CN102085367A - 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用 - Google Patents
优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及应用B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白治疗自身免疫性疾病领域，更具体地说，涉及优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用。本发明所述的药物对于治疗类风湿性关节炎安全有效，并且利于降低本类重组蛋白质药物的成本，适用于工业化推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及应用B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白治疗自身免疫性疾病领域，更具体地说，涉及优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用。
技术背景
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是临床上发病率较高的系统性自身免疫性疾病。自身免疫性疾病是指由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身组织和细胞成分导致组织损害和器官功能障碍的免疫性疾病，它分为器官或细胞特异性和系统性自身免疫性疾病两种。前者的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官或某一类细胞；后者的自身抗原为多种器官、组织的共有成分，例如细胞核、线粒体等，故能引起多器官组织的损害。类风湿性关节炎是一种慢性异质性系统性疾病，属自身免疫性疾病，可能与感染、遗传和免疫机制紊乱等多种因素有关。主要表现为周围对称性的多关节慢性非特异性炎症，可伴有关节外的系统性损害。
据报道，我国RA的患病率为0.3％，以这个患病率推算我国RA患者约在390万人左右。目前，RA不能被根治，治疗于段主要是对症治疗，防止关节破坏、保护关节功能，最大限度的提高患者的生活质量，如早期积极治疗，合理使用药物治疗，可以减少致残的发生。由于无法从根本上解决问题，而且药物的毒副作用较大，患者十分痛苦，因此非常有必要研发出治疗RA疗效确切并且毒副作用小的药物。
RA的药物治疗不断发展，从上世纪初的阿司匹林、羟基氯喹(HQC)、金制剂、柳氮磺胺吡啶(SSZ)到50年代的糖皮质激素、60年代的非甾体抗炎药(NSAIIDs)，再到80～90年代的改善病情药物(DMARDs)的应用，使RA的治疗水平不断提高。尤其DMARDs在RA治疗中的应用，不仅减少了疼痛，而且改善了患者的病情，目前主要分为以下几类：非甾体抗炎免疫药(Non-steroidalanti-inflammatory-immune drugs，NSAIIDs)，慢作用抗风湿药(Slow-acting antirheumatic drugs，SAARDs)，生物制剂等。上世纪90年代生物制剂的应用，使得RA的治疗真正迈进了靶向治疗(target therapy)的时代。目前针对RA的靶向治疗药物主要针对细胞因子(Cytokine)、B细胞、T细胞、破骨细胞和一些小分子等靶点。
RA是由T、B淋巴细胞共同参与的、损害滑膜、软骨和骨的系统性自身免疫病。B淋巴细胞通过作用于抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，分泌促炎症细胞因子，产生自身抗体，并活化T淋巴细胞，促进T淋巴细胞浸润滑膜组织。B淋巴细胞表面有独特的细胞受体(B cell receptor，BCR)，可结合特异抗原。跨膜活化子和CAML作用子(Transmembrane Activator and CAMLInteractor，TACI)、B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)和B细胞活化因子受体(B cell-activating factor receptor，BAFF-R)是表达在B淋巴细胞上的I型跨膜蛋白受体，它们都属于TNF受体超家族成员，都表达在静息和活化的CD19 B细胞上，TACI也表达在活化的T细胞上，TACI、BCMA和BAFF-R三个受体都与B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS)结合，TACI和BCMA还与增殖诱导配体(A Proliferating Inducing Ligand，APRIL)结合。BLyS与APRIL都是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)配体超家族成员，调节B细胞池的大小和功能，促进B细胞存活、增殖、抗原呈递以及B细胞不同发育阶段Ig类别转换和重组，在B细胞发育中起着关键作用，也是自身免疫病中B细胞增生和抗体产生的强力驱动子。BLyS和APRIL不仅调节B细胞的功能，也调节T细胞介导的免疫应答。由于TACI对BLyS和APRIL具有很高的亲和力，可以用可溶性TACI阻止BLyS或APRIL与细胞膜受体(TACI，BCMA，BAFF-R)之间的相互作用，从而达到阻断BLyS或APRIL的生物学活性，治疗自身免疫疾病或肿瘤的目的。
