领域已公开、报导或提出过。
以上对具体实施方式的描述完全揭示了本发明的总体特征,他人可通过应用本技术领域的知识(包括本说明书所引参考文献的内容)无须过多实验和不背离本发明的总体概念,不难修饰和/或改编这样的具体实施方式以供各种应用。因此,这些依据本说明书提供的说明和指南作出的改编和修饰意在落入所公开实施方式的同等范围内。也应理解本说明书所用的措词和术语目的是为了说明而非限制,因此本说明书的术语或措词可由本领域技术人员根据本说明书提供的说明和指南,结合本领域普通技术人员的知识予以解释。
在描述了本发明后,参见以下示范性临床研究状况的实施例不难理解,它只是为了说明而提供的,并非为了限制本发明。
实施例1.液体制剂的开发
词汇表
AUC:分析型超离心,
CD:园二色性
DLS:动态光散射,
DSC:差示扫描热量法
IEC:离子交换色谱,
MALDI-ToF:基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱
OD:光密度,
RALS:直角光散射
RP:反相色谱,
SEC:分子大小排阻色谱
材料
-TACI-Fc药品,磷酸盐缓冲液,pH6.0,+140mM NaCl
-TACI-Fc药品,磷酸盐缓冲液,pH5
-TACI-Fc药品,乙酸盐缓冲液,pH5
-正磷酸(1.00563,Merck)
-琥珀酸(1.00682,Merck)
-柠檬酸(1.59134,Merck)
-组氨酸(1.04351,Merck)
-冰乙酸100%(1.00063,Merck)
-D-甘露醇DMB,Ph Eur,BP,USP,FCC,E421(1.05980,Merck)-D-山梨醇(S-1876,Sigma)
-蔗糖DAB,Ph Eur,BP,NF(1.07653,Merck)
-海藻糖(1.08216,Merck)
-D-葡萄糖一水合物(346971,Carlo Erba)
-氢氧化钠片GR(1.06498,Merck)
-吐温20,合成的(8.22184,Merck);
-波洛沙姆(Poloxamer)188(Lutrol F 68 DAC,USP/NF,Basf)
-氯化钙二水合物(1.02382,Merck)
-氯化镁(1.05833,Merck)
-氯化钠(1.06404,Merck)
-盐酸精氨酸(A-5131,Sigma);
-赖氨酸盐酸盐(1.0571,Merck)
-甘氨酸(5.00190,Merck);
-乙腈(00030,Merck)
-10xPBS(P/N 70013-032,Gibco)
-三氟乙酸(9470,Baker)
-硫酸铵(1.01217,Merck)
-1N氢氧化钠(1.09137,Merck)
-1N盐酸(1.09057,Merck)
-HPLC级水(MilliQ)
-注射用水
-无水硫酸钠(代码6649,Merck)
-甲醇(代码06009,Merck)
-叠氮化钠(代码6688,Merck)
-磷酸二氢钠一水合物(代码06346,Merck)
-磷酸氢二钠二水合物(代码06580,Merck)
生物学试验用:
-Jurkat pKZ142克隆(WCB)24细胞
-TACI-Fc5(1-8.66mg/ml)
-zTNF4(1.44mg/ml)
-RPMI 1640,含或不含酚红(Gibco)
-胎牛血清(FBS)(GIBCO)
-L-谷氨酰胺(Hyclone)
-丙酮酸钠(Gibco)嘌呤霉素(Sigma)
-稳定的GLO萤光素酶试验缓冲液和底物(ProMegaE2510)
白色组织培养96孔板加盖(Dynex)
-96孔板加盖(Falcon)
-5mL聚丙烯试管(Falcon)
设备
-HPLC系统(Waters)
-计量移液管(Gilson)
-差示扫描量热仪(2920型,TA仪器公司)
-微热量计(VP-DSC型,MicroCal)
-pH计(713型,Metrohm)
-渗透压计(Osmomat 030-D,Gonotec)
-旋光分光光度仪J-810,配备有Peltier温度控制计PTC-423S(Jasco)
-荧光分光光度仪FluoroMax3,配备有微板计数计MicroMax384(Jobin Yvon)
-96-孔MaxSorp板(Nunc)
-分光光度计λ354(Perkin-Elmer)
-石英杯0.1和1cm光路径(Perkin Elmer)
-Zetasizer Nano Series(Malvern)
-小容量(约70μL)石英杯
-细胞搅拌系统(8400或8450型,Amicon)
-10kDa截留膜(YM10型,Amicon)
-不锈钢容器22mL和220mL容量(Sartorius)
-滤膜0.22μm(Durapore型GWV P,Millipore)
-滤膜0.45μm(Durapore型HVLP,Millipore)
-荧光/RALS光度计(Photon Technology International)
-IKA-Vibrax-VXR振荡器(IKA-Works,Inc.)
-冻干机(Lyoflex 06,Lyoflex 08,Edwards)
-旋涡振荡器(Falc)
-恒温箱(Heraeus)
-低温冰箱(Angelantoni)
生物学检测用:
-发光计平板读数仪Lumicount Packard
-Graph Pad Prism软件
-层流通风柜(Flow Laboratories)
-37℃ CO2培养箱(Heraeus)
-37℃水浴箱
-细胞计数器
-显微镜
-摇动平台
-桌面离心机
-单通道和多通道刻度移液管和移液头
-移液辅助器
主要包装材料
-DIN2R(3mL)玻璃小瓶(Nuova OMPI)
-Flurotec橡皮塞(S2F452,D777-1,B2-40,West Pharmaceutical)
-橡皮塞(1779W1816灰色Pharmagummi)
方法
分子大小排阻色谱法(SEC)
方法1
用PBS1X pH=7.2稀释样品至0.5mg/ml,取40μl(20μg)加到TSK凝胶柱G3000SWXL(5μm,7.8×300mm)上。每次试验,洗脱液为0.05M乙酸钠,0.5M硫酸铵pH=6.0。
方法2
用移动相稀释样品至0.25mg/ml,取40μl(20μg)加到TSK凝胶柱G3000SWXL(5μm,7.8×300mm)上,此柱连接于TSK凝胶SWXL保护柱(6mm×4cm)。每次试验,洗脱液为0.05M磷酸钠,0.5M硫酸铵pH=6.0。
反相色谱法(RP)
用PBS1X pH=7.2稀释样品至0.5mg/ml,取40μl(20μg)加到已用71%缓冲液A(0.1%TFA/水)和29%缓冲液B(0.1%TFA/乙腈)平衡的柱(8μm,50×4.6mm)上。用线性梯度液洗脱样品,流速2ml/分。注入不同量的标准液(IRS ACI-Fc5 2002/2001)产生标准曲线。
C-末端截短(RP)
将样品用酶(Cys-C)37℃消化2小时,然后在带保护柱的Vydac C18柱(4,6×50mm)上进行反相层析。
洗脱液A:0.1%TFA/水;洗脱液B:0.08%TFA/70%CH3CN
流速:1ml/分,
温度:40°+/-5℃,
检测:214nm
洗脱梯度:7分钟内洗脱液B 15%-23%,共15分钟。
修剪形式(RP)
用纯水稀释TACI-Fc药品的样品至蛋白浓度4mg/ml。取10μl稀释的样品用还原变性液(0.15M DTT/6M盐酸胍)稀释至200μl,旋涡振荡后60±2℃培育90分钟。取75-150μl(15-30μg)注入先前已用起始条件液(71%洗脱液A,0.05%TFA/水和29%洗脱液B,0.04%TFA/乙腈)平衡的柱(大孔丁基柱,5mm,直径4.6mm×高50mm,货号7116-05,J.T.Baker公司产品)中。
游离Fc二聚体(IEC)
用Poloxamer188 100mg/L溶液(以10mM磷酸钠缓冲液pH4.0配制)稀释TACI-Fc药品的样品至蛋白浓度为10mg/ml。当TACI-Fc浓度高于100mg/ml时,应通过称重进行样品稀释。
取25μl(250μg)注入预先用起始条件液(80%洗脱液A,10mM磷酸钠pH4.00和20%洗脱液B,10mM磷酸钠pH 4.00+0.5M KCI)平衡的柱(ProPac WCX-10G(保护),4x50mm,货号054994,Dionex公司产品)中。
氧化形式(MALDI-ToF)
对TACI-Fc药品样品进行肽图描绘,应用NALDI-ToF检测定量其氧化形式而验证。
分析型超离心(AUC)
将样品加到有二通道碳环氧树脂十字头的小杯中,光路径12mm。用SE-HPLC洗脱缓冲液作为稀释剂将样品稀释以模拟HPLC检测的条件。将相对应的缓冲液加入参比通道(该仪器操作类似于双光束分光光度计)中。然后将加样小杯放入AN-59Ti分析转头,安置在Beckman Optima XL-I分析型离心机中。采用以下实验设置进行分析:
转头类型:8孔转头;
转速;40000rpm;
十字头:碳环氧树脂;
通道长度:12mm;
AUC试验期间的温度20℃±0.2℃;
检测波长:280nm;
样品浓度:0.5mg/ml;
样品体积:432ml/通道;
参比品体积:442ml/通道。
用国立卫生研究院Peter Schuck开发的c(s)法分析数据,用其分析程序SEDFIT(8.7版)进行分析。
差示扫描热量法(DSC)
DSC 2920CE,TA仪;温度范围25-100℃;升温速度2℃/分;填装的最大体积(HVP)75μl溶液;用安慰剂溶液为参比液。微热量计为MicroCalVP-DSC;温度范围25-100℃;升温速度70℃/小时;反应=15秒;数据间距0.2-8℃;样品杯填装约600ml的5mg/ml Taci-Fc5液;用水作参比溶液。
光密度(OD)
用水稀释制备0.5mg/ml TACI-Fc5液,用兰伯特-比尔公式OD=εbc(ε是摩尔消光系数;b是光杯的厚度)计算浓度(c)。ε(280nm)=1.56(mL/mg)/cm。将这些计算值乘以稀释倍数测得起始液的浓度。
园二色性(CD)
构缘分析
通常采用CD研究肽和蛋白质的构象。几种因素可能影响CD光谱远紫外(180-250nm)区和近紫外区9250-350nm)特征峰的形态,如蛋白浓度、温度、pH和离子强度。文献报告在远紫外区观察到的总谱带位置代表了特定类型的二级结构(α-螺旋,β-片层,随机卷曲)。在近紫外区观察到的CD谱带主要由Trp、Tyr、Phe和二硫键产生。
然而,必须指出,二硫键的信号一般比芳族氨基酸的信号低得多。只要这些残基位于不对称环境即可产生CD信号。蛋白三级结构的构象变化常导致起始环境的变化,从而引起CD波谱改变。事实上,天然蛋白的各氨基酸占据三维结构中的独特位置。这种结构的改变可导致其可及度的改变。
近紫外区CD光谱的没置:
扫描速度=5-20nm/分;范围=250-350nm;反应速度=8秒;浓度=2mg/ml;光路径长=1cm;数据间距=0.5nm;带宽=1nm;累积=2标准灵敏度。室温下获得光谱。
远紫外区CD光谱的设置;
扫描速度=5-20nm/分;范围=200-300nm;反应速度=8秒;浓度=0.25mg/ml;光路径长0.1cm;数据间距=0.5nm;带宽=1nm;累积=2标准灵敏度。室温下获得光谱。
蛋白质去折叠温度
用CD以固定波长监测温度扫描是在不同温度下研究蛋白质二级和三级结构的有价值的方法。这种检测可以评价在不同制剂中蛋白质的去折叠温度(Tunf)。虽然Tunf与蛋白质去折叠释放的自由能(它是蛋白质稳定性的一种指标)不直接相关,但广为接受的是Tunf升高应与蛋白质稳定性增加相关。因此,Tunf的变化可表明特定组合物是否有稳定或去稳定的效果。通过监测色氨酸(Trp)信号的变化对热变性进行了研究,该信号的变化与蛋白质构象随温度变化有关。在55-70℃范围内加热药品制剂(1℃/分)。可通过CD椭园相对极小值292.5nm的变化检测温度对三级结构的影响。采用第4级多项拟合法计算出解链温度值。
CD温度扫描的设置
温度范围=55-70℃;升温速度=1℃/分;λ=292.5nm;浓度=2mg/ml;反应速度=8秒;数据间距=0.2-8℃;带宽=1nm;标准灵敏度;搅拌速度=低速。
动态光散射法(DLS)
动态光散射法是检测颗粒布朗运动产生的与颗粒大小有关的光散射。此法需要将颗粒置于激光束下,分析散射光中的强度波动。更精确地说,颗粒布朗运动的速度与颗粒大小相关(史托克-爱因斯坦等式)。用数字相关器检测在一段时间内两种信号(此例为强度信号)之间的相似程度,给出与散射光强度波动的性质和程度相关的信息,这些信息与颗粒大小有关。测定相关函数后,可用其计算出颗粒大小分布。
用Zetasizer Nano Series检测接近180°的散射光强度(反相散射检测)。这种设置可减少通过样品时多重散射光的影响和大污染颗粒的影响。采用一次性小杯(内部容量约70μl)。检测时的温度=25℃。平衡时间=1分钟,运行次数=11次;运行时间=10秒;检测次数=2;分散剂为水(粘度=0.8872cP;屈光率=1.330),不经稀释。
荧光直角光散射(RALS)
用荧光检测器检测RALS,其激发光和发射光的波长设置相同。在此种配置中,荧光检测器成为非常灵敏的RALS检测器。RALS升高表明样品中有凝聚/沉淀。
荧光
内荧光
蛋白质含三种芳族氨基酸残基(色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe),这成为其发出内荧光的原因。折叠蛋白的荧光是各芳族残基荧光的集合。一般用280nm波长或常用更长的295nm光激发蛋白荧光。大多数发射光由色氨酸残基发射产生,少数发射光由酪氨酸和苯丙氨酸产生。色氨酸最大荧光发射的强度、量子率和波长极其依赖于溶剂。随着色氨酸残基周围溶剂极性的降低,荧光光谱转移为较短波长,荧光强度增加。包埋在蛋白疏水核心中的色氨酸与蛋白表面的色氨酸相比,其光谱可能漂移10-20nm。此外,色氨酸荧光可被邻近的质子化酸性基团如Asp或Glu淬灭。因此,可利用荧光作为强效监测工具,反映芳族残基所处微环境的变化。
MicroMax384是一种微孔板读数仪,能装下多达384孔的平板并连接FluoroMax荧光分光光度计。单色光镜的激发光和发射光通过光纤束进出MicroMax 384,因此,用户可用该主荧光光度计扫描并选择强度测量用的激发光和发射光波长对。MicroMax的所有控制均为通过DataMax软件的自动控制,通过此软件也可自定义选择板中微孔。
用MicroMax384平板读数仪进行高通量荧光扫描,采用以下设置:激发光和发射光间隔=5nm;λexc=280nm;发射光范围=300-450nm;积分时间=0.1秒;不稀释。用Fluromax3软件自动计算最大发射光波长。
RALS
用FluoroMax荧光分光光度计在500-800nm之间同步扫描(λexc=λem)进行RALS检测。在这些条件(无样品吸收和不受光源影响)下显示的强度主要为溶液中存在的(光/蛋白质)散射现象所致。散射总强度随着蛋白粒度增加而增加,因此,可用此技术监测凝聚、亚单位分离、降解等等。
散射强度也依赖于蛋白浓度与屈光系数,因此,应在相同的蛋白浓度下进行检测比较。
进行RALS检测设置的参数如下:同步扫描,波长范围=500-800nm,间距=15nm,积分时间=0.5秒,偏移=0nm,样品浓度=35mg/ml(用milliQ水作为稀释剂)。
