PT1436003E - Proteínas de fusão imunoglobulina taci - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
PROTEÍNAS DE FUSÃO IMUNOGLOBULINA TACI
ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se geralmente a proteínas de fusão compreendendo uma melhoria do receptor do factor de agrupamento e uma molécula de imunoglobulina da necrose tumoral. Em particular, a presente invenção refere-se à melhoria das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As citocinas são pequenas proteínas solúveis, que medeiam uma variedade de efeitos biológicos, incluindo a regulação do crescimento e diferenciação dos vários tipos de células (ver, por exemplo, Arai et al. Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul e Seder, Cell 76:241 (1994)). Proteínas que constituem o grupo de citocinas incluem as interleucinas, interferões, factores estimuladores de colónias, factores de necrose tumoral, e outras moléculas reguladoras. Por exemplo, a interleucina-17 humana é uma citocina que estimula a expressão da interleucina-6, da molécula de adesão intracelular 1, interleultina-8, factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos e expressão da prostaglandina E2, e desempenha um papel na maturação preferencial dos precursores hematopoiéticos de CD34+ em 1 neutrófilos (Yao et al. J. Immunol. 155:5483 (1995);
Fossiez et al. J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).
Receptores que ligam as citocinas são normalmente compostos por uma ou mais proteínas de membrana integral, que ligam a citocina com alta afinidade e fazem a transdução deste evento de ligação para a célula através de porções do citoplasma de certas subunidades do receptor. Receptores de citocinas foram agrupados em várias categorias, com base em similaridades nos seus domínios de ligação extracelulares. Por exemplo, as cadeias dos receptores responsáveis pela ligação e/ou o efeito de transdução de interferões são membros da família de receptores de citocinas do tipo II, com base num característico resíduo 200 do domínio extracelular.
Interações celulares que ocorrem durante uma resposta imune, são regulados por membros de várias famílias de receptores da superfície celular, incluindo a família do receptor do factor de necrose tumoral (TNFR). A família TNFR consiste numa série de receptores da glicoproteína integral de membrana, muitos dos quais, em conjunto com seus respectivos ligantes, regulam as interacções entre diferentes linhagens de células hematopoiéticas (ver, por exemplo, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant et al. Cytokine Growth Factor Rev. 10: 15 (1999); Yeh et al. Immunol. Rev. 169:283 (1999); Idriss e Naismith, Microsc.
Res. Tech. 50:184 (2000)). 2
Um receptor, é TACI, activador de transmembrana e CAML-interactor (von Bulow e Bram, Science 228:138 (1997); Bram e von Bulow, Patente US 5,969,102 (1999)). TACI é um receptor de membrana acoplado, que tem um domínio extracelular, contendo duas pseudo-repetições ricas em cisteína, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático que interage com CAML (cálcio- modulador e ligante de ciclofilina) , uma proteína integral da membrana localizada em vesículas intracelulares que é um co-indutor da activação de NF-AT quando sobre-expresso em células Jurkat. TACI está associado com as células B e um subconjunto de células T. As sequências de nucleotídeos que codificam TACI e a sua sequência de aminoácido correspondente são fornecidas aqui como SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. O receptor TACI liga-se a dois membros da familia de ligante do factor de necrose tumoral (TNF) . Um ligante é comummente designado como ZTNF4, "BAFF", "neutroquina-a" "BlyS","TALL-1", e "THANK"(Yu et al. Publicação internacional W098/18921 (1998), Moore et al. Science 285:269 (1999); Mukhopadhyay et al. J Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider et al. J. Exp. Med. 189:1747 (1999) ; Shu et al. J Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). A sequência de aminoácidos de ZTNF4 é fornecido como SEQ ID NO: 3. O outro ligante tem sido designado como "ZTNF2", "APRIL" e "morte TNRF do ligante-1" (Hahne et al. J Exp. Med. 188:1185 (1998); Kelly et al. Câncer Res. 60:1021 (2000) ). A sequência de aminoácidos de ZTNF2 é fornecida como SEQ ID NO: 4. Ambos os ligantes são também ligados pelao receptor de maturação de célula-B (BCMA) (Gross et al. Nature 404:995 (2000)). A sequência de nucleotídeos e 3
aminoácidos de BCMA são fornecidos como SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, respectivamente.
As demonstradas actividades in vivo dos receptores do factor de necrose tumoral ilustram o potencial clinico de formas solúveis do receptor. Formas solúveis do receptor TACI foram geradas como proteínas de fusão de imunoglobulina. As versões iniciais resultaram em proteínas heterogéneas de baixa expressão. A heterogeneidade foi observada no terminal amino TACI, no terminal carboxila Fc, e na região do pedúnculo TACI. Existe, portanto, uma necessidade para as composições de receptor de TACI farmaceuticamente úteis. A WO 00/40716 descreve polipeptídeos segregados solúveis, e os seus usos para a detecção de ligantes, agonistas e antagonistas, e em métodos que modulam a activação de células B. A WO 01/81417 descreve TACI como um agente anti-humano. A presente invenção prevê a utilização de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e uma proteína de fusão de imunoglobulina de interactor ligante de ciclofilina (TACI) para a fabricação de um medicamento para inibir a proliferação de células tumorais, em que a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste num fragmento de 4 um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2, em que a metade do receptor TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionados de (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; e na qual a fracção receptor TACI liga pelo menos uma das ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina. A presente invenção, portanto, também fornece uma proteína de fusão que compreende: (a) um activador transmembrana e um modulador de cálcio e interactor-preceptor ligante de ciclofilina (TACI), onde a fracção receptor TACI consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; em que o receptor TACI se liga as moléculas de pelo menos um dos ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma molécula de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. A presente invenção proporciona melhores proteínas de fusão de imunoglobulina TACI adequadas como compostos terapêuticos. 5
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos de TACI humana. Os locais das pseudo-repetições ricas em cisteina são indicados pelo sombreamento, o dominio transmembrana é a caixa, e a região do caule é indicada pelas marcas cardinal. A Figura 2 é um diagrama esquemático de uma imunoglobulina da subclasse IgGl. CL: região constante de cadeia leve; CHi, CH2, CH3; regiões constantes de cadeia pesada; VL: região variável de cadeia leve; VH: região variável de cadeia pesada; CHO: carbohidratos; N: amino-terminal; C: terminal carboxila.
As Figuras 3A, 3B, 3C e 3D mostram uma comparação da sequência de aminoácidos da região constante Fc do tipo selvagem humano γΐ com variantes Fc-488, FC4, Fc5, o FC6, FC7 e FC8. 0 dominio Chi da região constante γΐ humana não faz parte da CF e, portanto, não é mostrado. A localização da região da dobradiça, e os domínios CH2r CH3 são indicados. Os resíduos de Cys normalmente envolvidos na ligação dissulfeto à região constante de cadeia leve (LC) e região constante da cadeia pesada (HC) são indicados. 0 símbolo indica a identidade do tipo selvagem nessa posição, enquanto "***" indica a localização do terminal carboxila, e ilustra a diferença no terminal carboxila da Fc6 em relação às outras versões de Fc. Locais de aminoácidos são indicadas por posições de índice da UE. A Figura 4 mostra a ligação específica de 125I-ZTNF4 com várias construções de TACI-Fc. As proteínas de fusão TACI-Fc têm metades TACI a que faltam os primeiros 29 resíduos 6 de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Uma das proteínas de fusão tem uma fracção TACI com uma região de pedúnculo intacta (TACI (dl-29)-FC5) enquanto que três das proteínas de fusão TACI-Fc têm metades TACI com supressões diversas na região do pedúnculo (TACI (dl—29, dl07-154)-FC5; TACI (dl-29, dlll-154)-FC5; TACI (dl-29, dl20-154)-FC5). Detalhes experimentais estão descritos no Exemplo 4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. Visão geral
Como descrito abaixo, a presente invenção fornece um activador transmembrana e um modulador de cálcio e proteínas de fusão de imunoglobulina e ligante do interactor de ciclofilina (TACI), tal como definido nas reivindicações, e seu uso como definido nas reivindicações. Por exemplo, a presente invenção providencia o uso para inibir a proliferação de células tumorais, incluindo o uso de uma composição que compreende uma proteína de fusão DE imunoglobulina TACI, tal como definido nas reivindicações. Essa composição pode ser administrada em células cultivadas in vitro. A composição pode ser uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI, e a composição farmacêutica pode ser para administração a um sujeito, que tem um tumor. 0 sujeito pode ser um mamífero. A administração da composição farmacêutica pode inibir, por exemplo, a proliferação de linfócitos B num mamífero. 7 A presente descrição descreve a uso para inibir a actividade ZTNF4 num mamífero, compreendendo a administração a um mamífero de uma composição compreendendo uma imunoglobulina TACI. A actividade ZTNP4 pode ser associada a diversas doenças e distúrbios. Por exemplo, uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI pode ser usada para tratar uma doença auto-imune, como o lúpus eritematoso sistémico, miastenia gravis, esclerose múltipla, diabetes mellitus insulino-dependente, doença de Crohn, artrite reumatóide artrite reumatóide juvenil poliarticular e artrite psoriática. Alternativamente, uma composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina TACI pode ser usada para tratar uma doença como a asma, bronquite, enfisema e insuficiência renal. Uma composição farmacêutica compreendendo uma imunoglobulina TACI também pode ser usada para tratar uma doença renal, como a glomerulonefrite, vasculite, nefrite, amiloidose, e pielonefrite, ou uma doença, como neoplasia, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiplo, linfoma não-Hodgkin, doença linfoproliferativa pós-transplante e gamopatia de cadeia leve. Em certos casos, a actividade ZTNF4 pode ser associada com as células T. A composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina TACI também pode ser usada para tratar uma doença ou distúrbio associado a imunossupressão, rejeição do enxerto, doença do enxerto contra hospedeiro, e inflamação. Por exemplo, uma composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina TACI pode ser utilizada para diminuir a inflamação e para tratar problemas como dores nas articulações, inchaço, anemia e choque séptico. 8 A presente descrição descreve o uso para reduzir os níveis de ZTNF4 circulantes no sangue num mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI, onde a administração da composição farmacêutica reduz o nível de circulação de ZTNF4 no sangue do mamífero. Como ilustração, a administração de tal composição farmacêutica pode reduzir os níveis de ZTNF4 circulantes no sangue pelo menos 10%, pelo menos, 20%, pelo menos 10 a 5090, pelo menos, 20 a 50%, ou de pelo menos 30 para 40%, em comparação com os níveis sanguíneos de ZTNF24 antes da administração da composição farmacêutica. Os peritos na técnica podem medir os níveis circulantes de ZTNP4. Métodos ilustrativos são descritos nos Exemplos 4 e 5.
Como descrito abaixo, as proteínas de fusão de imunoglobulina TACI ilustrativas compreendem: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2, e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina. A molécula de imunoglobulina de uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI pode incluir uma região constante da cadeia pesada, tal como uma região constante de cadeia 9 pesada humana. Uma região constante de cadeia pesada IgGl é um exemplo de uma região constante de cadeia pesada adequada. Uma região constante de cadeia pesada IgGl ilustrativa é um fragmento Fc de IgGl que compreende dominios CE2 e CH3. 0 fragmento Fc de IgGl pode ser um fragmento Fc de IgGl de tipo selvagem ou um fragmento Fc de IgGltransformado, tal como o fragmento Fc compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. Um exemplo de proteína de fusão de imunoglobulina TACI é uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que constituem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.
As proteínas de fusão de imunoglobulina TACI aqui descritas podem ser multímeros, tais como dímeros. A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico (como definido nas reivindicações) que codificam uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI. Uma sequência de nucleotídeos ilustrativa que codifica uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI é fornecida pela SEQ ID NO: 53.
A descrição da presente invenção descreve receptores solúveis TACI que consistem num fragmento de um polipeptídeo que tem a sequência de resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2, onde o receptor solúvel TACI compreende pelo menos um de (i) resíduos de aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID NO: 2, e (ii) resíduos de aminoácidos 71 a 104 da SEQ ID NO: 2, e no qual o receptor solúvel TACI 10 liga-se, pelo menos, a um dos ZTNF2 ou ZTNF4. Receptores solúveis TACI adicionais são aqui descritos como metades de receptores TACI adequados para proteínas de fusão de imunoglobulina TACI. Além disso, os receptores solúveis TACI podem ser usados em métodos descritos para as proteínas de fusão de imunoglobulina TACI.
Estes e outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos. Além disso, várias referências são identificadas a seguir. 2. Definições
Na descrição que se segue, uma série de termos são usados extensivamente. As definições a seguir são fornecidas para facilitar a compreensão da invenção.