TACI最早是由美国著名学术机构St.Jude儿童医院科学家Von Bulow和Bram发现的，但后来的研究发现，TACI细胞外区的自然序列存在蛋白质易于降解的问题，不适合作为药物生产。此后，有几家公司对TACI原分子做了改进，包括美国著名的生物技术公司基因泰克(Genentech)、Amgen和ZymoGenetics。目前，ZymoGenetics公司与瑞士默克雪兰诺公司合作的TACI融合蛋白Atacicept已针对系统性红斑狼疮(SLE)、RA、淋巴瘤等疾病进行临床试验，结果表明Atacicept具有明确的生物学活性，无明显的副作用。
中请人采用蛋白质前体加工酶人工神经网络计算机软件系统的独特方法找到了TACI自然序列降解的原因，进而用基因工程构建了优化的TACI-Fc融合蛋白(CN200710111162.2)，研究结果表明优化的TACI-Fc融合蛋白具有更好的生物学活性，具有抑制自身免疫疾病的作用，对RA、系统性红斑狼疮等自身免疫病有潜在的治疗前景。
发明内容
本发明的目的是提供优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用。中请人研究了优化的TACI-Fc融合蛋白的具体作用机制并确认其对类风湿性关节炎的疗效，本发明所提供的治疗类风湿性关节炎药物具有生物学活性高、用量小、安全有效的优点。
中请人通过蛋白质前体加工酶人工神经网络分析找到了天然TACI降解的位点，最大限度的保留TACI氨基末端区的大部分氨基酸残基，使优化的TACI-Fc融合蛋白解决了TACI降解的难题并具有更好的生物学活性。
本发明所述的优化的TACI-Fc融合蛋白的TACI部分包括来自TACI胞外区从氨基酸残基13开始的氨基末端区序列，富半胱氨酸区的全部序列，和柄区的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白Fc包括铰链区，CH2区和CH3区，TACI序列与Fc序列之间是直接融合或经连接序列融合。
本发明所述的优化的TACI-Fc融合蛋白的TACI序列优选TACI的第13至108氨基酸序列或第13至118氨基酸序列。
本发明所述的免疫球蛋白Fc序列选自人或动物的免疫球蛋白Fc，是Fc全长或是部分序列，Fc选自IgG，，IgM，IgD，IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，优选IgG1。
本发明所述的优化的TACI-Fc融合蛋白的TACI序列与免疫球蛋白Fc序列之间可以直接融合或经连接序列融合，如果经连接序列融合，优选经连接序列9Gly融合。
本发明所述的优化的TACI-Fc融合蛋白优选由TACI的第13至118氨基酸序列和免疫球蛋白IgG1 Fc融合而成，即序列表中序列1，以下简称RCT-18。
本发明所述的优化的TACI-Fc融合蛋白可与药学上可接受的载体以本领域常规方法制备治疗类风湿性关节炎的药物，所述载体包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、稳定剂等。
本发明所述药物可制成临床上可接受的各种剂型，包括但不限于口服制剂或注射制剂，优选注射剂。
申请人通过体外给药对血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)模型(以T细胞活化为主要病理表现的动物模型)小鼠T、B淋巴细胞，BLyS或抗CD3抗体刺激的T、B淋巴细胞活性和功能的影响，探讨优化的TACI-Fc融合蛋白对免疫细胞的作用特点及其药效作用机制。优化的TACI-Fc融合蛋白体外用药抑制KLH诱导小鼠的T、B淋巴细胞活性和功能，抑制BLyS或抗CD3抗体刺激的T、B淋巴细胞活性和功能，调节细胞因子和抗体产生，同样对异常活化的T、B淋巴细胞增殖、抗体及细胞因子产生以及T、B淋巴细胞亚群具有调节作用。
药效学试验研究表明优化的TACI-Fc融合蛋白的药理作用与其以BLyS和APRIL为作用靶标的T、B淋巴细胞功能密切相关。整体给药对RA和SLE动物模型有明确疗效；体外用药能直接抑制KLH小鼠T细胞异常增殖活化功能、调节细胞因子和抗体产生，调节T细胞亚群；体外用药能直接抑制BLyS或CD3单抗刺激的T、B淋巴细胞增殖活性，调节细胞因子和抗体产生，调节T、B淋巴细胞亚群。整体和离体药效试验显示了优化的TACI-Fc融合蛋白的作用特点，其作用机制是其TACI胞外可溶性部分能中和淋巴细胞发育成熟的两个关键调节因子BLyS和APRIL，高效阻断了BLyS和APRIL与其受体(TACI、BCMA和BAFF-R)之间的相互作用，从而有效阻断B淋巴细胞的增生和T淋巴细胞的成熟，具有抑制自身免疫疾病的作用。
申请人通过II型胶原所致DBA/1雄性小鼠的CIA模型初步探讨优化的TACI-Fc融合蛋白对RA的治疗作用、药物起效剂量及其相关的作用机制。
DBA/1小鼠于d0和d21，尾根部、背部多点皮内注射100μgII型胶原和完全弗氏佐剂诱导CIA小鼠模型。DBA/1小鼠，随机分为10组，即正常组、模型组、RCT-18五个剂量组(0.35、1.1、3.3、10、30mg/kg/次，腹腔注射，每周三次，用药6周)、阳性对照组益赛普(rhTNFR:Fc，4mg/kg，腹腔注射，每周三次，用药6周)、甲氨蝶呤(MTX，2mg/kg，灌胃，每周用药一次)组，并设IgG-Fc(10mg/kg，腹腔注射，每周三次，用药6周)对照组。免疫后每周一次进行小鼠体重称量，每隔3天进行关节炎指数评分。d70处死小鼠进行足爪踝关节X线摄片、踝关节和脾脏病理检查及病理学评分，观察关节和脾脏病理变化；测定胸腺和脾指数；采用3H-TdR掺入法检测LPS和ConA诱导的B和T淋巴细胞增殖反应；ELISA法检测血清中细胞因子BLyS和PGE2水平；流式细胞术测定小鼠脾脏总B细胞(CD19+)、成熟B细胞(CD19+/IgD+)、记忆B细胞(CD19+/CD27+)、早期B细胞(CD19+/IgM+)、表达补体受体B细胞(CD19+/CD21+)和表达Fc受体B细胞(CD19+/CD23+)百分含量；流式细胞术测定小鼠胸腺总Th细胞(CD3+/CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+/CD154+)、活化Th细胞(CD4+/CD25+)、表达活化诱导分子Th细胞(CD4+/CD69+)和未致敏Th细胞(CD4+/CD62L+)百分含量。
