PT2219675E - Formulações para proteínas de fusão de taci-imunoglobulina - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES PARA PROTEÍNAS DE FUSÃO DE TACI—IMUNOGLOBULINA"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é no campo de formulações para proteínas terapêuticas. Mais especificamente, refere-se a formulações para proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina (Ig), tendo um pH variando entre 4,5 e 5,5, como definido nas reivindicações.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A Família de Ligando/Receptor de BLyS
Foram identificados três receptores, TACI (activador transmembranar e interactuador de CAML), BCMA (antigénio de maturação de célula B) e BAFF-R (receptor para factor de activação de célula B) , que têm afinidades de ligação únicas para os dois factores de crescimento BlyS (estimulador de linfócitos B) e APRIL (um ligando de indução de proliferação) (Marsters et al. 2000; Thompson et al. 2001). O TACI e BCMA ligam-se a BLyS e APRIL, enquanto o BAFF-R parece ser capaz de se ligar apenas a BLyS com elevada afinidade (Marsters et al., 2000; Thompson et al. 2001). Como resultado, o BLyS é capaz de sinalizar através de todos os três receptores, 1 enquanto o APRIL apenas parece ser capaz de sinalizar através de TACI e BCMA. Além disso, complexos heterotriméricos em circulação de BLyS e APRIL (agrupamentos de três subunidades proteicas, contendo uma ou duas cópias cada das subunidades de BLyS e APRIL) foram identificados em amostras séricas retiradas de doentes com doenças reumáticas de base imunitária sistémicas e mostrou-se que induzem proliferação de células B in vitro (Roschke et al., 2002). O BLyS e APRIL são potentes estimuladores da maturação, proliferação e sobrevivência de células B (Moore et al., 1999;
Schneider et al., 1999; Do et al., 2000). O BLyS e APRIL podem ser necessários para persistência de doenças auto-imunes, especialmente aquelas envolvendo células B. Murganhos transgénicos manipulados para expressarem níveis elevados de BLyS exibem distúrbios de célula imunitária e apresentam sintomas semelhantes aos verificados em doentes com Lúpus Eritematoso Sistémico (Gross et al. 2000; Mackay et al. 1999).
De modo semelhante, níveis aumentados de BLyS/APRIL foram medidos em amostras séricas retiradas de doentes de Lúpus Eritematoso Sistémico e outros doentes com diversas doenças auto-imunes, como Artrite Reumatóide (Roschke 2002; Cheema et al. 2001; Groom et al. 2002), alargando a associação de BLyS e/ou APRIL e doenças mediadas por células B de modelos animais para humanos. A expressão de BLyS e APRIL está regulada positivamente em monócitos de sangue periférico e células T de doentes de MS (Thangarajh et al., 2004; Thangarajh et al., 2005) . Em lesões de MS, verificou-se que a expressão de BLyS estava regulada positivamente em astrócitos localizados próximo de células imunitárias expressando BAFF-R (Krumbholz et al., 2005) . 2
Atacicept A atacicept (DCI) é um proteína de fusão recombinante contendo a porção de ligação de ligando extracelular do receptor TACI (Activador transmembranar e modulador de cálcio e ligando de ciclofilina (CAML)-interactuador) e a porção de Fc modificada de IgG humana. A atacicept actua como um antagonista para BLyS (estimulador de linfócitos B) e APRIL (um ligando de indução de proliferação), ambos membros da superfamília do factor de necrose tumoral (TNF). Mostrou-se que o BLyS e APRIL são reguladores importantes da função e sobrevivência de maturação de célula B. A atacicept é uma glicoproteína solúvel contendo 313 aminoácidos, resultando da fusão de uma Fc de IgGi humana e uma porção do domínio extracelular do receptor TACI de BLyS, com uma massa prevista de 35,4 quilodalton (kDa). A conformação de produto é dimérica, com uma massa prevista de 73,4 kDa. A atacicept é produzida em células de Ovário de Hámster Chinês (CHO) por tecnologia recombinante.
Na atacicept, a Fc de IgGi humana foi modificada para reduzir a ligação de Fc ao componente de Clq do complemento e a interacção com receptores de anticorpo (Tao et al., 1993; Canfield et al., 1991). A atacicept foi testada e confirmada para redução destas funções efectoras de Fc.
Formulações de proteínas terapêuticas
As proteínas de fusão de TACI-Ig, tal como atacicept, são produtos biológicos, i. e., proteínas terapêuticas para 3 tratamento de doenças humanas e, por este motivo, para administração humana.
As formulações são desenvolvidas de modo a suportarem a distribuição bem-sucedida de proteínas terapêuticas. Os problemas frequentemente encontrados no contexto das proteínas terapêuticas são, e. g., fraca estabilidade da proteína (o armazenamento em frigorífico ou arca congeladora é frequentemente necessário), fraca biodisponibilidade e formas de dosagem pouco amigas do doente, habitualmente na via parentérica.
Em processos de produção biotecnológica, as proteínas terapêuticas são, em geral, obtidas numa forma altamente purificada em solução aquosa. Quando se formulam estas soluções de proteína, e. g., para distribuição parentérica, a estabilização da proteína é importante. Por conseguinte, têm que ser escolhidos excipientes que estabilizam a proteína. A estabilidade de proteínas altamente purificadas em solução também pode ser afectada pelo tampão. Os tampões afectam a estabilidade de uma proteína em solução pela força iónica e pelo pH da solução. Os exemplos de tampões que foram utilizados para este efeito são os tampões de fosfato, citrato, maleato e succinato.
Mesmo se a proteína terapêutica estiver em solução no início da sua estabilidade em armazenamento, o desafio é manter a proteína em solução e prevenir a agregação durante o armazenamento, conduzindo à formação de particulados ou precipitação e prevenção da degradação (e. g., por hidrólise, oxidação, desamidação, truncamento ou desnaturação). 4 A temperatura também influencia a solubilidade. Normalmente, a solubilidade aumenta com a temperatura. Contudo, acima de um determinado limiar de temperatura, a proteína pode desenrolar-se parcialmente, conduzindo a solubilidade diminuída ou agregação/precipitação.
De modo a prevenir a agregação e degradação e de modo a obter-se um fármaco que seja estável ao longo de um período de tempo prolongado, uma formulação contendo um ou mais excipientes que estabilizam a proteína terapêutica necessita de ser desenvolvida. A presente invenção aborda a necessidade de uma formulação estável e farmaceuticamente aceitável para proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina, que são utilizadas como proteínas terapêuticas para o tratamento de doença humana. 0 documento WO 01/60397 descreve agonistas e antagonistas de moléculas relacionadas com o factor de necrose tumoral (TNF) e suas utilizações. O documento WO 02/094852 descreve proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina para utilização como compostos terapêuticos. O documento WO 2007/059188 descreve um anticorpo anti-CD20 para utilização no tratamento da lesão de articulação. O documento US 2006/067933 descreve polipéptidos relacionados com o receptor de TNF solúvel, polinucleótidos e composições relacionados e suas utilizações. 5
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada no desenvolvimento de formulações estáveis para proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina.
Num primeiro aspecto, a formulação da invenção compreende: a) proteína de fusão de TACI-imunoglobulina (TACI-Ig) compreendendo i. o domínio extracelular de TACI ou um seu fragmento ou variante que se liga a BlyS e/ou APRIL; e ii. um domínio constante de imunoglobulina; e b) um tampão de acetato tamponando a formulação a um pH variando entre 4,9 e 5,1; e c) trealose, numa concentração variando entre 60 e 100 mg/mL.
Num segundo aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo essa formulação.
Um terceiro aspecto da invenção refere-se à formulação ou à composição farmacêutica da invenção para tratamento ou prevenção de uma doença auto-imune ou um distúrbio linfoproliferativo. A descrição descreve um processo para a preparação de uma formulação de acordo com a invenção, compreendendo a etapa de 6 preparar uma solução líquida da proteína de fusão de TACI-Ig e ajustar o pH da referida solução líquida para um pH variando entre 4,5 e 5,5.
Um processo para preparação de uma formulação de acordo com a invenção pode compreender a etapa de carregamento de uma quantidade predeterminada da formulação num recipiente estéril.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada no desenvolvimento de uma formulação para proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina (TACI-Ig) , na qual a proteína de fusão de TACI-Ig é estável ao longo de um período de tempo prolongado (e. g., mais de 3 meses, mais de 6 meses, mais de 12 meses, mais de 15 meses ou mais de 18 meses).
De acordo com a presente invenção, a formulação compreende: a) proteína de fusão de TACI-imunoglobulina (TACI-Ig) compreendendo i. o domínio extracelular de TACI ou um seu fragmento ou variante que se liga a BlyS e/ou APRIL; e ii. um domínio constante de imunoglobulina; b) um tampão de acetato tamponando a formulação a um pH variando entre 4,9 e 5,1; e c) trealose, numa concentração variando entre 60 e 100 mg/mL. 7
Na formulação da invenção, o pH da formulação tem um pH variando entre 4,9 e 5,1. A formulação pode, deste modo, e. g., ter um pH de 4,9, 5,0 ou 5,1. Numa forma de realização preferida, o pH da formulação é 5,0. O tampão utilizado na formulação da invenção é tampão de acetato. O tampão pode ter um titulo na gama de 1 a 50 mM, de um modo preferido, 5 a 25 mM. Por exemplo, o tampão compreendido na formulação da invenção pode ter um titulo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 mM.
Numa forma de realização preferida da formulação da invenção, o tampão é tampão de acetato de sódio (Na-Acetato). Numa forma de realização da invenção, o tampão é 5 a 25 mM, de um modo preferido, 8 a 12 mM, de um modo mais preferido, cerca de 10 mM de tampão de Na-acetato.
Numa forma de realização, a formulação da invenção compreende um excipiente. São excipientes adequados, e. g., manitol, sorbitol, glicina ou trealose. O manitol ou sorbitol podem, e. g. , estar presentes na formulação a uma concentração variando entre 30 e 80 ou 40 e 60 ou cerca de 50 ou 51 mg/mL. A glicina pode, e. g., estar presente na formulação a uma concentração variando entre 10 e 30 ou, de um modo preferido, de 15 a 25, ou 20 ou 21 mg/mL. A trealose é um dissacárido (açúcar) composto por duas moléculas de glucose, ligadas por uma ligação alfa, alfa-1,1. A trealose, tal como trealose anidra, está presente na formulação da invenção numa concentração variando entre 60 e 100 mg/mL. Por exemplo, a formulação pode compreender 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 mg/mL de trealose. Numa forma de realização preferida, a formulação compreende cerca de 80 mg/mL de trealose anidra.
Embora a formulação da invenção possa compreender um excipiente ou sal, tais como NaCl, CaCl2, MgCl2, prefere-se, no contexto da presente invenção, que a formulação seja isenta de sal. A formulação pode ainda compreender um tensioactivo, tal como, e. g., Tween 20, ou, de um modo preferido, Poloxâmero 188 (Lutrol® ou Pluronic® F68) . De acordo com uma forma de realização da invenção, a formulação é isenta de um tensioactivo.
Numa forma de realização, a formulação da invenção compreende, ainda, um conservante. Prefere-se utilizar álcool benzilico em combinação com cloreto de benzalcónio como um conservante. Por exemplo, a formulação pode compreender 0,1% a 0,5% de álcool benzilico, e. g., 0,2%, 0,3% ou 0,4% de álcool benzilico e 0, 0007% a 0,0015% de cloreto de benzalcónio, e. g., 0,0008%, 0,0009%, 0,001%, 0,0011% ou 0,0012% de cloreto de benzalcónio. Numa forma de realização altamente preferida, a formulação compreende álcool benzilico a 0,3% em combinação com cloreto de benzalcónio a 0,001%. A formulação da presente invenção compreende proteína de fusão de TACI-imunoglobulina (TACI-Ig) como o composto terapeuticamente activo, i. e., como o ingrediente activo. A referida proteína de fusão de TACI-Ig compreende ou consiste em (a) o domínio extracelular de TACI ou um seu variante ou fragmento que se liga a BlyS e/ou APRIL; e (b) um domínio 9 constante de imunoglobulina. É compreendido pelo especialista na técnica que uma proteína de fusão de TACI-Ig a ser formulada de acordo com a presente invenção não é um anticorpo anti-TACI. Um anticorpo anti-TACI não compreenderia o domínio extracelular de TACI ou um seu variante ou fragmento que se liga a BlyS e/ou APRIL, mas seria dirigido contra um epitopo do domínio extracelular de TACI.
No quadro da presente invenção, a expressão "domínio extracelular de TACI" também se refere a qualquer seu variante sendo, pelo menos, 80% ou 85%, de um modo preferido, pelo menos, 90% ou 95% ou 99% idêntico ao domínio extracelular de TACI (SEQ ID N°: 1). A expressão "domínio extracelular de TACI" também inclui variantes compreendendo não mais de 50 ou 40 ou 30 ou 20 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 ou 1 substituições conservadoras de aminoácidos. Qualquer desses variantes é capaz de se ligar a BlyS e/ou APRIL e/ou qualquer heterotrímeros de BlyS-APRIL. De um modo preferido, esse variante também inibe a actividade biológica de BlyS e/ou de APRIL e/ou de qualquer heterotrímeros de BlyS/APRIL. A actividade biológica de BlyS ou APRIL é, e. g., proliferação de células B.
Os fragmentos (fragmentos activos) e variantes do domínio extracelular de TACI podem ser igualmente utilizados no contexto da presente invenção, desde que o fragmento seja capaz de se ligar a BlyS e/ou APRIL e/ou um heterotrímero de BlyS-APRIL. De um modo preferido, esse fragmento também inibe ou reduz a actividade biológica de BlyS e/ou de APRIL e/ou de um heterotrímeros de BlyS/APRIL. A capacidade de qualquer domínio extracelular de TACI, proteína de fusão de TACI-Ig ou qualquer seu variante ou 10 fragmento se ligar a BlyS e/ou APRIL e/ou heterotrímero de BLyS/APRIL pode ser avaliada, e. g. , de acordo com o Exemplo 2 abaixo. A capacidade de inibir ou reduzir a actividade biológica de BlyS, APRIL ou heterotrímero de BlyS/APRIL pode ser avaliada, e. g. , de acordo com o Exemplo 3 abaixo. É preferido, no contexto da presente invenção, que qualquer desses fragmentos ou variantes de um domínio extracelular de TACI ou uma proteína de fusão de TACI-Ig não tenha qualquer actividade biológica que seja significativamente mais baixa do que a de atacicept, i. e., uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3. A expressão "domínio constante de imunoglobulina (Ig)", como aqui utilizado, também é denominado um "domínio de Fc" e é derivado de uma imunoglobulina (Ig) humana ou animal que é, de um modo preferido, uma IgG. A IgG pode ser uma IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. 0 domínio de Fc, de um modo preferido, compreende, pelo menos, o domínio CH2, CH3 de IgGl, de um modo preferido, juntamente com a região de articulação.
De um modo preferido, o domínio constante de Ig é um domínio de IgGl humana.
Numa forma de realização, o domínio constante de IgGl humana foi modificado para citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) reduzidas.
Na ADCC, o domínio de Fc de um anticorpo liga-se a receptores de Fc (FcvRs) na superfície de células efectoras imunitárias, tais como assassinas naturais e macrófagos, 11 conduzindo à fagocitose ou lise das células visadas. Na CDC, os anticorpos matam as células visadas, pelo desencadeamento da cascata do complemento na superfície celular. A ligação de IgG às FcvRs de activação (FcyRI, FcvRIIa, FcYRIIIa e FcYRIIIb) e inibitórias (FcvRIIb) ou ao primeiro componente do complemento (Clq) depende de resíduos situados na região de articulação e no domínio de CH2. Duas regiões do domínio de CH2 são importantes para a ligação de FcvRs e Clq de complemento e têm sequências únicas em IgG2 e IgG4. Por exemplo, a substituição de resíduos de IgG2 nas posições 233-236 em IgGl humana reduziu grandemente a ADCC e CDC (Armour et al. , 1999 e Shields et al. , 2001) . As seguintes mutações de Fc, de acordo com as posições do índice EU (Kabat et al., 1991), podem, e. g. , ser introduzidas numa Fc derivada de IgGl:
T250Q/M428L
M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
E233P/L234V/L235A/AG236 + A327G/A330S/P331S E333A; K322A.
Mutações de Fc adicionais podem, e. g., ser as substituições nas posições do índice EU seleccionadas de 330, 331 234 ou 235 ou suas combinações. No contexto da presente invenção, uma substituição de aminoácido na posição 297 do índice EU, situada no domínio de CH2, também pode ser introduzida no domínio de Fc, eliminando um potencial sítio de conjugação de hidrato de carbono ligado a N. O resíduo de cisteína na posição 220 do índice EU também pode ser substituído com um resíduo de serina, eliminando o resíduo de cisteína que 12 normalmente forma ligações dissulfureto com a região constante de cadeia leve de imunoglobulina.
Os domínios de Fc particulares, adequados para proteínas de fusão de TACI-Ig, a serem utilizados de acordo com a presente invenção foram preparados.