荧光发射光的各向异性
大分子的旋转取决于其大小、形状和局部环境(即溶剂)。通常采用偏振发射测量来检测分子大小的微小变化(凝聚、结合、切断)及环境变化(局部粘度,相转变等)。这些检测的第一步是激发所选择的荧光基团(光选择)。通常用垂直偏振光以垂直方向激发能吸收偶极子的分子群。在此时相中,用激发途径中的偏振器产生垂直的偏振激发光。一旦受到激发,分子可在激发状态寿命期(约10-9秒)内旋转。这种旋转将使荧光发射消偏振。测定偏振发射光的组成可以出计算分子旋转的类型与程度。用发射途径中的偏振器检测荧光发射的偏振组成部分。从垂直(V)和水平(H)发射光组成部分的大小,可计算出旋转的程度和类型。Anisotropy(A)是一种比例,定义为线性偏振组成部分的强度除以光的总强度:
A=(IVV-G*IVH)/(IVV+2G*IVH)
此式中,G是校正因子,G=IHV/IHH
在这些方程式中,强度I的第一个下标表示激发光偏振器的位置(H或V),第二个为发射光偏振器的位置(H或V)。当激发光波长设为λ=295nm时,荧光的各向异性给出了与色氨酸残基移动和它们所处局部粘度的有关信息。因此,荧光各向异性的增加可反映蛋白质的这些残基处于更刚性的环境。
检测各向异性所设置的参数如下:λexc=295nm,发射光范围=500-800nm,积分时间=0.5秒,间距=15nm,样品浓度=35mg/ml(用milliQ水作为稀释液)。
生物学试验
TACI-Fc体外生物学试验基于Jurkat(人急性T细胞淋巴瘤)转染的细胞(Jurkat pKZ142)。用二种质粒转染此细胞系,第一种编码在CMV启动子控制下的全长TACI cDNA,第二种含NF-kB/AP-1驱动的荧光素酶报告基因。该方法基于zTNF4结合细胞表面TACI受体、触发信号转导级联反应、导致转染的NF-kB/AP-1荧光素酶报告基因激活的能力。可溶性TACI-Fc的存在抑制了zTNF4与TACI受体的结合,从而降低荧光素酶的表达。
将Jurkat pKZ142细胞与TACI-Fc标准品一起培育,建立27.86-1.63U/ml全剂量反应曲线,以及与两种浓度(即4和6U/ml)的受试样品一起培育,这两种浓度位于标准曲线的线性部分。
然后将zTNF4溶液以能诱导次级最大荧光素酶产生的浓度(即每孔150ng/ml)加入标准品和样品中;以最少和最多荧光素酶产生为对照。37℃(5%CO2)培育4小时后,用荧光素酶Steady Glo试剂盒加入细胞,以发光光度计检测荧光素酶的表达。
在标准剂量反应曲线的线性部分内插两种测试浓度的Y值(RLU),计算出样品效能,获得X轴上的TACI-Fc浓度(Graph Pad软件)。求得各次独立试验中两种浓度的平均值,然后从各次独立试验获得的效能算术平均值计算出TACI-Fc5的生物学活性。
预配制过程
对pH、缓冲液类型和辅料对蛋白质稳定性的影响进行了评价。制备浓度70或100mg/ml的TACI-Fc溶液,初步研究以下变量:
-pH(4、5、6、7)
-缓冲液(乙酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸)
-糖(甘露醇、山梨醇、甘油、蔗糖、海藻糖)
-辅料(氯化钠、氯化镁、氯化钙、甘氨酸)
除此之外,对70mg/ml的TACI-Fc5进行了以下进一步的预筛选研究:
-用pH 5-6-7的20mM缓冲液(组氨酸、磷酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐)进行反复冻融(F-T)1、3、5F-T次;
-40℃培育(摇动和不摇动);
-储存在2-8℃,pH 4-5-6,20mM缓冲液(乙酸盐、组氨酸、磷酸盐)中。
根据这些第一批观察到的结果,选择pH 5和6的两种缓冲液(磷酸盐和组氨酸),制备第二批制剂,用以研究再加入稳定剂(剩余重量克分子渗透浓度0.280 OSM)的效果。测试了以下稳定剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、甘氨酸、NaCl、MgCl2、CaCl2。
将各溶液储存于2-8℃、25℃和40℃,在14天中对凝聚物(SE-HPLC)、蛋白含量(RP-HPLC)、pH和外观进行检测。
实验设计
根据前期所作的选择,进行实验设计以评估以前所研究的不同水平的因素对蛋白质稳定性的影响。对乙酸盐和组氨酸缓冲液中的制剂进行检测,同时检测以下表面活性剂:Poloxamer 188(F-68)和吐温20,及以下辅料:精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、甘露醇和海藻糖。将这些制剂装在玻璃小瓶中,贮存于2-8℃、25℃和40℃,检测凝聚物(SE-HPLC和AUC)、pH、外观和重量克分子渗透浓度。也采用生物物理分析方法(如园二色性、2nd UV衍生光谱法、内荧光法)。
候选制剂
在预制备期结束时,检测鉴定了某些候选制剂,含70或100mg/mlTACI-Fc、10mM乙酸盐缓冲液、甘露醇(51mg/ml)或无水海藻糖(80或96mg/ml)为辅料的有或无Poloxamer 188(F-68)(0.05mg/ml),pH4.8、5.0、5.2和5.4。
将所有溶液通过0.22μm Durapore滤膜过滤除菌后收集到灭菌容器中。然后将溶液装填到DIN2R玻璃小瓶(1ml填量)中。取制备期间的加工样品(过滤前、后)评估蛋白质的损失或凝聚物的增多。
将样品贮存在2-8℃、25℃和40℃,检测储存1个月(40℃)和6个月(2-8℃和25℃)的结果。
检测候选制剂的凝聚物(SE-HPLC)、蛋白含量(RP-HPLC)、pH、重量克分子渗透浓度和生物学活性。也检测C-末端截短的程度和截短/修剪形式的比例。还采用了生物物理方法(内荧光、动态光散射、90°光散射)。
也评估了冻-融对2-8℃保存的候选制剂液体样品的影响:-80℃冰冻样品然后室温融化。用SE-HPLC评估冻-融前后的凝聚物含量。
评价了模拟药品装船运输摇动24小时对2-8℃保存样品的影响,将样品放在微孔板摇动平台上室温摇动24小时后用SE-HPLC评估凝聚物水平并与起初的水平比较。
结果
候选制剂用10mM NaAc配制。
以下表A-T报告了详细结果。
表A:SE-HPLC测定的总凝聚物百分比%(2-8℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 4周 | 6周 | 8周 | 12周 | 16周 | 26周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 3,3 | 3,6 | 3,7 | 3,2 | 2,9 | - | 2,0 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,4 | 3,7 | 3,8 | 3,5 | 3,0 | - | 2,1 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,4 | 3,6 | 3,8 | 3,9 | 3,1 | - | 2,2 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,4 | 3,6 | 3,9 | 3,5 | 3,0 | - | 2,3 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,7 | 4,5 | 3,8 | 3,8 | 3,3 | - | 2,3 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 3,7 | 3,9 | 3,4 | 3,4 | - | 2,8 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 3,7 | 3,7 | 3,9 | 4,1 | 3,2 | - | 2,6 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 3,8 | 3,7 | 4,1 | 3,6 | 3,3 | - | 2,6 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 3,3 | 2,9 | 3,0 | - | 2,6 | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 3,4 | 3,3 | 3,3 | - | 2,7 | - |
所用批量原料,S128/L20a(10mM乙酸钠缓冲液,pH=5.0),总凝聚物%=3.9(Tre=海藻糖,Man=甘露醇)。
表B SE-HPLC测定的总凝聚物百分比%(25℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 2周 | 4周 | 6周 | 8周 | 12周 | 17周 | 27周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 3,3 | 2,6 | 4,0 | 3,8 | 3,7 | 3,5 | - | 3,4 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,4 | 3,0 | 3,7 | 4,1 | 3,9 | 3,4 | - | 3,5 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,4 | 3,1 | 3,9 | 4,2 | 4,6 | 4,0 | - | 4,5 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,4 | 5,0 | 4,0 | 4,1 | 4,4 | 4,2 | - | 4,4 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,7 | 3,3 | 3,9 | 4,6 | 4,5 | 4,4 | - | 4,7 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 3,8 | 4,5 | 5,0 | 5,1 | 5,2 | - | 6,5 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 3,7 | 3,9 | 3,9 | 4,7 | 4,7 | 4,5 | - | 4,9 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 3,8 | 3,4 | 3,9 | 4,6 | 4,5 | 4,4 | - | 4,9 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 3,0 | 3,6 | 3,3 | 3,5 | - | 5,0 | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 3,4 | 4,1 | 3,8 | 4,2 | - | 4,9 | - |
所用批量原料,S128/L20a(10mM乙酸钠缓冲液,pH=5.0),总凝聚物%=3.9(Tre=海藻糖,Man=甘露醇)。
表C.SE-HPLC测定的总凝聚物百分比%(40℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 1周 | 2周 | 4周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 3,3 | 3,9 | 4,1 | 6,1 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,4 | 4,0 | 4,4 | 6,3 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,4 | 4,4 | 5,3 | 7,4 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,4 | 5,0 | 5,3 | 7,9 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,7 | 5,0 | 5,5 | 7,9 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 6,2 | 7,4 | 11,0 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 3,7 | 5,0 | 6,1 | 8,4 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 3,8 | 5,9 | 6,1 | 8,4 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 6,1 | 7,4 | 12,2 |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,6 | 7,6 | 8,9 | 14,0 |
所用批量原料,S128/L20a(10mM乙酸钠缓冲液,pH=5.0),总凝聚物%=3.9(Tre=海藻糖,Man=甘露醇)。
表D.AUC测定的二聚物百分比%(2-8℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 4周 | 8周 | 13周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 4,0 | 7,4 | 3,0 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,2 | 1,6 | 3,6 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 7,5 | 2,6 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 4,2 | 3,7 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,3 | 4,5 | 3,2 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 4,0 | 2,9 | 4,1 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 3,1 | 4,0 | 3,1 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 3,7 | 4,7 | 2,8 |
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 4周 | 8周 | 13周 | |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,9 | - | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,5 | - | - |