D0天将CII乳剂于DBA/1小鼠的尾根部皮内注射0.1ml致炎，d21将相同剂量CII乳剂0.1ml在尾根部皮内注射，作为激发。d28观察发现，小鼠足爪没有红肿，又进行第二次激发，d31小鼠足爪出现红肿，首先是前足红肿，以后延伸到后足，CIA组足爪红肿从d35到d70天，d40-d60为肿胀高峰，关节炎指数增高；免疫后d42开始，CIA组和IgG-Fc组小鼠体重开始下降，与正常组体重比较，差异显著；CIA组小鼠足爪及踝关节X线片显示有软组织肿胀，足爪关节变形，有骨赘生成，伴有骨质溶解；踝关节病理，CIA模型组明显可以看到滑膜组织增生，衬覆多层滑膜细胞，炎细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现，出现骨和软骨破坏；CIA组小鼠脾脏生发中心增多，白髓淋巴样滤泡增生明显，边缘区细胞密度增大、红髓充血。RCT-18(3.3、10、30mg/kg)、rhTNFR:Fc(4mg/kg)和MTX可明显降低CIA小鼠关节炎指数；RCT-18(10mg/kg)在d42-d56，可以恢复下降的体重，rhTNFR:Fc和MTX也分别在D42-D49和D49-D56恢复下降的体重；RCT-18(3.3，10和30mg/kg)组、rhTNFR:Fc组和MTX组X线片与模型组比较，无明显关节变形，骨赘生成少，对X线改变有改善趋势；RCT-18(3.3，10，30mg/kg)、rhTNFR:Fc(4mg/kg)和MTX(2mg/kg)治疗用药明显改善踝关节和脾脏病理。这些结果表明优化的TACI-Fc融合蛋白对小鼠CIA具有明显治疗作用。
CIA小鼠的胸腺指数和脾脏指数明显高于正常组，T、B淋巴细胞增殖反应明显增高，血清BLyS和PGE2水平也明显增高；RCT-18(3.3，10，30mg/kg)、rhTNFR:Fc(4mg/kg)和MTX(2mg/kg)治疗用药明显降低CIA小鼠的胸腺指数和脾脏指数，降低CIA小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖反应，降低CIA小鼠血清PGE2水平；RCT-18(1.1，3.3，10和30mg/kg)显著降低CIA小鼠血清BLyS水平。这些结果提示优化的TACI-Fc融合蛋白对小鼠CIA治疗作用与其抑制T、B淋巴细胞增殖反应、抑制细胞因子BLyS和PGE2产生密切相关。
与正常组比较，CIA组总B细胞及其亚群的细胞百分含量均显著增加；总Th细胞(CD3+/CD4+)、CD4+/CD25+、CD4+/CD69+和CD4+/CD154+的细胞百分含量增加，CD4+/CD62L+的细胞百分含量明显下降。RCT-18(3.3，10mg/kg)剂量组能够降低CD19+/CD21+、CD19+/CD23+和CD19+/IgM+细胞百分含量；RCT-18(1.1，3.3，10mg/kg)降低成熟B细胞CD19+/IgD+的细胞百分含量；但各剂量组对记忆B细胞CD19+/CD27+的细胞百分含量没有明显影响。RCT-18(3.3，10mg/kg)剂量组降低CD4+/CD69+细胞百分含量，能够升高CD4+/CD62L+的细胞百分含量；RCT-18(1.1，3.3，10mg/kg)降低CD4+/CD25+和CD4+/CD154+的细胞百分含量，各剂量组对CD3+/CD4+细胞无明显影响。提示，优化的TACI-Fc融合蛋白调节CIA小鼠T、B细胞亚群及活性是其发挥治疗作用的重要机制之-。
RCT-18对CIA小鼠关节炎指数的影响实验结果指示RCT-18对CIA小鼠的无效剂量≤0.35mg/kg，起效剂量1.1mg/kg，有效剂量≥3.3mg/kg。RCT-18对CIA小鼠上述所有考察指标有显著影响的剂量范围主要在3.3，10，30mg/kg剂量组，1.1mg/kg组对有些指标(如血清BLyS水平、成熟B细胞、CD4+/CD25+和CD4+/CD154+T细胞的表达)有明显疗效，0.35mg/kg上述指标均未显示明显疗效。根据上述量效结果，优化的TACI-Fc融合蛋白的用量可以是0.35mg/kg-30mg/kg。
动物药效试验表明：优化的TACI-Fc融合蛋白对RA动物(胶原性关节炎小鼠和佐剂性关节炎大鼠)均有治疗作用，皮下注射给药对RA模型小鼠的显著有效治疗剂量是3mg/kg；优化的TACI-Fc融合蛋白体外给药直接抑制BLyS对T和B淋巴细胞的活性和功能；研究还证实SLE与其调节T、B淋巴细胞增殖和活化、细胞因子水平和抑制抗体产生密切相关，也与其降低外周循环血液和脾脏中升高的BLyS和APRIL水平密切相关，优化的TACI-Fc融合蛋白作用于B淋巴细胞生长发育阶段的从未成熟B细胞至长寿命浆细胞的各阶段，但对记忆B细胞没有作用。