Como usado aqui, "ácido nucléico" ou "molécula do ácido nucleico" refere-se a polinucleotídeos, como o ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucléico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reacção em cadeia da polimerase (PCR), e fragmentos gerados por qualquer da ligação, cisão, acção de endonuclease, e acção de exonuclease. As moléculas de ácido nucléico podem ser compostas de monómeros que são nucleotídeos de ocorrência natural (como o ADN e RNA), ou análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas α-enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos. Nucleotídeos modificados podem ter alterações em moléculas de açúcar e/ou em metades base de pirimidina ou 11 purina. As alterações de acúcar incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxilo com halogénios, grupos alquilo, grupos aminas, e azido, ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a molécula de açúcar inteira pode ser substituída com estruturas electrónica e estericamente semelhantes tais como aza-açúcares e análogos de açúcar carbocíclico. Exemplos de modificações numa molécula de base incluem purinas alquiladas e pirimidinas, purinas acilatadas ou pirimidinas ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Os monómeros de ácidos nucleicos podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos dessas ligações. Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, e assim por diante. 0 termo "molécula de ácido nucléico" inclui também os chamados "peptídeos de ácidos nucléicos", que compreendem bases de ácidos nucleicos de ocorrência natural ou modificados ligados a uma cadeia principal de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou dupla. 0 termo "complemento de uma molécula de ácido nucléico" refere-se a uma molécula de ácido nucléico com uma sequência de nucleotídeos complementar e orientação inversa, em comparação com uma sequência de nucleotídeos de referência. Por exemplo, a sequência 5 'ATGCACGGG 3' (SEQ ID NO: 57) é complementar à 5 ' CCCGTGCAT 3' (SEQ ID NO: 58) . 12 0 termo "contíguo" denota uma molécula de ácido nucléico que tem um trecho contíguo de sequência idêntica ou complementar a uma outra molécula de ácido nucléico. Sequências contíguas são ditas de "sobreposição" a um determinado trecho de uma molécula de ácido nucléico quer na sua totalidade ou ao longo de um trecho parcial da molécula do ácido nucléico. 0 termo "sequência de nucleotídeos degenerados" denota uma sequência de nucleotídeos, que inclui um ou mais códons degenerados em relação a uma molécula de ácido nucléico de referência que codifica um polipeptídeo. Os códons degenerados contêm trios de nucleotídeos diferentes, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (ou seja, trios de GAU e GAC cada um codifica Asp). 0 termo "gene estrutural" se refere a uma molécula de ácido nucléico que é transcrito num mensageiro de RNA (mRNA), que é depois traduzido numa sequência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.
Uma "molécula de ácido nucléico isolada" é uma molécula de ácido nucléico que não está integrada no ADN genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de ADN que codifica um factor de crescimento que foi separado do ADN genómico de uma célula é uma molécula de ADN isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucléico isolada é uma molécula de ácido nucléico quimicamente sintetizada que não está integrado no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido 13 nucléico que foi isolada a partir de uma determinada espécie é menor do que a molécula de ADN completa de um cromossoma dessa espécie. A "construção de molécula de ácido nucléico" é uma molécula de ácido nucléico, de fita única ou dupla, que foi modificada através da intervenção humana para conter segmentos de ácido nucléico combinados e justapostos num arranjo não existente na natureza. "ADN linear" denota moléculas de ADN não-circulares com extremidades 5' e 3' livres. 0 AND linear pode ser preparado a partir de moléculas de ADN circular fechado, como plasmideos, por digestão enzimática ou ruptura física. "ADN complementar (cADN)" é uma molécula de AND de fita simples que é formada a partir de um modelo de mRNA por transcriptase de enzimas reversas. Normalmente, um iniciador complementar a porções de mRNA é empregue para a iniciação da transcrição reversa. Os peritos na técnica também usam o termo "cADN" para se referirem a uma molécula de ADN de fita dupla constituída por uma molécula de ADN de fita única e a sua vertente de ADN complementar. 0 termo "cADN" também se refere a um clone de uma molécula de ADN sintetizada a partir de um modelo de RNA.
Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos que direcciona a transcrição de um gene estrutural. Normalmente, um 14 promotor está localizado na região de um gene 5' não-codificada, proximal ao local do começo da transcrição de um gene estrutural. A sequência de elementos dentro dos promotores que funcionam no inicio da transcrição são frequentemente caracterizados por sequências de nucleotideos consensuais. Estes elementos promotores incluem sitios de ligação da polimerase do RNA, sequências TATA, sequências CAAT, e diferenciação de elementos específicos (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de resposta AMP ciclicos (CREs), elementos do soro de resposta (SREs; Treisman, Seminars in Câncer Biol. 1:47 (1990)), elementos de resposta de glicocorticóide (GREs), e sitios de ligação para outros factores de transcrição, como o CRF/ATF (0'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J.
Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, elemento de ligação da proteína de resposta cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) e factores octamer (ver, em geral, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), e Lemaigre e Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Se um promotor é um promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, a taxa de transcrição não é regulada por um agente indutor, se o promotor é um promotor constitutivo. Também são conhecidos promotores repressíveis. O "promotor do núcleo" contém sequências de nucleotideos essenciais para a função de promotor, incluindo a caixa TATA e o início da transcrição. Por esta definição, um promotor do núcleo pode ou não ter actividade detectada na 15 ausência de sequências especificas que podem aumentar a actividade ou conferir a actividade de tecidos específicos.
Um "elemento regulador" é uma sequência de nucleótidos que modula a actividade de um promotor do núcleo. Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma sequência de nucleotídeos que se liga com factores celulares que permitem a transcrição exclusiva ou, preferencialmente, em células particulares, tecidos e organelas. Estes tipos de elementos regulatórios estão normalmente associadas a genes que são expressos numa "célula específica", "tecidos específicos", ou "organela específica".
Um "potenciador" é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficiência da transcrição, independentemente da distância ou da orientação do potenciador relativo ao local do início da transcrição. "ADN heterólogo" refere-se a uma molécula de ADN, ou de uma população de moléculas de ADN, que não existem naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. Moléculas de ADN heterólogo a uma célula hospedeira particular pode conter derivados de ADN das espécies da célula hospedeira (ou seja, ADN endógeno) , enquanto que o ADN de acolhimento é combinado com o ADN de não acolhimento (i.e. ADN exógeno). Por exemplo, uma molécula de ADN contendo um segmento de AND de não-acolhimento que codifica um polipeptídeo operacionalmente ligado a um segmento de ADN hospedeiro compreendendo um promotor de transcrição é considerado ser 16 uma molécula de ADN heterólogo. Inversamente, uma molécula de ADN heterólogo pode incluir um gene endógeno operacionalmente ligado com um promotor exógeno. Como outro exemplo, uma molécula de ADN contendo um gene proveniente de uma célula tipo selvagem é considerada ser ADN heterólogo se essa molécula de ADN for introduzida numa célula mutante a que falta o gene do tipo selvagem.
Um "polipeptídeo" é um polímero de resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas, quer seja natural ou produzido sinteticamente. Polipeptídeos de menos de cerca de 10 resíduos de aminoácidos são geralmente referidos como "peptídeos."
Uma "proteína" é uma macromolécula constituída por um ou mais cadeias polipeptídicas. Uma proteína pode também incluir componentes não-peptídicos, tais como grupos de carboidratos. Os carboidratos e outros substituintes não-peptídicos podem ser adicionados a uma proteína da célula na qual a proteína é produzida, e irá variar de acordo com o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos das suas estruturas cadeia principal de aminoácidos; substituintes, tais como grupos de carboidratos são, em geral, não especificados, mas podem estar presentes mesmo assim.
Um peptídeo ou polipeptídeo codificado por uma molécula de ADN de não-acolhimento é um peptídeo "heterólogo" ou polipeptídeo. 17
Um "elemento genético integrado" é um segmento de ADN que foi incorporado num cromossoma de uma célula hospedeira, após esse elemento ser introduzido na célula através da manipulação humana. Dentro da presente invenção, elementos genéticos integrados são mais comummente derivados de plasmideos linearizados que são introduzidos nas células por electroporação ou outras técnicas. Elementos genéticos são passados a partir da célula hospedeira original para a sua descendência.
Um "vector de clonagem" é uma molécula de ácido nucléico, como um plasmideo, cosmideo ou bacteriófago, que tem a capacidade de replicar de forma autónoma numa célula hospedeira. Tipicamente, vectores de clonagem contêm uma ou um pequeno número de sitios de reconhecimento de restrição de endonuclease que permitem a inserção de uma molécula de ácido nucléico de uma forma determinável, sem perda de uma função biológica essencial do vector, bem como as sequências de nucleotideos que codificam um gene marcador que é adequado para a utilização na identificação e selecção das células transformadas com o vector de clonagem. Os genes marcadores tipicamente incluem genes que conferem resistência à tetraciclina ou resistência à ampicilina.
Um "vector de expressão" é uma molécula de ácido nucléico que codifica um gene que se expressa numa célula hospedeira. Normalmente, um vector de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene, e um terminador de transcrição. A expressão genética é geralmente colocada sob o controlo de um promotor, e tal gene é dito estar 18 "operacionalmente ligado ao promotor. Da mesma forma, um elemento regulador e promotor do núcleo são operacionalmente ligados se o elemento regulador modula a actividade do promotor do núcleo.
Um "hospedeiro recombinante" é uma célula que contém uma molécula de ácido nucléico heterólogo, como um vector de clonagem ou vector de expressão. No contexto actual, um exemplo de um hospedeiro recombinante é uma célula que produz uma proteína de fusão TACI-Fc de um vector de expressão. "Transformantes integrativos" são células hospedeiras recombinantes, em que o ADN heterólogo está integrado no ADN genómico das células.
Uma "proteína de fusão" é uma proteína híbrida de expressa por uma molécula de ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotídeos de pelo menos dois genes. Por exemplo, um proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende uma molécula de receptor TACI e uma molécula de imunoglobulina. Conforme utilizado aqui, um "agrupamento receptor TACI" é uma parte do domínio extracelular do receptor TACI que liga pelo menos a um dos ZTNF2 ou ZTNF4. A frase uma "molécula de imunoglobulina" refere-se a um polipeptídeo que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. Por exemplo, a molécula de imunoglobulina pode incluir uma região constante da cadeia pesada. 0 termo proteína de fusão "TACI-Fc" refere-se a uma proteína de fusão de 19 imunoglobulina TACI em que o agrupamento de imunoglobulina compreende regiões constantes de imunoglobulina de cadeia pesada CH2 e CH3. O termo "receptor" denota uma célula-associada da proteína que se liga a uma molécula bioactiva denominado "ligante". Essa interacção medeia o efeito do ligante na célula. No contexto da ligação ao receptor TACI, a frase "ligado especificamente" ou "ligação específica" refere-se à capacidade do ligante se vincular competitivamente com o receptor. Por exemplo, o ZTNF4 liga-se especificamente com o receptor TACI, e isso pode ser demonstrado pela observação da concorrência para o receptor TACI entre o ZTNF4 detectável marcado e ZTNF4 não marcado.
Os receptores podem ser ligados por membranado, citosólico ou nuclear; monomérico (por exemplo, receptor de hormona estimuladora da tireoide, receptor beta-adrenérgico) ou multimérica (por exemplo, o receptor PDGF, receptor da hormona do crescimento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor de eritropoietina e receptor IL-6). Receptores ligados por membrana são caracterizados por uma estrutura multi-domínio compreendendo um domínio de ligação extracelular e um domínio efector intracelular que são tipicamente envolvidos na transdução de sinal. Em determinados receptores ligados por membrana, o domínio extracelular de ligação e o domínio efector intracelular estão localizados em polipeptídeos distintos que compõem o receptor funcional completo. 20
Em geral, a ligação do ligante ao receptor resulta numa mudança conformacional no receptor que causa uma interacção entre o domínio efector e outra molécula(s) na célula, que por sua vez leva a uma alteração no metabolismo da célula. Eventos metabólicos que são muitas vezes ligados às interacções receptor-ligante incluem transcrição de genes, fosforilação, desfosforilação, aumento da produção de ΔΜΡ cíclico, mobilização de cálcio celular, mobilização de lipídios de membrana, adesão celular, hidrólise de lipídios inositol e hidrólise de fosfolipídios. 0 termo "sequência de sinal de secreção" denota uma sequência de ADN que codifica um peptídeo ("peptídeo de secreção") que, como um componente de um grande polipeptídeo, dirige o polipeptídeo maior através de uma via de excreção de uma célula em que é sintetizada. 0 maior polipeptídeo é comummente clivado para remover o peptídeo secretor durante o trânsito através da via secretora.
Um "polipeptídeo isolado" é um polipeptídeo que é essencialmente livre de contaminação de componentes celulares, tais como carboidratos, lipídios, ou outras impurezas proteicas associadas ao polipeptídeo na natureza. Normalmente, uma preparação do polipeptídeo isolado contém o polipeptídeo numa forma altamente purificada, ou seja, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos, cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95%, superior a 95%, ou superior a 99% puro. Uma forma de mostrar que uma preparação contém uma particular preparação de proteína contém um polipeptídeo isolado é pelo aparecimento de uma única faixa 21 seguintdo o dodecil sulfato de sódio (SDS)-eletroforese em gel de poliacrilamida da preparação na proteína e coloração do gel Coomassie Brilliant Blue. No entanto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipeptídeo em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou, em alternativa, formas glicosiladas ou derivatizadas.