表E.AUC测定获得的大凝聚物百分比%(2-8℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 4周 | 8周 | 13周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 2,3 | 2,8 | 1,1 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 2,0 | 0,5 | 2,5 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 3.0 | 0,6 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 2,1 | 1,4 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 1,2 | 1,5 | 1,2 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 1,1 | 0,8 | 1,6 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 1,5 | 2,1 | 1,5 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 1,9 | 2,1 | 1,3 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 1,9 | - | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 2,0 | - | - |
表F.AUC测定获得的二聚物百分比%(25℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0(4周5℃) | 4周 | 8周 | 13周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 4,0 | 2,6 | 3,8 | 5,3 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,2 | 3,9 | 3,4 | 2,7 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/m l Tre,F680.05 | - | 2,8 | 4,0 | 5,6 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 2,4 | 4,2 | 3,2 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,3 | 3,3 | 3,7 | 3,7 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 4,0 | 4,3 | 5,2 | 4,2 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 3,1 | 3,9 | 3,9 | 3,8 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 3,7 | 3,0 | 4,3 | 6,6 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,9 | - | - | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,5 | - | - | - |
表G.AUC测定获得的大凝聚物百分比%(25℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0(4周5℃) | 4周 | 8周 | 13周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 2,3 | 0,3 | 0,8 | 2,5 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 2,0 | 1,1 | 0,6 | 0,2 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 0,1 | 0,8 | 1,3 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | - | 0,4 | 1,3 | 0,2 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 1,2 | 0,9 | 0,9 | 0,9 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 1,1 | 1,6 | 1,2 | 0,7 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 1,5 | 1,9 | 1,1 | 1,1 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 1,9 | 1,5 | 2,6 | 3,6 |
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0(4周5℃) | 4周 | 8周 | 13周 | |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 1,9 | - | - | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 2,0 | - | - | - |
表H.AUC测定获得的二凝聚物百分比%(40℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0(4周5℃) | 2周 | 3周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 4,0 | - | 4,4 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,2 | - | 3,9 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | - | - | 5,3 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | - | - | - |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 3,3 | - | 6,4 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 4,0 | - | 7,0 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 3,1 | - | 6,0 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 3,7 | - | 6,4 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,9 | 4,9 | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 3,5 | 8,0 | - |
表I.AUC测定获得的大凝聚物百分比%(40℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0(4周5℃) | 2周 | 3周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 2,3 | - | 1,8 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 2,0 | - | 1,5 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | - | - | 2,0 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | - | - | - |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 1,2 | - | 2,8 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 1,1 | - | 2,6 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 1,5 | - | 3,0 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 1,9 | - | 3,9 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 1,9 | 5,8 | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 2,0 | 4,6 | - |
表J.SE-HPLC测定获得的蛋白含量(2-8℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 4周 | 6周 | 8周 | 12周 | 16周 | 26周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 64,7 | 64,2 | 66,3 | 63,2 | 66,9 | 66,0 | |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 69,8 | 62,2 | 67,3 | 62,1 | 67,6 | 63,1 | |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 62,1 | 64,7 | 66,4 | 63,7 | 65,7 | 64,4 | |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 90,7 | 91,5 | 91,8 | 89,1 | 96,8 | 92,5 | |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 92,6 | 97,7 | 99,8 | 87,7 | 92,9 | 92,4 | |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 96,1 | 91,8 | 94,3 | 90,4 | 92,8 | 93,5 | |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 94,7 | 100,4 | 95,7 | 91,2 | 93,3 | 90,4 | |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 89,0 | 98,6 | 90,6 | 89,0 | 93,3 | 88,8 | |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 94,3 | 99,5 | 88,8 | 100,0 | 91,5 | ||
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 96,9 | 85,2 | 93,3 | 99,6 | 98,2 |
表K.SE-HPLC测定获得的蛋白含量(25℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 2周 | 4周 | 6周 | 8周 | 12周 | 17周 | 27周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 64,7 | 61,6 | 66,8 | 67,5 | 65,3 | 68,3 | 63,3 | |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 69,8 | 60,0 | 63,2 | 66,1 | 63,4 | 64,7 | 62,7 | |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 62,1 | 59,0 | 64,1 | 66,8 | 64,5 | 64,4 | 62,9 | |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 90,7 | 99,5 | 89,6 | 94,9 | 91,6 | 94,3 | 89,4 | |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 92,6 | 85,0 | 91,0 | 98,0 | 92,0 | 95,6 | 82,1 | |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 96,1 | n.v. | 90,9 | 96,0 | 94,5 | 94,4 | 91,1 | |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 94,7 | 88,4 | 96,1 | 92,7 | 105,0 | 93,5 | 87,8 | |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 89,0 | 88,4 | 94,4 | 94,7 | 89,9 | 91,3 | 88,5 | |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 94,3 | 95,3 | 97,8 | 89,7 | 98,6 | 95,2 | ||
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 96,9 | 100,0 | 100,1 | 92,7 | 103,0 | 92,7 |