动物药代试验表明：单次皮下注射给药在大鼠和恒河猴的药物动力学参数Tmax分别为7-16h和6-12h，T1/2分别为40-50h和79-129h；且体内的绝对生物利用度随着给药剂量的增加呈下降趋势；在大鼠和猴中的药动学行为没有性别差异。优化的TACI-Fc融合蛋白在大鼠皮下给药后，迅速分布到各组织，肾脏为最主要的分布器官，其次为心、肝、肺和性腺，再次为脾、胃、肠、肌肉、脂肪和胸腺，在脑组织中的分布最低；随着给药时间的延长，这些组织中的浓度逐渐下降，未观察到蓄积现象。在粪便、尿液和胆汁中的排泄率分别为17.89％±3.26％，77.98％±4.95％和12.17％±3.49％，表明皮下注射给药后优化的TACI-Fc融合蛋白主要通过尿液排泄，在粪便和尿液中的平均总排泄率为95.87％。多次给药的药动学实验还显示皮下注射给药在大鼠体内不存在明显的蓄积性，但在猴体内有一定的蓄积现象。
动物的安全评价试验表明：优化的TACI-Fc融合蛋白在所有试验动物上均表现出良好的耐受性和安全性。
中请人将RCT-18与文献Atacicept非临床RA药效进行了对比，结果表明，总的给药剂量RCT-18小于Atacicept，但药效作用相当。Atacicept对胶原性关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)小鼠药效实验文献资料显示其能够抑制CIA模型小鼠的疾病进展(Gross JA，Dillon SR，Mudri S，et al.TACI-Ig neutralizes molecules criticalfor B cell development and autoimmune disease.Impaired B cell maturation in mice lacking BLyS.Immunity，2001，15(2)：289-302，Wang H，Marsters SA.Baker T，et al.TACI-ligand interactions are required for T cell activation and collagen-induced arthritis in mice.Nat Immunol，2001，2(7)：632-637)。每只小鼠ip给予Atacicept 100μg 3周，每周给药3次，不管是在疾病发生前的预防给药和发生后的治疗给药给与Atacicept，疾病发病率和炎症的严重程度均降低，Atacicept抑制胶原蛋白特异性抗体产量和减少了脾脏滤泡B细胞数量。CIA小鼠治疗给药ip给予Atacicept 100μg(每只小鼠20g体重计算为5mg/kg)6周，每周给药3次，结果Atacicept通过抑制疾病的进程，表现为更低的关节炎症评分，降低发生疾病动物百分率；血清抗体水平降低；关节的X摄片和病理表明Atacicept组小鼠关节软骨基本没有损伤，滑膜组织和关节周围的软组织有更少的炎症细胞，与模型组比较有显著改善。研究结果表明Atacicept减弱CIA的进展是由于抑制了CIA小鼠的B细胞和T细胞的反应所致。离体试验也表明Atacicept能抑制CD4+T细胞的活化。RCT-18也进行了CIA小鼠的药效试验，两者对CIA小鼠的药效作用比较表明，RCT-18的给药时间是在小鼠出现CIA病理症状后给予，而Atacicept是在出现CIA症状前给予的药物；RCT-18和Atacicept对CIA小鼠作用的显效剂量分别为sc 3mg/kg和ip 5mg/kg，给药方法分别为2d/次连续6周(共给药20次)和3次/周连续6周(共给药18次)，两者总的给药剂量RCT-18小于Atacicept(60mg/kg与90mg/kg)，但药效作用相当。
本发明所述的优化的TACI-Fc融合蛋白最大限度的保留TACI氨基末端区的大部分氨基酸残基，相对于现有技术大幅提高了融合蛋白与BlyS的亲和力，药物与靶标的亲和力增加即意味着药物所需有效浓度的下降，即可以用更少的药而达到同样的临床治疗目的，这对于价格昂贵的重组蛋白质药物来说尤为重要。本发明的推广应用有利于降低药物成本，更适用于工业化生产。
附图说明
图1：RCT-18对CIA小鼠关节炎指数的影响。
d32小鼠足爪出现红肿，持续到d71大，d40-d60为肿胀高峰，d60后，足爪肿胀开始减轻。d44-d71，MTX可明显降低CIA小鼠关节炎指数。d50-d71，RCT-18(3，9mg/kg)和rhTNFR:Fc可明显降低CIA小鼠关节炎指数。d56-d60，RCT-18(1mg/kg)也降低CIA小鼠关节炎指数。IgG-Fc对CIA小鼠关节炎指数无影响。#P＜0.05，##P＜0.01 VS CIA.
图2：RCT-18对AA大鼠全身表现评分的影响。
RCT-18(6.3mg/kg，sc)、rhTNFR:Fc(2.8mg/kg，sc)和MTX(0.5mg/kg，ig)各给药组在d30和d34明显降低AA大鼠的全身表现评分。#P＜0.05，##P＜0.01vs model group.
图3：RCT-18对AA大鼠关节肿胀数的影响。
RCT-18(6.3mg/kg，sc)、rhTNFR:Fc(2.8mg/kg，sc)和MTX(0.5mg/kg，ig)各给药组在d26、d30和d34明显降低AA大鼠的关节肿胀数。#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.
图4：RCT-18对AA大鼠关节炎指数的影响。
RCT-18(6.3mg/kg，sc)、rhTNFR:Fc(2.8mg/kg，sc)和MTX(0.5mg/kg，ig)各给药组在d30和d34明显降低AA大鼠的关节炎指数。#P＜0.05，##P＜0.01vsmodel group.