Os termos "amino terminal" e "carboxila terminal" são usados aqui para designar posições dentro dos polipeptídeos. Sempre que o contexto permite, estes termos são usados com referência a uma sequência particular ou parte de um polipeptídeo para indicar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência carboxi-terminal posicionada a uma sequência de referência dentro de um polipeptídeo está localizada próxima ao terminal carboxila da sequência de referência, mas não é necessariamente no terminal carboxila do polipeptídeo completo. 0 termo "expressão" refere-se à biossíntese de um produto do gene. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural em mRNA e tradução do mRNA em uma ou mais polipeptídeos.
0 termo "variante de emenda" é aqui utilizado para designar as formas alternativas de RNA transcrito de um gene. A variante de emenda surge naturalmente com o uso de sítios de emenda alternativos dentro de uma molécula de RNA transcrita, ou menos frequente entre as moléculas de RNA 22 transcritas separadamente, e pode resultar em vários mRNAs transcritos a partir do mesmo gene. Variantes de emenda podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. 0 termo variante de emenda também é usado aqui para denotar um polipeptidio codificado por uma variante de uma emenda do mRNA transcrito de um gene.
Conforme utilizado aqui, o termo "imunomodulador" inclui citocinas, células-tronco de factores de crescimento, limfotoxinas, moléculas co-estimulantes, factores hematopoiéticos e análogos sintéticos destas moléculas. 0 termo " par complemento/anti-complemento" denota metades não-idênticas que formam uma ligação não-covalente associada, par estável em condições adequadas. Por exemplo, a biotina e avidina (ou estreptavidina) são membros prototípicos de um par complemento/anti-complemento. Outros exemplos de pares complementar/anti-complementar incluem pares receptor/ligante, pares anticorpo/antígeno (ou epítopo ou hapteno), pares de polinucleotídeo senso/anti-senso, e assim por diante. Onde a dissociação subsequente do par complemento/anti-complemento é desejável, o par complemento/anti-complemento de preferência tem uma afinidade de ligação inferior a 109 M"1.
Um "fragmento de anticorpo" é uma porção de um anticorpo, como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, e assim por diante.
Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo 23 liga-se com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. 0 termo "fragmento de anticorpo" inclui também um polipeptideo sintético ou geneticamente modificafo que se liga a um antígeno específico, como os polipeptídeos que consistem na região variável de cadeia leve, fragmentos "Fv" consistindo nas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas de polipeptídeos recombinantes de cadeia simples nas quais as regiões variáveis leves e pesados estão ligadas por um ligante peptídeo ("proteínas scFv"), e o mínimo de unidades de reconhecimento que consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável.
Um "anticorpo quimérico" é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e regiões de determinação complementares derivadas de um anticorpo de roedores, enquanto o restante da molécula de anticorpo é derivada de um anticorpo humano. "Anticorpos humanizados" são proteínas recombinantes em que as regiões determinantes de complementaridade murina de um anticorpo monoclonal foram transferidas de cadeias pesadas e leves variáveis da imunoglobulina murina em um domínio humano variável.
Conforme utilizado aqui, um "agente terapêutico" é uma molécula ou átomo, que é conjugado a uma molécula de 24 anticorpo para produzir um conjugado, que é útil para a terapia. Exemplos de agentes terapêuticos incluem medicamentos, toxinas, imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes fotoactivos ou corantes e radioisótopos.
Um "rótulo detectável" é uma molécula ou átomo, que pode ser conjugado a uma molécula de anticorpo para produzir uma molécula útil para o diagnóstico. Exemplos de etiquetas detectáveis incluem quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iões paramagnéticos, ou outras metades de marcador. 0 termo "marca de afinidade" é aqui utilizado para designar um segmento polipeptideo que pode ser ligado a um segundo polipeptídeo para fornecer a purificação ou a detecção do segundo polipeptideo ou fornecer locais para a ligação do segundo polipeptideo a um substracto. Em principio, qualquer peptideo ou proteína para a qual um anticorpo ou outro agente de ligação específico está disponível pode ser usado como uma marca de afinidade. Marcas de afinidade incluem um tracto polihistidina, proteína A (Nilsson et al. EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al. Methods Enzymol. 198:3 (1991)), transferase de glutationa S (Smith e Johnson, Gene 67:31 (1988)), marca de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al. Proc. Natl. Acad., USA 82:7952 (1985)), substância P, peptideo FLAG (Hopp et al. Biotecnologia 6:1204 (1988)), peptideo de ligação de estreptavidina, ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Ver, em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Moléculas de ADN codificandp 25 marcas de afinidade estão disponíveis em fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .
Um "anticorpo nu" é um anticorpo inteiro, ao contrário de um fragmento de anticorpo, que não é conjugado com um agente terapêutico. Anticorpos nus incluem tanto anticorpos policlonais e monoclonais, bem como alguns anticorpos recombinantes, como anticorpos quiméricos e humanizados.
Conforme utilizado aqui, o termo "componente de anticorpos" inclui tanto o anticorpo inteiro como um fragmento de anticorpo.
Um "imunoconjugante" é um conjugado de um componente de anticorpos com um agente terapêutico ou uma etiqueta detectável.
Um "polipeptídeo alvo" ou um "peptídeo alvo" é uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos um epitope, e que se expressa numa célula-alvo, como uma célula tumoral, ou uma célula que carrega um agente antigeno infeccioso. As células T reconhecem epitopos peptidicos apresentado por uma molécula complexa de histocompatibilidade principal a um polipeptídeo alvo ou um peptídeo alvo e tipicamente lisam a célula-alvo ou recrutam 26 outras células do sistema imunológico ao local da célula-alvo, matando assim a célula-alvo.
Um "peptídeo antigénico", é um peptídeo, que vai ligar uma molécula complexa de histocompatibilidade principal para formar um complexo MHC-pepdde, que é reconhecido por uma célula T, induzindo uma resposta de linfócitos citotóxicos mediante a apresentação às células T. Assim, os peptideos antigénicos são capazes de se ligar a uma molécula complexa de histocompatibilidade principal adequada e induzir uma resposta das células T citotóxicas, como a lise celular ou liberação de citocinas especificas contra a célula-alvo, que se liga ou expressa o antigeno. 0 peptídeo antigénico pode ser ligado no contexto de uma molécula complexa de histocompatibilidade da classe I ou II principal, na apresentação de um antigeno de célula ou numa célula-alvo.
Em eucariotos, a polimerase II RNA catalisa a transcrição de um gene estrutural para a produção de mRNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser projectada para conter um modelo de polimerase II RNA no qual a transcrição do RNA tem uma sequência que é complementar ao do mRNA específico. A transcrição do RNA é chamada de um " RNA anti-senso " e uma molécula de ácido nucléico que codifica o RNA anti-senso é chamada de um "gene anti-senso." As moléculas de RNA anti-senso são capazes de se ligar a moléculas de mRNA, resultando numa inibição da tradução do mRNA. 27
Devido à imprecisão dos métodos analíticos padrão, pesos moleculares e comprimentos de polímeros devem ser entendidos como valores aproximados. Quando esse valor é expresso como "cerca de X" ou "aproximadamente X", o valor declarado de X deve ser entendido como uma precisão de ± 10%. 3. Produção de Moléculas de Ácido Nucleico Codificando Proteínas de Imunoglobulinas taci A Figura 1 apresenta a previsto sequência de aminoácidos do TACI humano (von Bulow e Bram, Science 278:138 (1997)). O polipeptídeo TACI contém os seguintes elementos previstos: (a) duas estruturas de pesudo-repetição ricas em cisteína características dos domínios de ligação do factor de ligante de necrose tumoral, (b) um aminoácido 62 "região talo", que reside entre os domínios de ligação e os domínios transmembrana, (c) um domínio transmembrana de aminoácido 20, e (d) um domínio intracelular de aminoácido 127. A sequência de aminoácidos não contém uma sequência de sinal hidrofóbico amino terminal previsto. A fim de criar uma forma solúvel de Taci humano para uso como um inibidor do ligante nativo: foi gerado uma interacção do receptor nativo, e um domínio extracelular da proteína de fusão de Fc de imunoglobulina humana TACI. A sequência disponível de TACI humano foi utilizada como ponto de partida para a criação da molécula de proteína de fusão (von Bulow e Bram, Science 278:138 (1997)). Esta 28 primeira construção, designada como "TACI-FC4," incluem os resíduos de aminoácidos 1 a 154 do polipeptídeo TACI, e uma região humana Fc modificada, como descrito abaixo. 0 ponto de fusão do resíduo 154 foi escolhido de forma a incluir tanto da região da haste de TACI como possível, embora não inclua qualquer parte potencial do domínio transmembrana previsto.
Uma vez que o polipeptídeo TACI nativo não contém uma sequência de sinal amino terminal, uma sequência de sinal amino terminal foi adicionada ao TACI a fim de gerar uma forma segregada da proteína de fusão TACI-Fc. A sequência sinal foi modificada para sequência pré-pro do activador de plasminogénio de tecido humano. As alterações foram incluídas para melhorar a segmentação do sinal de peptidase e o processamento da protease furin específica e por isso essa sequência tem sido referida como o "líder optimizado tPA (otPA)." A sequência otPA (SEQ ID NO: 25), está ilustrada abaixo; os resíduos de aminoácidos são sombreados. A sequência codificante da proteína recombinante de fusão TACI-Fc foi inserida num vector de expressão, que foi transfectado em células de ovário de hamster chinês. -35 -30
Hat ftsp Ala Ket fcys Arg Gly Leu Cys Cys Vai teu Leu Leu Cys sinal de peptidase sitio de clivagem -20 ^ __„
Gly Ala Vai Phe Vai Ser teu Ser Gin Glu lie Hís Ala Glu I»ê$ sítio de clivagem furin
Arg Arg gtoS fii Arg 29
As células transfectadas de ovário de hamster chinês produziram a proteína TACI-FC4 a um nível baixo de cerca de 0,3 pg/célula/dia. Análises Western blot da proteína TACI-Fc com IgG Fc de cabra anti-humano revelou duas bandas, uma banda foi menor do que o tamanho esperado de aproximadamente 48 kDa. A análise da sequência de aminoácidos de proteínas purificadas revelou que a banda menor reflete a clivagem de proteínas de fusão TACI em vários locais dentro da região de caule TACI Com referência à SEQ ID NO: 2, os terminais maiores foram encontrados em resíduos de aminoácidos 118 e 123, embora, as proteínas também fossem clivados nas posições de aminoácidos 110, 139 e 141.
Além da heterogeneidade causada pela clivagem na região do pedúnculo, a heterogeneidade também foi observada nos terminais carboxi e amino. Com referência à SEQ ID NO: 2, os terminais amino principais foram encontrados nos resíduos de aminoácidos 1, 10 e 13. Diferenças no terminal carboxila refletem a heterogeneidade natural das imunoglobulinas recombinantes e proteínas de fusão de imunoglobulina, que incluem a remoção incompleta do carboxil-terminal codificando o resíduo de lisina. Outra fonte de heterogeneidade foi encontrada na natureza variável da estrutura de carboidrato ligado Fc codificando o domínio da imunoglobulina CH2.
Novas versões de TACI-Fc foram geradas para resolver a heterogeneidade observada. As construções foram projectadas para incluir pelo menos uma das seguintes variações na metade TACI: (1) porções da região do pedúnculo TACI foram 30 excluídas, (2) uma parte da região do pedúnculo TACI foi substituída por uma parte da região do pedúnculo BCMA, (3) o resíduo de arginina na posição 119 foi transformado para eliminar um sítio de clivagem potencial furin (4), o resíduo de glutamina na posição 121 foi transformado para eliminar um sítio de clivagem potencial furin (5), o residuo de arginina na posição 122 foi transformado para eliminar um sítio de clivagem potencial furin (6), resíduos de aminoácidos nas posições 123 e 142 foram transformados para resíduos de aminoácidos encontrados nas posições correspondentes da TACI murino (7) , a sequência dos sinais humanos otPA foi substituída por uma região variável de sequência de sinal de cadeia pesada humana (8), o resíduo de valina na posição 29 foi transformado em metionina, e a sequência sinal otPA foi junta a uma posição amino terminal para este resíduo, e (9) a sequência de sinal otPA foi junta a uma localização amino terminal do resíduo de alanina na posição 30.