表L.SE-HPLC测定获得的蛋白含量(40℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 1w | 2周 | 4周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 64,7 | 64,9 | 60,9 | 67,1 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 69,8 | 64,5 | 59,8 | 66,9 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 62,1 | 63,8 | 61,2 | 65,2 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 90,7 | 89,3 | 85,7 | 91,4 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 92,6 | 90,5 | 86,2 | 88,6 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 96,1 | 93,5 | 85,1 | 90,7 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 94,7 | 88,6 | 85,6 | 97,8 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 89,0 | 93,0 | 83,9 | 96,5 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 94,3 | 92,0 | 91,2 | 99,7 |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 96,9 | 97,1 | 94,9 | 103,3 |
表M.pH值(2-8℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 4周 | 6周 | 8周 | 12周 | 16周 | 26周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | - | 5,1 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | - | 5,1 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,4 | 5,3 | 5,3 | 5,3 | 5,3 | - | 5,3 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,1 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | - | 5,0 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 5,1 | 5,0 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | - | 5,1 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,5 | 5,4 | 5,4 | 5,4 | 5,3 | - | 5,4 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | - | 5,1 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | - | 5,1 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 4,8 | 4,8 | 4,9 | 4,8 | - | 4,8 | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,2 | 5,2 | 5,3 | 5,2 | - | 5,2 | - |
表N.pH值(25℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 2周 | 4周 | 6周 | 8周 | 12周 | 17周 | 27周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 5,2 | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | - | 5,1 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 5,2 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | - | 5,1 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,4 | 5,4 | 5,3 | 5,3 | 5,3 | 5,4 | - | 5,3 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,1 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,1 | 5,1 | - | 5,0 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 5,1 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | - | 5,0 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,5 | 5,4 | 5,4 | 5,4 | 5,4 | 5,4 | - | 5,3 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | - | 5,1 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,1 | - | 5,1 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 4,8 | 4,8 | 4,8 | 4,9 | 4,9 | - | 4,9 | - |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,2 | 5,3 | 5,2 | 5,2 | 5,3 | - | 5,2 | - |
表O.pH值(40℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 时间0 | 1周 | 2周 | 4周 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 5,2 | 5,1 | 5,2 | 5,1 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,4 | 5,4 | 5,4 | 5,4 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,1 | 5,0 | 5,1 | 5,0 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 5,1 | 5,1 | 5,1 | 5,0 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,5 | 5,4 | 5,4 | 5,4 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 5,2 | 5,1 | 5,1 | 5,1 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 4,8 | 4,9 | 4,9 | 4,9 |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 5,2 | 5,3 | 5,3 | 5,3 |
表P.重量克分子渗透浓度(OSM/kg)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0 | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 0,444 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 0,359 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/m l Tre,F680.05 | 0,359 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 0,409 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 0,414 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 0,414 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 0,445 |
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | T=0 | |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 0,438 |
21I | 100 | pH 4.8,80mg/ml Tre,F680.05 | 0,388 |
21L | 100 | pH 5.2,80mg/ml Tre,F680.05 | 0,368 |
表Q.生物学试验(U/ml)(2-8℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 期望值 | 时间0 | 4周 | 8周 | 13w | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 350000 | 347704 | 365778 | 319050 | 387896 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 350000 | 336185 | 318012 | 289824 | 357861 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 350000 | 323222 | 333715 | 306941 | 335181 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 500000 | 461204 | 452442 | 431738 | 489743 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 500000 | 458617 | 439084 | 435680 | 470251 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 500000 | 455676 | 470037 | 407200 | 424278 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 500000 | 494293 | 543338 | 401277 | 445267 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 500000 | 471667 | 446056 | 387503 | 445371 |
表R.生物学试验(U/ml)(25℃)
TACI-Fc5(mg/ml) | 组成 | 期望值 | 时间0 | 4周 | 8周 | 13w | |
21A | 70 | pH 5,96mg/ml Tre,F680.05 | 350000 | 347704 | 311541 | 279159 | 304644 |
21B | 70 | pH 5,80mg/ml Tre | 350000 | 336185 | 302066 | 268469 | 342827 |
21C | 70 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 350000 | 323222 | 315938 | 269441 | 318150 |
21D | 100 | pH 5,80mg/ml Tre,F680.05 | 500000 | 461204 | 508830 | 431335 | 418713 |
21E | 100 | pH 5,80mg/ml Tre | 500000 | 458617 | 441768 | 396159 | 405400 |
21F | 100 | pH 5.4,80mg/ml Tre,F680.05 | 500000 | 455676 | 449141 | 387455 | 476384 |
21G | 100 | pH 5,51mg/ml Man,F680.05 | 500000 | 494293 | 496542 | 433228 | 440685 |
21H | 100 | pH 5,51mg/ml Man | 500000 | 471667 | 465114 | 365910 | 433696 |
表S.C-末端截短
样品 | 稳定时间 | 截短的 |
S128/L20a批量 | - | 95.0% |
样品 | 稳定时间 | 截短的 |
21E | 8个月2-8℃ | 95.3% |
21E | 8个月25℃ | 94.7% |
表T.修剪形式
样品 | 稳定时间 | 峰1(Fc片段) | 峰2+3 | 峰4(完整) | 总修剪 |
S128/L20a批量 | - | 4.2% | 14.0% | 81.8% | 18.2% |
21E | 10个月2-8℃ | 4.5% | 15.0% | 80.5% | 19.5% |
21E | 10个月25℃ | 8.2% | 37.5% | 54.3% | 45.7% |
主要结果总结
分子大小排阻色谱法
在25℃,70mg/ml制剂就凝聚率而言,其斜率(%凝聚/月)通常比100mg/ml组低。在后一组中,制剂21D和21E显示的斜率最低。40℃时,在100mg/ml液体制剂组中,制剂21E显示的斜率值最低。
AUC
在2-8℃和25℃,未观察到制剂21E的AUC状态有所改变,而70mg/ml制剂检测到在整个稳定期间(研究)中单体倾向增多。
用CD监测的去折叠
在100mg/ml制剂组中,制剂21E显示最高的Tunf,pH值不同于导致较低Tunf的5.0。70mg/ml制剂则显示较高的Tunf值(即稳定性较好)。
内荧光
在40℃,检测到70mg/ml各制剂及100mg/ml组备选制剂21E的最大发射光波长有微小变化。
RALS