具体实施方式
以RCT-18为例，对本发明作进-步说明。以下实施例是对本发明进行进一步的阐述和解释，而不应被看作是对本发明的限制。
实施例1：RCT-18对小鼠胶原性关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)和大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis，AA)的主要药效学研究。
1.1试验方法
①对CIA小鼠的药效学试验方法
DBA/1小鼠于d0和d21，尾根部、背部多点皮内注射100μgII型胶原和完全弗氏佐剂诱导CIA小鼠模型，随机分为8组，即正常组、模型组、RCT-18三个剂量组(1、3、9mg/Kg，皮下注射，两天一次，用药6周)、阳性对照组益赛普(rhTNFR:Fc，4mg/Kg，皮下注射，两天一次，用药6周)、甲氨蝶呤(MTX，2mg/Kg，灌胃，每周用药一次)组，并设IgG-Fc(9mg/Kg，皮下注射，两天一次，用药6周)阴性对照组。正常组、模型组皮下注射生理盐水。免疫后每周一次进行小鼠体重称量；每隔3天进行关节炎指数评分；d71处死小鼠进行足爪踝关节X线摄片、踝关节和脾脏病理检查及病理学评分，观察关节和脾脏病理变化；测定胸腺和脾指数；采用3H-TdR掺入法检测LPS和ConA诱导的B和T淋巴细胞增殖反应；ELISA法检测血清中抗体IgM、IgA和细胞因子BlyS水平；流式细胞术测定小鼠脾脏总B细胞(CD19+)、成熟B细胞(CD19+/IgD+)、记忆B细胞(CD19+/CD27+)、早期B细胞(CD19+/IgM+)、表达补体受体B细胞(CD19+/CD21+)和表达Fc受体B细胞(CD19+/CD23+)百分含量；流式细胞术测定小鼠胸腺总Th细胞(CD3+/CD4+)、表达CD40L的Th细胞(CD4+/CD154+)、活化Th细胞(CD4+/CD25+)、表达活化诱导分子Th细胞(CD4+/CD69+)和未致敏Th细胞(CD4+/CD62L+)百分含量。
②对AA大鼠的药效学试验方法
大鼠足跖皮内注射完全弗氏佐剂(Complete Freund adjuvant，CFA)诱导SD大鼠AA模型，随机分为8组，即正常对照组、模型组、RCT-18三个剂量组(0.7，2.1，6.3mg/kg)、阳性对照组rhTNFR:Fc(2.8mg/kg)组和MTX(0.5mg/kg)组以及阴性对照组IgG-Fc(6.3mg/kg)组。AA大鼠全身炎症出现后开始给药，RCT-18各剂量组、阳性对照组rhTNFR:Fc和阴性对照组IgG-Fc皮下注射，两天一次，用药18天；MTX灌胃，三天一次，用药18天。大鼠每周一次进行体重称量，每隔3天足容积法测量继发侧大鼠足爪肿胀度、进行全身表现评分、关节肿胀数、关节肿胀度和关节炎指数测定；d35处死大鼠，进行足爪踝关节X线摄片，踝关节和脾脏病理检查及病理学评分；测定胸腺和脾指数；3H-TdR掺入法检测B、T淋巴细胞增殖反应；ELISA法检测脾组织BLyS、IL-17、IL-2、IL-10、IFN-γ、IgG1、IgG2a、IgM和IgA含量以及血清中IL-1β、TNF-α、PGE2、BLyS、IL-17、IL-2、IL-10、APRIL、TGF-β1、IFN-γ、IgG1、IgG2a、IgM和IgA水平；免疫组化法检测脾组织中CD20和CD68表达；流式细胞术检测外周血CD3+/CD4+和CD4+/CD62L+T淋巴细胞百分含量和脾脏中总CD3+、CD3+/CD4+和CD25+/CD4+T淋巴细胞百分含量。
1.2试验结果
①RCT-18对小鼠CIA有明显的治疗作用
免疫后d32小鼠足爪出现红肿，首先是前足红肿，以后延伸到后足，CIA组和IgG-Fc组的小鼠足爪红肿从d35到d71天，d40-d60为肿胀高峰，关节炎指数增高；免疫后d42开始，CIA组和IgG-Fc组小鼠体重开始下降，与正常组体重比较，差异显著，一直持续到d70；CIA组小鼠足爪及踝关节X线片显示有软组织肿胀；踝关节病理，CIA模型组明显可以看到滑膜组织增生，衬覆多层滑膜细胞，炎细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现，出现骨和软骨破坏；CIA组小鼠脾脏生发中心增多，白髓淋巴样滤泡增生明显，边缘区细胞密度增大、红髓充血。RCT-18(3，9mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX可明显降低CIA小鼠关节炎指数(说明书附图图1)；对软组织肿胀有改善趋势；可明显降低滑膜组织增生、细胞浸润、血管翳形成、炎症和骨质侵蚀评分；RCT-18(1mg/kg)组也可降低滑膜组织增生、细胞浸润、血管翳形成、炎症评分，但对骨质侵蚀评分无影响；RCT-18(3，9mg/kg)组、RhTNFR组和MTX组减少脾脏生发中心数量，明显减轻淋巴滤泡增生，减低边缘区细胞密度、改善红髓充血，能够明显降低动脉周围淋巴鞘细胞密度评分、淋巴滤泡增生评分、边缘区细胞密度评分和红髓淤血评分。各用药组对CIA小鼠的体重无明显影响。这些结果表明RCT-18对小鼠CIA具有明显治疗作用。
②RCT-18对小鼠CIA治疗作用与其抑制T、B淋巴细胞增殖反应、抑制IgM和IgA抗体及细胞因子BLyS产生密切相关