Especificamente, foram geradas seis versões de uma Fc de IgGl humana modificada para criação de proteínas de fusão de Fc e são denominadas Fc-488, assim como Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 e Fc8. A Fc-488 (tendo uma sequência de ADN de SEQ ID N°: 4 e uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 5) foi concebida para clonagem conveniente de uma proteína de fusão contendo a região de Fc de γΐ humana e foi construída utilizando a região constante de γΐ de imunoglobulina humana de tipo selvagem como um molde. Preocupações com potenciais efeitos deletérios, devido a um resíduo de cisteína desemparelhado, conduziram à decisão de substituir a cisteína, que normalmente se liga por dissulfureto com a região constante de cadeia leve de imunoglobulina, com um resíduo de serina. Foi introduzida uma alteração adicional no codão codificando a posição 218 do índice EU, para introduzir um sítio de reconhecimento da enzima de restrição BglII, para facilidade de futuras manipulações de ADN. Estas alterações foram introduzidas no produto de PCR codificado nos iniciadores de PCR. Devido à localização do sítio BglII e de modo a completar a região de articulação de Fc, codões para as posições 216 e 217 do índice EU foram incorporados nas sequências parceiras de proteínas de fusão. Fc4, Fc5 e Fc6 contêm mutações para reduzir as funções efectoras mediadas pela Fc, pela redução da ligação de FcyRI e ligação de Clq do complemento. A Fc4 contém as mesmas substituições de aminoácido que foram introduzidas na Fc-488. Substituições de aminoácido 13 adicionais foram introduzidas para reduzir potenciais funções efectoras mediadas por Fc. Especificamente, foram introduzidas três substituições de aminoácido para reduzir a ligação de FcyRI. Estas são as substituições nas posições 234, 235 e 237 do índice EU. Mostrou-se que as substituições nestas posições reduzem a ligação a FcyRI (Duncan et al., 1988) . Estas substituições de aminoácido também podem reduzir a ligação de FcyRIIa, assim como a ligação de FcyRIII (Sondermann et al., 2000; Wines et al., 2000). Vários grupos descreveram a relevância das posições 330 e 331 do índice EU na ligação de Clq do complemento e subsequente fixação do complemento (Canfield e Morrison, 1991; Tao et al., 1993). As substituições de aminoácido nestas posições foram introduzidas em Fc4 para reduzir a fixação do complemento. O domínio de CH3 de Fc4 é idêntico ao verificado no correspondente polipéptido de tipo selvagem, à excepção do codão de terminação, que foi alterado de TGA para TAA, para eliminar um potencial sítio de metilação de dam, quando o ADN clonado é cultivado em estirpes dam positivas de E. coli.
Em Fc5, o resíduo de arginina na posição 218 do índice EU foi mutado de volta para uma lisina, porque o esquema de clonagem de BglII não foi utilizado em proteínas de fusão contendo esta Fc particular. O restante da sequência de Fc5 corresponde à descrição acima para Fc4. A Fc6 é idêntica a Fc5, com a excepção de que o codão de lisina carboxiterminal foi eliminado. A lisina C-terminal de imunoglobulinas maduras é frequentemente removida de imunoglobulinas maduras pós-traducionalmente, antes da secreção de células B, ou removida durante a circulação sérica. 14
Consequentemente, o resíduo de lisina C-terminal tipicamente não se verifica em anticorpos em circulação. Como em Fc4 e Fc5 acima, o codão de terminação na sequência de Fc6 foi alterado para TAA. A Fc7 é idêntica à Fc de γΐ de tipo selvagem, à excepção de uma substituição de aminoácido na posição 297 do índice EU, situada no domínio de CH2 · A posição Asn-297 do índice EU é um sítio de conjugação de hidrato de carbono ligado a N. 0 hidrato de carbono ligado a N introduz uma potencial fonte de variabilidade numa proteína expressa recombinantemente, devido a potenciais variações de lote para lote na estrutura de hidrato de carbono. Numa tentativa de eliminar esta potencial variabilidade, o Asn-297 foi mutado para um resíduo de glutamina, para prevenir a conjugação de hidrato de carbono ligado a N nessa posição de resíduo. 0 hidrato de carbono no resíduo 297 também está envolvido na ligação de Fc à FcRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000)).
Por conseguinte, a remoção do hidrato de carbono deverá, em geral, diminuir a ligação de Fc7 recombinante contendo proteínas de fusão às FcvRs. Como acima, o codão de terminação na sequência de Fc7 foi mutado para TAA. A Fc8 é idêntica à região de γ1 de imunoglobulina de tipo selvagem mostrada na SEQ ID N°: 4, com a excepção de que o resíduo de cisteína na posição 220 do índice EU foi substituído com um resíduo de serina. Esta mutação eliminou o resíduo de cisteína que normalmente se liga por dissulfureto com a região constante de cadeia leve de imunoglobulina. 15 A utilização de qualquer destes domínios de Fc específicos para formação de uma proteína de fusão de TACI-Ig está dentro do âmbito da presente invenção. 0 domínio constante de imunoglobulina de TACI-Ig, de um modo preferido, compreende ou consiste num polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, ou um seu variante sendo, pelo menos, 80% ou 85%, de um modo preferido, pelo menos, 90% ou 95% ou 99% idêntico ao domínio constante de Ig de SEQ ID N° : 2, ou um variante compreendendo menos de 50 ou 40 ou 30 ou 20 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 substituições conservadoras de aminoácidos, desde que não haja impacto na actividade biológica global da proteína de fusão de TACI-Ig e a imunogenicidade da proteína de TACI-Ig não seja significativamente mais elevada do que a de atacicept (SEQ ID N°: 3).
No contexto da presente invenção, o termo "identidade" reflecte uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas, determinada pela comparação das sequências. Em geral, identidade refere-se a uma correspondência exacta de aminoácido para aminoácido das duas sequências polipeptídicas, respectivamente, ao longo do comprimento das sequências sendo comparadas.
Para sequências onde não haja uma correspondência exacta, uma "% de identidade" pode ser determinada. Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para proporcionar uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de "lacunas" em uma ou ambas as sequências, para melhorar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode ser determinada ao longo do comprimento total de cada das sequências sendo comparadas (denominado alinhamento global), que é 16 particularmente adequado para sequências do mesmo comprimento ou comprimento semelhante ou ao longo de comprimentos definidos, mais curtos (denominado alinhamento local), que é mais adequado para sequências de comprimento desigual.
Os métodos para comparação da identidade de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Deste modo, por exemplo, os programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux J et al., 1984), por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, podem ser utilizados para determinar a % de identidade entre dois polinucleótidos e a % de identidade entre duas sequências polipeptídicas. 0 BESTFIT utiliza o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e procura a melhor região única de semelhança entre duas sequências. Outros programas para a determinação de sequências de identidade também são conhecidos na técnica, por exemplo, a família de programas BLAST (Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, acessível através da página inicial do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990).
As substituições de aminoácidos preferidas de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas como substituições "conservadoras". As substituições conservadoras de aminoácidos do domínio extracelular de TACI ou a porção do domínio constante de imunoglobulina da proteína de fusão de TACI-Ig, incluem aminoácidos sinónimos dentro de um grupo que têm propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes, que a substituição entre membros do grupo irá preservar a função biológica da molécula (Grantham, 1974) . É manifesto que as inserções e deleções de aminoácidos também podem ser realizadas nas sequências definidas acima, sem alteração da sua função, particularmente se as inserções ou deleções apenas envolverem 17 alguns aminoácidos, e. g., abaixo de 50 ou abaixo de 30, abaixo de 20 ou, de um modo preferido, abaixo de 10 ou abaixo de 5 resíduos de aminoácido e não removam ou desloquem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, tal como, e. g., resíduos de cisteína. As proteínas e variantes produzidos por essas deleções e/ou inserções pode ser utilizados para tratamento de MS recorrente, desde que a sua actividade biológica não seja significativamente inferior à actividade biológica de atacicept (uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3).
Os pedidos de patente internacional publicados como WO 00/40716 e WO 02/094852 divulgam sequências para o domínio extracelular de TACI, assim como fragmentos específicos do domínio extracelular de TACI que interagem com os seus ligandos, BlyS e APRIL.
Como divulgado, e. g., no documento WO 00/40716, o domínio extracelular de TACI compreende duas repetições ricas em cisteína (Cys) que são características para membros da superfamília do receptor do factor de necrose tumoral (TNF), a que o receptor TACI pertence. No documento WO 00/40716, também foi estabelecido que um variante de excisão de TACI, designado BR42x2, compreendendo apenas a segunda repetição rica em Cys, menos conservada, foi capaz de se ligar a BlyS. Por conseguinte, no quadro da presente invenção, o fragmento do domínio extracelular de TACI compreende ou consiste, de um modo preferido, pelo menos, nos resíduos de aminoácido 71 a 104 de SEQ ID N°: 1, correspondendo à segunda repetição rica em Cys. É ainda preferido que a proteína de fusão de TACI-Ig compreenda, ainda, os resíduos de aminoácido 34 a 66 de SEQ ID N°: 1, correspondendo à primeira repetição rica em Cys. 18
Numa forma de realização adicional da presente invenção, o referido fragmento do domínio extracelular de TACI, que se liga e inibe a actividade de BlyS e/ou APRIL, compreende ou consiste nos resíduos de aminoácido 30 a 110 de SEQ ID N°: 1.
Ainda numa forma de realização adicional da invenção, a proteína de fusão de TACI-Ig compreende ou consiste num polipéptido tendo a sequência de SEQ ID N°: 3, ou um seu variante sendo, pelo menos, 90% ou 95% ou 98% ou 99% idêntico a esta ou tendo menos de 3 0 ou 20 ou 15 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
Ainda numa forma de realização adicional da invenção, a proteína de fusão de TACI-Ig compreende ou consiste num polipéptido tendo a sequência de SEQ ID N°: 8, ou um seu variante sendo, pelo menos, 90% ou 95% ou 98% ou 99% idêntico a esta ou tendo menos de 30 ou 20 ou 15 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
Ainda numa forma de realização adicional da invenção, a proteína de fusão de TACI-Ig compreende ou consiste num polipéptido tendo a sequência de SEQ ID N°: 10, ou um seu variante sendo, pelo menos, 90% ou 95% ou 98% ou 99% idêntico a esta ou tendo menos de 30 ou 20 ou 15 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
Ainda numa forma de realização adicional da invenção, a proteína de fusão de TACI-Ig compreende ou consiste num polipéptido tendo a sequência de SEQ ID N°: 12, ou um seu 19 variante sendo, pelo menos, 90% ou 95% ou 98% ou 99% idêntico a esta ou tendo menos de 30 ou 20 ou 15 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
Ainda numa forma de realização adicional da invenção, a proteína de fusão de TACI-Ig compreende ou consiste num polipéptido tendo a sequência de SEQ ID N°: 14, ou um seu variante sendo, pelo menos, 90% ou 95% ou 98% ou 99% idêntico a esta ou tendo menos de 30 ou 20 ou 15 ou 10 ou 5 ou 3 ou 2 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
Noutra forma de realização da invenção, a formulação compreende uma proteína de fusão de TACI-Ig, numa concentração variando entre 20 mg/mL e 180 mg/mL, e. g., numa concentração de 25, 30, 35, 40, 45, ΟΊ O 55, 60, 65, 70, 75, O cr> LO co o OD 95, 100 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165 170, 175 mg/mL.
Numa forma de realização adicional da invenção, a formulação é na forma líquida (e. g., aquosa). Ainda numa forma de realização adicional, a formulação de acordo é para administração multidose. No contexto de uma formulação multidose, prefere-se incluir um conservante. Como mencionado acima, numa forma de realização preferida, a formulação compreende álcool benzílico (e. g., a 0,3%) e cloreto de benzalcónio (e. g., a 0,001%). A formulação de proteína de fusão de TACI-Ig pode ser para administração todos os dias ou de dois em dois dias, de um modo preferido, duas vezes por semana ou semanalmente. De um modo 20 preferido, a administração de TACI-Ig é uma administração de bólus, uma vez por semana. Alternativamente, a formulação também pode ser para administração de duas em duas semanas ou uma vez por mês. A formulação da presente invenção pode, e. g. , ser para as vias intravenosa, subcutânea ou intramuscular. Numa forma de realização da invenção, a formulação é para administração subcutânea. A formulação da presente invenção é destinada para tratamento de doença, de um modo preferido, para tratamento de doença humana. Por conseguinte, numa forma de realização, a formulação da invenção é preparada como composição farmacêutica. A formulação ou composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão de TACI-Ig é, de um modo preferido, para utilização no tratamento ou para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença auto-imune ou um distúrbio linfoproliferativo.
Uma doença auto-imune, no contexto da presente invenção, inclui mas não está limitada a, e. g., lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite de lúpus, artrite reumatóide, esclerose múltipla ou nevrite óptica.
Um distúrbio linfoproliferativo é uma doença na qual as células do sistema linfático crescem excessivamente. As malignidades de células B são, e. g., distúrbios linfoproliferativos. As malignidades de células B incluem mas não estão limitadas a leucemias e linfomas, tais como, e. g., leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica 21 aguda, leucemia de mieloblastos, leucemia promielocítica, leucemia mielomonocítica, eritroleucemia monocítica, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) , leucemia linfocítica crónica, policitemia vera, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo e macroglobulinemia de Waldenstrom. A presente invenção também se refere a um processo (como definido nas reivindicações) para a produção ou preparação de uma formulação de acordo com a invenção, compreendendo a etapa de misturar os componentes de (a) a (c) , de um modo preferido, numa solução liquida (e. g., aquosa). A presente invenção também se refere a um processo (como definido nas reivindicações) para a produção ou preparação de uma formulação de acordo com a invenção, compreendendo a etapa de colocar uma quantidade predeterminada da formulação num recipiente estéril. Uma quantidade predeterminada pode, e. g., ser 0,5 a 5 mL, de um modo preferido 1 a 2 mL.
Numa forma de realização da invenção, o recipiente é seleccionado de um frasquinho de vidro ou uma seringa pré-carregada. O frasquinho de vidro pode, e. g., ser fechado utilizando uma rolha não revestida ou uma rolha revestida. A rolha pode, e. g. , ser uma rolha de borracha ou uma rolha de bromobutilo. A seringa, e. g., uma seringa pré-carregada, pode ser rolhada com um êmbolo de borracha ou com um êmbolo revestido. O revestimento pode, e. g., ser um revestimento de silicone isento de óleo.
Uma seringa pré-carregada pode ter diferentes volumes, tais como 0,5, 1, 1,5, ou 2 mL. De um modo preferido, é uma seringa 22 de 1 mL. 0 volume de carregamento da seringa é, de um modo preferido, 1 ou 1,2 mL. A seringa pré-carregada pode ser feita de plástico ou, de um modo preferido, pode ser uma seringa de vidro. Uma seringa de vidro apropriada é, e. g., a seringa de vidro Hypac de 1 mL 27G1/2 RNG W 7974/50G, fabricada pela Becton Dickinson. A seringa pré-carregada pode, de um modo preferido, ser rolhada com uma rolha revestida (e. g., W4023/50G, fabricada pela FluroTec) e um êmbolo não revestido (e. g., W4023/50G, fabricado pela West Pharmaceutical) . De acordo com a presente invenção, a seringa pré-carregada compreende, de um modo preferido, uma quantidade de uma proteína de fusão de TACI-Ig na gama de 20 a 160 mg, tal como, e. g., 20, 25, 50, 75, 100, 125 ou 150 mg de substância de fármaco. Como mostrado no Exemplo 4 abaixo, uma formulação de uma proteína de fusão de TACI-Ig a pH 5,0, compreendendo tampão de acetato de sódio e trealose, foi estável ao longo de períodos de tempo prolongados, e. g., até 18 meses, quando mantida a 5 ou 25 °C. A utilização de valores numéricos nas diversas gamas especificadas neste pedido, salvo expressamente indicado em contrário, é referida como aproximações, como se os valores mínimo e máximo dentro das gamas referidas fossem ambos precedidos pela palavra "cerca de". Neste modo, ligeiras variações acima e abaixo das gamas referidas podem ser utilizadas para alcançar substancialmente os mesmos resultados que os valores dentro das gamas. Do mesmo modo, a divulgação de gamas é compreendida como uma gama contínua incluindo qualquer valor entre os valores mínimo e máximo enumerados, assim como quaisquer gamas que possam ser formáveis desse modo.
No contexto da presente invenção, a formulação ou composição farmacêutica da invenção, além de uma proteína de 23 fusão de TACI-Ig, pode compreender ou ser administrada em combinação com ingredientes activos adicionais. Por exemplo, um corticosteróide, em particular metilprednisolona, pode estar presente. Além disso, interferão beta, cladribina, mitoxantrona, acetato de glatiramer, natalizumab, rituximab, teriflunomida, fingolimod, laquinimod ou BG-12 (um fumarato oral). 0 tratamento combinado pode ser simultâneo, separado ou sequencial.