40℃贮存后,pH不同于“最适pH”5.0的制剂其RALS有显著增高。含甘露醇制剂的散射光值高于其它制剂。制剂21A、21B、21D和21E是显示较低散射光值的制剂。2-8℃贮存后,它们都不显示任何散射光的增加。
荧光发射光的各向异性
制剂21A和21B于40℃贮存(1个月)后,未观察到各向异性的变化。制剂21F和21H有相关改变,其它制剂观察到处于二者之间的变化。
动态光散射
在2-8℃未检测到大小分布有相关改变。25℃贮存后观察到较大颗粒有所减少。40℃贮存后,除了含甘露醇的制剂和pH不同于5.0的制剂外,所有制剂中分子量较高物质无显著增加。
去折叠的自由能
100mg/ml制剂组中,制剂21D和21E观察到较高的热动力学稳定性。
生物学试验
25℃和40℃贮存3个月未见生物学活性降低。
总体结论
对液体制剂的预筛选研究表明,使70mg/ml TACI-Fc5溶液稳定的最佳pH为约5.0。pH值越高,出现凝聚现象(用SE-HPLC评价)和浓度下降(用RP-HPLC和光密度估计)越强烈。盐的存在(如NaCl、CaCl2和MgCl2)也导致凝聚增加。如在不同缓冲液中(pH=4.0与5.0相比较)的园二色构象研究所示,低于5的pH值不是最适pH。DSC初步研究表明海藻糖和蔗糖对分子稳定性(即在较高去折叠温度时)有某种正面影响。
实验设计阶段目的在于研究溶于pH=5.0乙酸盐或组氨酸缓冲液(也试验不同缓冲强度)的几种辅料在存在表面活性剂如F-68和吐温20时的作用。存在甘露醇或山梨醇时低浓度的乙酸盐缓冲液为样品提供了较高的抗降解稳定性。在稳定蛋白质上,F-68看来比吐温20更有效。
荧光和动态光散射检测与这些结果相一致。
以实验室规模制备70mg/ml和100mg/ml浓度的TACI-Fc候选样品。用海藻糖和甘露糖作辅料(存在乙酸钠缓冲液,pH=4.8、5.0、5.2和5.4)。用SE-HPLC和AUC及几种分光光度法监测候选制剂随时间的变化。
此研究结果是,蛋白浓度越低导致的凝聚也越少。证实最佳pH为5.0。对于稳定TACI-Fc制剂,海藻糖比甘露醇更成功。在100mg/mlTACI-Fc候选制剂中,制剂21E(10mM NaAc,pH=5.0,80mg/ml无水海藻糖)显示了对40℃凝聚更强的抵抗力(2-8℃检测的凝聚无统计学相关的增多)。更精确地说,2-8℃候选液体制剂21E在26周内纯度提高1.4%。25℃时其纯度只降低1%(26周)。
用RP-HPLC分析检测了候选制剂21E(2-8℃和25℃,10个月)的全部修剪形式,与起始原料药(约19%)相比,修剪形式的含量无变化。发现C-末端截短物约95%,与起始原料药相似,此水平的截短常见于人抗体。
也用RP-MALDI分析了液体候选制剂21E(2-8℃和25℃贮存10个月)中氧化形式的含量,与制备此制剂的基础原料药相比,未见贮存期氧化形式的显著改变(约2.4%)。
实施例2:TACI-Fc与抑菌剂的相容性
目的
此研究的目的是评估多剂量制剂中TACI-Fc与不同抑菌剂的相容性。检测了以下抑菌剂:0.9%苯甲醇、0.3%间甲酚、0.5%苯酚、0.5%三氯叔丁醇、0.5%苯基乙醇、0.3%苯甲醇+0.001%苯扎氯铵。
主要结果
药品+抑菌剂:
-有防腐剂存在的药品与参比样品(不加抑菌剂)相比,40℃存贮存2周后,观察到总凝聚物(用SEC)增多(15-70%);25℃和2-8℃时观察到降解速率可比。
-提供了最少负面影响(根据SEC和CD分析)的抑菌剂是苯甲醇+苯扎氯铵。
液体候选制剂+抑菌剂:
-在TACI-Fc液体候选制剂(乙酸盐、pH5.0,海藻糖)中加入防腐剂导致的凝聚显著低于药品所导致的凝聚(40℃,2周后约10-25%)。这表明海藻糖有效地防止了天然二级结构的凝聚和损失(远紫外CD实验证明)。
-存在防腐剂的制剂组中,就凝聚率而言,苯甲醇+苯扎氯铵联用提供了最佳结果。
结论
评价了几种抑菌剂对TACI-Fc药品(原批量装)和用pH 5.0乙酸钠和海藻糖配制的100mg/ml TACI-Fc制剂中蛋白质完整性的影响。
包含任何这些抑菌剂对蛋白质的完整性均有负面影响,特别是对原批量装药品。0.3%苯甲醇+0.001%苯扎氯铵联用成为对蛋白质结构有害作用最小的。
实施例3:TACI-Fc液体候选制剂在预装填针筒中的稳定性
目的
此研究的目的是评估在用两种橡皮塞塞住的1ml Hypak针筒(W4023/50和W4023/50G,FluroTec公司)中充装的100mg/ml TACI-Fc液体制剂(乙酸钠,海藻糖,pH5.0)的稳定性。
主要结果
对充装在用涂层塞子(W4023/50G Fluro Tec公司)和无涂层塞子(W4023/50G)塞住的1ml玻璃针筒中TACI-Fc100mg/ml进行6个月的检测,结果小结如下:
-二聚体和HMW:40℃(每周增加1.6%)和25℃(每月增加0.5%)的降解速率是可比的。2-8℃观察到的表现稍有不同,虽然并不明显影响总体稳定性:两种不同生产批号每月增加0.2%和0.1%;
-蛋白质含量:蛋白质含量在贮存期未见减少;
-修剪形式:检测到与小瓶中产品可比水平的剪接形式(2-8℃时与药品相比不增加,25℃5个月后约增加40%);
-生物效能:生物学活性保持直到3个月(2-8℃和25℃);
-pH:贮存期未见pH变化。
结论
充装在1ml Hypak针筒中的100mg/ml TACI-Fc液体制剂(乙酸钠+海藻糖,pH5.0)是稳定的。此研究评价的两种橡皮塞(W4023/50和W4023/50GFluroTec公司)是等价的,均不影响该液体制剂的稳定性。
实施例4:装在预充装针筒中的不同强度ATACICEPT的稳定性
评估了装在预充装针筒中的不同强度atacicept的稳定性。按实施例1中报告的方法进行。
受试样品的组合物如下:
批次编号 | Ataciceptmg/ml | 缓冲液 | 海藻糖二水合物mg/ml |
Atacicept 25/1 | 25 | 10mM乙酸钠,pH 5 | 88.4 |
Atacicept 75/1 | 75 | 10mM乙酸钠,pH 5 | 88.4 |
Atacicept 150/1 | 150 | 10mM乙酸钠,pH 5 | 88.4 |
Atacicept 25/1.2 | 20.5 | 10mM乙酸钠,pH 5 | 88.4 |
Atacicept 150/1.2 | 125 | 10mM乙酸钠,pH 5 | 88.4 |
稳定性研究的结果报告见以下表U-Z。
表U.SE-HPLC检测的纯度%
5℃贮存1、2、3、6、9、12和18个月后:
25℃贮存1、2、3和6个月后:
表V.SE-HPLC测定的蛋白含量(mg/ml)
5℃贮存1、2、3、6、9、12和18个月后:
0时 | 1个月+5℃ | 2个月+5℃ | 3个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 23.9 | 27.9 | 22.7 | 21.9 |
Atacicept 75/1 | 75.0 | 80.4 | 77.9 | 76.6 |
Atacicept 150/1 | 150.0 | 165.5 | 160.2 | 161.0 |
Atacicept 25/1.2 | 21.8 | 24.3 | 23.6 | 22.0 |
Atacicept 150/1.2 | 138.1 | 138.4 | 144.9 | 148.5 |
6个月+5℃ | 9个月+5℃ | 12个月+5℃ | 18个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 25.1 | 24.9 | 26.1 | 25.2 |
Atacicept 75/1 | 80.1 | 78.8 | 77.2 | |
Atacicept 150/1 | 156.5 | 152.0 | 157.9 | 152.1 |
Atacicept 25/1.2 | 22.3 | 21.3 | 22.2 | 21.6 |
Atacicept 150/1.2 | 136.3 | 134.1 | 132.4 | 126.1 |
25℃贮存1、2、3和6个月后
0时 | 1个月+25℃ | 2个月+25℃ | 3个月+25℃ | 6个月+25℃ | |
Atacicept 25/1 | 23.9 | 28.0 | 21.5 | 21.9 | 25.1 |
Atacicept 75/1 | 75.0 | 80.1 | 77.4 | 73.5 | 79.8 |
Atacicept 150/1 | 150.0 | 163.8 | 165.5 | 162.8 | 152.2 |
Atacicept 25/1.2 | 21.8 | 22.9 | 23.4 | 21.3 | 21.6 |
Atacicept 150/1.2 | 138.1 | 141.6 | 137.2 | 147.7 | 128.6 |
40℃贮存1、2和4周后
0时 | 1周+40℃ | 2周+40℃ | 4周+40℃ | |
Atacicept 75/1 | 75.0 | 71.7 | 71.9 | 71.8 |
表W.修剪形式(%)
5℃贮存1、2、3、6、9、12和18个月后:
0时 | 1个月+5℃ | 2个月+5℃ | 3个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 11.0 | 12.8 | 12.8 | 12.5 |
Atacicept 75/1 | 11.6 | 13.8 | 12.1 | 13.0 |
Atacicept 150/1 | 11.5 | 12.3 | 13.5 | 13.1 |
Atacicept 25/1.2 | 12.7 | 12.7 | 12.8 | 13.5 |
Atacicept 150/1.2 | 12.3 | 13.0 | 12.5 | 14.1 |
6个月+5℃ | 9个月+5℃ | 12个月+5℃ | 18个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 14.1 | 14.7 | 15.4 | 18.4 |
Atacicept 75/1 | 13.5 | 15.4 | 16.7 | |
Atacicept 150/1 | 14.3 | 16.1 | 16.7 | 19.3 |
Atacicept 25/1.2 | 15.9 | 15.8 | 16.9 | 18.5 |
Atacicept 150/1.2 | 15.4 | 16.5 | 18.6 | 18.7 |
25℃贮存1、2、3和6个月后:
0时 | 1个月+25℃ | 2个月+25℃ | 3个月+25℃ | 6个月+25℃ | |
Atacicept 25/1 | 11.0 | 17.5 | 20.1 | 25.8 | 32.8 |
Atacicept 75/1 | 11.6 | 17.4 | 20.4 | 24.1 | 33.8 |
Atacicept 150/1 | 11.5 | 18.3 | 21.7 | 26.7 | 35.1 |
Atacicept 25/1.2 | 12.7 | 16.7 | 20.6 | 25.4 | 34.9 |
0时 | 1个月+25℃ | 2个月+25℃ | 3个月+25℃ | 6个月+25℃ | |
Atacicept 150/1.2 | 12.3 | 17.1 | 22.1 | 26.7 | 37.3 |
表X.IEC-HPLC检测的游离Fc%
5℃贮存1、2、3、6、9、12和18个月后:
0时 | 1个月+5℃ | 2个月+5℃ | 3个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | - | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
Atacicept 75/1 | 0.09 | 0.14 | 0.14 | 0.11 |
Atacicept 150/1 | - | 0.09 | 0.09 | 0.10 |
Atacicept 25/1.2 | 0.09 | 0.08 | 0.09 | 0.09 |
Atacicept 150/1.2 | 0.08 | 0.09 | 0.11 | 0.13 |
6个月+5℃ | 9个月+5℃ | 12个月+5℃ | 18个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 0.18 | 0.13 | 0.12 | 0.12 |
Atacicept 75/1 | 0.12 | 0.13 | 0.12 | |
Atacicept 150/1 | 0.19 | 0.16 | 0.15 | 0.16 |
Atacicept 25/1.2 | 0.11 | 0.11 | 0.12 | 0.11 |
Atacicept 150/1.2 | 0.13 | 0.17 | 0.15 | 0.16 |
25℃贮存1、2、3和6个月后:
0时 | 1个月+25℃ | 2个月+25℃ | 3个月+25℃ | 6个月+25℃ | |
Atacicept 25/1 | - | 0.17 | 0.22 | 0.40 | 0.77 |
Atacicept 75/1 | 0.09 | 0.25 | 0.39 | 0.43 | 0.72 |
Atacicept 150/1 | - | 0.20 | 0.32 | 0.52 | 0.87 |
Atacicept 25/1.2 | 0.09 | 0.13 | 0.30 | 0.49 | 0.70 |
Atacicept150/1.2 | 0.08 | 0.18 | 0.38 | 0.51 | 0.81 |
表Y.生物学活性(U/ml)
5℃贮存1、2、3、6、9、12和18个月后:
0时 | 1个月+5℃ | 2个月+5℃ | 3个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 140213 | 137160 | 134504 | 135542 |
Atacicept 75/1 | 423184 | 410261 | 379575 | 374383 |
Atacicept 150/1 | 836070 | 774584 | 754834 | 819172 |
Atacicept 25/1.2 | 111981 | 115990 | 126041 | 121648 |
Atacicept 150/1.2 | 646679 | 642858 | 743090 | 694864 |
6个月+5℃ | 9个月+5℃ | 12个月+5℃ | 18个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 126923 | 147341 | 130609 | 108207 |
Atacicept 75/1 | 363668 | 468484 | 346080 |
6个月+5℃ | 9个月+5℃ | 12个月+5℃ | 18个月+5℃ | |
Atacicept 150/1 | 814539 | 843419 | 809840 | 565084 |
Atacicept 25/1.2 | 114946 | 123750 | 106004 | 113312 |