CIA小鼠的胸腺指数和脾脏指数明显高于正常组，T、B淋巴细胞增殖反应明显增高，血清BLyS、IgM和IgA水平也明显增高，RCT-18(1，3，9mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX治疗用药可以降低CIA小鼠的胸腺指数，降低CIA小鼠血清BLyS水平；RCT-18(3，9mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX治疗用药可以降低CIA小鼠的脾脏指数，降低CIA小鼠T淋巴细胞增殖反应和B淋巴细胞增殖反应，降低IgA水平；RCT-18(9mg/kg)降低血清IgM水平。该结果提示RCT-18对CIA小鼠异常免疫应答有调节作用。
③RCT-18调节CIA小鼠T、B细胞亚群及活性是其发挥治疗作用的重要机制之一
与正常组比较，CIA组总B细胞(CD19+)、成熟B细胞(CD19+/IgD+)、早期B细胞(CD19+/IgM+)、记忆B细胞(CD19+/CD27+)、表达Fc受体B细胞(CD19+/CD23+)和表达补体受体B细胞(CD19+/CD21+)的细胞白分含量增加；总Th细胞(CD3+/CD4+)、活化Th细胞(CD4+/CD25+)、表达活化诱导分子Th细胞(CD4+/CD69+)和表达CD40L的Th细胞(CD4+/CD154+)的细胞百分含量增加，未致敏Th细胞(CD4+/CD62L+)的细胞百分含量明显下降。RCT-18(1，3，9mg/kg)剂量组能够降低CD19+、CD19+/IgD+、CD19+/IgM+和CD19+/CD21+的细胞百分含量，RCT-18(3，9mg/kg)剂量组能够降低CD19+/CD23+百分含量，但各剂量组对记忆B细胞(CD19+/CD27+)的细胞百分含量没有明显影响；RCT-18(1，3，9mg/kg)剂量组能降低CD4+/CD69+和CD4+/CD154+的细胞百分含量，能够升高CD4+/CD62L+的细胞百分含量；RCT-18(9mg/kg)剂量组能够降低CD4+/CD25+的细胞百分含量；各剂量组对CD3+/CD4+的细胞百分含量没有明显影响。阳性对照药RhTNFR:Fc能够降低CD19+/IgM+、CD19+/CD27+、CD19+/CD23+的细胞百分含量，但对总B细胞(CD19+)、CD19+/IgD+和CD19+/CD21+无明显影响；能够降低CD4+/CD25+、CD4+/CD69+和CD4+/CD154+的细胞百分含量，升高CD4+/CD62L+细胞百分含量，对CD3+/CD4+细胞无明显影响。该结果提示，RCT-18可通过调节CIA小鼠T、B细胞亚群及活性发挥治疗作用，可能是RCT-18治疗RA的重要作用机制之一。
④RCT-18对大鼠AA有显著的治疗作用
以CFA诱导大鼠AA模型，X线摄片可见AA大鼠足爪及踝关节软组织肿胀明显，未见骨侵蚀和关节间隙改变等骨破坏现象；病理学结果表明，AA大鼠关节腔积液，炎性渗出，滑膜细胞增生水肿，血管翳形成，滑膜组织内小血管增生，扩张充血，大量炎细胞浸润，严重者炎性滑膜组织侵犯软骨表面和软骨下骨；AA大鼠脾脏可见白髓增生，生发中心出现，红髓增生、充血，范围增大。RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX治疗给药均不同程度的减轩AA大鼠的继发性足爪肿胀度、全身评分(说明书附图图2)、关节肿胀数(说明书附图图3)和关节炎指数(说明书附图图4)等表现；RCT-18(6.3mg/kg)明显减轻关节软细织肿胀；RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX对关节和脾脏病理变化具有明显的改善作用，表现为关节滑膜细胞增生减轻，炎性细胞浸润减少，炎性渗出减少，血管翳形成减少，软骨、骨破坏罕见，脾脏白髓增生减轻或接近正常，红髓增生减轻，生发中心消失。该结果表明RCT-18对大鼠AA具有明显治疗作用。
⑤调节AA大鼠Th1、Th2、Th3和Th17细胞因子和抗体产生平衡，是RCT-18发挥治疗作用的重要机制之一
RCT-18(2.1，6.3mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX明显降低AA大鼠增高的脾脏指数，对胸腺指数无影响；RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)和MTX(0.5mg/kg)明显提高胸腺T淋巴细胞增殖反应，AA大鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应无明显变化。RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)、rhTNFR:Fc和MTX明显降低AA大鼠脾脏中升高的BLyS、IL-17、IFN-γ和IgM水平，RCT-18(2.1，6.3mg/kg)明显降低升高的IgG1水平，RCT-18(6.3mg/kg)明显降低升高的IgG2a水平，各剂量组对IgA水平无明显影响。RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)不同程度的降低血清升高的IL-1β、TNF-α、PGE2、BLyS、APRIL、IL-2和IgM水平，增加血清IFN-γ、IL-10和TGF-β1水平；对血清IgG1、IgG2a和IgA水平无明显变化。提示RCT-18抑制抗体产生、调节Th1、Th2、Th3和Th17细胞因子平衡是RCT-18发挥治疗作用的重要机制之一。