Foram igualmente introduzidas alterações na molécula de imunoglobulina. Cinco classes de imunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE, foram identificadas nos vertebrados superiores. As proteínas IgG, IgD, IgE são caracteristicamente dissulfetos heterotetrâmeros ligados compostos por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Normalmente, a IgM é encontrada como um pentâmero de um tetrâmero, enquanto a IgA ocorre como um dímero de um tetrâmero. A IgG compreende a principal classe em que normalmente existe como a segunda proteína mais abundante no plasma. 31
Nos seres humanos, a IgG consiste em quatro subclasses, designadas IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Conforme mostrado na Figura 2, cada cadeia pesada da imunoglobulina possui uma região constante, que consiste em domínios da proteína de região constante (CHi, dobradiça, CE2 e CH3) que são invariantes por uma dada subclasse. As regiões constantes de cadeia pesada da classe IgG são identificadas com o símbolo grego γ. Por exemplo, as imunoglobulinas da subclasse IgGl contêm uma região constante de cadeia pesada ΥΙ Ο fragmento Fc, ou domínio Fc, consistem em dissulfeto ligado a regiões de dobradiça de cadeia pesada, domínios Ch2 e Ch3 . Em proteínas de fusão de imunoglobulina, os domínios Fc da subclasse IgGl são frequentemente utilizados como a molécula de imunoglobulina porque a IgGl tem a maior meia-vida sérica de qualquer uma das proteínas do soro. A morosidade do soro meia-vida pode ser uma característica desejável para os estudos de proteína animal e uso terapêutico humano potencial. Além disso, a subclasse IgGl possui a maior capacidade de realizar as funções efectoras mediadas por anticorpos. A função efectora primária que pode ser mais útil numa proteína de fusão de imunoglobulina é a capacidade de um anticorpo IgGl para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Por outro lado, esta poderia ser uma função indesejável para uma proteína de fusão que funciona principalmente como um antagonista. Vários dos resíduos de aminoácidos específicos que são importantes para a actividade mediada da região constante de anticorpos na subclasse IgGl foram identificados. Inclusão ou exclusão destes aminoácidos específicos, portanto, permite a inclusão ou a exclusão da 32 actividade mediada da região constante de imunoglobulina especifica.
Seis versões de IgGl humana modificada foram geradas para a criação de proteínas de fusão de Fc. A Fc-488 foi projectada para a clonagem conveniente de uma proteína de fusão contendo a região Fc humana γΐ, e foi construída usando o tipo selvagem de região constante da imunoglobulina humana γΐ como um modelo. A preocupação quanto aos potenciais efeitos deletérios devido a um resíduo de cisteína não emaparelhada levou à decisão de substituir a cisteína (resíduos de aminoácidos 24 de SEQ ID NO: 6) que as ligações dissulfeto normalmente com a região constante de cadeia leve de imunoglobulina com um resíduo de serina. Outra mudança foi introduzida no códon codificando a posição do índice UE 218 (resíduo de aminoácido 22 de SEQ ID NO: 6) para introduzir uma restrição Bgl II do sítio de reconhecimento da enzima para facilitar as futuras manipulações de ADN. Estas alterações foram introduzidas no produto da PCR codificada nos iniciadores de PCR. Devido à localização do sítio III Bgl e para completar a região de dobradiça Fc, códons com índice da UE para as posições 216 e 217 (resíduos de aminoácidos 20 e 21 de SEQ ID NO: 6) foram incorporadas nas sequências das proteínas de fusão. O FC4, FC5, e Fc6 contém mutações para reduzir as funções efectoras mediadas pelo Fc reduzindo a ligação FcyRI e o complemento Clq vinculativo. O FC4 contém as mesmas substituições de aminoácidos que foram introduzidas no Fc-488. Substituições adicionais de aminoácidos foram 33 introduzidas para reduzir potenciais funções efectoras mediadas de Fc. Especificamente, três substituições de aminoácidos foram introduzidas para reduzir o FcyRI vinculativo. Estas são as substituições nas posições do índice da UE 234, 235 e 237 (resíduos de aminoácidos 38, 39 e 41 de SEQ ID NO: 6) . As substituições nestas posições têm sido mostradas para reduzir a ligação para FcyRI (Duncan et al. Nature 332:563 (1988)). Estas substituições de aminoácidos podem também reduzir FcYRIIa vinculativo, bem como FcyRIII vinculativo (Sondermann et al. Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 164:5313 (2000) ) . Vários grupos têm descrito a importância das posições de índice UE 330 e 331 (resíduos de aminoácidos 134 e 135 da SEQ ID NO: 6), em complemento de Clq vinculativo e subsequente fixação de complemento (Canfield e Morrison, J. Exp. Med 173:1483 (1991); Tao et al. J. Exp. Med. 178:661 (1993)). Substituições de aminoácidos nestas posições foram introduzidas no FC4 para reduzir a fixação de complemento. O domínio CH3 do FC4 é idêntico à encontrada no polipeptídeo correspondente de tipo selvagem, excepto para o códon de paragem, que foi alterado de TGA para TAA para eliminar um sítio de barragem potencial de metilação do ADN clonado quando é cultivado em mais cepas de barragem E. coli.
Em FC5, o resíduo de arginina na posição do índice UE 218 foi transformado de novo para uma lisina, porque o esquema de clonagem Bgl II não foi utilizado em proteínas de fusão 34 contendo este Fc particular. 0 restante da sequência Fc5 corresponde à descrição acima para FC4 . 0 FC6 é idêntico ao Fc5 excepto que o códon de lisina carboxila terminal foi eliminado. O terminal C de lisina de imunoglobulinas maduras é muitas vezes removido de imunoglobulinas maduras pós-translacionais antes de secreção das células B, ou removidas durante a circulação do soro. Consequentemente, o terminal C de resíduos de lisina não é normalmente encontrado em anticorpos circulantes. Como no FC4 e FC5 acima, o códon de paragem na sequência Fc6 foi mudado para TAA. FC7 é idêntico ao do tipo selvagem Fc yl excepto para uma substituição de aminoácido na posição do índice UE 297 localizado no domínio CH2. A posição de índice UE Asn-297 (resíduo de aminoácido 101 da SEQ ID NO: 6) é um sítio de ligação de carboidratos N-ligação. A N-ligação de carboidratos introduz uma fonte potencial de variabilidade de uma proteína recombinante expressa por um lote de potenciais de variações na estrutura de carboidratos. Numa tentativa de eliminar a variabilidade potencial, Asn-297 foi transformado para um resíduo de glutamina para impedir a fixação do N-ligação de carboidrato nessa posição de resíduo. O carboidrato no resíduo 297 também está envolvido na ligação Fc ao FcyRIII (Sondermann et al. Nature 406:267 (2000)). Portanto, a remoção do carboidrato deve diminuir ligação do FC7 35 recombinante contendo proteínas de fusão para o FcyRs em geral. Como acima, o códon de paragem na sequência FC7 foi transformado para TAA.
Fc8 é idêntica à região selvagem da imunoglobulina do tipo γΐ mostrada em SEQ ID NO: 6, excepto que o resíduo de cisteína na posição do índice UE 220 (resíduo de aminoácido 24 de SEQ ID NO: 6) foi substituído por um resíduo de serina. Esta mutação eliminou o resíduo de cisteína das ligações dissulfeto normais com região constante de imunoglobulina de cadeia leve. TACI-Fc ilustrativos são descritos na Tabela 1. 36
Tabela 1
Construções de Proteínas de Fusão TACI-Fc ilustrativas Sequência3 TACI Versão Fc TACI13 Fc4 TACI13 Fc5 TACI13 Fcyl TACI (d 107-154) Fc5 TACI (R119Q) Fc4 TACI (1-104)-BCMA (42-54)c Fc5 TACI (d 143-150) Fc5 TACI (R142G, d 143-150) Fc5 TACI (R119G, Q121P, R122Q, S123A) Fc5 TACI (R119G, R122Q) Fc5 TACI (dl —28, V29M) Fc6 TACI (dl — 2 9) Fc6 TACI (dl —2 9) Fc5 TACI (dl-29, dl07-154) Fc5 TACI (dl-29, dlll-154) Fc5 TACI (dl-29, d!20-154) Fc5 §;;;;;;|l§dÉÍ|á:ÍSÍÍíííííííÍdÍIÍíííííííÍÍííííííí|dd^^ iiiii si lisisii! ||| i§$ |||! §d||s|§iáiíííííjii|isj !s!!!!i!!!!§§(|s|i||g7!!!i^!!!!gi|iã:sg|:§:g:s||^ b Inclui resíduos de aminoácidos 1-154 da SEQ ID NO: 2. c Esta construção inclui resíduos de aminoácidos 1 a 104 de SEQ ID NO: 2 (TACI) e aminoácidos 42 a 54 de SEQ ID NO: 27 (BCMA). 37
As proteínas TACI-Fc recombinantes foram produzidas por células de ovário de hamster chinês, isoladas, e analisadas usando análise de Western blot e análise da sequência de aminoácidos. Surpreendentemente, a supressão dos primeiros 29 aminoácidos do N-terminal do polipeptideo TACI resultou num aumento de dez vezes na produção de proteínas de fusão TACI-Fc pelas células de ovário de hamster chinês. Esta supressão também reduziu a clivagem de comprimento completo da região de pedúnculo. Além disso, a clivagem na região caule TACI foi reprimida tanto por truncatura da região de pedúnculo TACI, ou substituindo a região do pedúnculo TACI dentro de outra sequência de aminoácidos (por exemplo, a sequência de aminoácidos da região do pedúnculo BCMA).
Conforme descrito no Exemplo 4, análises funcionais das construções TACI-Fc indicam que as proteínas de fusão TACI (dl —29)-FC5, TACI (dl —29, dl07-154)-FC5, TACI (dl-29, dlll-154)-FC5, e TACI (dl-29, dl20-154)-FC5 têm afinidades semelhantes de ligação para ZTNF24. No entanto, as construções, TACI (dl-29)-FC5, TACI (dl-29, dlll-154)-FC5, e TACI (dl-29, dl20-154)-FC5 parecem vincular mais ZTNF4 por mole de TACI-Fc do que a construção TACI (dl-29, dl07-154)-FC5. Dependendo fim a que se destina (ou seja, terapêutica, diagnóstico ou pesquisa), seja a alta capacidade ou baixa capacidade das proteínas de fusão TACI-Fc podem ser empregues. Além disso, uma combinação de alta capacidade e baixa capacidade das proteínas de fusão TACI-Fc possibilita a titulação de ZTNF2 ou ZTNF24. A presente invenção contempla proteínas de fusão TACI de imunoglobulina, tal como definido nas reivindicações que 38 compõem uma molécula do receptor TACI constituído por resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2, 30 a 110 da SEQ ID NO: 2, ou 30 a 154 da SEQ ID NO: 2. A especificação descreve proteínas de fusão TACI de imunoglobulina que compõem uma molécula do receptor TACI constituído por resíduos de aminoácidos 31 a 106 da SEQ ID NO: 2, 31 a 110 da SEQ ID NO: 2, 31 a 119 da SEQ ID NO: 2, ou 31 a 154 da SEQ ID NO: 2.
Mais genericamente, a especificação descreve proteínas de fusão de imunoglobulina TACI, onde a metade dos receptores TACI consiste num fragmento de resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; e em que a molécula de receptor TACI liga pelo menos uma dos ZTNF2 ou ZTNF4. Esses fragmentos compõem uma pseudo-repetição da região rica em cisteína, e, opcionalmente, podem incluir pelo menos um segmento N-terminal, que reside numa posição amino-terminal da pseudo-repetição da região rica em cisteína, e um segmento de caule, que reside numa posição de terminal carboxilo de uma pseudo-repetição de região rica em cisteína. Regiões ricas de peseudo-repeticão em cisteína incluem polipeptídeos que: (a), incluem pelo menos um dos resíduos de aminoácidos 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, e os resíduos de aminoácidos 71 a 104 da SEQ ID NO: 2; (b) compreendem ambos os resíduos de aminoácidos 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, e os resíduos de aminoácidos 71 a 104 da SEQ ID NO: 2; ou (c) incluem resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2.