Atacicept 150/1.2 | 645404 | 714223 | 620301 | 550851 |
25℃贮存1、2、3和6个月后:
0时 | 1个月+25℃ | 2个月+25℃ | 3个月+25℃ | 6个月+25℃ | |
Atacicept 25/1 | 140213 | 134212 | 124601 | 132349 | 118224 |
Atacicept 75/1 | 423184 | 387654 | 336790 | 365202 | 327925 |
Atacicept 150/1 | 836070 | 776645 | 719725 | 760795 | 677110 |
Atacicept 25/1.2 | 111981 | 114068 | 117615 | 114296 | 103328 |
Atacicept 150/1.2 | 646679 | 694993 | 696945 | 606957 | 586586 |
表Z.pH测定
5℃贮存1、2和3个月后:
0时 | 1个月+5℃ | 2个月+5℃ | 3个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 5.0 | 5.0 | 4.9 | 4.9 |
Atacicept 75/1 | 5.1 | 5.1 | 5.1 | 5.1 |
Atacicept 150/1 | 5.0 | 5.1 | 5.0 | 4.9 |
Atacicept 25/1.2 | 5.0 | 4.9 | 4.9 | 4.8 |
0时 | 1个月+5℃ | 2个月+5℃ | 3个月+5℃ | |
Atacicept 150/1.2 | 5.0 | 5.0 | 4.9 | 4.9 |
6个月+5℃ | 9个月+5℃ | 12个月+5℃ | 18个月+5℃ | |
Atacicept 25/1 | 5.0 | 4.9 | 5.1 | 4.9 |
Atacicept 75/1 | 5.0 | 5.1 | 5.1 | |
Atacicept 150/1 | 5.1 | 5.0 | 5.2 | 5.0 |
Atacicept 25/1.2 | 4.9 | 4.9 | 5.0 | 5.0 |
Atacicept 150/1.2 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
25℃贮存1、2、3和6个月后:
0时 | 1个月+25℃ | 2个月+25℃ | 3个月+25℃ | 6个月+25℃ | |
Atacicept 25/1 | 5.0 | 4.9 | 4.9 | 4.9 | 5.0 |
Atacicept 75/1 | 5.1 | 5.1 | 5.1 | 5.1 | 5.1 |
Atacicept 150/1 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 4.9 | 5.1 |
Atacicept 25/1.2 | 5.0 | 4.9 | 4.9 | 4.8 | 4.9 |
Atacicept 150/1.2 | 5.0 | 5.0 | 4.9 | 4.9 | 5.0 |
实施例5.BLYS拮抗剂的制备
制备了4种氨基酸末端截短的TACI-Fc。这4种都含有融合于SEQ IDNO:6的氨基酸残基30的修饰的人组织纤维蛋白溶解酶原激活剂序列(如WO 02/094852(SEQ ID NO:25)所揭示的)。然而,这4种蛋白中的“Fc5”融合于SEQ ID NO:6的TACI氨基酸序列的位点不同。表1概括了这4种融合蛋白的结构。
表1.TACI-Fc融合蛋白
TACI-Fc蛋白的名称 | TACI氨基酸残基 |
TACI(d1-29)-Fc5 | SEQ ID NO:6的30-154氨基酸 |
TACI(d1-29,d107-154)-Fc5 | SEQ ID NO:6的30-106氨基酸 |
TACI(d1-29,d111-154)-Fc5 | SEQ ID NO:6的30-110氨基酸 |
TACI(d1-29,d120-154)-Fc5 | SEQ ID NO:6的30-119氨基酸 |
采用标准技术通过重叠PCR制备了编码蛋白的表达盒(参见,例如Horton等,1989)。采用编码TACI的核酸分子和编码Fc5的核酸分子作为PCR模板。表2和3为其鉴定的寡核苷酸引物。
表2.用于制备TACI融合蛋白的寡核苷酸引物
表3.寡核苷酸的序列
引物 | 核苷酸序列 | SEQ IDNO. |
ZC24,903 | 5′TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3′ | 15 |
ZC24,955 | 5′TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3′ | 16 |
引物 | 核苷酸序列 | SEQ IDNO. |
ZC24,952 | 5′TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3′ | 17 |
ZC24,946 | 5′TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3′ | 18 |
ZC24,951 | 5′TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3′ | 19 |
ZC24,949 | 5′ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3′ | 20 |
ZC28,978 | 5′TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3′ | 21 |
ZC28,979 | 5′CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3′ | 22 |
ZC28,981 | 5′TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3′ | 23 |
ZC28,980 | 5′GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3′ | 24 |
第一轮PCR扩增包括4种氨基末端截短物各自的二次反应。分别进行这二次反应,一次反应用5’和3’TACI寡核苷酸。另一次反应用各自的5’和3’Fc5寡核苷酸。第一轮PCR扩增的条件如下:加入约200ng模板DNA、2.5μl 10xPfu反应缓冲液(Stratagene)、2μl的2.5mMdNTP、0.5μl的20μM各种5′寡核苷酸和3′寡核苷酸及0.5μl Pfu聚合酶(2.5单位,Stratagene)至终体积25μl。扩增的温度设置为94℃3分钟,35轮94℃15秒,50℃15秒,72℃2分钟,再于72℃延伸2分钟。用琼脂糖凝胶电泳分离反应产物,用QIAGEN QIAQUICK凝胶抽提试剂盒(Qiagen公司)按照厂商说明书从凝胶中切割并回收对应于预计大小的条带。
用第一轮PCR凝胶纯化的片段作为DNA模板,进行第二轮PGR扩增或重叠PCR扩增反应。第二轮PCR扩增的条件如下:加入约10ng TACI片段和Fc5片段各自的模板DNA、2.5μl 10xPfu反应缓冲液(Stratagene)、2μl的2.5mMdNTP、0.5μl的20μM ZC24,903(SEQ ID NO:15)和ZC24,946(SEQ ID NO:18)及0.5μl Pfu聚合酶(2.5单位,Stratagene)至终体积25μl。扩增的温度设置为94℃1分钟,35轮94℃15秒、55℃15秒、72℃2分钟,再72℃延伸2分钟。用琼脂糖凝胶电泳分离反应产物,用QIAGENQIAQUICK凝胶抽提试剂盒(Qiagen公司)按照厂商说明书从凝胶中切割并回收对应于预计大小的条带。
用Invitrogen公司的ZEROBLUNT TOPO PCR克隆试剂盒按厂商推荐的方案分别分离4种氨基末端截短的TACI-Fc PCR产物。表4是这些TACI-Fc构建物的核苷酸和氨基酸序列。
表4.TACI-Fc变体的序列
验证核苷酸序列后,用Fsel和Ascl消化包含4种氨基末端截短TACI-Fc融合核酸的各自质粒,以释放编码氨基酸的区段。将Fsel-Ascl消化片段连接入含CMV启动子和SV40聚A区段的哺乳动物表达载体中。如下所述将该表达载体引入中国仓鼠卵巢细胞中。
实施例6.用中国仓鼠卵巢细胞生产TACI-Fc蛋白
通过电穿孔用TACI-Fc表达构建物转染已适应悬浮生长的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)DG44细胞,用无动物蛋白的培养基(Urlaub等,1986)培养。CHO DG44细胞由于染色体的二氢叶酸还原酶有2个位置缺失而缺乏功能性二氢叶酸还原酶基因。在递增浓度甲氨喋呤的存在下培养细胞,导致该表达构建物中二氢叶酸还原酶基因和与之相连的编码重组蛋白基因的扩增。
在PFCHO培养基(JRH Biosciences公司,Lenexa,KS)、4mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences公司)和1x次黄嘌呤-胸苷添加物(LifeTechnologies公司)中将CHO DG44细胞传代。在旋转振荡平台上的Corning摇瓶中于37℃和5%CO2条件下以120rpm转动培养细胞。分别用线性化的表达质粒转染细胞。为确保无菌,在冰上的Eppendorf小管中将200μg质粒DNA与20μL剪切的硅鱼精子载体DNA(5′→3′Inc.Boulder公司,10mg/ml)、22μL的3M NaOAc(pH5.2)和484μL的100%乙醇(GoldShield Chemical公司,Hayward,CA)混合,进行一次乙醇沉淀步骤25分钟。培育后,用放在4℃冷室中的微量离心机于14,000rpm将小管离心,弃去上清液,用0.5ml 70%乙醇将沉淀洗涤2次,空气干燥。
在DNA沉淀干燥的同时,将25ml锥形离心管中总共106个细胞于900rpm离心5分钟,制备CHO DG44细胞。将CHO DG44细胞重悬于总体积300μl的PFCHO生长培养基中,放入有0.4cm电极间隙的基因-脉冲小杯(Bio-Rad)中。干燥约50分钟时间后,将DNA重悬浮于500μl的PFCHO生长培养基,加入小杯的细胞中,使总体积不超过800μl,置于室温下5分钟以减少气泡形成。将小杯置于BioRad基因脉冲器II单元中立即电穿孔,电穿孔的设置为0.296kV(千伏)和0.950HC(高电容)。
将细胞室温培育5分钟,然后置于CoStar T-75培养瓶总体积20ml的PFCHO培养基中。将培养瓶置于37℃和5%CO2培养48小时,用台盼兰排除法染色以血球计对细胞计数后,将细胞放入无次黄嘌呤-胸苷添加物而含200mM甲氨喋呤(Cal Biochem公司)的PFCHO选择培养基中。
甲氨喋呤选择处理回收后,用Western印染分析检查含所分泌的TACI-Fc蛋白的条件培养基。
参考文献
Altschul S F等,J Mol Biol,215,403-410,1990。
Altschul S F等,NucleicAcids Res.,25:389-3402,1997。
Armour KL等,1999.“缺乏Fcγ受体1结合和单核细胞触发活性的重组人IgG分子”Eur J Immunol.29(8):2613-24。
Canfield SM,Morrison SL.“人IgG与其高亲和Fc受体的结合亲和力由CH2区中多个氨基酸决定并受绞链区的调节”.J Exp Med 1991;173:1483-1491.
Cheema等,Arthritis Rheum 2001;44(6):1313-1319。
Devereux J等,Nucleic Acids Res,12,387-395,1984。
Do RKG,Hatada E,Lee H,Tourigny MR,Hilbert D,Chen-Kiang S.“基于B细胞刺激剂对体液免疫应答的增强而使细胞凋亡减弱”.J Exp Med2000;192(7):953-964。
Duncan等,Nature 332:563(1988)。
Grantham等,Science,Vol.185,pp.862-864(1974)。
Groom等,J Clin Invest 2002;109(I):59-68;Mariette X,Ann Rheum Dis2003;62(2):168-171。
Gross等,Nature 2000;404:995-999。
Horton等,Gene 77:61(1989)。
Kabat EA,Glusman M,Knaub V.“用免疫化学方法定量检测正常和病理脑脊液中的白蛋白和Y球蛋白”.Am J Med 1948;4:653-662。
Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.,and Foeller,C.(1991),“免疫学感兴趣蛋白质的序列”.第5版,国立卫生研究院,Bethesda,MD。
Kalled SL.“BAFF在免疫功能中的作用和与自身免疫的关联”.Immunol Rev2005;204:43-54。
Mackay等,J Exp Me 1999;190(11);1697-1710。
Marsters SA,Yan M,Pitti RM,Haas PE,Dixit VM,Ashkenazi A.“TNF同源物BLyS和APRIL与TNF受体同源物BCMA和TACI的相互作用”.CurrBiol 2000;10(13):785-788。
Moore等,Science 1999;285(5425):260-263;Schneider等,J Exp Med1999;189(11):1747-1756。
Do等,J E×p Med 2000;192(7):953-964。
Pearson,Methods Enzymol.1990;183:63-98.
Roschke V,Sosnovtseva S,Ward CD,Hong JS,Smith R,Albert V等,“BLyS和APRIL形成的生物学活性异质三聚体在全身性免疫风湿疾病患者中的表达”.J Immunol 2002;169:4314-4321。
Rudick等,Neurology 2001;56:1324-1330。
Schneider P,Mackay F,Steiner V,Hofmann K,Bodmer J-L,Holler N.“一种肿瘤坏死因子家族的新配体BAFF能刺激B细胞生长”.J E×p Med1999;189(11):1747-1756。
Shields RL.等,2001.“人IgG1的FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn结合位点的高分辨图谱和具有改进的FcγR结合能力的IgG1变体的设计”.J Biol Chem.276(9):6591-604.