Tendo-se agora descrito totalmente esta invenção, será entendido pelos especialistas na técnica que a mesma pode ser realizada numa ampla gama de parâmetros, concentrações e condições equivalentes, sem sair da invenção como definida nas reivindicações e sem experimentação indevida.
Embora esta invenção tenha sido descrita com respeito às suas formas de realização especificas, será compreendido que é capaz de modificações adicionais. Este pedido pretende abranger quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo esses afastamentos da presente divulgação, como advém da prática conhecida ou habitual na técnica a que a invenção pertence e como podem ser aplicados às características essenciais expostas acima como sucede no âmbito das reivindicações anexas. A referência a etapas de método conhecidas, etapas de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é, de qualquer modo, uma admissão que qualquer aspecto, descrição ou forma de realização da presente invenção é divulgado, ensinado ou sugerido na técnica relevante. A descrição anterior das formas de realização específicas irá, assim, revelar totalmente a natureza geral da invenção que 24 outros podem, pela aplicação de conhecimento na especialidade da técnica (incluindo os conteúdos das referências aqui citadas), facilmente modificar e/ou adaptar para diversa aplicação dessas formas de realização especificas, sem experimentação indevida, sem sair do conceito geral da presente invenção, como definido nas reivindicações. Por conseguinte, essas adaptações e modificações devem ser entendidas como estando numa gama de equivalentes das formas de realização divulgadas, com base no ensinamento e orientação aqui apresentados. Deve ser compreendido que a fraseologia ou terminologia presente é para efeitos de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia da presente descrição deve ser interpretada pelo especialista na técnica à luz dos ensinamentos e orientação aqui apresentados, em combinação com o conhecimento de alguém com conhecimentos gerais na técnica.
Tendo-se agora descrito a invenção, será mais facilmente compreendido por referência ao seguinte exemplo de um esboço de estudo clínico exemplificativo, que é proporcionado a título de ilustração e não pretende ser limitativo da presente invenção.
EXEMPLO 1: DESENVOLVIMENTO DE UMA FORMULAÇÃO LÍQUIDA GLOSSÁRIO AUC: Ultracentrifugaçao Analítica CD: Dicroísmo Circular DLS: Dispersão de Luz Dinâmica 25 DSC: Calorimetria de Varrimento Diferencial IEC: Cromatografia de Permuta Iónica MALDI-ToF: Espectrometria de massa de Ionização de Desorção Laser Assistida por Matriz de Tempo de Voo OD: Densidade Óptica RALS: Dispersão de Luz de Ângulo Recto RP: Cromatografia de Fase Reversa SEC: Cromatografia de Exclusão de Tamanho.
MATERIAIS
- Substância de fármaco de TACI-Fc em tampão de fosfatos, pH 6 + NaCl a 140 mM - Substância de fármaco de TACI-Fc em tampão de fosfatos, pH 5 - Substância de fármaco de TACI-Fc em tampão de acetato, pH 5 - Ácido Ortofosfórico (1.00563, Merck) - Ácido succínico (1.00682, Merck) - Ácido citrico (1.59134, Merck) 26 - Histidina (1.04351, Merck) - Ácido acético glacial a 100% (1.00063, Merck); - D-Manitol DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421 (1.05980,
Merck) - D-Sorbitol (S-1876, Sigma) - Sacarose DAB, Ph Eur, BP, NF (1.07653, Merck) - Trealose (1.08216, Merck) - D-Glucose mono-hidratada (346971, Cario Erba) - Péletes de hidróxido de sódio GR (1.06498, Merck) - Tween 20 para sintese (8.22184, Merck); - Poloxâmero 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf) - Cloreto de cálcio di-hidratado (1.02382, Merck) - Cloreto de magnésio (1.05833, Merck) - Cloreto de sódio (1.06404, Merck) - Cloridrato de arginina (A-5131, Sigma); - Cloridrato de lisina (1.0571, Merck) - Glicina (5.00190, Merck); 27 - Acetonitrilo (00030, Merck) - IOxPBS (P/N 70013-032, Gibco) - Ácido trifluoroacético (9470, Baker) - Sulfato de amónio (1.01217, Merck) - Hidróxido de sódio a 1 N (1.09137, Merck) - Ácido clorídrico a 1 N (1.09057, Merck) - Água de grau de HPLC (MilliQ) - Água para Injecção - Sulfato de sódio anidro (código 6649, Merck) - Metanol (código 06009, Merck) - Azida de sódio (código 6688, Merck)
Di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado 06346, Merck)
Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado (código Merck)
Para bioensaio: - Células Jurkat pKZ142 clone.24 (WCB) (código 06580, 28 TACI-Fc5 (1-8,66 mg/mL) - zTNF4 (1,44 mg/mL) - RPMI 1640 com e sem vermelho de fenol (Gibco) - Soro Fetal de Bovino (FBS) (GIBCO) - L-glutamina (Hyclone) - Piruvato de sódio (Gibco) Puromicina (Sigma)
Steady GLO Luciferase Assay Buffer and Substrate (ProMega. E2510) - Placas de 96 poços de cultura de tecidos brancas com tampas (Dynex) - Placas de 96 poços com tampas (Falcon) - Tubos de polipropileno de 5 mL (Falcon)
EQUIPAMENTO - Sistemas de HPLC (Waters) - Pipetas calibradas (Gilson)
Calorímetro de Varrimento Diferencial (mod. 2920, TA Instruments) 29 - Microcalorímetro (mod. VP-DSC, MicroCal) - Medidores de pH (mod. 713, Metrohm) - Osmómetro (Osmomat 030-D, Gonotec) - Espectropolarímetro J-810, equipado com um controlo de Peltier para temperatura, PTC-423S (Jasco) - Espectrofluorómetro FluoroMax3, equipado com um leitor de microplacas, MicroMax384 (Jobin Yvon) - Placas de 96 poços MaxSorp (Nunc) - Espectrofotómetro lambda 354 (Perkin-Elmer)
Cuvetas de quartzo de percurso óptico de 0,1 e 1 cm (Perkin Elmer) - Zetasizer Nano Series (Malvern) - Cuvetas de quartzo de volume reduzido (—70 pL) - Sistema Stirred Cell (mod. 8400 ou 8450, Amicon) - Membrana de 10 kDa de exclusão (tipo YM10, Amicon)
Suportes de aço inoxidável de 22 mL e 220 mL de capacidade (Sartorius) - Filtros de membrana de 0,22 pm (Durapore tipo GWVP, Millipore) 30 - Filtros de membrana de 0,45 pm (Durapore tipo Millipore)
Espectrofotómetro de fluorescência/RALS Technology International) - Agitador IKA-Vibrax-VXR (IKA-Works, Inc.) - Liofilizadores (Lyoflex 06, Lyoflex 08, Edwards) - Vortex (Fale) - Armários termostáticos (Heraeus) - Arcas congeladoras (Angelantoni)
Para bioensaio: - Leitor de placa de luminómetro, Lumicount Packard - Software Graph Pad Prism - Câmara de Fluxo Laminar (Flow Laboratories) - Incubadora de 37 °C e C02 (Heraeus)
- Banho-maria de 37 °C - Cell Coulter - Microscópio HVLP, (Photon 31 - Plataforma de Agitaçao - Centrífuga de Bancada
Pipetas calibradas simples e multicanal e pontas de pipeta - Auxiliar de pipeta
MATERIAL DE EMBALAGEM PRIMÁRIO - Frasquinhos de vidro DIN2R (3 mL) (Nuova OMPI) - Rolhas de borracha Flurotec (S2F452, D777-1, B2-40, West
Pharmaceutical) - Rolhas de borracha (1779 W1816 grey, Pharmagummi)
MÉTODOS
Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) Método 1
As amostras foram diluídas para 0,5 mg/mL com PBS1X, pH =7,2 e 40 pL (20 pg) carregados num gel de TSK G3000SWXL, 5 pm, 7, 8 x 300 mm. Para cada corrida, o eluente foi fosfato de sódio a 0,05 M, sulfato de amónio a 0,5 M, pH = 6,0. 32 Método 2
As amostras foram diluídas para 0,25 mg/mL na fase móvel e 40 pL (20 pg) carregados num gel de TSK G3000SWXL 5 pm, 7, 8 x 300 mm, ligado a uma pré-coluna de gel de TSK SWXL de 6 mm x 4 cm. Para cada corrida, o eluente foi fosfato de sódio a 0,05 M, sulfato de amónio a 0,5 M, pH = 6,0.
Cromatografia de Fase Reversa (RP)
As amostras foram diluídas para 0,5 mg/mL com PBS1X pH = 7,2 e 40 pL (20 pg) carregados numa coluna PLRP 4000 Á de 8 pm, 50 x 4,6 mm, equilibrada em 71% de tampão A (TFA a 0,1% em água) e 29% de tampão B (TFA a 0,1% em acetonitrilo) . As amostras foram eluídas utilizando um gradiente linear com um caudal de 2 mL/min. A curva de calibração foi gerada pela injecção de diferentes quantidades de padrão (IRS TACI-Fc5 2002/2001) .
Truncamento de Terminação C (RP)
As amostras foram submetidas a digestão enzimática (Lys-C), durante 2 horas, a 37 °C e, depois, corridas em Cromatografia de fase reversa em Vydac C18 (4,6 x 50 mm) com pré-coluna,
Eluente A: TFA a 0,1% em água B: TFA a 0,08% em CH3CN a 70%
Fluxo: 1 mL/min T. : 40° +/- 5 °C Detecção: 214 nm 33
Gradiente de eluição: de B a 15% para 23% em 7 minutos. Total de 15 minutos.
Formas Cortadas (RP)
As amostras de produto de fármaco de TACI-Fc foram diluídas em água purificada, de modo a obter-se uma concentração de proteína de 4 mg/mL. Depois, 10 pL da amostra diluída são diluídos em 200 pL da solução de redução desnaturante (DTT a 0. 15 M em guanidina a 6 M) , agitados em vórtice e, finalmente, incubados a 60 ± 2 °C, durante 90 minutos. 75-150 pL (15-30 pg) são injectados na coluna (butilo de poro largo, 5 mm, 4,6 mm 1. d. x 50 mm, cód. 7116-05, de J. T. Baker) anteriormente equilibrada com as condições de partida (71% de eluente A, ácido trif luoroacético a 0,05% em água e 29% de eluente B, ácido trifluoroacético a 0,04% em acetonitrilo). Dímero de Fc livre (IEC)
As amostras de produto de fármaco de TACI-Fc foram diluídas numa solução de Poloxâmero 188 a 100 mg/L, em tampão de fosfato de sódio a 10 mM, pH 4,00, de modo a obter-se uma concentração de proteína de 10 mg/mL. No caso de concentração de TACI-Fc superior a 100 mg/mL, a diluição das amostras deve ser realizado por pesagem. 25 pL (250 pg) são injectados na coluna (ProPac WCX-10G (pré-coluna), 4 x 50 mm, cód. 054994, da Dionex), anteriormente equilibrada com as condições de partida (80% de eluente A, Fosfato de Sódio a 10 mM, pH 4,00 e 20% de eluente B, Fosfato de 34 Sódio a 10 inM, pH 4,00+KCl a 0,5 M) .
Formas Oxidadas (MALDI-ToF)
Um mapeamento peptídico foi desenvolvido nas amostras de substância de fármaco de TACI-Fc e a aplicabilidade da detecção de MALDI-ToF para quantificação das formas oxidadas verificada.
Ultracentrifugação Analítica (AUC)
As amostras foram carregadas em células com peças centrais epon de carvão de 2 canais, com percurso óptico de 12 mm. As amostras foram diluídas utilizando um tampão de eluição de SE-HPLC como diluente, de modo a mimetizar as condições da testagem de HPLC. O tampão correspondente foi carregado no canal de referência (o instrumento trabalha como um espectrofotómetro de feixe duplo). As células carregadas foram, depois, colocadas num rotor analítico AN-50TÍ, carregado numa centrífuga analítica Óptima XL-I, Beckman. A análise foi efectuada com as seguintes configurações experimentais:
Tipo de rotor: Rotor de 8 cavidades
Velocidade de rotor: 40 K rpm peças centrais:
Epon de carvão
Comprimento de canal: 12 mm
Temperatura durante a corrida de AUC: 20 °C ± 0,2 °C 35
Comprimento de onda de detecção: 280 nm
Concentração de amostra: 0,5 mg/mL Volume de amostra: 432 mL/canal Volume de referência: 442 mL/canal
Os dados foram analisados utilizando o método de c(s), desenvolvido por Peter Schuck no N.I.H., e implementado no seu programa de análise SEDFIT (versão 8.7).
Calorimetria de Varrimento Diferencial (DSC) DSC 2920 CE por TA Instrument: Gama de T = 25-100 °C; taxa de aguecimento = 2 °C/min; os recipientes de elevado volume (HVP) foram carregados com 75 pL de solução; os placebos foram utilizados como soluções de referência.
Microcalorímetro MicroCal VP-DSC: gama de T = 25-100 °C; taxa de aquecimento = 70 °C/hora; resposta =15 s; passo de dados = 0,2-8 °C; a célula de amostra foi carregada com cerca de 600 mL de solução de Taci-Fc5 a 5 mg/mL; a água foi utilizada como solução de referência.
Densidade Óptica (OD)
Foram preparadas soluções de TACI-Fc5 a 0,5 mg/mL (por diluição com água) e as suas concentrações (c) obtidas pela equação de Lambert-Beer: OD = ε b c (ε = coeficiente de extinção molar; b = espessura de célula óptica). 36 Ε (280 nm) = 1,56 (mL/mg) .cm-1. A concentração das soluções de partida foi determinada pela multiplicação destes valores calculados pelo factor de diluição.
Dicroísmo Circular (CD)
Análise Conformacional O CD é geralmente utilizado para o estudo da conformação de péptidos e proteínas. Vários factores podem afectar o aparecimento dos picos característicos nos espectros de CD, ambos na região de UV distante (180-250 nm) e na de UV próximo (250-350 nm), tais como concentração de proteína, temperatura, pH e força iónica. Na literatura são referidas posições de bandas gerais observadas no UV distante e representam tipos particulares de estrutura secundária (hélice a, folha β, enrolamento aleatório) . As bandas de CD observadas na gama de UV próximo são devidas, principalmente, a Trp, Tyr, Phe e ligações dissulfureto.
Contudo, deve ser salientado que o sinal da ligação dissulfureto é, em geral, muito mais fraco do que o dos aminoácidos aromáticos. Desde que estes resíduos se situem num ambiente assimétrico, um sinal de CD pode ser proporcionado. As alterações conformacionais na estrutura terciária da proteína conduzem, habitualmente, a variações do ambiente de partida causando, deste modo, uma modificação no espectro de CD. De facto, numa proteína nativa, os aminoácidos individuais ocupam posições únicas na estrutura tridimensional. As alterações nesta estrutura poderiam conduzir a uma alteração na sua acessibilidade. 37
Configurações de espectros de CD de UV próximo
Taxa de varrimento = 5-20 nm/min; gama = 250-350 nm; resposta = 8 s; concentração = 2 mg/mL; percurso óptico = 1 cm; passo de dados = 0,5 nm; largura de banda = 1 nm; acumulações = 2. Sensibilidade padrão. Os espectros foram adquiridos à temperatura ambiente.
Configurações de espectros de CD de UV distante
Taxa de varrimento = 5-2 0 nm/min; gama = 2 0 0-300 nm; resposta = 8 s; concentração = 0,25 mg/mL; percurso óptico =0,1 cm; passo de dados =0,5 nm; largura de banda = 1 nm; acumulações = 2. Sensibilidade padrão. Os espectros foram adquiridos à temperatura ambiente.
Temperaturas de Desenrolamento
Os varrimentos de temperatura, monitorizados por CD a um comprimento de onda fixo, são uma ferramenta valiosa para investigar a estrutura secundária e terciária da proteína a diferentes temperaturas. Essa medição torna possível avaliar a temperatura de desenrolamento de proteína (Tunf) em diferentes formulações. Embora a Tunf não tenha uma relação directa com a energia livre do desenrolamento de proteína (que é um indicador da estabilidade de proteína), é largamente aceite que qualquer aumento na Tunf deve ser correlacionado com um aumento na estabilidade de proteína. Por conseguinte, uma alteração na Tm poderá indicar se uma composição particular tem qualquer efeito estabilizante ou desestabilizante. A desnaturação térmica foi 38 investigada pela monitorização da variação do sinal de Trp (triptofano), associado a alteração conformacional de proteína com a temperatura. As formulações de substância de fármaco sofreram um aquecimento (1 °C/min) na gama de 55-70 °C. O efeito da temperatura na estrutura terciária foi detectado por alterações no mínimo relativo de elipticidade de CD a 292,5 nm. Foram utilizados ajustes polinomiais de quarto grau para calcular o valor das temperaturas de transição.
Configurações de varrimento de temperatura de CD
Gama de T = 55-70 °C; taxa de aquecimento = 1 °C/min; λ = 292,5 nm; concentração = 2 mg/mL; resposta = 8 s; passo de dados = 0,2-8 °C; largura de banda = 1,5 nm. Sensibilidade padrão. Taxa de agitação = baixa.