Os segmentos N-terminal incluem o seguinte com referência a SEQ ID NO: 2: resíduos de aminoácidos 33, resíduos de aminoácidos 32 a33, resíduos de aminoácidos 31 a 33, e 39 resíduos de aminoácidos 30 a 33. Segmentos de pedúnculo adequados incluem um ou mais aminoácidos de resíduos de aminoácidos 105 a 154 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, o segmento de caule pode consistir no seguinte com referência a SEQ ID NO 2: resíduo de aminoácido 105, resíduos de aminoácidos 105 a 106, resíduos de aminoácidos 105 a 107, resíduos de aminoácidos 105 a 108, resíduos de aminoácidos 105 a 109, resíduos de aminoácidos 105 a 110, resíduos de aminoácidos 105 a 111, resíduos de aminoácidos 105 a 112, resíduos de aminoácidos 105 a 113, resíduos de aminoácidos 105 a 114, resíduos de aminoácidos 105 a 115, resíduos de aminoácidos 105 a 116, resíduos de aminoácidos 105 a 117 e resíduos de aminoácidos 105 a 118, resíduos de aminoácidos 105 a 119, resíduos de aminoácidos 105 a 120, resíduos de aminoácidos 105 a 121, resíduos de aminoácidos 105 a 122, resíduos de aminoácidos 105 a 123, resíduos de aminoácidos 105 a 124, resíduos de aminoácidos 105 a 125, resíduos de aminoácidos 105 a 126, resíduos de aminoácidos 105 a 127, resíduos de aminoácidos 105 a 128, resíduos de aminoácidos 105 a 129, resíduos de aminoácidos 105 a 130, resíduos de aminoácidos 105 a 131, resíduos de aminoácidos 105 a 132, resíduos de aminoácidos 105 a 133, resíduos de aminoácidos 105 a 134, resíduos de aminoácidos 105 a 135, resíduos de aminoácidos 105 a 136, resíduos de aminoácidos 105 a 137, resíduos de aminoácidos 105 a 138, resíduos de aminoácidos 105 a 139, resíduos de aminoácidos 105 a 140, resíduos de aminoácidos 105 a 141, resíduos de aminoácidos 105 a 142, resíduos de aminoácidos 105 a 143, resíduos de aminoácidos 105 a 144, resíduos de aminoácidos 105 a 145, resíduos de aminoácidos 105 a 146, resíduos de aminoácidos 105 a 147, resíduos de aminoácidos 105 a 148, resíduos de aminoácidos 105 a 149, resíduos de aminoácidos 105 a 150, resíduos de aminoácidos 105 a 151, resíduos de aminoácidos 105 a 152, 40 resíduos de aminoácidos 105 a 153, e os resíduos de aminoácidos 105 a 154.
Segmentos de pedúnculo adicionais adequados incluem um ou mais aminoácidos da região do pedúnculo BCMA (i.e. resíduos de aminoácidos 42 a 54 de SEQ ID NO: 27) . Por exemplo, um segmento de caule pode consistir no seguinte com referência a SEQ ID NO: 27: resíduos de aminoácidos 42, resíduos de aminoácidos 42 a 43, resíduos de aminoácidos 42 a 44, resíduos de aminoácidos 42 a 45, resíduos de aminoácidos 42 a 46, resíduos de aminoácidos 42 a 47, resíduos de aminoácidos 42 a 48, resíduos de aminoácidos 42 a 49, resíduos de aminoácidos 42 a 50, resíduos de aminoácidos 42 a 51, resíduos de aminoácidos 42 a 52, resíduos de aminoácidos 42 a 53, e os resíduos de aminoácidos 42 a 54.
Mais genericamente, um segmento de caule pode ser composto de dois a 50 resíduos de aminoácidos. A molécula de imunoglobulina de uma proteína de fusão aqui descrita compreende pelo menos uma região constante de uma imunoglobulina. Preferencialmente, a molécula de imunoglobulina representa um segmento de uma imunoglobulina humana. A sequência de imunoglobulina humana pode ser uma sequência de aminoácidos de tipo selvagem, ou uma versão modificada da sequência de aminoácidos do tipo selvagem, que tem pelo menos uma das mutações do aminoácido discutido acima. 41 A sequência de aminoácidos da imunoglobulina humana também pode variar de tipo selvagem por ter uma ou mais mutações características determinante de um conhecido alotópico. A Tabela 2 mostra os determinantes alotópicos da região constante de IgGYl humana (Putman, The Plasma Proteins, vol. V, páginas 49 a 140 (Academic Press, Inc. 1957)). As posições do indice da UE 214, 356, 358 e 431 definem os alótipos IgGYl conhecidos. A posição 214 está no domínio CHi da região constante IgGYl, e, portanto, não reside na sequência Fc. A sequência Fc do tipo selvagem da SEQ ID NO: 6 inclui os alótipos Glm(l) e Glm (2) . No entanto, a fracção Fc da proteína TACI-Fc pode ser modificada para reflectir qualquer combinação destes alótipos.
Tabela 2
Alótipos Determinantes da Região Constante de Imunoglobulina γΐ Humana Alótipo Resíduo de Aminoácido Posição de Aminoácido índice EU SEQ ID NO: 6 Glm(1) Asp, Leu 356, 358 160, 162 Glm(l-) Glu, Met 356, 358 160, 162 Glm(2) Gly 431 235 Glm(2-) Ala 431 235 Glm(3) Arg 214 — Glm(3-) Lys 214 — 42
Os exemplos de proteínas TACI-Fc aqui divulgadas incluem regiões constantes de IgGl humana. No entanto, moléculas de imunoglobulina adequadas também incluem polipeptídeos compreendendo pelo menos uma região constante, como uma região constante da cadeia pesada de qualquer das imunoglobulinas seguintes: IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE e IgM. Vantajosamente, moléculas de imunoglobulina derivadas de IgG2 de tipo selvagem ou IgG4 de tipo selvagem oferecem reduzida função efectora, em comparação com a IgGl de tipo selvagem ou IgG3 de tipo selvagem. A especificação descreve proteínas de fusão que compreendem uma molécula do receptor TACI, como descrito acima, e tanto albumina ou β2-macroglobulina.
Outro tipo de proteína de fusão do receptor que se liga ao ZTNF2 ou ao ZTNF24 é uma proteína de fusão de imunoglobulina BCMA. Estudos têm sido realizados com um proteína de fusão BCMA-FC4 em que a fracção BCMA consiste em resíduos de aminoácidos 1 a 48 da SEQ ID NO: 27. Surpreendentemente, estudos de farmacocinética em ratos revelaram que a proteína de fusão BCMA-FC4 tinha uma meia-vida de cerca de 101 horas, enquanto que uma proteína TACI-Fc tinha uma meia-vida de 25 horas. Assim, a administração de uma proteína de fusão de imunoglobulina BCMA pode ser preferida em determinadas situações clínicas. Além disso, uma combinação de proteínas de fusão de imunoglobulina TACI e BCMA e pode ser vantajosa para o tratamento de determinadas condições. Esta terapia combinada pode ser obtida pela administração de proteínas de fusão de imunoglobulina TACI e BCMA, ou pela administração de heterodímeros de e proteínas de fusão de imunoglobulina TACI e BCMA. 43
Outro tipo de proteína de fusão do receptor que se liga ao ZTNF4 é uma proteína de fusão de imunoglobulina compreendendo um domínio extracelular do receptor designado "Ztnfrl2". 0 aminoácido Ztnfrl2 e sequências de nucleotídeos são fornecidos como SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente. Metades do receptor Ztnfrl2 incluem polipeptídeos compreendendo resíduos de aminoácidos 1 a 69 de SEQ ID NO: 60, ou resíduos de aminoácidos 19 a 35 de SEQ ID NO: 60.
As proteínas de fusão da presente invenção podem ter a forma de polipeptídeos de cadeia simples, dímeros, trímeros, ou múltiplos de dímeros ou trímeros. Os dímeros podem ser homodímeros ou heterodímeros e os trímeros podem ser homotrímeros ou heterotrímeros. Exemplos de heterodímeros incluem um polipeptídeo de imunoglobulina TACI com um polipeptídeo de imunoglobulina BCMA, um polipeptídeo de imunoglobulina TACI com um polipeptídeo de imunoglobulina Ztnfrl2, e um polipeptídeo de imunoglobulina BCMA com um polipeptídeo de imunoglobulina Ztnfrl2. Exemplos de heterotrímeros incluem um polipeptídeo de imunoglobulina TACI com dois polipeptídeos de imunoglobulina BCMA, um polipeptídeo de imunoglobulina TACI com dois polipeptídeos de imunoglobulina Ztnfrl2, um polipeptídeo de imunoglobulina BCMA com dois polipeptídeos de imunoglobulina Ztnfrl2, dois polipeptídeos de imunoglobulina TACI com um polipeptídeo de imunoglobulin BCMA, dois polipeptídeos de imunoglobulina TACI com um polipeptídeo de imunoglobulina Ztnfrl2, dois polipeptídeos de imunoglobulina BCMA com um polipeptídeo de imunoglobulina Ztnfrl2, e um trímero de um polipeptídeo de 44 imunoglobulina TACI, um polipeptídeo de imunoglobulina BCMA e um polipeptídeo de imunoglobulina Ztnfrl2.
Em tais proteínas de fusão, o agrupamento receptor TACI pode consistir na seguinte sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2: resíduos de aminoácidos 30 a 154. A fracção de receptor BCMA pode compreender pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 27: resíduos de aminoácidos 1 a 48, resíduos de aminoácidos 8 a 41, e os resíduos de aminoácidos 21 a 37. A fracção do receptor Ztnfrl2 pode compreender pelo menos uma das seguintes sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 60: resíduos de aminoácidos 1 a 69, e os resíduos de aminoácidos 19 a 35.
Proteínas de fusão podem ser produzidas utilizando os métodos de PCR utilizados para construir as moléculas TACI-Fc que são descritas nos exemplos. No entanto, os peritos na técnica podem usar outras abordagens padrão. Por exemplo, moléculas de ácido nucléico codificando TACI, BCMA, Ztnfrl2, ou polipeptídeos de imunoglobulina podem ser obtidos através do rastreio de bibliotecas de ADN genómico humano ou usando sondas de polinucleotídeo baseadas em sequências aqui divulgadas. Estas técnicas são padronizadas e bem estabelecidas (ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons, 1995) ("Ausubel (1995)"); Wu et al. Methods in Gene Biotecnologia, páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ("Wu (1997)"); Ausubel (1995) nas páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) nas páginas 307-327)) . 45
Como alternativa, a construção de moléculas de proteínas de fusão de imunoglobulina pode ser obtida pela síntese de moléculas de ácidos nucléicos utilizando mutuamente iniciadores de oligonucleotídeos longos e as sequências de nucleotídeos aqui descritas (ver, por exemplo, Ausubel (1995) nas páginas 8-8 para 8-9) . Técnicas estabelecidas usando a reacção em cadeia da polimerase fornecem a capacidade de sintetizar moléculas de ADN de, pelo menos, dois kilobases de comprimento (Adang et al. Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al. PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al. "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", in Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), e HOLOWACHUK et al. PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).
As moléculas de ácido nucléico da presente invenção também podem ser sintetizadas com "máquinas de genes" utilizando protocolos como o método de fosforamidite. Se quimicamente sintetizados o ADN de fita dupla é exigido para um aplicativo, como a síntese de um gene ou um fragmento do gene, depois cada cadeia complementar é feita separadamente. A produção de genes curtos (60 a 80 de pares de base) é tecnicamente simples e pode ser realizada pela sintetização das fitas complementares e, em seguida, pela recozimentação. Para a produção de genes mais longos (> 300 pares de base), no entanto, estratégias especiais podem ser necessárias, porque a eficiência de acoplamento de cada ciclo, durante a síntese de ADN químico raramente é de 100%. Para ultrapassar este problema, são montados genes sintéticos (dupla fita) de forma modular de 46 fragmentos de fita simples que têm de 20 a 100 nucleotideos de comprimento. Para comentários sobre a síntese de polinucleotídeos, ver, por exemplo, Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al. Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), e Climie et al., Proc.
National Acad. Sei. USA 87:633 (1990). 4. Produção de Polipeptídeos de Imunoglubutina taci
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos em células hospedeiras recombinantes seguindo técnicas convencionais. Para expressar uma sequência de codificação de imunoglobulina TACI, uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo deve ser operacionalmente ligada a sequências regulatórias que controlam a expressão transcricional num vector de expressão e, em seguida, introduzido numa célula hospedeira. Além das sequências regulatórias de transcrição, tais como promotores ou intensificadores, os vectores de expressão podem incluir sequências regulatórias de translação e um gene marcador, o que é adequado para a selecção de células que carregam o vector de expressão.
Vectores de expressão que são adequados para a produção de uma proteína estranha nas células eucarióticas contêm tipicamente (1) elementos procarióticos de ADN que codificam para uma origem de replicação bacteriana e um marcador de resistência a antibióticos para assegurar o 47 crescimento e selecção do vector de expressão numa bactéria hospedeira; (2) elementos eucarióticos de ADN que controlam a iniciação da transcrição, tais como um promotor, e (3) elementos de ADN que controlam o processamento de transcritos, como a terminação da transcrição/sequência de poliadenilação.
Vectores de expressão também podem incluir sequências de nucleotideos que codificam uma sequência secretora que direcciona o polipeptideo heterólogo para a via de excreção de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vector de expressão pode incluir uma sequência de nucleotideos que codifica imunoglobulina TACI e uma sequência secretora derivada de qualquer gene secretado. Como discutido acima, uma sequência de sinais adequada é uma sequência de sinal tPA. Um exemplo de sequência de sinal tPA é fornecido pela SEQ ID NO: 25. Outra sequência de sinal adequada é uma sequência sinal murina 26-10 Vh. O anticorpo murina 26-10 é descrito, por exemplo, por Near et al., Mol. Immunol. 27:901 (1990). Aminoácidos e sequências de nucleotideos ilustrativos de murino 26-10 VH são fornecidos pela SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, respectivamente. A SEQ ID NO: 62 revela a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão TACI-FC5 que compreende umA sequência sinal de murino 26-10 VH.