Soderstrom M,Link H,Xu Z,Fredriksson S.“视神经和多发性硬化症:抗-MBP和抗-MBP肽抗体分泌细胞在CSF中的累积”.Neurology 1993;43:1215-1222。
Sondermann等,Nature 406:267(2000)。
Tao M-H,Smith RIF,Morrison S L.“人免疫球蛋白IgG的结构特征决定了补体激活的同种型差异”.J Exp Med 1993;178:661-667。
Thangarajh M,Gomes A,Masterman T,Hillert J,Hjelmstrom P.“多发性硬化症中TNF家族B细胞活化因子(BAFF)及其受体的表达”JNeuroimmunol 2004;152:183-190。
Thompson JS,Bixler SA,Qian F,Vora K,Scott ML,Cachero TG.BAFF-R,“一种新鉴定的能与BAFF特异性相互作用的TNF受体”Science 2001;293:2108-2111。
Urlaub等,Som.Cell.Molec.Genet.12:555(1986)。
Wines等,J.Immunol.164:5313(2000)。
序列表
<110>阿雷斯贸易股份有限公司
<120>TACI-免疫球蛋白融合蛋白制剂
<130>101966PWCN
<150>EP 07120489.5
<151>2007-11-12
<150>EP 07120490.3
<151>2007-11-12
<150>US 61/002,988
<151>2007-11-14
<150>US 61/003,028
<151>2007-11-14
<150>US 61/072,038
<151>2008-03-27
<150>EP 08005923.1
<151>2008-03-27
<160>25
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp
1 5 10 15
Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg
20 25 30
Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met
35 40 45
Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala
50 55 60
Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp
65 70 75 80
His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His
85 90 95
Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val
100 105 110
Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn
115 120 125
Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Gly His Arg Gly Ser
130 135 140
Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asn Gln Val
145 150 155 160
Ala Leu Val Tyr Ser Thr
165
<210>2
<211>232
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210>3
<211>313
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr
20 25 30
Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys
35 40 45
Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys
50 55 60
Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
85 90 95
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
100 105 110
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
115 120 125
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
130 135 140
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
145 150 155 160
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
165 170 175
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
195 200 205
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
210 215 220
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
225 230 235 240
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
245 250 255
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
260 265 270
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
275 280 285
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
290 295 300
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305 310
<210>4
<211>762
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(7)..(759)
<400>4
ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro
1 5 10
aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 96
Arg Trp Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
15 20 25 30
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 144
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35 40 45
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 192
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
50 55 60
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 240
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
65 70 75
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
80 85 90
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 336
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
95 100 105 110
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
115 120 125
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 432
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
130 135 140
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
145 150 155
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 528
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
160 165 170
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 576
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
175 180 185 190
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
195 200 205
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 672
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
210 215 220
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
225 230 235
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 762
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
240 245 250
<210>5
<211>251
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
20 25 30
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
35 40 45
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
50 55 60
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
65 70 75 80
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
85 90 95
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
100 105 110
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
115 120 125
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
130 135 140
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
165 170 175
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
180 185 190
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
195 200 205
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
210 215 220
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
225 230 235 240
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245 250
<210>6
<211>293
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp
1 5 10 15
Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg
20 25 30
Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met
35 40 45
Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala
50 55 60
Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp
65 70 75 80
His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His
85 90 95
Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val
100 105 110
Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn
115 120 125
Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser
130 135 140
Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gln Val
145 150 155 160
Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys
165 170 175
Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro
180 185 190
Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser
195 200 205
Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro
225 230 235 240
Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala
245 250 255
Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro Cys Pro
260 265 270
His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala Gln Glu
275 280 285
Gly Gly Pro Gly Ala
290
<210>7
<211>1214
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(17)..(1192)
<400>7
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
1 5 10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc 100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
15 20 25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
30 35 40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
45 50 55 60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc 244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
65 70 75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc 292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
80 85 90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
95 100 105
ttc tgt gag aac aag ctc agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc 388
Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu
110 115 120
agg aga cag cgg agt gga gaa gtt gaa aac aat tca gac aac tcg gga 436
Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly
125 130 135 140
agg tac caa gga ttg gag cac aga ggc tca gaa gca agt cca gct ctc 484
Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu
145 150 155
cca ggt ctc aag gag ccc aaa tct tca gac aaa act cac aca tgc cca 532
Pro Gly Leu Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
160 165 170
ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc 580
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
175 180 185
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc 628
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
190 195 200
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 676
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
205 210 215 220
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 724
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
225 230 235
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc 772
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
240 245 250
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 820
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
255 260 265
tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc 868
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
270 275 280
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 916
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
285 290 295 300
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 964
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
305 310 315
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg 1012
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
320 325 330
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1060
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
335 340 345
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 1108
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
350 355 360
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1156
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
365 370 375 380
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatctagag 1202
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385 390
gcgcgccaat ta 1214
<210>8
<211>392
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
20 25 30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
35 40 45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
50 55 60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65 70 75 80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
100 105 110
Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg
115 120 125
Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys
145 150 155 160
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
180 185 190
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
195 200 205
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
210 215 220
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
245 250 255
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
260 265 270
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
275 280 285
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
305 310 315 320
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
325 330 335
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
340 345 350
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
355 360 365
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
370 375 380
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385 390
<210>9
<211>1070
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(17)..(1048)
<400>9
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
1 5 10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc 100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
15 20 25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
30 35 40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
45 50 55 60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc 244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
65 70 75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc 292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
80 85 90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
95 100 105
ttc tgt gag aac gag ccc aaa tct tca gac aaa act cac aca tgc cca 388
Phe Cys Glu Asn Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
110 115 120
ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc 436
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
125 130 135 140
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc 484
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 532
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
160 165 170
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 580
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
175 180 185
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc 628
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
190 195 200
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 676
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
205 210 215 220
tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc 724
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 772
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
240 245 250
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 820
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
255 260 265
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg 868
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
270 275 280
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 916
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
285 290 295 300
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag 964
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
305 310 315
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1012
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
320 325 330
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatctagag 1058
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
335 340
gcgcgccaat ta 1070
<210>10
<211>344
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
20 25 30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
35 40 45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
50 55 60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65 70 75 80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
100 105 110
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210>11
<211>1082
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(17)..(1060)
<400>11
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
1 5 10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc 100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
15 20 25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
30 35 40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
45 50 55 60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc 244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
65 70 75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc 292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
80 85 90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
95 100 105
ttc tgt gag aac aag ctc agg agc gag ccc aaa tct tca gac aaa act 388
Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
110 115 120
cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca 436
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser
125 130 135 140
gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 484
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155
acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 532
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
160 165 170
gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 580
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
175 180 185
aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc 628
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
190 195 200
agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 676
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
205 210 215 220
aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc 724
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
225 230 235
atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 772
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
240 245 250
ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 820
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
255 260 265
ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 868
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
270 275 280
aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 916