Dispersão de Luz Dinâmica (DLS)
A dispersão de luz dinâmica mede a dispersão induzida pelo Movimento Browniano de partículas e relaciona-a com o tamanho das partículas. Requer a submissão das partículas a um raio laser e a análise das flutuações de intensidade na luz dispersada. Mais precisamente, a velocidade das partículas que se movem devido ao Movimento Browniano é relacionada com o tamanho das partículas (equação de Stokes-Einstein). O correlacionador digital mede o grau de semelhança entre dois sinais (neste caso, sinais de intensidade) ao longo de um período de tempo e proporciona informação relacionada com a natureza e extensão das flutuações de intensidade de dispersão, que estão relacionadas com as dimensões das partículas. Após a 39 função de correlação ter sido determinada, pode, depois, ser utilizada para calcular a distribuição de tamanhos. 0 Zetasizer Nano Series mede a intensidade de dispersão próximo de 180° (detecção de retrodispersão). Essa configuração reduz o efeito de múltipla dispersão através da amostra e o efeito de contaminantes de grandes dimensões. Foi utilizada a cuveta de determinação de tamanho descartável (volume interno ~70 pL) . As medições foram efectuadas a T = 25 °C. Tempo de equilibração = 1 min; número de corridas =11; duração de corrida = 10 s; número de medições = 2. Dispersante: água (viscosidade = 0,8872 cP; índice refractivo = 1,330). Não foram realizadas diluições.
Dispersão de Luz de Ângulo Recto (RALS) utilizando Fluorescência A RALS é medida utilizando um detector de fluorescência, no qual os comprimentos de onda de excitação e emissão foram fixos de forma idêntica. Nesta configuração, o detector de fluorescência torna-se num detector de RALS muito sensível. Os aumentos em RALS são indicativos de agregação/precipitação numa amostra.
Fluorescência
Fluorescência Intrínseca
As proteínas contêm três resíduos de aminoácido aromáticos (triptofano: Trp; tirosina: Tyr; fenilalanina: Phe), que podem 40 contribuir para a sua fluorescência intrínseca. A fluorescência de uma proteína enrolada é uma combinação da fluorescência de resíduos aromáticos individuais. A fluorescência de proteína é, em geral, excitada a 280 nm ou a comprimentos de onda maiores, habitualmente a 295 nm. A maioria das emissões deve-se à excitação de resíduos de triptofano, com algumas emissões devido a tirosina e fenilalanina. A intensidade, rendimento quântico e comprimento de onda de emissão de fluorescência máxima de triptofano estão muito dependentes do solvente. Os desvios do espectro de fluorescência para comprimento de onda mais curto e a intensidade da fluorescência aumentam à medida que a polaridade do solvente circundando os resíduos de triptofano diminui. Os resíduos de triptofano, que estão ocultos no núcleo hidrófobo das proteínas, podem ter espectros que são desviados em 10 a 20 nm, em comparação com triptofanos na superfície da proteína. Além disso, a fluorescência de triptofano pode ser neutralizada pela colocação em vizinhança de grupos acídicos protonados, tais como Asp ou Glu. Deste modo, a fluorescência pode ser utilizada como uma poderosa ferramenta de monitorização que reflecte as variações no microambiente no qual se situam os resíduos aromáticos. O MicroMax 384 é um leitor de placas de micropoços capaz de aceitar placas com até 384 poços e de se ligar ao espectrofotómetro FluoroMax. A luz dos monocromadores de excitação e emissão é transportada por meio de um feixe de fibra óptica de e para o MicroMax 384, deste modo, o utilizador pode varrer com o espectrofotómetro principal e seleccionar qualquer par de comprimento de onda de excitação e emissão para medições de intensidade. Todo o controlo do MicroMax 384 é automatizado através de software DataMax; a selecção personalizada de Micropoços na placa é possível através do software. 41
Os varrimentos de fluorescência de alta capacidade foram corridos utilizando o leitor de placas Micromax 384 utilizando as seguintes configurações: aberturas de excitação e emissão = 5 nm; Xexc= 280 nm; gama de emissão = 300-450 nm; tempo de integração = 0,1 s. Não foi feita diluição. O comprimento de onda de emissão máximo foi automaticamente calculado pelo software Fluromax 3.
RALS
As medições de RALS são realizadas correndo varrimentos síncronos (Àexc = Xem) com o espectrofotómetro FluoroMax entre 500-800 nm. Nestas condições (sem absorção pela amostra e sem influência pela fonte de luz), a intensidade revelada deve-se, principalmente, a fenómenos de dispersão (luz incidente/proteína) ocorrendo em solução. A intensidade dispersada total aumenta com dimensões crescentes de proteína, deste modo, esta técnica pode ser útil para monitorizar a ocorrência de eventos, tais como agregação, dissociação de subunidade, degradação, etc. A intensidade de dispersão também depende da concentração de proteína e índice refractivo, assim, as medições comparativas devem ser realizadas à mesma concentração de proteína.
As medições de RALS foram efectuadas pela configuração dos seguintes parâmetros: varrimento síncrono; gama de comprimento de onda = 500-800 nm; aberturas = 15 nm; tempo de integração = 0,5 s; compensação = 0 nm; concentração de amostra = 35 mg/mL (a água milliQ foi utilizada como diluente). 42
Anisotropia de emissão de fluorescência A rotação de macromoléculas depende do seu tamanho, forma e ambiente local (i. e., solvente). As medições de emissão polarizada são, frequentemente, utilizadas para detectar pequenas alterações no tamanho molecular (agregação, ligação, clivagem), assim como alterações ambientais (viscosidade local, transições de fase, etc.). A primeira etapa nestas medições é a excitação de um grupo seleccionado de fluoróforos (fotosselecção) . A luz polarizada verticalmente é, tipicamente, utilizada para excitar uma população de moléculas cujo dipolo de absorção está orientado na direcção vertical. Nesta fase, a luz de excitação polarizada verticalmente é produzida utilizando um polarizador no percurso de excitação. Uma vez excitada, a molécula pode rodar durante o tempo de vida do estado excitado (~1CT9 s) . Essa rotação irá despolarizar a emissão de fluorescência. As medições dos componentes de emissão polarizada permitem o cálculo do tipo e extensão dos movimentos rotacionais da molécula. Os componentes polarizados da emissão de fluorescência são medidos utilizando um polarizador no percurso de emissão. A partir da magnitude dos componentes de emissão vertical (V) e horizontal (H) , a extensão e tipo de comportamento rotacional podem ser calculados. A anisotropia (A) é uma razão definida como a diferença entre a intensidade do componente polarizado linearmente dividida pela intensidade de luz total: A = (Iw—G Ivh)/ (Iw + 2G Ivh)
Onde: G é um factor de correcção, G = Ihv/Ihh 43
Nestas equações, o primeiro subscrito para intensidade, I, indica a posição do polarizador de excitação (H ou V) e o segundo o polarizador de emissão (H ou V) . A anisotropia de fluorescência, quando o comprimento de onda de excitação é fixo a λ = 295 nm, dá informação relacionada com a mobilidade dos resíduos de Trp e sobre a viscosidade local que sentem. Deste modo, um aumento na anisotropia de fluorescência pode reflectir um ambiente mais rígido destes resíduos nas proteínas.
As medições de anisotropia foram efectuadas pela configuração dos seguintes parâmetros: Xexc = 295 nm; gama de emissão = 330-350 nm; tempo de integração =0,5 s; aberturas = 15 nm; concentração de amostra = 35 mg/mL (a água milliQ foi utilizada como diluente).
Bioensaio O bioensaio in vitro de TACI-Fc é baseado em células transfectadas em Jurkat (linfócito de célula T agudo humano) (Jurkat pKZ142). Esta linha celular foi transfectada com 2 plasmideos. O primeiro codifica o ADNc de TACI de comprimento completo sob controlo do promotor de CMV e o segundo com NF-kB/AP-1 dirigindo um gene repórter de luciferase. O método é baseado na capacidade de o zTNF 4 se ligar ao receptor TACI de superfície celular, provocando uma cascata de transdução de sinal, resultando na estimulação do gene repórter de luciferase de NF-kB/AP-1 transfectado. A presença de TACI-Fc solúvel inibe o zTNF4 de se ligar ao receptor TACI reduzindo, desse modo, a expressão de luciferase. 44
As células Jurkat pKZl42 foram incubadas com padrão de TACI-Fc para construir uma curva de dose-resposta total (de 27, 86 a 1,63 U/mL) e com amostras testadas a duas concentrações situadas na parte linear da curva-padrão (i. e., 4 e 6 U/mL). A solução de zTNF4 é, depois, adicionada à curva-padrão e amostras, à concentração que é capaz de induzir a produção submáxima de luciferase (i. e., 150 ng/mL/poço); a produção mínima e máxima de luciferase também é realizada como controlo. Após 4 h de incubação, a 37 °C (C02 a 5%), as células são adicionadas com o kit Steady Glo de luciferase e a expressão de luciferase é detectada por um luminómetro. A potência das amostras é calculada pela interpolação dos valores de Y (RLU) para as duas concentrações testadas na parte linear da curva de dose-resposta padrão alcançando-se, deste modo, a concentração de TACI-Fc no eixo x (software Graph Pad) . Faz-se a média dos valores das duas concentrações de ensaios independentes e, depois, a actividade biológica de TACI-Fc5 é calculada realizando-se a média aritmética da potência obtida de cada ensaio independente.
PROCESSO de PRÉ-FORMULAÇÃO O efeito do pH, tipo de tampão e excipientes na estabilidade de proteína foi avaliado. As soluções de TACI-Fc, a uma concentração de 70 ou 100 mg/mL, foram preparadas para investigar de modo preliminar as seguintes variáveis: - pH (4, 5, 6, 7) 45 - tampão (acetato, fosfato, succinato, citrato, histidina) - açúcares (manitol, sorbitol, glucose, sacarose, trealose) excipientes (cloreto de sódio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, glicina)
Além disto, os seguintes estudos de pré-rastreio adicionais foram efectuados em TACI-Fc5, a 70 mg/mL: - ciclos de congelação-descongelação (F-T) (1, 3, 5 F-T) em tampão a 20 mM (histidina, fosfato, succinato, citrato), a pH 5-6-7; - incubação a 40 °C (condições de agitação & não agitação); armazenamento a 2-8 °C em tampão a 20 mM (acetato, histidina, fosfato), a pH 4-5-6.
Com base nos resultados surgindo destas primeiras observações, dois tampões (fosfato e histidina) , a pH 5 e 6, foram seleccionados e um segundo conjunto de formulações preparado, para investigar o efeito da inclusão de agentes estabilizantes adicionais (a 0,280 OSM de osmolalidade residual). Os seguintes agentes estabilizantes foram testados: Glucose, Manitol, Sorbitol, Sacarose, Trealose, Glicina, NaCl,
MgCl2, CaCl2 ·
As soluções foram armazenadas a 2-8 °C, 25 °C e 40 °C e testadas até 14 dias para agregados (SE-HPLC), teor de proteína (RP-HPLC), pH e aparência. 46
CONCEPÇÃO EXPERIMENTAL
Com base na selecção realizada durante a fase anterior, foi implementada uma concepção experimental para avaliar a influência de factores anteriormente investigados em diferentes níveis, com respeito a estabilidade de proteína. As formulações em tampão de acetato e histidina foram testadas juntamente com os seguintes tensioactivos: Poloxâmero 188 (Lutrol® F-68) e Tween 20 e com os seguintes excipientes: Arginina, Glicina, Lisina, Manitol e Trealose. Estas formulações foram armazenadas em frasquinhos de vidro, a 2-8 °C, 25° e 40 °C e testadas para agregados (por SE-HPLC e AUC), pH, aparência e osmolalidade. Também foram aplicados métodos analíticos biofísicos (e. g., dicroísmo circular, espectroscopia de 2a derivada de UV, fluorescência intrínseca).
FORMULAÇÕES CANDIDATAS
No fim da fase de pré-formulação, algumas formulações candidatas foram identificadas contendo TACI-Fc a 70 ou 100 mg/mL, tampão de acetato a 10 mM, manitol (51 mg/mL) ou trealose anidra (80 ou 96 mg/mL) como excipiente, com ou sem Poloxâmero 188 (Lutrol® F-68) (0,05 mg/mL). Os valores de pH de 4,8, 5,0, 5,2 e 5,4 foram testados.
Todas as soluções foram filtradas de modo asséptico através de uma membrana Durapore de 0,22 pm e recolhidas num recipiente esterilizado. As soluções foram, depois, introduzidas em frasquinhos DIN2R de vidro (volume de carregamento de 1 mL) . As amostras em processo (antes e após filtração) foram retiradas durante a preparação, para avaliar a perda de proteína ou 47 aumento na agregação.
As amostras foram armazenadas a 2-8 °C, 25 °C e 40 °C e testadas até 1 mês (40 °C) e 6 meses (2-8 °C e 25 °C).
As formulações candidatas foram testadas para agregados (SE-HPLC, AUC) , teor de proteína (SE-HPLC) , pH, osmolalidade e actividade biológica. A extensão do truncamento de terminação C e a percentagem de formas truncadas/cortadas também foram determinadas. Também foram aplicados métodos biofísicos (fluorescência intrínseca, dispersão de luz dinâmica, dispersão de luz de 900) . O efeito de congelação-descongelação também foi avaliado em amostras líquidas das formulações candidatas, armazenadas a 2-8 °C: as amostras foram congeladas a -80 °C e, depois, descongeladas à temperatura ambiente. A quantidade de agregados antes e após congelação-descongelação foi avaliada por SE-HPLC. O efeito da agitação de 24 horas para estimular o envio do produto de fármaco foi avaliado em amostras armazenadas a 2-8 °C, que tinham sido colocadas sob agitação num agitador de microplacas, à temperatura ambiente, durante 24 h. O nível de agregados foi avaliado por SE-HPLC vs o nível inicial. 48
RESULTADOS
As formulações candidatas estavam em Na-Acetato a 10 mM.
Formulação TACI—Fc (mg/mL) Composição 21a 70 pH 5, Trealose a 96 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 21B 70 pH 5, Trealose a 80 mg/mL 21C 70 pH 5,4, Trealose a 80 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 21D 100 pH 5, Trealose a 80 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 21E 100 pH 5, Trealose a 80 mg/mL 21F 100 pH 5,4, Trealose a 80 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 21G 100 pH 5, Trealose a 51 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 21H 100 pH 5, Manitol a 51 mg/mL 211 100 pH 4,8, Trealose a 80 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 21L 100 pH 5,2, Trealose a 80 mg/mL, Poloxâmero 188 a 0,05 mg/mL (Lutrol® F-68) 49
Os resultados detalhados sao referidos nas seguintes tabelas A a T.