Proteínas de imunoglobulina TACI da presente invenção podem ser expressas em células de mamíferos. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem células do rim do macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), as células embrionárias do rim (293-HEK; ATCC CRL 1573), as células do 48 rim do hamster bébé (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544 , CRL ATCC 10314), células do rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células do ovário de hamster chinês (CHO-Kl; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células da pituitária de rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células do hepatoma de rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células SV40 transformadas do rim de macaco (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embrionárias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Para um mamífero hospedeiro, os sinais regulatórios de transcrição e translação podem ser provenientes de fontes virais, tais como o adenovírus, o vírus do papiloma bovino, o vírus do símio, ou algo semelhante, em que os sinais regulatórios estão associados a um determinado gene, que tem um elevado nível de expressão. Sequências regulatórias transcricionais e translacionais adequadas também podem ser obtidas a partir de genes de mamíferos, tais como a actina, o colágeno, a miosina, e os genes de metalotioneína.
Sequências regulatórias transcricionais incluem uma região promotora suficiente para direccionar o início da síntese de RNA. Promotores eucarióticos adequados incluem o promotor do rato metallothíonein I gene (Harner et al. J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), o promotor TK do vírus Herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), o promotor SV40 precoce (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), o promotor do vírus Rous sarcoma (Gorman et al., Proc. National Acad. Sei. USA 79:6777 (1982)), o promotor de citomegalovírus (Foecking et al. Gene 45:101 (1980)), e o promotor do vírus do tumor mamário do rato (ver, em geral, 49
Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", em Proteinn Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Uma combinação útil de um promotor e o intensificador é fornecida por um promotor de virus do sarcoma mieloproliferativo e um intensificador de citomegalovirus humano.
Alternativamente, um promotor procariótico, como o promotor da polimerase do bacteriófago T3 RNA, pode ser usado para controlar a produção de proteínas de imunoglobulina TACI em células de mamíferos, se o promotor procariótico for regulado por um promotor eucariótico (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), e Kaufman et al., Nucl. Ácidos. Res. 19:4485 (1991)).
Um vector de expressão pode ser introduzido nas células hospedeiras, usando uma variedade de técnicas usuais, incluindo a transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossomas, entrega microprojéctil mediada, electroporação, etc. As células transfectadas podem ser seleccionadas e propagadas para fornecer células hospedeiras recombinantes que compreendem o vector de expressão estável integrado no genoma da célula hospedeira. Técnicas para a introdução de vectores em células eucarióticas e técnicas para a selecção de transformantes estáveis através de um marcador dominante selecionável são descritas, por exemplo, em Ausubel (1995) e Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991). 50
Por exemplo, um marcador seleccionável adequado é um gene que oferece resistência ao antibiótico neomicina. Neste caso, a selecção é realizada na presença de um medicamento tipo neomicina, tais como G-418 ou similar. Sistemas de selecção também podem ser usados para aumentar o nivel de expressão do gene de interesse, num processo conhecido como "amplificação". A amplificação é realizada através do cultuvo de transfectantes na presença de um baixo nivel do agente selectivo e, em seguida, aumentando a quantidade de agente selectivo para seleccionar as células que produzem altos níveis dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador amplificável seleccionável adequado é o diidrofolato redutase, que confere resistência ao metotrexato. Genes de resistência a outros medicamentos (p. ex., resistência à higromicina, multi-resistência aos medicamentos, acetiltransferase puromicina) também podem ser usados. Alternativamente, os marcadores que apresentam um fenótipo alterado, tais como a proteína verde fluorescente, ou proteínas da superfície celular, tais como CD4, CD8, MHC Classe I, e fosfatase alcalina placentária podem ser usados para classificar as células transfectadas de células não transfectadas por meios como a triagem FACS ou a tecnologia de separação de contas magnéticas.
Os polipeptídeos de imunoglobulina TACI também podem ser produzidos por culturas de células de mamíferos utilizando um sistema de entrega virai. Exemplos de vírus para esse fim incluem adenovírus, herpesvírus, o vírus vaccinia e vírus adeno-associado (AAV). 0 adenovírus, um vírus de ADN de dupla fita, é actualmente o melhor estudado vector de transferência de gene para a entrega de ácido nucléico heterólogo (para uma revisão, veja Becker et al., Meth. 51
Biol Cell. 43:161 (1994), e Douglas e Curiel, Science &
Medicine 4:44 (1997)). Vantagens do sistema de adenovirus incluem o alojamento de inserções de ADN relativamente grandes, a capacidade de crescer com alta titulação, a capacidade de infectar uma grande variedade de tipos de células de mamíferos, e a flexibilidade que permite o uso com um grande número de vectores disponíveis contendo diferentes promotores.
Por exclusão de partes do genoma do adenovirus, maiores inserções (até 7 kb) do ADN heterólogo podem ser acomodadas. Essas inserções podem ser incorporadas ao ADN virai pela ligadura directa ou por recombinação homóloga com um plasmídeo co-trnsfectado. Uma opção é excluir o gene essencial El do vector virai, o que resulta na incapacidade de reproduzir a menos que o gene El seja fornecido pela célula hospedeira. Células humanas infectadas pelo vector de adenovirus 293 (n°s ATCC CRL-1573, 45504, 45505), por exemplo, podem ser cultivadas como células aderentes ou na cultura da suspensão com uma densidade de células relativamente elevada para produzir quantidades significativas de proteínas (ver, Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)).
Os peritos na técnica podem conceber vectores de expressão adequados para produzir as proteínas de fusão acima descritas, com células de mamíferos. O Exemplo 4 descreve as características de um vector de expressão. Como outro exemplo, um vector de expressão pode incluir um cassete de expressão bicistrónica que inclui uma porção do intensificador do citomegalovírus humano, o promotor do 52 vírus do sarcoma mieloproliferativo, uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão, o sítio de entrada ribossomal do poliovírus interno, uma sequência de nucleotídeos codificando redutase murino diidrofolato, seguido pela sequência de adição SV40 poli A. A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 69 mostra uma construção de vírus Ltr intensificador de citomegalovírus/promotor de sarcoma mieloproliferativo, em que o intensificador de citomegalovírus se extende dos nucleotídeos 1 a 407. O promotor de vírus LTR do sarcoma mieloproliferativo, ausente da região de controlo negativo, extende-se dos nucleotídeos 408 aos nucleotídeos 884 de SEQ ID NO: 69. A sequência de nucleotídeos para o promotor LTR vírus do sarcoma mieloproliferativo sem a região de controlo negativo é fornecida em SEQ ID NO: 70. O Exemplo 1 descreve um vector de expressão que compreende um promotor citomegalovírus para direccionar a expressão da proteína transgene recombinante, um intron de imunoglobulina, e uma sequência de sinal activadora de tecido plasminogénio. Um intron de imunoglobulina adequado é um intron de murina 26-10 VH. A SEQ ID NO: 66 fornece uma sequência de nucleotídeos ilustrativa de um intron de murina 26-10 VH. Um vector de expressão também pode incluir uma região não traduzida 5' (UTR), localizada a montante da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de imunoglobulina TACI. Uma 5'-UTR adequada pode ser obtida a partir do gene de murina 26-10 VH. A SEQ ID NO: 63 revela a sequência de nucleotídeos de uma murina nativa útil 26-10 VH 5' -UTR, enquanto que a SEQ ID NO: 64 mostra a sequência de nucleotídeos de uma murina 26-10 VH 5'-UTR, que foi optimizada na extremidade 3'. 53
Como ilustração, a SEQ ID NO: 67 fornece uma sequência de nucleotideos, que inclui os seguintes elementos: uma murina nativa 26-10 VH 5'-UTR (nucleotideos 1 a 51), uma sequência de sinal de murina 26-10 VH (nucleotideos 52 a 97, e 182 a 192), um intron de murina 26-10 VH (nucleotideos 98 a 181), uma sequência de nucleotideos que codifica uma molécula TACI (nucleotideos 193 a 435), e uma sequência de nucleotideos que codifica uma molécula Fc5 (nucleotideos 436 a 1131) . A sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 68 difere da SEQ ID NO: 67, devido à substituição de uma murinoa optimizada 26-10 VH 5'-UTR (nucleotideos 1 a 51) da sequência nativa.
As proteínas de imunoglobulina TACI também podem ser expressas em outras células eucarióticas superiores, como a gripe aviária, fungos, insectos, leveduras, ou células vegetais. O sistema de baculovírus fornece um meio eficiente para introduzir genes clonados em células de insecto. Vectores de expressão adequados são baseados no virus de políhedrosis nuclear múltipla Autographa californica (AcMNPV), e contém promotores bem conhecidos tais como o promotor Drosophíla heat shock protein (HSP) 70, o promotor do gene precoce Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (ie-1), o promotor do atraso inicial 39K, o promotor baculovírus plO, e o promotor de Drosophíla metallothioneín. Um segundo método de fazer o baculovírus recombinante utiliza um sistema de transposon baseado no descrito por Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferência, é vendido em kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza um vector de transferência, PFASTBAC (Life Technologies), 54 contendo um transposon Tn7 para mover o ADN codificando o polipeptideo de imunoglobulina TACI num genoma de baculovirus mantido em E. coli como um grande plasmideo chamado de "bacmid Ver, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma moldura de fusão com o ADN que codifica para uma marca de epitopo no terminal C ou N do polipeptideo de imunoglobulina TACI expresso, por exemplo, uma marca de epitopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. National Acad. Sei. 82:7952 (1985)). Usando uma técnica conhecida na técnica, um vector de transferência contendo uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína de imunoglobulina TACI é transformado em E. Coli, e seleccionado para baemids, que contêm um gene interrompido lacZ indicativo de baculovirus recombinante. O bacmid ADN contendo o genoma do baculovirus recombinante é então isolado utilizando técnicas comuns. O vector PFASTBAC ilustrativo pode ser modificado num grau considerável. Por exemplo, o promotor poliedrina pode ser removido e substituído com o promotor da proteína base de baculovirus (também conhecida como Pcor, ρβ.9 ou promotor MP) que se expressa no início da infecção do baculovirus, e tem se mostrado vantajosa para expressar proteínas secretadas (ver, por exemplo, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). No vector de transferência de tais construções, uma versão curta ou longa do promotor da proteína básica pode ser usada. Além disso, os vectores de 55 transferência podem ser construídos, com sequências de sinal de secreção derivadas de proteínas do insecto. Por exemplo, uma sequência de sinais de secreção de ecdiesteróide glicosiltransferase (EGT), mel de abelha Melittin (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), ou baculovírus GP67 (PharMingen: San Diego, CA) pode ser usada em tais construções. 0 vírus recombinante ou bacmid é usado para a transfecção de células hospedeiras. Células hospedeiras do insecto adequadas incluem linhas de células derivadas de IPLB-Sf-21, uma linha de células de ovário de pupa Spodoptera frugiperda, tais como o Sf9 (ATCC CRL 1711), SÍ21AE, e Sf 21 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), bem como células de Drosophila Schneider-2, e a linhagem de células HIGH FIVEO (Invitrogen) provenientes de Trichoplusia ni (Patente US 5,300,435). O meio de soro livre omercialmente disponível pode ser usado para fazer crescer e manter as células. Meios adequados são Sf900 II™ (Life Technologies) ou ESF 921™ (Expression Systems) para as células Sf9 e Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lawrence, KS) ou Express FiveO™ (Life Technologies) para as células T. ni. Quando o vírus recombinante é utilizado, as células são normalmente cultivadas acima de uma densidade de inoculação de cerca de 2-5 x 105 células para uma densidade de 1-2 x 106 células no momento em que uma quantidade de recombinação virai é acrescentada a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 a 10, mais geralmente perto de 3.