⑥调节AA大鼠T、B细胞亚群及活性是RCT-18发挥治疗作用的重要特点之一
脾脏免疫组化显示，RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)不同程度减少生发中心和边缘区CD20表达，减轻B淋巴细胞大量增生；减少边缘区和脾索CD68表达，减轻巨噬细胞大量增生；RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)明显增加外周血CD3+/CD4+T淋巴细胞表达；外周血和脾脏细胞流式结果显示，RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)对CD4+/CD62L+T淋巴细胞表达无明显作用；RCT-18(0.7，2.1，6.3mg/kg)明显增加脾脏CD3+、CD3+/CD4+和CD4+/CD25+T淋巴细胞的表达。这些结果表明RCT-18调节AA大鼠T、B细胞亚群及活性是其发挥治疗作用的重要特点之一。
1.3试验结论
①RCT-18对RA动物具有治疗作用
RCT-18对小鼠CIA和大鼠AA有明显治疗作用，RCT-18可降低CIA小鼠和AA大鼠的关节炎指数；可减轩AA大鼠继发性足爪肿胀度、全身评分、关节肿胀数；减少CIA小鼠和AA大鼠足爪踝关节滑膜组织增生，炎细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现；改善脾脏病理变化，减少脾脏生发中心，白髓淋巴样滤泡增生，降低边缘区细胞密度和红髓淤血；改善CIA小鼠和AA大鼠X线摄片所示的关节软组织肿胀。这些结果提示其对RA有潜在临床应用前景。
②RCT-18对RA动物的治疗作用与其抑制T、B淋巴细胞增殖反应、调节抗体及细胞因子产生密切相关
表现在RCT-18能降低CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数，抑制CIA小鼠T、B淋巴细胞增殖反应，降低CIA小鼠血清BLyS、IgM和IgA水平。RCT-18能降低AA大鼠BLyS和APRIL水平，调节IL-1β、TNF-α、PGE2、IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β1、IgG1、IgG2a和IgM水平。
③RCT-18对RA动物的治疗作用与其抑制BLyS和APRIL密切相关
④RCT-18调节T、B细胞亚群是其发挥治疗作用的重要机制之一
RCT-18能抑制总B细胞、成熟B细胞、早期B细胞、表达补体受体B细胞和表达Fc受体B细胞亚群百分含量；抑制表达CD40LTh细胞、活化Th细胞、表达活化诱导分子Th细胞亚群百分含量，提高未致敏Th细胞亚群百分含量；明显增加AA大鼠总CD3+、CD3+CD4+和CD25+CD4+T淋巴细胞百分含量。
⑤RCT-18调节B细胞、巨噬细胞和T细胞平衡发挥治疗AA的作用
RCT-18能抑制CD20表达，减轩B淋巴细胞大量增生；抑制CD68表达，减轻巨噬细胞增生；增加外周血CD3+/CD4+T淋巴细胞表达；增加脾脏CD3+、CD3+/CD4+和CD4+/CD25+T淋巴细胞的表达。
实施例2：RCT-18在大鼠体内与恒河猴体内的药代动力学研究
2.1.1大鼠药代动力学研究
本研究建立了血浆中RCT-18的125I同位素标记示踪测定方法，并应用建立的方法，研究了大鼠静脉注射(iv)1mg/kg和皮下注射(sc)三个单剂量组(1，4和16mg/kg)以及多次(5次)皮下注射一个剂量组(4mg/kg)RCT-18冻干注射剂后，血浆中RCT-18经时变化曲线，应用DAS2.0软件，采用房室模型和统计矩法分别进行了药物动力学分析。结果：①空白血浆CPM值较低且为一个稳定的值。血浆中RCT-18的萃取回收率大于79％，方法回收率大于99％，批间和批内变异系数都小于10％。RCT-18的线性范围为0.1～20μg/ml，标准曲线的相关系数r均＞0.999。RCT-18的定量下限为0.1μg/ml(RSD＜10％)。血浆中RCT-18在稳定性实验中均符合要求。②药物动力学结果：按统计矩法计算的药代动力学参数见表1。由表1可见，大鼠sc 1、4和16mg/kg RCT-18冻干注射剂后，三种剂量的Cmax与剂量呈线性相关(r＝0.999)，AUC与剂量也呈现一定的相关性(r＝0.989)。iv和sc三个单剂量组的t1/2z不存在显著性差异。单剂量给药和5次多次给药后的AUC(0-∞)，CLz和Cmax都没有显著性差异，说明该药物在大鼠体内不存在明显的蓄积性。皮下给药的绝对生物利用度随着给药剂量的增加呈现明显的下降趋势。另外，该药物在大鼠中的药动学行为没有性别差异。
表1RCT-18皮下注射给药在大鼠体内的主要药代动力学参数
2.1.2大鼠组织分布试验