Tabela A: % De agregados totais por SE-HPLC (2-8 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 4w 6w 8w 12w 16w 26w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 3,3 3,6 3,7 3,2 2,9 - 2, 0 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,4 3,7 3, 8 3,5 3, 0 - 2,1 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,4 3,6 CO 00 3,9 3,1 - 2,2 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,4 3,6 3,9 3,5 3, 0 - 2,3 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,7 4,5 3,8 CO oo 3,3 - 2,3 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 3,7 3,9 3,4 3,4 - 2,8 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 3,7 3,7 3,9 4,1 3,2 - 2,6 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 3,8 3,7 4, 1 3,6 3,3 - 2,6 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 3,3 2,9 3,0 - 2,6 - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 3,4 3,3 3,3 - 2,7 -
Material em bruto utilizado: S128/L20a (tampao de acetato de sódio a 10 mM, pH = 5,0). % De agregados totais =3,9 50
Tabela B: % De agregados totais por SE-HPLC (25 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 2w 4w 6w 8w 12w 17w 27w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 3,3 2,6 4,0 3,8 3,7 3,5 - 3,4 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,4 3,0 3,7 4,1 3,9 3,4 - 3,5 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,4 3,1 3,9 4,2 4,6 4,0 - 4,5 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,4 5, 0 4,0 4, 1 4, 4 4,2 - 4, 4 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,7 3,3 3,9 4,6 4,5 4,4 - 4,7 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 3,8 4,5 5, 0 5, 1 5,2 - 6,5 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 3,7 3,9 3,9 4, 7 4, 7 4,5 - 4,9 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 3,8 3,4 3,9 4,6 4,5 4, 4 - 4,9 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 3,0 3,6 3,3 3,5 - 5, 0 - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 3,4 4, 1 3,8 4,2 - 4,9 -
Material em bruto utilizado: S128/L20a (tampao de acetato de sódio a 10 mM, pH = 5,0). % De agregados totais =3,9 51
Tabela C:
o O
De agregados totais por SE-HPLC (40 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 lw 2w 4w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 3,3 3,9 4, 1 6,1 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,4 4,0 4, 4 6,3 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,4 4, 4 5,3 7, 4 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,4 5, 0 5,3 7,9 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,7 5, 0 5,5 7,9 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 6,2 7, 4 11, 0 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 3,7 5, 0 6,1 8,4 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 3,8 5,9 6,1 8,4 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 6,1 7, 4 12,2 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,6 7,6 8,9 14, 0
Material em de sódio a 10 mM, bruto utilizado: S128/L20a (tampao de pH = 5,0). % De agregados totais =3,9 acetato 52
Tabela D: % De dímero por AUC (2-8° C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição 4w 8w 13w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 4,0 7,4 3,0 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,2 1,6 3,6 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 7,5 2,6 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 4,2 3,7 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,3 4,5 3,2 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 4,0 2,9 4, 1 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 3,1 4,0 3,1 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 3,7 4, 7 2,8 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,9 - - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,5 - -
Tabela E: % De agregados grandes por AUC (2-8 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição 4w 8w 13w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 2,3 ND CO 1,1 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 2,0 0,5 2,5 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 3,0 0,6 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 2,1 1,4 53 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição 4w 8w 13w 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 1,2 1,5 1,2 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 1,1 O co 1,6 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 1,5 2,1 1,5 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 1,9 2,1 1,3 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 1,9 - - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 2, 0 - -
Tabela F: % De dímero por AUC (25 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição T=0 (4w 5°C) 4w 8w 13w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 4,0 2,6 3,8 5,3 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,2 3,9 3,4 2,7 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 2,8 4,0 5,6 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 2,4 4,2 3,2 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,3 3,3 3,7 3,7 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 4,0 4,3 5,2 4,2 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 3,1 3,9 3,9 3,8 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 3,7 3,0 4,3 6,6 211 100 pH 4,8, Tre a 0 8mg/mL, F68 0,05 3,9 - - - 54 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição T=0 (4w 5°C) 4w 8w 13w 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,5 - - -
Tabela G: % De agregados grandes por AUC (25 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição T=0 (4w 5°C) 4w 8w 13w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 2,3 0,3 0,8 2,5 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 2,0 1,1 0,6 0,2 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 0,1 O co 1,3 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - 0,4 1,3 0,2 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 1,2 0,9 0,9 0,9 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 1,1 1,6 1,2 0,7 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 1,5 1,9 1,1 1,1 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 1,9 1,5 2,6 3,6 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 1,9 - - - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 2,0 - - - 55
Tabela Η: % De dímero por AUC (40 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição T=0 (4w 5°C) 2w 3w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 4,0 - 4,4 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,2 - 3,9 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - - 5,3 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - - - 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 3,3 - 6, 4 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 4,0 - 7,0 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 3,1 - 6,0 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 3,7 - 6, 4 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,9 4,9 - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 3,5 co o -
Tabela I: % De agregados grandes por AUC (40 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição T=0 (4w 5°C) 2w 3w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 2,3 - 1,8 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 2,0 _ 1,5 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - - 2,0 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 - - - 56 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição T=0 (4w 5°C) 2w 3w 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 1,2 - 2,8 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 1,1 - 2,6 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 1,5 - 3,0 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 1,9 - 3,9 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 1,9 5, 8 - 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 2,0 4,6 -
Tabela J: Teor de proteína por SE-HPLC (2-8 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 4w 6w 8w 12w 16w 26w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 64, 7 64,2 66,3 63,2 66,9 66,0 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 69,8 62,2 67,3 62,1 67,6 63,1 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 62,1 64, 7 66,4 63,7 65, 7 64, 4 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 90, 7 91,5 91,8 89,1 96,8 92,5 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 92,6 97, 7 99,8 87, 7 92,9 92,4 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 96,1 91,8 94,3 90,4 92,8 93,5 57 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 4w 6w 8w 12w 16w 26w 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 94, 7 100, 4 95, 7 91,2 93,3 90, 4 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 89, 0 98,6 90,6 89,0 93,3 88,8 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 94,3 99,5 88,8 100,0 91,5 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 96,9 85,2 93,3 99,6 98,2
Tabela K: Teor de proteína por SE-HPLC (25 °C) TACI-Fcõ (mg/mL) Composição tempo 0 2w 4w 6w 8w 12w 17w 27w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 64, 7 61,6 66,8 67,5 65,3 68,3 63,3 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 69,8 60,0 63,2 66,1 63,4 64, 7 62,7 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 62,1 59,0 64, 1 66,8 64,5 64, 4 62,9 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 90,7 99,5 89,6 94,9 91,6 94,3 89,4 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 92,6 85, 0 91,0 98,0 92,0 95,6 82,1 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 96,1 n. v. 90,9 96,0 94,5 94, 4 91, 1 58 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 2w 4w 6w 8w 12w 17w 27w 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 94, 7 88,4 96,1 92,7 105, 0 93,5 87, 8 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 89, 0 88,4 94, 4 94, 7 89,9 91,3 88,5 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 94,3 95,3 97, 8 89,7 98,6 95,2 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 96,9 100,0 100, 1 92,7 103,0 92,7
Tabela L: Teor de proteína por SE-HPLC (40 °C) TACI-Fcã (mg/mL) Composição tempo 0 lw 2w 4w 21a 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 64, 7 64,9 60,9 67, 1 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 69,8 64,5 59,8 66,9 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 62,1 63,8 61,2 65,2 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 90,7 89,3 85, 7 91, 4 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 92,6 90,5 86,2 88,6 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 96,1 93,5 85, 1 90,7 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 94, 7 88,6 85,6 97, 8 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 89,0 93,0 83,9 96,5 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 94,3 92,0 91,2 99, 7 59 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 lw 2w 4w 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 96,9 97, 1 94,9 103,3
Tabela M: Valores de pH (2-8 °C) TACI-Fcõ (mg/mL) Composição tempo 0 4w 6w 8w 12w 16w 26w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 5,2 5, 1 5, 1 5, 1 5, 1 - 5, 1 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 5,2 5, 1 5, 1 5, 1 5, 1 - 5, 1 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5,4 5,3 5,3 5,3 5,3 - 5,3 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5,1 5, 0 5, 0 5, 0 5, 0 - 5, 0 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 5,1 5, 0 5, 1 5, 0 5, 1 - 5, 1 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 5 5, 4 5, 4 5, 4 5,3 - 5, 4 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 5,2 5, 1 5, 1 5, 1 5, 1 - 5, 1 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 4,8 4,8 4,9 4,8 - 4,8 - 60 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 4w 6w 8w 12w 16w 26w 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 2 5,2 5,3 5,2 - 5,2 -
Tabela N: Valores de pH (25 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 2w 4w 6w 8w 12w 17w 27w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 5, 2 5,2 5, 1 5, 1 5, 0 5, 1 - 5, 1 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 5, 2 5, 1 5, 0 5, 1 5, 0 5, 1 - 5, 1 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 4 5, 4 5,3 5,3 5,3 5, 4 - 5,3 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 1 5, 0 5, 0 5, 0 5, 1 5, 1 - 5, 0 21E 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 5, 1 5, 1 5, 0 5, 1 5, 0 5, 1 - 5, 0 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 5 5, 4 5, 4 5, 4 5, 4 5, 4 - 5,3 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 5, 2 5, 1 5, 1 5, 1 5, 1 5, 1 - 5, 1 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 5, 2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 - 5,1 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 4,8 4,8 4,8 4,9 4,9 - 4,9 - 61 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 2w 4w 6w 8w 12w 17w 27w 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 2 5,3 5,2 5,2 5,3 - 5,2 -
Tabela O: Valores de pH (40 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição tempo 0 lw 2w 4w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 5,2 5, 1 5,2 5, 1 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 5,2 5, 1 5, 1 5, 1 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5, 4 5, 4 5, 4 5, 4 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5,1 5, 0 5,1 5, 0 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 5, 1 5, 1 5, 1 5, 0 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5,5 5,4 5,4 5,4 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 5,2 5, 1 5, 1 5, 1 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 5,2 5,1 5,1 5,1 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 4,8 4,9 4,9 4,9 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 5,2 5,3 5,3 5,3 62
Tabela P: Osmolalidade (OSM/kg) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição o II H 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 0, 444 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 0,359 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 0,359 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 0, 409 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 0, 414 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 0,414 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 0, 445 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 0, 438 211 100 pH 4,8, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 0,388 21L 100 pH 5,2, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 0,368
Tabela Q: Bioensaio (U/mL) (2-8 °C) TACI-Fcã (mg/mL) Composição Esperado tempo 0 4w 8w 13w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F68 0,05 350000 347704 365778 319050 387896 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 350000 336185 318012 289824 357861 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 350000 323222 333715 306941 335181 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 500000 461204 452442 431738 489743 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 500000 458617 439084 435680 470251 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 500000 455676 470037 407200 424278 63 (continuação) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição Esperado tempo 0 4w 8w 13w 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F6 8 0,05 500000 494293 543338 401277 445267 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 500000 471667 446056 387503 445371
Tabela R: Bioensaio (U/mL) (25 °C) TACI—Fc5 (mg/mL) Composição Esperado tempo 0 4w 8w 13w 21A 70 pH 5, Tre a 96 mg/mL, F6 8 0,05 350000 347704 311541 279159 304644 21B 70 pH 5, Tre a 80 mg/mL 350000 336185 302066 268469 342827 21C 70 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 350000 323222 315938 269441 318150 21D 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 500000 461204 508830 431335 418713 21Ξ 100 pH 5, Tre a 80 mg/mL 500000 458617 441768 396159 405400 21F 100 pH 5,4, Tre a 80 mg/mL, F68 0,05 500000 455676 449141 387455 476384 21G 100 pH 5, Man a 51 mg/mL, F68 0,05 500000 494293 496542 433228 440685 21H 100 pH 5, Man a 51 mg/mL 500000 471667 465114 365910 433696 64
Tabela S: Truncamento de Terminação C
Amostra Tempo de estabilidade Truncado Volume de S128/L20a - 95, 0% 21E 8 meses a 2-8 °C 95, 3% 21E 8 meses a 25 °C 94, 7%
Tabela T: Formas cortadas
Amostra Tempo de estabilidade Pico 1 (fragmento de Fc) Picos 2+3 Pico 4 (Intacto) Corte total S128/L20a em bruto - 4, 2% 14, 0% 81, 8% 18,2% 21Ξ 10 meses 2-8 °C 4, 5% 15, 0% 80,5% 19,5% 21Ξ 10 meses 25 °C 8,2% 37,5% 54,3% 45, 7% SUMARIO DOS RESULTADOS PRINCIPAIS Cromatografia de Exclusão de Tamanho A 25 °C, com respeito à taxa de agregação (% de agregados/mês), as formulações de 70 mg/mL mostraram, em geral, declives mais baixos do que as de 100 mg/mL. No último grupo, as formulações 21D e 21E foram as que exibiam os declives mais baixos. A 40 °C, a formulação 21E exibiu o valor mais baixo de 65 declive no grupo de formulações líquidas a 100 mg/mL.
AUC
Para a formulação 21E, não foi observada alteração no perfil de AUC a 2-8 e 25 °C. Para as formulações de 70 mg/mL, foi detectada uma tendência para 0 aumento de monómero com prejuízo do tempo de estabilidade.
Desenrolamento monitorizado por CD
No grupo das formulações de 100 mg/mL, a 21E foi a que exibiu a Tunf mais elevada. Os valores de pH diferentes de 5,0 conduziram a TW inferior. As formulações de 70 mg/mL exibem valores mais elevados de Tunf (i. e., estabilidade mais elevada).
Fluorescência Intrínseca A 40 °C, foram detectadas variações menores no comprimento de onda de emissão máximo para formulações de 70 mg/mL e, no grupo de candidatos de 100 mg/mL, para a formulação 21E.
RALS
Aumentos perceptíveis em RALS para formulações a pH
diferentes do "óptimo" de 5, após armazenamento a 40 °C. A dispersão das formulações com manitol foi consideravelmente superior às outras. As formulações 21A, 21B, 21D e 21E foram as que exibiam valores inferiores de dispersão. Após armazenamento a 2 - 8 °C, não mostraram qualquer aumento na luz dispersada.
Anisotropia de emissão de fluorescência Não foram observadas variações em anisotropia para as formulações 21A e 21B após armazenamento a 40 °C (1 mês). Houve variações relevantes para as formulações 21F e 21H. Inter-variações observadas para as outras.
Dispersão de Luz Dinâmica A 2 - 8 °C, não foram detectadas variações relevantes na distribuição de tamanhos. Foram observadas algumas diminuições na % de espécies maiores após armazenamento a 25 °C. Sem aumentos dramáticos em espécies de peso molecular mais elevado após armazenamento a 40 °C para todas as formulações, excepto para aquelas contendo manitol e aquelas a pH diferente de 5,0.
Energia Livre de Desenrolamento
No grupo das formulações de 100 mg/mL, foi observada estabilidade termodinâmica mais elevada para as formulações 21D e 21E. 67
Bioensaio
Nao foram observadas diminuições na bioactividade superior a 3 meses, a 25 e 40 °C.
Conclusões globais
Os estudos de pré-rastreio sobre formulações liquidas mostraram que o pH óptimo para a estabilização de soluções de TACI-Fc5 a 70 mg/mL foi de cerca de pH 5. Quanto maiores os valores de pH, mais fortes eram os fenómenos de agregação (avaliada por SE-HPLC) e a ocorrência de quedas de concentração (estimada por RP-HPLC e densidade óptica). A presença de sais (tais como NaCl, CaC12 e MgC12) conduziu igualmente a aumentos nos agregados. Os valores de pH inferiores a 5 também não foram óptimos, como também mostrado por estudos de conformação por dicroísmo circular a pH = 4,0, em comparação com 5,0 em diferentes tampões. As experiências de DSC preliminares mostraram que a trealose e sacarose tiveram algum efeito positivo na estabilidade da molécula (i. e., temperaturas de desenrolamento mais elevadas). A fase de concepção experimental visou a investigação do efeito de vários excipientes dissolvidos em tampão de acetato ou histidina, a pH = 5,0 (também foram testados diferentes títulos de tamponamento), na presença de tensioactivos, tais como Lutrol® F-68 e Tween20. Concentrações baixas de tampão de acetato na presença de manitol ou trealose proporcionaram as amostras com uma estabilidade mais elevada contra a degradação. O Lutrol® F-68 pareceu ser mais eficaz do que Tween 20 na estabilização da proteína. 68
Os testes de fluorescência e dispersão de luz dinâmica estavam em concordância com esses resultados.
As amostras candidatas foram preparadas à escala laboratorial, às concentrações de 70 e 100 mg/mL de TACI-Fc. A trealose e manitol foram utilizados como excipientes (na presença de tampão de acetato de sódio, a pH = 4,8, 5,0, 5,2 e 5,4). A evolução dos candidatos ao longo do tempo foi monitorizada por SE-HPLC e AUC, juntamente com várias ferramentas espectroscópicas. A partir deste estudo, resultou que concentrações mais baixas da proteína conduziram a menor agregação. O valor de pH óptimo foi confirmado como sendo 5,0. A trealose foi mais bem-sucedida do que o manitol na estabilização das formulações de TACI-Fc. No grupo dos candidatos de TACI-Fc a 100 mg/mL, a formulação 21E (acetato de sódio a 10 mM, pH = 5,0, trealose anidra a 80 mg/mL) exibiu uma resistência mais forte contra a agregação a 40 °C (sem aumento estatisticamente relevante na agregação detectado a 2 -8 °C) . Mais precisamente, a 2-8 °C, o candidato líquido 21E, aumentou a sua pureza em 1,4%, em 26 semanas A 25 O O a pureza diminuiu em apenas 1 3- X o (26 semanas).
As formas cortadas totais do candidato 21E (10 meses, a 2-8 e 25 °C) foram determinadas por uma análise de RP-HPLC: não ocorreu variação no teor das formas cortadas, em comparação com o material em bruto de partida (cerca de 19%) . Verificou-se que o truncamento de terminação C foi cerca de 95%, o mesmo que no material em bruto de partida; este nível de truncamento é, habitualmente, observado para anticorpos humanos. 69 0 nível de formas oxidadas também foi verificado por análise de RP-MALDI no candidato líquido 21E (armazenado durante 10 meses a 2-8 e 25 °C) : em comparação com a substância de fármaco em bruto, a partir da qual é preparado, não foi observado aumento siqnificativo na oxidação após armazenamento (cerca de 2,4%).
EXEMPLO 2 : COMPATIBILIDADE DE TACI-FC COM AGENTES
BACTERIOSTÁTICOS
Objectivo: O alvo deste estudo foi o de avaliar a compatibilidade de TACI-Fc com diferentes agentes bacteriostáticos em vista de uma formulação de multidose. Os sequintes aqentes bacteriostáticos foram testados: álcool benzílico a 0,9%; m-cresol a 0,3%; fenol a 0,5%; clorobutanol a 0,5%; feniletanol a 0,5%; álcool benzílico a 0,3% + cloreto de benzalcónio a 0,001%.