As técnicas já estabelecidas para a produção de proteínas recombinantes em sistemas de baculovírus são fornecidos por 56
Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectores", em Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and
Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel et al., "The baculovirus expression system", em ADN Cloning 2:
Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por
Ausubel (1995) nas páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocolos (The Humana Press, Inc. 1995), e por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", em Protein Engineering: Principies and
Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) . Células fúngicas, incluindo as células de levedura, também podem ser usadas para expressar os genes descritos neste documento. Espécies de leveduras de interesse particular, neste domínio, incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Promotores adequados para a expressão em levedura incluem promotores de GALl (galactose), PGK (fosfoglicerato quinase), ADH (álcool desidrogenase), AOXl (álcool oxidase), HIS4 (histidinol desidrogenase), e assim por diante. Muitos vectores de clonagem de levedura foram projectados e estão prontamente disponíveis. Um vector pode ser projectado para gerar construções utilizando os elementos necessários para realizar a recombinação homóloga em levedura (ver, por exemplo, Raymond et al., BioTechniques 26:134 (1999)). Por exemplo, tal vector de expressão pode incluir sequências URA3 e CEN-ARS (sequência replicante autónoma) necessárias para a selecção e replicação em S. Cerevisiae. Outros vectores adequados incluem vectores baseados em Ylp, 57 tais como YIp5, vectores YRp, YRpl7, vectores YEp, tais como YEpl3 e vectores YCp, tais como YCpl9. Métodos para transformar células de S. cerevisiae com o ADN exógeno e produzir polipeptideos recombinantes destas células são divulgados, por exemplo, em Kawasaki, Patente US 4,599,311, Kawasaki et al., Patente US 4,931,373, Brake, Patente US 4,870,008, Welch et al., Patente US 5,037,743, e Murray et al., Patente US 4,845,075. As células transformadas são seleccionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador de selecção, comummente a resistência a medicamentos ou a capacidade de crescer na ausência de um determinado nutriente (por ex., leucina). Um sistema de vector adequado para uso em Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vector POTl divulgado por Kawasaki et al., (Patente US 4,931,373), que permite as células transformadas ser seleccionadas pelo crescimento num meio contendo glucose. Promotores adequados e terminadores adicionais para uso em leveduras incluem os genes da enzima glicolitica (ver, por exemplo, Kawasaki, Patente US 4,599,311, Kingsman et al., Patente US 4,615,974 e Bitter, Patente US 4,977,092) e os genes de álcool desidrogenase. Veja também as Patentes US 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936 e 4,661,454.
Sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragílís, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Maltosa Candida, são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986), e Cregg, Patente US 4,882,279. As células de Aspergillus podem ser utilizadas de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente US 4,935,349. Métodos 58 para transformar Acremonium chrysogenum são divulgados por Sumino et al., Patente US 5,162,228. Métodos para transformar Neurospora são divulgados por Lambowitz, Patente US 4,486,533.
Por exemplo, o uso de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é divulgado por Raymond, Patente US 5,716,808, Raymond, Patente US 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998), e nas publicações internacionais WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. Moléculas de ADN para uso na transformação de P. methanolica serão geralmente preparadas como plasmídeos circulares de dupla fita, que são de preferência linearizadops antes da transformação. Para a produção de polipeptídeo em P. methanolica, o promotor e o terminador no plasmídeo podem ser o de um gene p. methanolica, tal como um gene de utilização de álcool p. methanolica (AUG1 ou AUG2) . Outros promotores úteis incluem os genes da sintase dihidroxiacetona (DHAs), formate-desidrogenase (FA) e catalase (CAT). Para facilitar a integração do ADN no cromossoma hospedeiro, é preferível ter o segmento de expressão inteiro do plasmídeo flanqueado em ambos os lados por sequências de ADN de acolhimento. Um marcador seleccionável adequado para uso em Pichia methanolica é um gene ADE2 de p. methanolica, que codifica fosforribosil-5-aminoimidazole carboxilase (AIRC; EC 4.1.1.21), e que permite às células do hospedeiro ADE2 crescer na ausência de adenina. Para grande escala, os processos industriais onde é desejável minimizar o uso de metanol, as células do hospedeiro podem ser usadas nas quais ambos os genes de utilização do metanol (AUG1 e AUG2) são excluídos. Para a produção de proteínas secretadas, as 59 células do hospedeiro podem ser deficientes em genes da protease vacuolar (PEP4 e PRBl). A electroporação é usada para facilitar a introdução de um plasmideo contendo ADN que codifica um polipeptideo de interesse em células P. methanolica. As células P. methanolica podem ser transformadas por electroporação utilizando um decaimento exponencial de um campo elétrico pulsante com uma intensidade de campo de 2,5-4,5 kV/cm, de preferência cerca de 3,75 kV/cm, e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milissegundos, de preferência de cerca de 20 milissegundos.
Os vectores de expressão também podem ser introduzidos em protoplastos de plantas, tecidos vegetais inteiros, ou células de plantas isoladas. Métodos de introdução de vectores de expressão em tecidos vegetais incluem a infecção directa ou co-cultivo de tecidos vegetais com Agrobacterium tumefadens, entrega microprojéctil mediada, injecção de ADN, electroporação, etc. Veja, por exemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992), e Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al., (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).
Alternativamente, proteínas de imunoglobulina TACI podem ser produzidas em células hospedeiras procarióticas. Promotores adequados que podem ser usados para produzir polipeptideos de imunoglobulina TACI num hospedeiro procariótico são bem conhecidos pelos peritos na técnica e incluem promotores capazes de reconhecer as polimerases T4, T3, Sp6 e T7, os promotores PR e PL do bacteriófago lambda, 60 o trp, recA, choque térmico, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA e promotores lacZ de E. coli, promotores de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promotores Streptomyces, o promotor int do bacteriófago lambda, o promotor bla de pBR322, e o promotor do gene CAT do cloranfenicol acetil transferase. Promotores procarióticos foram revistos por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (Benjamin Cummins 1987), e por Ausubel et al., (1995) .
Hospedeiros procarióticos adequados incluem E. Coli e Bacillus Subtilus. Cepas adequadas de E. coli incluem BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, DHl, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 e ER1647 (ver, por exemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Cepas dequadas de Bacillus Subtilus incluem BR151, YB886, MI119, MI120 e B170 (ver, por exemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", em DNA Cloning: A Praticai Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).
Ao expressar uma proteína de imunoglobulina TACI em bactérias como E. Coli, o polipeptídeo pode ser mantido no citoplasma, geralmente na forma de grânulos insolúveis, ou pode ser direccionado para o espaço periplásmico por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas e os grânulos são recuperados e desnaturados, utilizando, por exemplo, o isotiocianato de guanidina ou uréia. O polipeptídeo desnaturado pode ser reaberto e dimerizado diluindo o desnaturante,como por 61 diálise contra uma solução de ureia e umacombinação de glutationa reduzida e oxidada, seguida por diálise contra uma solução salina. No último caso, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do espaço periplásmico numa forma solúvel e funcional pelo rompimento das células (como, por exemplo, sonicação ou choque osmótico) para libertar o conteúdo do espaço periplásmico e recuperar a proteína, suprimindo assim a necessidade de desnaturação e reabertura. Métodos para a expressão de proteínas em hospedeiros procarióticos são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", em ADN Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al. "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), e Georgiou, "Expression of Proteins in Bactéria," em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al., (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Métodos padrão para a introdução de vectores de expressão em levedura de bactérias, insectos, e células vegetais são fornecidos, por exemplo, Ausubel (1995). 62 Métodos gerais para expressar e recuperar proteínas estranhas produzidas por um sistema de células de mamíferos são fornecidos, por exemplo, em Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", em Protein Engineering: Principies and Prqactice, Cleland et al., (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Técnicas padrão de recuperação da proteína produzida por um sistema de bactérias são fornecidas, por exemplo, em Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Métodos estabelecidos para isolamento de proteínas recombinantes de um sistema baculovírus são descritos por Richardson (ed.), Baculovírus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).
Como alternativa, polipeptídeos da presente invenção podem ser sintetizados pela síntese de fase sólida exclusiva, métodos em fase sólida parciais, condensação do fragmento ou síntese de solução clássica. Estes métodos de síntese são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer e Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase
Peptide Synthesis: A Praticai Approach (IRL Press 1989), Fields e Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), e Lloyd-Williams et al., Chemical Approachs to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Variações nas estratégias de síntese química total, como "ligação química nativa" e "ligadura de proteína expressa" também 63 são padrão (ver, por exemplo, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997) , Muir et al, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 95:6705 (1998) , e Severinov e Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)) .
5. Ensaios para Proteínas de Fusão de Imunoglobulinas TACI A função das proteínas de fusão de imunoglobulina TACI podem ser examinadas usando uma variedade de abordagens para avaliar a capacidade das proteínas de fusão para vincular o ZTNF4 ou o ZTNF2. Como ilustração, o Exemplo 4 fornece métodos para medir a afinidade de ligação do ZTNF4 e a capacidade de ligação.
Alternativamente, as proteínas de fusão de imunoglobulina TACI podem ser caracterizadas pela capacidade de inibir a estimulação de células B por ZTNF4 solúvel, tal como descrita por Gross et al., publicação internacional WO00/40716. Resumidamente, as células humanas B são isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico utilizando grânulos magnéticos CD19 e o sistema de separação magnética VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA), de acordo com as instruções do fabricante. As células B purificadas são misturadas com ZTNF4 solúvel (25 ng/ml) e IL-4 recombinante humana (10 ng/ml Pharmingen), e as células são plaqueadas no fundo redondo de 96 placasa 1 x 105 células por poço. 64
Proteínas de imunoglobulina TACI solúvel podem ser diluídas de cerca de 5 yg/ml para cerca de 6 ng/ml, e incubadas com as células B por cinco dias, pulsando durante a noite no quarto dia com 1 pCi3 H-timidina por poço. Como controlo, a proteína de imunoglobulina TACI também pode ser incubada com as células B e IL-4 sem ZTNF4. As placas são colhidas com a placa Packard, e contadas usando o leitor Packard.
Esta abordagem geral foi usada para examinar três proteínas de fusão TACI-Fc. Embora todas as proteínas de fusão inibam a proliferação das células B, as construções TACI (dl—29, dlll-154)-FC5 e TACI (dl-29, dl20-154)-FC5 são mais potentes do que a TACI (dl-29, d!07-154)-FC5.
Modelos animais bem estabelecidos estão disponíveis para testar a eficácia in vivo das proteínas de imunoglobulina TACI em determinados estados da doença. Por exemplo, as proteínas de imunoglobulina TACI podem ser testadas num número de modelos animais de doenças auto-imunes, como as linhagens de ratos congénicos MRL-lpr/lpr ou NZBxNZWFl, que servem como um modelo de LES (lúpus eritematoso sistémico). Modelos animais são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Cohen e Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc. 1994).
Descendentes de um cruzamento entre os ratos New Zealand Black (NZB) e New Zealand White (NZW) desenvolvem uma forma espontânea do LES que se assemelha ao LES em seres humanos. Os ratos descendentes, conhecidos como NZBW começam a 65 desenvolver auto-anticorpos IgM contra as células T com um mês de idade, e aos cinco a sete meses de idade, os auto-anticorpos anti-ADN são a imunoglobulina dominante. A hiperactividade da célula B policlonal leva à superprodução de auto-anticorpos. A deposição desses auto-anticorpos, particularmente aqueles dirigidos contra o ADN de fita simples, está associada com o desenvolvimento de glomerulonefrite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azotemia, e morte por insuficiência renal. A insuficiência renal é a principal causa de morte em ratinhos afectados com LES espontâneo, e na tensão NZBW, este processo é crónico e obliterante. A doença é mais rápida e grave nas fêmeas do que machos, com sobrevivência média de apenas 245 dias, em comparação com 406 dias para os machos. Embora muitos dos ratos fêmeas irão ser sintomáticos (proteinúria) aos sete a nove meses de idade, algumas podem ser muito mais jovens ou mais velhas quando desenvolvem sintomas. A nefrite imune fatal vista nos ratos NZBW é muito semelhante à glomerulonefrite vista no LES humano, tornando este modelo murino espontânea muito atraente para os testes de terapêutica SLE potencial (Putterman e Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus", em Autoimmune Disease Model: A Guidebook, páginas 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan et al. J. Immunol. 154:1470 (1995); e Daikh et al. J. Immunol. 159:3104 (1997)).
Conforme descrito por Gross et al., publicação internacional WO00/40716, as proteínas de imunoglobulina TACI podem ser administradas a ratos NZBW para monitorizar 66 o seu efeito supressor sobre as células B durante o período de cinco semanas, quando, em média, a produção de auto-anticorpos de células B se acredita ser em níveis elevados nos ratos NZBW. Resumidamente, 100 ratos do sexo feminino com 8 semanas, (NZB x NZW) Fi podem ser divididos em seis grupos de 15 ratos. Antes do tratamento, os ratos são monitorizados uma vez por mês para a proteína na urina, e o sangue é destinada a um banco de soro e CBC. O soro pode ser analisado para a presença de auto-anticorpos. Porque a proteinúria é o sinal típico da glomerulonefrite, os níveis de proteína na urina são monitorizados por vareta a intervalos regulares ao longo do estudo. O tratamento pode começar quando os ratos têm cerca de cinco meses de idade. Os ratos recebem injecções intraperitoneais de veículo único (tampão de fosfato salino) ou imunoglobulina TACI humana (proteína de controlo) ou proteína de imunoglobulina TACI (por ex., de 20 a 100 pg de proteína de teste por dose) três vezes por semana durante cinco semanas. O sangue é recolhido duas vezes durante o tratamento, e será recolhido pelo menos duas vezes após o tratamento. Os valores da urina por vareta para proteinúria e os pesos corporais são determinados a cada duas semanas depois do início do tratamento. Sangue, valor da urina por vareta e peso são recolhidos no momento da eutanásia. O baço e timo são divididos para análise de triagem de células fluorescentes activadas e análise histológica. As glândulas salivares submandibulares, o nó da cadeia de linfonodos mesentéricos, o lobo do fígado com a vesícula biliar, o ceco e o intestino grosso, o estômago, o intestino delgado, o pâncreas, o rim direito, a glândula 67 adrenal, a língua com a traquéia e o esófago, o coração e os pulmões também são recolhidos para exame histológico.