本研究建立了大鼠组织匀浆样品中RCT-18的125I同位素标记示踪测定方法，并应用建立的方法，研究了大鼠皮下注射(sc)4mg/kg RCT-18冻干注射剂后，各组织中的RCT-18分布情况。结果：①空白血浆的CPM值较低且为一个稳定的值；组织匀浆中RCT-18在0.01～2μg/ml的浓度范围内呈现良好的线性关系；组织匀浆中的RCT-18在室温放置5h内稳定。②大鼠皮下注射RCT-18后，其迅速分布到各组织。肾脏为最主要的分布器官，其次为心、肝、肺和性腺，再次为脾、胃、肠、肌肉、脂肪和胸腺，在脑组织中的分布最低。随着给药时间的延长，这些组织中的RCT-18浓度逐渐下降，未观察到蓄积现象。
2.1.3大鼠尿液、胆汁和粪便中的排泄试验
本研究建立了粪便、尿液和胆汁中RCT-18的125I同位素标记示踪测定方法，并应用建立的方法，研究了大鼠颈部皮下注射4mg/kg RCT-18后，三种排泄途径的排泄率。研究发现在粪便、尿液和胆汁中的排泄率分别为17.89％±3.26％，77.98％±4.95％和12.17％±3.49％。结果表明，皮下注射给药后RCT-18主要通过尿液排泄，在粪便和尿液中的平均总排泄率为95.87％。其中RCT-18大部分在0-48h内排出体外，0-48h内经尿液的平均排泄率为51.28％±5.51％，经粪便的平均排泄率为5.75％±3.31％。经胆汁的排泄也有一定的作用，0-84h内的总排泄率为12.17％±3.49％。
2.2恒河猴药物动力学研究
本研究建立了恒河猴血浆中RCT-18的ELISA测定方法，并应用建立的方法，研究了恒河猴静脉注射(iv)0.5mg/kg和皮下注射(sc)三个单剂量组(0.5，2和8mg/kg)以及一个剂量组重复6次皮下注射(2mg/kg)RCT-18冻干注射剂后，血浆中RCT-18经时变化曲线，应用DAS2.0软件，采用统计矩法进行了药物动力学参数分析。获得结果如下：①空白血浆对测定干扰较低。血浆中RCT-18的回收率在85％～90％之间，批内和批间的变异系数小于15％。RCT-18的线性范围为0.039～80μg/ml，标准曲线的相关系数r均＞0.995。RCT-18的定量下限为0.039μg/ml(RSD＜15％)。②不同剂量主要药物动力学结果按统计矩模型计算见表2。
表2RCT-18皮下注射给药在恒河猴体内的主要药物动力学参数
由表2可见，在0.5～8mg/kg给药范围内，sc三个单剂量组的t1/2z随着给药剂量的增加而增加，Cmax与剂量呈线性相关(r＝1)，AUC(0-∞)也随剂量增加而增加，与剂量呈一定的相关性(r＝0.995)。单剂量和多次给药后的AUC(0-∞)具有显著性差异(P＜0.01)，多次给药组的AUC(0-∞)明显高于单剂量给药组。同样，单剂量和多次给药后的Cmax也具有显著性差异(P＜0.05)，多次给药组的Cmax明显高于单剂量给药组。虽然，多次给药组和单剂量组的t1/2z没有显著性差异(P＝0.416)，但多次给药组的平均t1/2z略高于单剂量给药组。这说明RCT-18在猴体内有一定的蓄积现象。另外，经过统计分析，RCT-18药动学行为不存在性别差异。
低中高三个剂量组RCT-18在猴体内的绝对生物利用度，分别为83.0％±39.9％，73.4％±19.9％和50.1％±13.3％。结果表明，随着给药剂量的增加，绝对生物利用度呈下降趋势。
实施例3：RCT-18动物安全性评价研究
在非临床动物安全性评价各试验中，RCT-18在所有试验动物上均表现出良好的耐受性和安全性，试验结果见表3。
表3RCT-18非临床安全性试验结果
综上所述，本发明提供了一种优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用，本发明所述的药物对于治疗类风湿性关节炎安全有效，并且利于降低本类重组蛋白质药物的成本，适用于工业化推广应用。
Claims (8)
1.优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎的药物的应用，所述融合蛋白的TACI部分包括来自TACI胞外区从氨基酸残基13开始的氨基未端区序列，富半胱氨酸区的全部序列，和柄区的部分序列，融合蛋白的免疫球蛋白Fc包括铰链区，CH2区和CH3区，TACI序列与Fc序列之间是直接融合或经连接序列融合。
2.根据权利要求1所述的应用，所述融合蛋白的TACI序列选自TACI的第13至108氨基酸序列或第13至118氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的免疫球蛋白Fc序列选自人或动物的免疫球蛋白Fc，选自IgG，，IgM，IgD，IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的免疫球蛋白Fc序列选自IgG1。
5.根据权利要求1所述的应用，所述的融合蛋白的TACI序列与免疫球蛋白Fc序列之间经连接序列9Gly融合。
6.根据权利要求1所述的应用，所述的优化的TACI-Fc融合蛋白优选序列表中的序列1。
7.根据权利要求1所述的应用，所述融合蛋白制备的治疗类风湿性关节炎的药物包含作为活性物质的权利要求1-6中任一项所述的优化的TACI-Fc融合蛋白和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的应用，所述融合蛋白制备的治疗类风湿性关节炎的药物为口服制剂或注射制剂。
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