Resultados Chave
Substância de fármaco + bacteriostáticos: - Foram observados aumentos (15 - 70%) em agregados totais (por SEC), após 2 semanas de armazenamento, a 40 °C, para a substância de fármaco na presença de conservantes, em comparação com a amostra de referência (sem bacteriostático adicionado); taxas de degradação comparáveis foram observadas a 25 °C e 2-8 °C. 70 - 0 agente bacteriostático que se provou ter a influência menos negativa (de acordo com as análises de SEC e CD) foi a mistura de álcool benzilico + cloreto de benzalcónio.
Candidato liquido + bacteriostáticos: - A adição de conservantes ao candidato líquido TACI-Fc (acetato a pH 5, trealose) conduziu a aumentos menos pronunciados na agregação (cerca de 10 - 25%, após 2 semanas a 40 °C) do que os observados para a substância de fármaco. Isto demonstra a eficácia de trealose na prevenção da agregação e perda da estrutura secundária nativa (como evidenciado por experiências de CD de UV distante) . - A associação álcool benzilico + cloreto de benzalcónio proporcionou os melhores resultados, de entre o grupo de formulações na presença de conservantes, em termos de taxa de agregação.
Conclusão O impacto de vários agentes bacteriostáticos na integridade de proteína foi avaliado na substância de fármaco de TACI-Fc (material em bruto nativo) e em TACI-Fc formulada a 100 mg/mL, formulada em Na-Acetato e trealose, a pH 5. A inclusão de qualquer dos agentes bacteriostáticos afectou negativamente a integridade de proteína, em particular na substância de fármaco em bruto nativa. A associação de álcool 71 benzílico a 0,3% + cloreto de benzalcónio a 0,001% revelou-se a menos prejudicial para a estrutura de proteína.
EXEMPLO 3: ESTABILIDADE DO CANDIDATO LÍQUIDO DE TACI-FC EM SERINGAS PRÉ-CARREGADAS
Objectivo O alvo do estudo foi o de avaliar a estabilidade da formulação líquida de TACI-Fc (Na-Acetato, Trealose, pH 5) , a 100 mg/mL, cheia em seringas Hypak de 1 mL, rolhadas com dois tipos de êmbolos de borracha (W4023/50 e W4023/50G FluroTec).
Resultados Chave
Os resultados podem ser sumariados como se segue para TACI-Fc a 100 mg/mL cheia em seringas de vidro de 1 mL, rolhadas com êmbolos revestidos (W4023/50G FluroTec) e não revestidos (W4023/50G), testadas até 6 meses: - Dímeros e HMWs: a taxa de degradação era comparável a 40 °C (aumento de 1,6%/semana) e 25 °C (aumento de 0,5%/mês). Um comportamento ligeiramente diferente foi observado a 2-8 °C, embora não impactando significativamente a estabilidade global: aumento de 0,2% e 0,1%/mês, para dois lotes diferentes de preparação; - Teor de proteína: não foi observada diminuição no teor de proteína após armazenamento; 72 - Formas cortadas: foi medido um nível comparável nas formas cortadas vs o produto em frasquinhos (sem aumento a 2-8 °C, em comparação com a substância de fármaco; cerca de 40%, a 25 °C, após 5 meses); - Biopotência: a actividade biológica é retida até 3 meses (2-8 °C e 25 °C) - pH: não foi observado desvio de pH após armazenamento.
Conclusão A formulação líquida de TACI-Fc a 100 mg/mL (tampão de acetato, pH 5 + trealose) cheia em seringas Hypak de 1 mL era estável. Os dois tipos de êmbolos de borracha (W4023/50 e W4023/50G FluroTec) avaliados no estudo foram equivalentes e não afectaram a estabilidade da formulação líquida.
EXEMPLO 4: ESTABILIDADE DE ATACICEPT A DIFERENTES TÍTULOS EM SERINGAS PRÉ-CARREGADAS A estabilidade de atacicept a diferentes títulos em seringas pré-carregadas foi avaliada. A metodologia foi efectuada como indicado no Exemplo 1. A composição das amostras testadas foi como se segue: 73 ID de volume Atacicept, mg/mL Tampão Trealose di-hidratada, mg/mL Atacicept 25/1 25 acetato de sódio a 10 mM, pH 5 88, 4 Atacicept 75/1 75 acetato de sódio a 10 mM, pH 5 88, 4 Atacicept 150/1 150 acetato de sódio a 10 mM, pH 5 88, 4 Atacicept 25/1.2 20,5 acetato de sódio a 10 mM, pH 5 88, 4 Atacicept 150/1.2 125 acetato de sódio a 10 mM, pH 5 88, 4
Os resultados do estudo de estabilidade sao referidos nas seguintes tabelas U até Z.
Tabela U: % de pureza por SE-HPLC A 5 °C, após 1, 2, 3, 6, 9, 12 e 18 meses:
Tempo Zero 1 mês +5 °C HMW + Dímero M LMW HMW + Dímero M LMW Atacicept 25/1 0,4 99,0 0,5 0,4 99,2 0,4 Atacicept 75/1 0,5 99,0 0,5 0,6 99, 1 0,3 Atacicept 150/1 0,5 99,0 0,5 0,7 98,8 0,4 Atacicept 25/1.2 0,5 99,1 0,4 0,5 99,1 0,4 Atacicept 150/1.2 0,6 99,0 0,4 0,7 98,9 0,5 74 2 meses +5 °C 3 meses +5 °C HMW + Dimero M LMW HMW + Dimero M LMW Atacicept 25/1 0,4 99,2 0,5 0,4 99, 1 0,5 Atacicept 75/1 0,6 99, 1 0,5 0,6 99,2 0,3 Atacicept 150/1 0,8 98,7 0,5 1,0 98,4 0,7 Atacicept 25/1.2 0,5 99,2 0,4 0,4 98,7 1,0 Atacicept 150/1.2 0,7 98,8 0,4 0,6 98,9 0,6 6 meses +5 °C 9 meses +5 °C HMW + Dimero M LMW HMW + Dimero M LMW Atacicept 25/1 0,4 99,3 0,4 0,3 99, 3 0,4 Atacicept 75/1 0,7 99,0 0,4 0,8 98, 9 0,3 Atacicept 150/1 1,1 98,7 0,3 1,2 98, 4 0,4 Atacicept 25/1.2 0,3 99,3 0,4 0,4 99, 3 0,4 Atacicept 150/1.2 0,8 98,7 0,4 1,0 98, 5 0,5 12 meses +5 °C 18 meses +5 °C HMW + Dimero M LMW HMW + Dimero M LMW Atacicept 25/1 0,3 99,2 0,4 0,4 99,3 0,3 Atacicept 75/1 0,9 98,9 0,3 Atacicept 150/1 1,3 98,2 0,5 1,9 97, 8 0,4 Atacicept 25/1.2 0,4 99,2 0,4 0,4 99,3 0,3 Atacicept 150/1.2 1,3 98,3 0,5 1,6 97,9 0,5 75 A 25 °C, após 1, 2, 3 e 6 meses:
Tempo Zero 1 mês +25 °C 2 meses +25 °C HMW + Dimero M LMW HMW + Dimero M LMW HMW + Dimero M LMW Atacicept 25/1 0, 4 99,0 0, 5 0, 4 98,9 0, 7 0, 4 98,8 0, 8 Atacicept 75/1 0, 5 99,0 0, 5 0, 9 98, 5 0,6 1,4 97,8 0, 8 Atacicept 150/1 0, 5 99,0 0, 5 2,0 97,1 0, 9 2,8 96, 1 1, 2 Atacicept 25/1.2 0, 5 99, 1 0, 4 0, 4 99,0 0,6 0,3 98,8 0, 9 Atacicept 150/1.2 0,6 99,0 0,4 1,5 97,7 0, 9 2,3 96, 3 1, 4 3 meses +25 °C 6 meses +25 °C HMW + Dimero M LMW HMW + Dimero M LMW Atacicept 25/1 0,4 98,5 1,1 0,4 98, 2 1,4 Atacicept 75/1 1,6 97, 7 0,7 2,6 96, 1 1,3 Atacicept 150/1 3,7 94, 8 1,5 5, 8 92, 1 2,1 Atacicept 25/1.2 0,3 98,5 1,2 0,3 98, 4 1,3 Atacicept 150/1.2 2,5 96,0 1,5 4,3 94, 1 1,6
Tabela V: Teor de Proteína por SE-HPLC (mg/mL) A 5 °C, após 1, 2, 3, 6, 9, 12 e 18 meses:
Tempo Zero 1 Mo +5 °C 2 Mo +5 °C 3 Mo +5 °C Atacicept 25/1 23,9 27,9 22, 7 21, 9 Atacicept 75/1 75, 0 80,4 77,9 76, 6 Atacicept 150/1 150,0 165,5 160,2 161, 0 Atacicept 25/1.2 21,8 24,3 23,6 22, 0 Atacicept 150/1.2 138,1 138,4 144,9 148,5 76 6 Mo +5 °C 9 Mo +5 °C 12 Mo +5 °C 18 Mo +5 °C Atacicept 25/1 25, 1 24,9 26,1 25, 2 Atacicept 75/1 80,1 78,8 77,2 Atacicept 150/1 156,5 152,0 157,9 152,1 Atacicept 25/1.2 22,3 21,3 22,2 21,6 Atacicept 150/1.2 136,3 134,1 132,4 126, 1 A 25 °C, após 1, 2, 3 e 6 meses:
Tempo Zero 1 Mo +25 °C 2 Mo +25 °C 3 Mo +25 °C 6 Mo +25 °C Atacicept 25/1 23,9 28,0 21,5 21,9 25, 1 Atacicept 75/1 75, 0 80,1 77, 4 73,5 79,8 Atacicept 150/1 150,0 163,8 165,5 162,8 152,2 Atacicept 25/1.2 21,8 22,9 23,4 21,3 21,6 Atacicept 150/1.2 138,1 141,6 137,2 147,7 128,6 A 40 °C, após 1, 2 e 4 semanas:
Tempo Zero 1 wk +40 °C 2 wk +40 °C 4 wk +40 °C Atacicept 75/1 75, 0 71, 7 71,9 71, 8 11
Tabela W: Formas cortadas (%) A 5 °C, após 1, 2, 3, 6, 9, 12 e 18 meses:
Tempo Zero 1 Mo +5 °C 2 Mo +5 °C 3 Mo +5 °C Atacicept 25/1 11, 0 12,8 12,8 12,5 Atacicept 75/1 11,6 13,8 12, 1 13,0 Atacicept 150/1 11,5 12,3 13,5 13,1 Atacicept 25/1.2 12, 7 12, 7 12,8 13,5 Atacicept 150/1.2 12,3 13,0 12,5 14,1 6 Mo +5 °C 9 Mo +5 °C 12 Mo +5 °C 18 Mo +5 °C Atacicept 25/1 14,1 14,7 15, 4 18, 4 Atacicept 75/1 13,5 15, 4 16,7 Atacicept 150/1 14,3 16, 1 16, 7 19,3 Atacicept 25/1.2 15,9 15, 8 16,9 18,5 Atacicept 150/1.2 15, 4 16,5 18,6 18, 7 A 25 °C, após 1, 2, 3 e 6 meses:
Tempo Zero 1 Mo +25 °C 2 Mo +25 °C 3 Mo +25 °C 6 Mo +25 °C Atacicept 25/1 11, 0 17,5 20,1 25, 8 32,8 Atacicept 75/1 11,6 17,4 20,4 24,1 33,8 Atacicept 150/1 11,5 18,3 21,7 26,7 35, 1 Atacicept 25/1.2 12, 7 16, 7 20,6 25, 4 34,9 Atacicept 150/1.2 12,3 17, 1 22,1 26,7 37,3 78
Tabela X:% Fc livre por IEC-HPLC A 5 °C, após 1, 2, 3, 6, 9, 12 e 18 meses:
Tempo Zero 1 Mo +5 °C 2 Mo +5 °C 3 Mo +5 °C Atacicept 25/1 - 0,08 0,08 0,08 Atacicept 75/1 0, 09 0, 14 0, 14 0,11 Atacicept 150/1 - 0,09 0,09 0,10 Atacicept 25/1.2 0, 09 0,08 0,09 0,09 Atacicept 150/1.2 0, 08 0,09 0, 11 0,13 6 Mo +5 °C 9 Mo +5 °C 12 Mo +5 °C 18 Mo +5 °C Atacicept 25/1 0,18 0,13 0,12 0,12 Atacicept 75/1 0,12 0,13 0,12 Atacicept 150/1 0,19 0,16 0, 15 0,16 Atacicept 25/1.2 0,11 0,11 0,12 0,11 Atacicept 150/1.2 0,13 0, 17 0, 15 0,16 A 25 °C, após 1, 2, 3 e 6 meses:
Tempo Zero 1 Mo +25 °C 2 Mo +25 °C 3 Mo +25 °C 6 Mo +25 °C Atacicept 25/1 - 0, 17 0,22 0,40 0, 77 Atacicept 75/1 0,09 0,25 0,39 0,43 0,72 Atacicept 150/1 - 0,20 0,32 0,52 0,87 Atacicept 25/1.2 0,09 0,13 0,30 0,49 0,70 Atacicept 150/1.2 0,08 0,18 0,38 0,51 0,81 79
Tabela Y: Actividade biológica (U/mL) A 5 °C, após 1, 2, 3, 6, 9, 12 e 18 meses:
Tempo Zero 1 Mo +5 °C 2 Mo +5 °C 3 Mo +5 °C Atacicept 25/1 140213 137160 134504 135542 Atacicept 75/1 423184 410261 379575 374383 Atacicept 150/1 836070 774584 754834 819172 Atacicept 25/1.2 111981 115990 126041 121648 Atacicept 150/1.2 646679 642858 743090 694864 6 Mo +5 °C 9 Mo +5 °C 12 Mo +5 °C 18 Mo +5 °C Atacicept 25/1 126923 147341 130609 108207 Atacicept 75/1 363668 468484 346080 Atacicept 150/1 814539 843419 809840 565084 Atacicept 25/1.2 114946 123750 106004 113312 Atacicept 150/1.2 645404 714223 620301 550851 A 25 °C, após 1, 2, 3 e 6 meses:
Tempo Zero 1 Mo +25 °C 2 Mo +25 °C 3 Mo +25 °C 6 Mo +25 °C Atacicept 25/1 140213 134212 124601 132349 118224 Atacicept 75/1 423184 387654 336790 365202 327925 Atacicept 150/1 836070 776645 719725 760795 677110 Atacicept 25/1.2 111981 114068 117615 114296 103328 Atacicept 150/1.2 646679 694993 696945 606957 586586 80
Tabela Z: determinação de pH A 5 °C, após 1, 2 e 3 meses:
Tempo Zero 1 Mo +5 °C 2 Mo +5 °C 3 Mo +5 °C Atacicept 25/1 5,0 5, 0 4,9 4,9 Atacicept 75/1 5,1 5, 1 5, 1 5,1 Atacicept 150/1 5,0 5,1 5, 0 4,9 Atacicept 25/1.2 5,0 4,9 4,9 4,8 Atacicept 150/1.2 5,0 5, 0 4,9 4,9 6 Mo +5 °C 9 Mo +5 °C 12 Mo +5 °C 18 Mo +5 °C Atacicept 25/1 5,0 4,9 5, 1 4,9 Atacicept 75/1 5,0 5,1 5,1 Atacicept 150/1 5,1 5, 0 5,2 5,0 Atacicept 25/1.2 4,9 4,9 5, 0 5,0 Atacicept 150/1.2 5,0 5, 0 5, 0 5,0 A 25 °C, após 1, 2, 3 e 6 meses:
Tempo Zero 1 Mo +25 °C 2 Mo +25 °C 3 Mo +25 °C 6 Mo +25 °C Atacicept 25/1 5,0 4,9 4,9 4,9 5, 0 Atacicept 75/1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 Atacicept 150/1 5,0 5, 0 5, 0 4,9 5, 1 Atacicept 25/1.2 5,0 4,9 4,9 4,8 4,9 Atacicept 150/1.2 5,0 5, 0 4,9 4,9 5, 0 81
EXEMPLO 5; PRODUÇÃO DE ANTAGONISTA DE BLYS
Quatro versões truncadas aminoterminais de TACI-Fc foram geradas. Todas as quatro tinham uma sequência sinal de activador do plasminogénio tecidular humano modificada, como divulgado no documento WO 02/094852 (SEQ ID N°: 25) fundida ao resíduo de aminoácido número 30 de SEQ ID N° : 6. Contudo, as quatro proteínas diferiam na localização do ponto no qual a "Fc5" estava fundida à sequência de aminoácidos de TACI da SEQ ID N°: 6. A Tabela 1 delineia as estruturas das quatro proteínas de fusão.