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
285 290 295 300
tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc 964
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315
agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 1012
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
320 325 330
ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1060
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
335 340 345
taatctagag gcgcgccaat ta 1082
<210>12
<211>348
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
20 25 30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
35 40 45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
50 55 60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65 70 75 80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
100 105 110
Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145 150 155 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
165 170 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
180 185 190
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
195 200 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
210 215 220
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
245 250 255
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
260 265 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
275 280 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
290 295 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
305 310 315 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
325 330 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210>13
<211>1109
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(17)..(1090)
<400>13
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
1 5 10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc 100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
15 20 25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
30 35 40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
45 50 55 60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc 244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
65 70 75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc 292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
80 85 90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
95 100 105
ttc tgt gag aac aag ctc agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc 388
Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu
110 115 120
agg gag ccc aaa tct tca gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 436
Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
125 130 135 140
gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 484
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 532
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
160 165 170
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 580
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
175 180 185
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 628
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
190 195 200
cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 676
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
205 210 215 220
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 724
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235
gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 772
Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
240 245 250
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 820
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
255 260 265
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 868
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
270 275 280
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 916
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
285 290 295 300
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 964
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 1012
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
320 325 330
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 1060
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
335 340 345
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa tctagaggcg cgccaatta 1109
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
350 355
<210>14
<211>357
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
20 25 30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
35 40 45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
50 55 60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65 70 75 80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
85 90 95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
100 105 110
Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
130 135 140
Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser
225 230 235 240
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>15
tattaggccg gccaccatgg atgcaatga 29
<210>16
<211>29
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>16
tgaagatttg ggctccttga gacctggga 29
<210>17
<211>29
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>17
tcccaggtct caaggagccc aaatcttca 29
<210>18
<211>36
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>18
taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca 36
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>19
tgaagatttg ggctcgttct cacagaagta 30
<210>20
<211>31
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>20
atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a 31
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>21
tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca 30
<210>22
<211>28
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>22
ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca 28
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>23
tttgggctcc ctgagctctg gtggaa 26
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>引物序列
<400>24
gagctcaggg agcccaaatc ttcagaca 28
<210>25
<211>35
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<223>修饰的信号肽序列
<400>25
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
20 25 30
Phe Arg Arg
35
Claims (23)
1.一种制剂,包含:
a)TACI-免疫球蛋白(TACI-Ig)融合蛋白,其包含:
i.TACI的胞外结构域或其能结合BLyS和/或APRIL的片段或变体;和
ii.免疫球蛋白的恒定区;和
b)使制剂的pH范围维持在4.5-5.5之间的缓冲液。
2.如权利要求1所述的制剂,其pH范围为4.7-5.3,或4.9-5.1,或pH5.0。
3.如权利要求1或2所述的制剂,其中所述缓冲液选自:乙酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和组氨酸缓冲液。
4.如以上权利要求中任何一项所述的制剂,其中所述乙酸盐缓冲液是乙酸钠。
5.如权利要求4所述的制剂,其中所述乙酸钠的浓度是5-25mM。
6.如以上权利要求中任何一项所述的制剂,该制剂还包含海藻糖。
7.如权利要求6所述的制剂,其中所述海藻糖的浓度范围为60-100mg/ml。
8.如权利要求7所述的制剂,其中所述TACI-Ig融合蛋白的浓度在70-100mg/ml之间,所述海藻糖的浓度在80-100mg/m之间,所述缓冲液是10mM乙酸钠缓冲液。
9.如以上权利要求中任何一项所述的制剂,该制剂还包含防腐剂。
10.如权利要求9所述的制剂,其中所述防腐剂是苯甲醇联合苯扎氯铵。
11.如以上权利要求中任何一项所述的制剂,其中所述TACI-Ig片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基34-66和/或氨基酸残基71-104。
12.如权利要求11所述的制剂,其中所述片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基30-110,或与其至少90%相同或少于10个保守性氨基酸替代的变体,所述变体能结合BlyS和/或APRIL。
13.如以上权利要求中任何一项所述的制剂,其中所述免疫球蛋白恒定区来自人IgG1的恒定区。
14.如权利要求13所述的制剂,其中所述人IgG1恒定区包含SEQ IDNO:2序列,或其含少于20个保守性氨基酸替代的变体。
15.如以上任何一项权利要求所述的制剂,该制剂包含SEQ ID NO:3序列,或与其至少90%相同或少于30个保守性氨基酸替代的变体,所述变体能结合BlyS和/或APRIL。
16.如以上任何一项权利要求所述的制剂,该制剂包含的所述TACI-Ig融合蛋白浓度范围为20-180mg/ml。
17.如以上任何一项权利要求所述的制剂,其中所述制剂是液体剂型。
18.如以上任何一项权利要求所述的制剂,其中所述制剂是多剂量给药用制剂。
19.一种包含以上权利要求任何一项所述制剂的药物组合物。
20.如权利要求1-18任何一项所述的制剂或权利要求19所述的药物组合物,所述制剂或药物组合物用于治疗自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病。
21.一种制备权利要求1-18任何一项所述制剂的方法,该方法包括制备TACI-Ig融合蛋白液体溶液和调节所述液体溶液的pH至4.5-5.5或4.7-5.3或4.9-5.1范围或pH5.0的步骤。
22.如权利要求21所述的制备制剂的方法,所述方法包括将预定量的所述制剂放置在灭菌容器中的步骤。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述容器选自玻璃小瓶或预装填的针筒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510626737.9A CN105168123B (zh) | 2007-11-12 | 2008-11-12 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 |
Applications Claiming Priority (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP07120490 | 2007-11-12 | ||
EP07120490.3 | 2007-11-12 | ||
EP07120489 | 2007-11-12 | ||
EP07120489.5 | 2007-11-12 | ||
US298807P | 2007-11-14 | 2007-11-14 | |
US302807P | 2007-11-14 | 2007-11-14 | |
US61/002,988 | 2007-11-14 | ||
US61/003,028 | 2007-11-14 | ||
US7203808P | 2008-03-27 | 2008-03-27 | |
EP08005923 | 2008-03-27 | ||
EP08005923.1 | 2008-03-27 | ||
US61/072,038 | 2008-03-27 | ||
PCT/EP2008/065395 WO2009062960A1 (en) | 2007-11-12 | 2008-11-12 | Formulations for taci-immunoglobulin fusion proteins |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510626737.9A Division CN105168123B (zh) | 2007-11-12 | 2008-11-12 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101854951A true CN101854951A (zh) | 2010-10-06 |
Family
ID=40347890
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510626737.9A Active CN105168123B (zh) | 2007-11-12 | 2008-11-12 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 |
CN200880115935A Pending CN101854951A (zh) | 2007-11-12 | 2008-11-12 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510626737.9A Active CN105168123B (zh) | 2007-11-12 | 2008-11-12 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8637021B2 (zh) |
EP (1) | EP2219675B1 (zh) |
JP (1) | JP5469077B2 (zh) |
CN (2) | CN105168123B (zh) |
AU (1) | AU2008322930B2 (zh) |
CA (1) | CA2705357C (zh) |
DK (1) | DK2219675T3 (zh) |
ES (1) | ES2436779T3 (zh) |
IL (1) | IL205716A (zh) |
PL (1) | PL2219675T3 (zh) |
PT (1) | PT2219675E (zh) |
WO (1) | WO2009062960A1 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102085367A (zh) * | 2011-01-19 | 2011-06-08 | 烟台荣昌生物工程有限公司 | 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用 |
WO2019223581A1 (zh) * | 2018-05-25 | 2019-11-28 | 荣昌生物制药烟台有限公司 | TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病和多发性硬化之药物中的应用 |
WO2022206872A1 (zh) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 截短的taci多肽及其融合蛋白和用途 |
WO2023051798A1 (zh) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il23抗体融合蛋白及用途 |
WO2023051660A1 (zh) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 用TACI-Fc融合蛋白治疗干燥综合征的方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1612750B (zh) | 2001-05-24 | 2012-10-31 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白质 |
WO2007019573A2 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Zymogenetics, Inc. | Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules |
PT2139517E (pt) | 2007-03-27 | 2013-07-11 | Ares Trading Sa | Combinação de inibição de blys e micofenolato mofetil para tratamento de doença auto-imune |
JP2011500715A (ja) | 2007-10-16 | 2011-01-06 | ザイモジェネティクス, インコーポレイテッド | 自己免疫疾患の治療のためのBLyS阻害剤および抗CD20剤の組合せ |
US8741591B2 (en) | 2009-10-09 | 2014-06-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | pH-insensitive glucose indicator protein |
BR112021025458A2 (pt) * | 2019-12-10 | 2022-06-21 | Remegen Co Ltd | Formulação farmacêutica, método de preparação e uso da mesma |
WO2021226551A1 (en) | 2020-05-08 | 2021-11-11 | Alpine Immune Sciences, Inc. | April and baff inhibitory immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
CN117529506A (zh) * | 2021-06-11 | 2024-02-06 | 海南先声药业有限公司 | 抗人il-17抗体和taci的双功能融合蛋白分子 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998056418A1 (en) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Genentech, Inc. | Stabilized antibody formulation |
US6171586B1 (en) * | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
NZ505324A (en) * | 1997-12-22 | 2002-11-26 | Human Genome Sciences Inc | Liquid and lyophilised KGF-2 polypeptide formulations used to accelerate soft tissue growth or regeneration |
US20060067933A1 (en) * | 1999-01-07 | 2006-03-30 | Gross Jane A | Soluble receptor BR43x2 and methods of using |
EP1666052B1 (en) * | 2000-02-16 | 2011-06-08 | Genentech, Inc. | Anti-APRIL monoclonal antibody and its use for the treatment of an immune related disease or cancer |
US20020086018A1 (en) * | 2000-05-12 | 2002-07-04 | Theill Lars Eyde | Methods and compositions of matter concerning APRIL/G70, BCMA, BLYS/AGP-3, and TACI |
ES2332402T5 (es) * | 2000-10-12 | 2018-05-14 | Genentech, Inc. | Formulaciones de proteína concentradas de viscosidad reducida |
CN1612750B (zh) * | 2001-05-24 | 2012-10-31 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Taci-免疫球蛋白融合蛋白质 |
AU2003221256A1 (en) * | 2002-02-21 | 2003-09-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Use of bcma as an immunoregulatory agent |
AU2005322019B2 (en) * | 2004-12-22 | 2010-08-26 | Ambrx, Inc. | Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid |
MY149159A (en) | 2005-11-15 | 2013-07-31 | Hoffmann La Roche | Method for treating joint damage |
RU2008118166A (ru) * | 2005-11-22 | 2009-12-27 | Вайет (Us) | Составы, содержащие гибридные белки, включающие иммуноглобулин |
-
2008
- 2008-11-12 CN CN201510626737.9A patent/CN105168123B/zh active Active
- 2008-11-12 PT PT88504543T patent/PT2219675E/pt unknown
- 2008-11-12 CN CN200880115935A patent/CN101854951A/zh active Pending
- 2008-11-12 ES ES08850454.3T patent/ES2436779T3/es active Active
- 2008-11-12 WO PCT/EP2008/065395 patent/WO2009062960A1/en active Application Filing
- 2008-11-12 JP JP2010532619A patent/JP5469077B2/ja active Active
- 2008-11-12 CA CA2705357A patent/CA2705357C/en active Active
- 2008-11-12 AU AU2008322930A patent/AU2008322930B2/en active Active
- 2008-11-12 US US12/740,845 patent/US8637021B2/en active Active
- 2008-11-12 DK DK08850454.3T patent/DK2219675T3/da active
- 2008-11-12 EP EP08850454.3A patent/EP2219675B1/en active Active
- 2008-11-12 PL PL08850454T patent/PL2219675T3/pl unknown
-
2010
- 2010-05-12 IL IL205716A patent/IL205716A/en active IP Right Grant
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102085367A (zh) * | 2011-01-19 | 2011-06-08 | 烟台荣昌生物工程有限公司 | 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用 |
CN102085367B (zh) * | 2011-01-19 | 2012-08-22 | 烟台荣昌生物工程有限公司 | 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用 |
WO2019223581A1 (zh) * | 2018-05-25 | 2019-11-28 | 荣昌生物制药烟台有限公司 | TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病和多发性硬化之药物中的应用 |
WO2022206872A1 (zh) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 截短的taci多肽及其融合蛋白和用途 |
WO2023051798A1 (zh) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il23抗体融合蛋白及用途 |
WO2023051660A1 (zh) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 用TACI-Fc融合蛋白治疗干燥综合征的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8637021B2 (en) | 2014-01-28 |
DK2219675T3 (da) | 2013-12-02 |
IL205716A (en) | 2014-09-30 |
JP5469077B2 (ja) | 2014-04-09 |
CA2705357C (en) | 2018-10-23 |
CN105168123A (zh) | 2015-12-23 |
EP2219675B1 (en) | 2013-10-23 |
EP2219675A1 (en) | 2010-08-25 |
PL2219675T3 (pl) | 2014-04-30 |
WO2009062960A1 (en) | 2009-05-22 |
US20100297122A1 (en) | 2010-11-25 |
CN105168123B (zh) | 2019-03-08 |
PT2219675E (pt) | 2013-11-18 |
JP2011503038A (ja) | 2011-01-27 |
IL205716A0 (en) | 2010-11-30 |
AU2008322930B2 (en) | 2014-05-15 |
CA2705357A1 (en) | 2009-05-22 |
ES2436779T3 (es) | 2014-01-07 |
AU2008322930A1 (en) | 2009-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101854951A (zh) | Taci-免疫球蛋白融合蛋白制剂 | |
TWI687435B (zh) | 用於t調節細胞之擴展的介白素-2突變蛋白 | |
CN109071623B (zh) | 用于扩增t调节性细胞的白细胞介素-2突变蛋白 | |
ES2385639T3 (es) | Producción de una proteína de unión a IL-18 recombinante | |
CN102892430A (zh) | 抗神经生长因子(ngf)抗体组合物 | |
CN106795213A (zh) | 选择性地活化调节性t细胞用于治疗自身免疫病的分子 | |
CA3073703A1 (en) | Liquid pharmaceutical composition | |
TW201008595A (en) | Stable protein formulations | |
CA2900949A1 (en) | Treatment of pediatric growth hormone deficiency with human growth hormone analogues | |
US20110200552A1 (en) | Cytokine design | |
CN106659785A (zh) | 包含gm‑csf中和化合物的液体制剂 | |
KR20220063222A (ko) | 고농축 단백질 제형에서 점도 감소제로서의 캄포술폰산 및 양이온성 부형제와 이의 조합 | |
CN114555634A (zh) | 用于扩增调节性t细胞的白介素-2突变蛋白 | |
JP6431476B2 (ja) | オステオプロテゲリン由来の組成物およびその使用 | |
CN114867749A (zh) | 用于疗法中的双重白介素-2/tnf受体激动剂 | |
BR112015023145B1 (pt) | Polipeptídeos contendo fc aglicosilados e anticorpo ou proteína de fusão fc | |
JP2017131228A (ja) | オステオプロテゲリン由来の組成物およびその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1145444 Country of ref document: HK |
|
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20101006 |
|
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1145444 Country of ref document: HK |