Tabela 1
Proteínas de fusão de TACI Fc
Designação de TACI-Fc Resíduos de aminoácidos de TACI TACI(dl-29)-Fc5 30 a 154 de SEQ ID N°: 6 TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5 30 a 106 de SEQ ID N°: 6 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 30 a 110 de SEQ ID N°: 6 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 30 a 119 de SEQ ID N°: 6
As cassetes de expressão codificando proteína foram geradas por PCR de sobreposição, utilizando técnicas padrão (ver, por exemplo, Horton et al., 1989). Uma molécula de ácido nucleico codificando TACI e uma molécula de ácido nucleico codificando Fc5 foram utilizadas como moldes de PCR. Os iniciadores oligonucleotídicos são identificados nas Tabelas 2 e 3. 82
Tabela 2
Iniciadores Oligonucleotidicos Utilizados para Produzir Proteínas de Fusão de Taci
Designação de TACI—Fc Designações de Oligonucleótido 5' TACI 3' TACI 5' Fc5 3 ' Fc5 TACI(dl-29) -Fc5 ZC2 4, 903 ZC2 4, 955 ZC2 4, 952 ZC2 4, 946 TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5 ZC2 4, 903 ZC2 4, 951 ZC2 4, 949 ZC2 4, 946 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 ZC2 4, 903 ZC2 8, 978 ZC2 8, 979 ZC2 4, 946 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 ZC2 4, 903 ZC2 8, 981 ZC2 8, 980 ZC2 4, 946
Tabela 3
Sequências Oligonucleotídicas
Iniciador Sequência Nucleotídica SEQ ID NS ZC24,903 5' TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3' 15 ZC24,955 5' TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3' 16 ZC24,952 5' TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3' 17 ZC24,946 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' 18 ZC24,951 5' TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3' 19 ZC24,949 5' ATAC T T C T GT GAGAAC GAGC C CAAAT C T T CA 3' 20 ZC28,978 5' TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3' 21 ZC28,979 5' CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 22 ZC28,981 5' TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3' 23 ZC28,980 5' GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 24 83
Esta primeira série de amplificações de PCR consistiu em duas reacções para cada das quatro versões truncadas aminoterminais. As duas reacções foram realizadas separadamente, utilizando os oligonucleótidos de TACI 5' e 3' numa reacção e os oligonucleótidos de Fc5 5' e 3' noutra reacção para cada versão. As condições da primeira série de amplificação de PCR foram como se segue. A um volume final de 25 pL foram adicionados, aproximadamente, 200 ng de ADN molde, 2,5 pL de Tampão de reacção de Pfu lOx (Stratagene) , 2 pL de dNTP a 2,5 mM, 0,5 pL de 20 pM cada de oligonucleót ido 5' e oligonucleótido 3' e 0,5 pL de Pfu Polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico de amplificação consistiu em 94 °C, durante 3 minutos, 35 ciclos a 94 °C, durante 15 segundos, 50 °C durante 15 segundos, 72 °C durante 2 minutos, seguido de uma extensão de 2 minutos a 72 °C. Os produtos de reacção foram fraccionados por electroforese em gel de agarose e as bandas correspondendo aos tamanhos previstos foram excisadas do gel e recuperadas utilizando um kit QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. A segunda série de amplificação de PCR, ou reacção de amplificação de PCR de sobreposição, foi realizada utilizando os fragmentos purificados do gel do PCR da primeira série como molde de ADN. As condições da segunda série de amplificação de PCR foram como se segue. A um volume final de 25 pL foram adicionados, aproximadamente, 10 ng de cada ADN molde do fragmento de TACI e do fragmento de Fc5, 2,5 pL de Tampão de reacção de Pfu lOx (Stratagene), 2 pL de dNTP a 2,5 mM, 0,5 pL de 20 pM cada de ZC24, 903 (SEQ ID N°: 15) e ZC24, 946 (SEQ ID N°: 18) e 0,5 pL de Pfu Polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico de amplificação consistiu em 94 °C, durante 1 minuto, 35 ciclos a 94 °C, durante 15 segundos, 84 55 °C durante 15 segundos, 72 °C durante 2 minutos, seguido de uma extensão de 2 minutos a 72 °C. Os produtos de reacção foram fraccionados por electroforese em gel de agarose e as bandas correspondendo aos tamanhos previstos foram excisadas do gel e recuperadas utilizando um kit QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction (Qiagen) , de acordo com as instruções do fabricante.
Cada das quatro versões dos produtos de PCR de TACI-Fc truncados aminoterminais foi clonada separadamente, utilizando o kit ZEROBLUNT TOPO PCR Cloning da Invitrogen, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A Tabela 4 identifica as sequências nucleotídicas e de aminoácidos destas construções de TACI-Fc.
Tabela 4
Sequências de Variantes de TACI-Fc
Designação de TACI-Fc SEQ ID N Nucleótido Aminoácido TACI(dl-29)-Fc5 7 8 TACI(dl-29, dl0 7-154)-Fc5 9 10 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 11 12 TACI(dl-2 9, dl2 0-154)-Fc5 13 14
Após as sequências nucleotídicas terem sido verificadas, os plasmídeos compreendendo cada das quatro versões das fusões de TACI-Fc truncadas aminoterminais foram digeridos com Fsel e Ascl, para libertar os segmentos codificando aminoácidos. Os 85 fragmentos de Fsel - Ascl foram ligados num vector de expressão mamífero contendo um promotor de CMV e um segmento de poli A de SV40. Os vectores de expressão foram introduzidos em células de ovário de hámster Chinês, como descrito abaixo.
EXEMPLO 6: PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS DE TACI-FC POR CÉLULAS DE OVÁRIO DE HAMSTER CHINÊS
As construções de expressão de TACI-Fc foram utilizadas para transfectar, por meio de electroporação, células DG44 de ovário de hamster Chinês (CHO) adaptadas a suspensão, cultivadas em meio isento de proteína animal (Urlaub et ai., 1986). As células DG44 CHO são desprovidas de um gene da di-hidrofolato redutase funcional, devido a deleções em ambas as localizações cromossómicas da di-hidrofolato redutase. 0 crescimento das células na presença de concentrações aumentadas de metotrexato resulta na amplificação do gene da di-hidrofolato redutase e o gene codificado por proteína recombinante ligado na construção de expressão.
As células DG44 CHO foram passadas em meios PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-Glutamina a 4 mM (JRH Biosciences) e suplemento de hipotanxina-timidina lx (Life Technologies) e as células foram incubadas, a 37 °C e CO2 a 5%, em balões de agitação Corning, a 120 RPM, numa plataforma agitadora rotativa. As células foram transfectadas separadamente com plasmídeos de expressão linearizados. Para garantir a esterilidade, foi realizada uma única etapa de precipitação de etanol sobre gelo, durante 25 minutos, pela combinação de 200 pg de ADN plasmídico num tubo Eppendorf com 20 pL de ADN veículo de esperma de salmão laminado (5' -► 3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/mL) , 22 pL de NaOAc a 86 3 Μ (ρΗ 5,2) e 484 pL de etanol a 100% (Gold Shield Chemical
Co., Hayward, CA) . Após incubação, o tubo foi centrifugado a 14000 RPM numa microcentrifuga colocada numa câmara frigorifica a 4 °C, o sobrenadante removido e o sedimento lavado duas vezes com 0,5 mL de etanol a 70% e deixado secar ao ar.
As células DG44 CHO foram preparadas enquanto o sedimento de ADN secava pela centrifugação de 106 células totais (16,5 mL) num tubo de centrífuga cónico de 25 mL, a 900 RPM, durante 5 minutos. As células DG44 CHO foram ressuspensas num volume total de 300 pL de meios de crescimento PFCHO e colocadas numa Cuveta Gene-Pulser com uma abertura de eléctrodo de 0,4 cm (Bio-Rad) . O ADN, após aproximadamente 50 minutos de tempo de secagem, foi ressuspenso em 500 pL de meios de crescimento PFCHO e adicionado às células na cuveta, de modo que o volume total não excedesse 800 pL e foi deixado repousar, à temperatura ambiente, durante 5 minutos, para diminuir a formação de bolhas. A cuveta foi colocada numa unidade Gene Pulser II, BioRad, fixada a 0,296 kV (quilovolts) e 0,950 HC (alta capacitância) e electroporada imediatamente.
As células foram incubadas 5 minutos, à temperatura ambiente, antes da colocação em 20 mL de volume total de meios de PFCHO num frasco 1-75, CoStar. O frasco foi colocado a 37 °C e CO2 a 5%, durante 48 horas, quando as células foram, depois, contadas por hemocitómetro, utilizando exclusão de azul de tripano e colocadas em meios de selecção PFCHO sem suplemento de hipotanxina-timidina e contendo metotrexato a 200 mM (Cal Biochem).
Após recuperação do processo de selecção de metotrexato, os meios condicionados contendo as proteínas de TACI-Fc segregadas 87 foram examinados por análise de transferência de Western.
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<211> 166 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai Asp 1 5 10 15 Gl η Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu T rp Thr Gly Vai Al a Met Arg 20 25 30 Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr T rp Asp Pro Leu Leu Gly Thr cys Met 35 40 45 Ser Cys Lys Thr ile Cys Asn Hi S Gin Ser Gl n Arg Thr Cys Al a Al a 50 55 60 Phe cys Arg Ser Leu Ser cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp 65 70 75 80 Hi S Leu Leu Arg Asp cys ile Ser cys Al a Ser ile cys Gly Gl n Hi S 85 90 95 Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Vai 100 105 110 Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai Glu Asn 115 120 12 5 Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gl n Gly Leu Gly Hi S Arg Gly Ser 130 135 140 Glu Al a Ser Pro Al a Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Al a Asn Gin vai 145 150 155 160 Ai a Leu vai Tyr Ser Thr
<210> 2 <211> 232 <212> PRT 93 165 <213> homo sapiens <400> 2
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hi S Thr cys Pro pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Glu Gly Al a Pro ser Vai Phe Leu Phe pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val val 35 40 45 Vai Asp vai Ser Hi S Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr val 50 55 60 Asp Gly Vai Glu Vai Hi S Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser val Leu Thr Val Leu Hi s Gin 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ser Ser ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gl n Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp ile Al a vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser cys ser Vai Met Hi S Glu Ala Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr Gin Lys 210 215 220 94
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 3 <21 ] L> 3 13 <2i; >> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Ai a Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 Thr Cys Met Ser cys Lys Thr ile cys Asn Hi s Gl n Ser Gin Arg Thr 20 25 30 cys Ai a Ala Phe cys Arg Ser Leu Ser cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys 35 40 45 Phe Tyr Asp Hi s Leu Leu Arg Asp cys ile Ser Cys Al a Ser ile cys 50 55 60 Gly Gin Hi S pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro Pro cys Pro 85 90 95 Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 100 105 110 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 115 120 125 Vai Vai Asp Vai Ser Hi s Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr 130 135 140 vai Asp Gly Vai Glu vai Hi S Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 145 150 155 160 Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai vai Ser val Leu Thr Val Leu Hi S 165 170 175 95
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 180 185 190
Ala Leu Pro ser Ser ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin 195 200 205 pro Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu 210 215 220
Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro 225 230 235 240
Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 245 250 255
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 260 265 270
Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn vai 275 280 285
Phe ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 290 295 300
Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 4 <211> 762 <212> ADN <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)..(759) <400> 4 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 96
Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 96 144 cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser val Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa CCC aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtC vai aca Thr tgc cys gtg vai gtg val gtg val gac Asp gtg Val age Ser cac Hi s gaa Glu gac Asp cct Pro gag GlU gtc val aag Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag Thr Vai Leu Hi s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro ile Glu Lys Thr ile ser Lys 130 135 140 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa Arg Asp GlU Leu Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Al a Val Glu T rp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac Gin Gly Asn Val Phe Ser cys Ser Val Met Hi s Glu Ala Leu Hi s Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga Hi s Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 762
<210> 5 <211> 251 <212> PRT <213> homo sapiens 97 <400> 5
Met Lys Hi S Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Al a Pro Arg Trp 1 5 10 15 Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 50 55 60 Cys vai vai vai Asp Val Ser Hi S Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn 65 70 75 80 T rp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser Val Leu Thr Val 100 105 110 Leu Hi s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 115 120 125 Asn Lys Al a Leu Pro Al a Pro ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 165 170 175 Tyr Pro Ser Asp ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 200 205 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 210 215 220 98
Asn Vai Phe Ser Cys Ser val Met Hi S Glu Ala Leu Hi S Asn Hi s Tyr 225 230 235 240 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 <210> 6 <211 .> 2 93 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg val Asp 1 5 10 15 Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly val Ala Met Arg 20 25 30 Ser cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met 35 40 45 Ser Cys Lys Thr lie Cys Asn Hi S Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala 50 55 60 Phe Cys Arg Ser Leu Ser cys Arg Lys Glu Gl n Gly Lys Phe Tyr Asp 65 70 75 80 HÍ S Leu Leu Arg Asp Cys ile Ser Cys Al a Ser ile Cys Gly Gin Hi S 85 90 95 Pro Lys Gl n Cys Ala Tyr phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro val 100 105 110 Asn Leu Pro pro Glu Leu Arg Arg Gl n Arg Ser Gly Glu Val Gl u Asn 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gl n Gly Leu Glu Hi S Arg Gly Ser 130 135 140 Glu Al a Ser Pro Al a Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gl n val 145 150 155 160 99
Al a Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Vai Leu cys 165 170 175 Cys Phe Leu Vai Al a vai Al a Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp pro 180 185 190 Cys Ser Cys Gl n Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Gin Asp Hi s Al a Met Glu Al a Gly Ser Pro Vai Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Glu Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Al a Pro 225 230 235 240 Thr Gl n Glu Ser Al a vai Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala 245 250 255 Gly Arg Trp Gly cys Hl s Thr Arg Thr Thr vai Leu Gin Pro cys Pro 260 265 270 Hl s ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly ile Vai Cys vai Pro Ala Gin Glu 275 280 285 Gly Gly Pro Gly Al a 290
<210> 7 <211> 1214 <212> ADN <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (17)..(1192) <400> 7 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys VaT Leu 15 10 ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc age cag gaa ate cat gee 100
Leu Leu cys Gly Ala vai Phe vai ser Leu ser Gin Glu ile His Ala 15 20 25 100 gag ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc CCC gaa gag cag 148 Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser cys Lys Thr Ile Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gea gee ttc tgc agg tea etc age 244 Asn Hi s Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292 Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp Hi s Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac 340 Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin Hi s Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age cca gtg aac ctt cca cca gag etc 388 Phe cys Glu Asn Lys Leu Arg ser Pro val Asn Leu Pro Pro Glu Leu 110 115 120 agg aga cag cgg agt gga gaa gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga 436 Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly 125 130 135 140 agg tac caa gga ttg gag cac aga ggc tea gaa gea agt cca gçt etc 484 Arg Tyr Gin Gly Leu Glu Hi s Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu 145 150 155 cca ggt etc aag gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 532 Pro Gly Leu Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hi s Thr cys Pro 160 165 170 ccg tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea gtc ttc etc ttc 580 Pro Cys Pro Al a Pro Glu Al a Glu Gly Al a Pro Ser Val Phe Leu Phe 175 180 185 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc 628 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu val 190 195 200 aca Thr tgc cys gtg vai gtg vai gtg vai gac Asp gtg vai age ser cac Hi s gaa Glu gac Asp cct Pro gag Glu gtc val aag Lys ttc phe 676 205 210 215 220 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg 724 Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Al a Lys Thr Lys Pro 225 230 235 cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc 772 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser val Leu Thr 240 245 250 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 820 vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val 255 260 265 tcc aac aaa gee etc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gee 868 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 270 275 280 aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 916 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 285 290 295 300 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 964 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly 305 310 315 ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 1012 Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 320 325 330 101 gag Glu aac Asn aac Asn 335 tac Tyr aag Lys acc Thr acg Thr cct Pro 340 ccc Pro gtg Vai ctg Leu gac Asp tcc Ser 345 gac Asp ggc Gly tcc Ser 1060 ttc Phe ttc Phe 350 ctc Leu tac Tyr age Ser aag Lys ctc Leu 355 acc Thr gtg Vai gac Asp aag Lys age Ser 360 agg Arg tgg Trp cag Gin cag Gin 1108 ggg Gly 365 aac Asn gtc Vai ttc Phe tea Ser tgc cys 370 tcc Ser gtg Vai atg Met cat Hl s gag Glu 375 gct Al a ctg Leu cac Hl s aac Asn cac Hl s 380 1156 tac Tyr acg Thr cag Gin aag Lys age Ser 385 ctc Leu tcc Ser ctg Leu tet Ser ccg Pro 390 ggt Gly aaa Lys taatctagag 1202 gcgcgccaat ta 1214 <210> 8 <211> 392 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu lie Hi s Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Al a Met Arg Ser cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr cys Met Ser cys Lys Thr ile Cys Asn Hi s Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gin Gly Lys Phe Tyr Asp Hi s Leu Leu Arg Asp Cys ile Ser Cys Ala 85 90 95 Ser lie cys Gly Gin Hl S Pro Lys Gin cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Lys Leu Arg Ser Pro val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg 115 120 125 102
Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly 130 135 140 Leu Glu Hi S Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys 145 150 155 160 Glu pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hi s Thr cys Pro Pro cys Pro Ala 165 170 175 Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 180 185 190 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys Val Val 195 200 205 vai Asp Vai Ser Hi S Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 210 215 220 Asp Gly Val Glu Val Hi S Asn Al a Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 225 230 235 240 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val Ser val Leu Thr Val Leu Hi s Gin 245 250 255 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 260 265 270 Leu Pro ser Ser ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 275 280 285 Arg Glu Pro Gl n val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 290 295 300 Lys Asn Gin val ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 325 330 335 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 340 345 350 Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe 355 360 365 103
Ser cys ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 370 375 380
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 <210> 9 <211> 1070 <212> ADN <213> homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (17)..(1048) <400> 9 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt teg ctc age cag gaa ate cat gee 100 Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu ile Hi S Al a 15 20 25 gag ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148 Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 50 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser cys Lys Thr lie Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gca gee ttc tgc agg tea ctc age 244 Asn Hi s Gin Ser Gin Arg Thr cys Al a Al a Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc 292 Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys phe Tyr Asp Hi s Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac 340 ile Ser Cys Ala Ser ile Cys Gly Gin Hi s Pro Lys Gin cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 388 phe cys Glu Asn Glu pro Lys ser ser Asp Lys Thr Hi s Thr cys Pro 110 115 120 ccg tgc cca gca cct gaa gee gag ggg gca ccg tea gtc ttc ctc ttc 436 Pro cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Al a Pro Ser vai Phe Leu Phe 125 130 135 140 104 ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 145 150 aca Thr tgc Cys gtg Vai gtg Vai gtg Val gac Asp gtg val age Ser cac His gaa Glu 160 165 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu val Hi s 175 180 cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 190 195 gtç ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag Vai Leu Hi s Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 205 210 tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu 225 230 aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 240 245 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gl n val ser Leu 255 260 ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Al a Val Glu T rp 270 275 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val 285 290 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 305 310 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat Gly Asn vai Phe Ser cys Ser val Met Hi s 320 325 tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 335 340 gcgcgccaat ta tcc Ser cgg Arg acc Thr cct Pro gag Glu 155 gtc Val 484 gac Asp cct Pro gag Glu gtc Val 170 aag Lys ttc Phe 532 aat Asn gcc Ala aag Lys 185 aca Thr aag Lys ccg Pro 580 gtg Val gtc Val 200 age Ser gtc Val ctc Leu acc Thr 628 gag Glu 215 tac Tyr aag Lys tgc Cys aag Lys gtc Val 220 676 aaa Lys acc Thr ate ile tcc Ser aaa Lys 235 gcc Ala 724 acc Thr ctg Leu ccc Pro cca Pro tcc Ser cgg Arg 772 250 acc Thr tgc cys ctg Leu 265 gtc val aaa Lys ggc Gly 820 gag Glu age Ser 280 aat Asn ggg Gly cag Gin ccg Pro 868 ctg Leu 295 gac Asp tcc ser gac Asp ggc Gly tcc Ser 300 916 aag Lys age Ser agg Arg tgg Trp cag Gin 315 cag Gin 964 gag Glu gct Ala ctg Leu cac Hi s 330 aac Asn cac Hi s 1012 ggt Gly aaa Lys taatctagag 1058 1070
<210> 10 <211> 344 <212> PRT <213> homo sapiens <40 0> 10
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 15 10 15 105
Al a Vai Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu ile Hi s Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Al a Met Arg Ser Cys pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn Hi s Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr cys Ala Al a Phe cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gin Gly Lys Phe Tyr Asp Hi S Leu Leu Arg Asp cys ile Ser cys Ala 85 90 95 ser lie cys Gly Gin Hi S Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hi S Thr cys Pro Pro cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Al a Glu Gly Al a Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Lys ASP Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 145 150 155 160 Vai Asp Val Ser Hi s Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly Vai Gl u Val Hi S Asn Al a Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser Val Leu Thr val Leu Hi s Gin 195 200 205 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Al a 210 215 220 Leu pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 225 230 235 240 Arg Glu Pro Gl n Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 245 250 255 106
Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270
Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 300
Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn vai Phe 305 310 315 320
Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340
<210> 11 <211> 1082 <212> ADN <213> homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (17)..(1060) <40 0> 11 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
Met Asp Al a Met Lys Arg Gl [y Leu Cys Cys Vai Leu 1 5 10 ctg ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt teg ctc age cag gaa ate cat gee 100 Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai Ser Leu Ser Gin Glu Ile Hi S Al a 15 20 25 gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148 Glu Leu Arg Arg phe Arg Arg Ala Met Arg Ser cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag cgc acc tgt gca gee ttc tgc agg tea ctc age 244 Asn Hi S Gin Ser Gin Arg Thr Cys Al a Al a Phe cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 107 292 292 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cys Arg Lys Glu Gl n Gly Lys Phe Tyr Asp 80 85 ate age tgt gcc tcc ate tgt gga cag cac Ile Ser Cys Al a Ser Ile Cys Gly Gin Hi s 95 100 ttc tgt gag aac aag ctc agg age gag ccc phe cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Glu Pro 110 115 cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa Hi s Thr Cys Pro Pro Cys Pro Al a Pro Glu 125 130 gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac Thr Pro Glu vai Thr cys vai vai val Asp 160 165 gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 175 180 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 190 195 age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp T rp 205 210 aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 240 245 ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac Pro Pro Ser 255 Arg Asp Glu Leu Thr 260 Lys Asn ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 270 275 aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 285 290 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 320 325 ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 335 340 cat ctc ctg agg gac tgc His Leu Leu Arg Asp cys 90 taatctagag gcgcgccaat ta cct aag caa tgt gca tac 340
Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 105 aaa tct tca gac aaa act 388
Lys Ser ser Asp Lys Thr 120 gcc gag gag gca ccg tca 436
Ala Glu Gly Ala Pro Ser 135 140 acc ctc atg ate tcc cgg 484
Thr Leu Met Ile Ser Arg 155 gtg age cac gaa gac cct 532 vai ser His Glu Asp Pro 170 gtg gag gtg cat aat gcc 580
Vai Glu Vai His Asn Ala 185 age acg tac cgt gtg gtc 628 ser Thr Tyr Arg vai vai 200 ctg aat ggc aag gag tac 676
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 215 220 tcc tcc ate gag aaa acc 724
Ser ser Ile Glu Lys Thr 235 cca cag gtg tac acc ctg 772
Pro Gin Vai Tyr Thr Leu 250 cag gtc age ctg acc tgc 820
Gin vai Ser Leu Thr Cys 265 gcc gtg gag tgg gag age 868
Ala vai Glu Trp Glu Ser 280 acg cct ccc gtg ctg gac 916
Thr Pro Pro Vai Leu Asp 295 300 ctc acc gtg gac aag age 964
Leu Thr vai Asp Lys Ser 315 tcc gtg atg cat gag gct 1012
Ser Vai Met His Glu Ala 330 tcc ctg tct ccg ggt aaa 1060
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 1082 108 <210> 12 <2ΐ: L> 3 48 <212> PRT <213> h omo sapiens <40 0> 1 2 Met Asp Al a Met Lys Arg Gly Leu cys cys val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Al a Vai Phe val Ser Leu Ser Gin Glu ile Hi s Al a Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Al a Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn Hi s Gin ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gl n Gly Lys Phe Tyr Asp HÍ s Leu Leu Arg ASP Cys ile Ser cys Ala 85 90 95 ser lie cys Gly Gin HÍ S Pro Lys Gin cys Al a Tyr Phe cys Glu Asn 100 105 110 Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser ser Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Al a Pro Glu Ala Glu Gly Al a Pro Ser val Phe Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val 145 150 155 160 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hi S Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 165 170 175 Asn T rp Tyr val ASP Gly val Glu val HÍ S Asn Al a Lys Thr Lys Pro 180 185 190 Arg Glu Glu Gl n Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser val Leu Thr 195 200 205 109
Vai Leu Hi s Gin Asp Trp Leu Asn 210 215 Ser Asn Lys Al a Leu Pro Ser Ser 225 230 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 245 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 260 Phe Tyr Pro Ser Asp ile Al a Vai 275 280 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 290 295 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 305 310 Gly Asn vai Phe ser cys Ser val 325 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 340
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 220 ile Glu Lys Thr ile ser Lys Al a 235 240 val Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg 250 255 Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly 265 270 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 285 Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 300 Val Asp Lys Ser Arg T rp Gin Gin 315 320 Met Hi s Glu Al a Leu Hi s Asn Hi S 330 335 Ser Pro Gly Lys 345 <210> 13 <211> 1109 <212> ADN <213> homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (17) . .(1090) <40 0> 13 1 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu 10 110 ctg ctg tgt ggc gee gtç ttc gtt teg etc age cag gaa ate cat gee 100 Leu Leu cys Gly Ala vai phe vai ser Leu ser Gin Glu ile Hi s Ala 15 20 25 gag ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 148 Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr cys Met ser cys Lys Thr Ile cys 45 50 55 60 aac cat cag age cag ege acc tgt gea gee ttc tgc agg tea etc age 244 Asn Hi s Gin Ser Gin Arg Thr cys Ala Ala Phe cys Arg ser Leu ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc 292 cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp cys 80 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac 340 lie ser cys Ala Ser Ile cys Gly Gin Hi s Pro Lys Gin cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age cca gtg aac ctt cca cca gag etc 388 Phe cys Glu Asn Lys Leu Arg ser Pro VaT Asn Leu Pro Pro Glu Leu 110 115 120 agg gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 436 Arg Glu pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hi s Thr cys Pro Pro cys Pro 12 5 130 135 140 gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea gtç ttc etc ttc ccc cca aaa 484 Al a Pro Glu Ala Glu Gly Al a pro Ser vai Phe Leu phe Pro Pro Lys 145 150 155 ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtç aca tgc gtg 532 ΡΓΟ Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr cys Val 160 165 170 gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtç aag ttc aac tgg tac 580 vaT VaT Asp vai Ser Hi s Glu Asp Pro Glu vai Lys phe Asn Trp Tyr 175 180 185 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg cgg gag gag 628 VaT Asp Gly vai Glu VaT HÍS Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 190 195 200 cag tac aac age acg tac cgt gtg gtç age gtç etc acc gtç ctg cac 676 Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Leu Thr vai Leu Hi s 205 210 215 220 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtç tcc aac aaa 724 Gin Asp Trp Leu Asn GTy Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 225 230 235 gee etc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gçc aaa ggg cag 772 Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys GTy Gin 240 245 250 ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 820 Pro Arg GlU Pro Gin vaT Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 255 260 265 acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtç aaa ggc ttc tat ccc 868 Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr cys Leu vai Lys GTy Phe Tyr Pro 270 275 280 age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac 916 Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn GTy Gin Pro Glu Asn Asn 285 290 295 300 111 tac Tyr aag Lys acc Thr acg Thr cct Pro 305 ccc Pro gtg Vai ctg Leu gac Asp tcc Ser 310 gac Asp ggc Gly tcc Ser ttc Phe ttc Phe 315 ctc Leu 964 tac Tyr age ser aag Lys etc Leu acc Thr gtg Vai gac Asp aag Lys age ser agg Arg tgg Trp cag Gin cag Gin ggg Gly aac Asn gtc vai 1012 320 325 330 ttc Phe tea Ser tgc Cys 335 tcc Ser gtg Vai atg Met cat Hi s gag Glu 340 gct Ala ctg Leu cac Hi s aac Asn cac Hi s 345 tac Tyr acg Thr cag Gin 1060 aag Lys age Ser 350 etc Leu tcc Ser ctg Leu tet Ser ccg Pro 355 ggt Gly aaa Lys taa tctagaggcg cgccaatta 1109
<210> 14 <211> 357 <212> PRT <213> homo sapiens < 4 Ο Ο > 14
Met Asp Al a Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Al a vai Phe Vai Ser Leu Ser Gl n Glu Ile Hi s Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Al a Met Arg ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn Hi s Gin Ser 50 55 60 Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 80 Gin Gly Lys Phe Tyr Asp Hl s Leu Leu Arg Asp cys ile Ser Cys Ala 85 90 95 Ser ile cys Gly Gin Hl S pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Lys Leu Arg ser Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr Hl S Thr cys Pro Pro Cys Pro Al a Pro Glu Ala 130 135 140 112
Glu Gly Ala Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val Asp Val 165 170 175 Ser HÍ S Glu Asp Pro Glu val Lys phe Asn Trp Tyr val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Vai Hi S Asn Al a Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Vai Vai ser Val Leu Thr Val Leu Hi s Gin Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Al a Leu Pro Ser 225 230 235 240 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 260 265 270 vai Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly phe Tyr Pro Ser Asp ile Ala 275 280 285 Vai Glu T rp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser cys Ser 325 330 335 Vai Met Hi s Glu Al a Leu Hi s Asn Hi s Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 1 5 <21: L> 2 9 <21; >> ADN 113 <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 15 tattaggccg gccaccatgg atgcaatga <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência iniciadora <40 0> 16 tgaagatttg ggctccttga gacctggga <210> 17 <211> 29 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência iniciadora <40 0> 17 tcccaggtct caaggagccc aaatcttca <210> 18 <211> 36 114
<212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 18 taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca 36 <210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 19 tgaagatttg ggctcgttct cacagaagta 30 <210> 20 <211> 31 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 20 atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a 31 115 <210> 21 <211> 30 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 21 tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca 30 <210> 22 <211> 28 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 22 ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 23 <211> 26 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 23 tttgggctcc ctgagctctg gtggaa 26 116 <210> 24 <211> 28 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência iniciadora <400> 24 gagctcaggg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 25 <211> 35 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência de péptido sinal modificada <400> 25
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys vai Leu Leu Leu Cys Gly 15 10 15
Ala Vai Phe vai ser Leu Ser Gin Glu ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30
Phe Arg Arg 35
Lisboa, 7 de Novembro de 2013 117

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Formulação compreendendo: a) Proteína de fusão de TACI-imunoglobulina (TACI-Ig) compreendendo: i. o domínio extracelular de TACI ou um seu fragmento ou variante que se liga a BlyS e/ou APRIL; e ii. um domínio constante de imunoglobulina; b) um tampão de acetato tamponando a formulação a um pH variando entre 4,9 e 5,1; e c) trealose, numa concentração variando entre 60 e 100 mg/mL.
  2. 2. Formulação de acordo com a Reivindicação 1, em que o referido tampão de acetato está numa concentração de 5 a 25 mM.
  3. 3. Formulação de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o referido tampão de acetato está numa concentração de 10 mM.
  4. 4. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido tampão de acetato é tampão de acetato de sódio.
  5. 5. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores tendo um pH de 5,0. 1 6.
  6. 6. Formulação anteriores 80 mg/mL. de acordo com qualquer das reivindicações em que a trealose está numa concentração de
  7. 7. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida proteína de fusão de TACI-Ig está compreendida numa concentração entre 20 e 180 mg/mL.
  8. 8. Formulação de acordo com a Reivindicação 7, em que a referida proteína de fusão de TACI-Ig está numa concentração de 70, 75, 100, 125 ou 150 mg/mL.
  9. 9. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido fragmento do domínio extracelular de TACI compreende os resíduos de aminoácido 34 a 66 e/ou resíduos de aminoácido 71 a 104 de SEQ ID N°: 1.
  10. 10. Formulação de acordo com a Reivindicação 9, em que o referido fragmento do domínio extracelular de TACI compreende os resíduos de aminoácido 30 a 110 da SEQ ID N°: 1, ou um seu variante sendo, pelo menos, 90% idêntico a esta ou tendo menos de 10 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
  11. 11. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido domínio constante de imunoglobulina compreende a sequência de SEQ ID N°: 2 ou um seu variante, compreendendo menos de 20 substituições conservadoras de aminoácidos. 2
  12. 12. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida proteína de fusão de TACI-Ig compreende a sequência de SEQ ID N°: 3, ou um seu variante sendo, pelo menos, 90% idêntico a esta ou tendo menos de 30 substituições conservadoras de aminoácidos, o variante ligando-se a BlyS e/ou APRIL.
  13. 13. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores compreendendo , ainda, uma combinação de álcool benzílico e cloreto de benzalcónio.
  14. 14. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a formulação está na forma líquida.
  15. 15. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a formulação é para administração multidose.
  16. 16. Formulação de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a formulação compreende: a referida proteína de fusão de TACI-Ig, numa concentração compreendida entre 70 e 180 mg/mL; trealose, numa concentração compreendida entre 60 e 100 mg/mL; e tampão de acetato de sódio, numa concentração de 100 mM.
  17. 17. Formulação de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 16, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune ou um distúrbio linfoproliferativo. 3
  18. 18. Processo para a preparação da formulação de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 16, compreendendo a etapa de misturar a proteína de fusão de TACI-Ig, o tampão de acetato e trealose, numa concentração variando entre 60 e 100 mg/mL e ajustar o pH na gama de 4,9 a 5,1.
  19. 19. Processo de acordo com a Reivindicação 18 compreendendo, ainda, a etapa de colocar uma quantidade predeterminada da formulação num recipiente estéril.
  20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que o recipiente estéril é seleccionado de um frasquinho de vidro ou uma seringa pré-carregada. Lisboa, 7 de Novembro de 2013 4
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