Modelos murinos experimentais de encefalomielite alérgica têm sido usados como uma ferramenta para investigar os mecanismos da doença imune-mediada, e métodos de intervenção terapêutica potencial. 0 modelo assemelha-se à esclerose múltipla humana, e produz desmielinização como resultado da activação de células T para neuroproteínas como a proteína básica de mielina, ou proteína proteolípida. A inoculação de antígeno leva à indução de células CD4 + , células T restritas classe II MHC (Thl). As mudanças no protocolo para a encefalomielite alérgica experimental podem produzir variantes do modelo agudo, crónico recidivante, ou passivo de transferência (Weinberg et al. J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba et al. Cell. Immunol. 186:94 (1999), e Glabinski, Meth. Enzym. 288:182 (1997) ) .
Gross et al., publicação internacional WO00/40716, descreve uma abordagem para avaliar a eficácia das proteínas de imunoglobulina TACI na melhoria dos sintomas associados à encefalomielite alérgica experimental. Resumidamente, a 25 ratos fêmeas PLxSJL F1 (12 semanas de idade) é dada uma injecção subcutânea de 125 yg/rato do antígeno (proteína de mielina proteolipídica, PLP, resíduos 139-151), formulada em adjuvante completo de Freund. Os ratos são divididos em cinco grupos de cinco ratos. Injecções intraperitoneais de toxina pertussis (400 ng) são dadas no Dia 0 e 2. São dados aos grupos lx, lOx ou lOOx doses de proteína de imunoglobulina TACI, um grupo receberá apenas o veículo, e 68 um grupo não irá receber tratamento. A terapia de prevenção começa no dia 0, a terapia de intervenção começa no dia 7, ou no aparecimento dos sinais clínicos. Os sinais da doença, perda de peso e paralisia manifestam-se em cerca de 10 a 14 dias, e duram cerca de uma semana. Os animais são avaliados diariamente através da recolha de pesos corporais e atribuição de um nível clínico para corresponder ao grau dos seus sintomas. Os sinais clínicos da encefalomielite alérgica experimental aparecem dentro de 10 a 14 dias após a inoculação e persistem por aproximadamente uma semana. No final do estudo, todos os animais são sacrificados por "overdose" de gás, e autopsiados. O cérebro e a coluna vertebral são recolhidos para exame histológico ou congelada para a análise do mRNA. O peso corporal e os dados do nível clínico são representados por indivíduo e por grupo.
No modelo de artrite por colágeno induzido, os ratos desenvolvem artrite inflamatória crónica, que se assemelha à artrite reumatóide humana. Uma vez que a artrite induzida pelo colagénio partilha características semelhantes imunológicas e patológicas com a artrite reumatóide, isso faz com que seja um modelo ideal para a selecção de potenciais compostos anti-inflamatórios humanos. Outra vantagem em utilizar o modelo de artrite induzida pelo colágeno é que os mecanismos de patogénese são conhecidos. Os epítopos das células T e B no colágeno tipo II, foram identificados, e vários parâmetros imunológicos (hipersensibilidade retardada e anticorpo anti-colágeno) e inflamatórios (citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz) relativos à artrite imuno-mediada foram determinados, e podem ser usados para testar 69 a eficácia dos compostos nos modelos (Wooley, Curr. Open. Rheum. 3:407 (1999); Williams et al., Immunol. 89:9784 (1992); Myers et al., Life Sei. 61:1861 (1997), e Wang et al. Immunol. 92:8955 (1995)).
Gross et al., publicação internacional WO00/40716, descreve um método para avaliar a eficácia das proteínas da imunoglobulina TACI na melhoria dos sintomas associados a artrite induzida por colágeno. Em resumo, ratos do sexo masculino, com oito semanas de idade, DBA/1J (Jackson Labs) são divididos em grupos de cinco ratos/grupo e são dadas duas injecções subcutâneas de 50 a 100 μΐ de 1 mg/ml de colágeno (de pintainho ou de origem bovina), com intervalos de três semanas. Um grupo de controlo não recebe injeções de colágeno. A primeira injecção é formulada com adjuvante completo de Freund, e a segunda injeção é formulado com adjuvante incompleto de Freund. A proteína de imunoglobulina TACI é administrada profilaticamente durante ou antes da segunda injeção, ou depois que o animal desenvolva um nível clínico de dois ou mais que persiste pelo menos 24 horas. Os animais começam a mostrar sintomas de artrite após a segunda injecção de colágeno, geralmente dentro de duas a três semanas. Por exemplo, TACI-Fc, uma proteína de controlo, IgFc humano, ou tampão de fosfato salino (veículo) pode ser administrado profilaticamente começando sete dias antes da segunda injecção (dia-7) . As proteínas podem ser administradas em 100 yg, administradas três vezes por semana, como uma injecção intraperitoneal de 200μ1, e continuado por quatro semanas. 70
No modelo de artrite induzida pelo colágeno, a extensão da doença é avaliado em cada pata usando um paquímetro para medir a espessura da pata e atribuindo um nível clínico a cada pata. Por exemplo, um nível clínico de "0" indica um rato normal, um valor "1" indica que um ou mais dedos estão inflamados, uma pontuação de "2" indica uma inflamação leve da pata, uma pontuação de "3" indica uma inflamação moderada da pata, e uma pontuação de "4" indica uma inflamação da pata grave. Os animais são sacrificados após a doença estar estabelecida por um determinado período de tempo, geralmente de sete dias. As patas são recolhidas para análise histológica ou mRNA, e o soro é recolhido para ensaios de imunoglobulina e citocina. A miastenia gravis é uma doença auto-imune em que os modelos murinos estão disponíveis. A miastenia gravis é uma doença de transmissão neuromuscular que envolve a produção de anticorpos dirigidos contra o receptor de acetilcolina. Esta doença é adquirida ou herdada com características clínicas, incluindo anormal fraqueza e fadiga no esforço.
Um modelo murino de miastenia gravis foi estabelecido. (Christadoss et al., "Establishment of a Mouse Modelo f Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravis Pathogenesis for Immune Intervention", em Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi e Bixler (Eds.), páginas 195-199 (1995)). A miastenia gravis experimental é uma doença auto-imune mediada por anticorpos, caracterizada pela presença de anticorpos contra o receptor de acetilcolina. Esses anticorpos destroem o receptor levando 71 a impulsos elétricos neuromusculares defeituosos, resultando em fraqueza muscular. No modelo experimental da miastenia gravis auto-imune, os ratos são imunizados com o receptor de acetilcolina. Os sinais clínicos da miastenia grave tornam-se evidentes semanas após a segunda imunização. A miastenia gravis auto-imune experimental é avaliada por vários métodos, incluindo a medição dos níveis de anticorpos séricos de receptor de acetilcolina por radioimunoensaio (Christadoss e Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom et al., Methods Enzymol. 74:432 (1981)), medição do músculo receptor de acetilcolina, ou eletromiografia (Coligan et al., (Eds.), Vol.3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)). 0 efeito da imunoglobulina TACI em miastenia gravis auto-imune experimental pode ser determinado pela administração de proteínas de fusão durante a miastenia gravis em ratos B6. Por exemplo, 100 ratos B6 são imunizados com 20 yg de receptor de acetilcolina em adjuvante completo de Freund nos dias 0 e 30. Cerca de 40% a 60% dos ratos irá desenvolver de moderada (grau 2) a grave (grau 3) miastenia grave, após o impulso com o receptor de acetilcolina. Os ratos com grau 2 e 3 da doença são divididos em três grupos (com graus iguais de fraqueza) e pesados (ratos com deficiência também perdem peso, já que eles têm dificuldade em consumir alimentos e água) e sangrados para soro (para pré-tratamento de anticorpo de receptor de anti-acetilcolina e nível de isótipo). O grupo A é injectado IP com tampão de fosfato salino, o grupo B é injectado intraperitonealmente com IgG-FC humano como uma proteína de controlo (100 yg) e o grupo C é injectado com 100 yg de TACI-Fc três vezes por semana durante quatro semanas. Os 72 ratos são seleccionados para a fraqueza muscular clínica duas vezes por semana, e pesados e sangrados para soro, 15 e 30 dias após o início do tratamento. O sangue é recolhido no dia 15 para determinar a ratio celular T/B análise de células activadas por fluorescência utilizando marcadores B220 e CD5. Os animais sobreviventes foram mortos 30 a 45 dias após o início do tratamento, e as respectivas carcaças congeladas para posterior extracção do receptor de acetilcolina muscular para determinar a perda de músculo receptor de acetilcolina, a patologia primária na miastenia grave (ver, por exemplo, Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).
Anticorpos séricos no para receptor de acetilcolina muscular do rato podem ser determinados por um radioimunoensaio estabelecido, e isotipos de anticorpos do receptor de anti-acetilcolina (IgM, IgGl, IgG2b e IgG2c) é medido por ELISA. Tais métodos são conhecidos. Os efeitos da imunoglobulina TACI na miastenia gravis, os anticorpos do receptor de anti-acetilcolina e nível de isótipo, e perda de receptores de acetilcolina muscular são determinados.
Cerca de 100 ratos podem ser imunizados com 20 yg receptor de acetilcolina em adjuvante completo de Freund no dia 0 e 30. Ratos com miastenia gravis são divididos em quatro grupos. O grupo A é injectado intraperitonealmente com 100 yg de Fc de controlo, o grupo B é injectado com 20 yg de Fc de controlo, o grupo C é injectado com 100 yg de TACI-Fc, e o grupo D é injectado com 20 yg de TACI-Fc três vezes por 73 semana durante quatro semanas. Os ratos são pesados e sangrados para soro antes, e 15 e 30 dias após o início do tratamento. O soro é testado para o anticorpo do receptor de anti-acetilcolina e isótipos como descrito acima. A perda de receptor de acetilcolina muscular, também pode ser medido.
Outros ensaios adequados de proteínas de fusão de imunoglobulina TACI podem ser determinados pelos peritos na técnica.
6. Produção de Conjugados de Imunoglobulina TACI A especificação descreve composições de imunoglobulinas TACI quimicamente modificadas, em que um polipeptídeo de imunoglobulina TACI está relacionado com um polímero. Tipicamente, o polímero é solúvel em água de modo a que o conjugado de imunoglobulina TACI não se precipite num meio aquoso, como um meio fisiológico. Um exemplo de um polímero adequado é aquele que foi modificado para ter um único grupo reactivo, tal como um éster activo para acilação, ou um aldeído de alquilação, desta forma, o grau de polimerização pode ser controlado. Um exemplo de um aldeído reactivo é o propionaldeído polietileno glicol, ou mono-(Ci-Cio) alcóxi, ou derivados arilóxi (ver, por exemplo, Harries, et al., Patente US 5,252,714). O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Além disso, uma mistura de polímeros pode ser usada para produzir conjugados de imunoglobulina TACI. 74
Os conjugados de imunoglobulina TACI utilizados para a terapia podem incluir moléculas de polímero solúvel em água farmaceuticamente aceitáveis. Polímeros solúveis em água adequados incluem polietileno glicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-(C1-C10) alcóxi-PEG, arilóxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona) PEG, tresil monometoxi PEG, propionaldeído PEG, Bis-succinimidil carbonato PEG, homopolímeros de propileno glicol, um óxido de polipropileno/co-polímero de óxido de etileno, polióis polioxitilados (por exemplo., glicerol), álcool polivinílico, dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em hidratos de carbono. PEG adequados podem ter um peso molecular de aproximadamente 600 para cerca de 60.000, incluindo, por exemplo, 5.000, 12.000, 20.000 e 25.000. O conjugado de imunoglobulina TACI também pode incluir uma mistura de tais polímeros solúveis em água.
Um exemplo de um conjugado de imunoglobulina TACI compreende uma fracção de imunoglobulina TACI e uma molécula de óxido polialquilo ligado ao N-terminal da imunoglobulina TACI. PEG é um óxido polialquilo adequado. Como ilustração, a imunoglobulina TACI pode ser modificada com PEG, um processo conhecido como "PEGuilação". A PEGuilação da imunoglobulina TACI pode ser efectuada por qualquer das recações de PEGuilação conhecidas na técnica (ver, por exemplo, EP 0 154 316 , Delgado et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), e Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)). Por exemplo, a PEGuilação pode ser realizada por uma reacção de acilação ou por uma reacção de alquilação com uma molécula reactiva de polietileno glicol. Numa abordagem alternativa, 75 os conjugados de imunoglobulina TACI são formados pela condensação de PEG activado, em que um grupo hidroxi terminal ou aminoácidos de PEG foram substituídos por um ligante activado (ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente US 5,382,657). A PEGuilação por acilação normalmente exige reagir um éster activo derivado do PEG com um polipeptídeo de imunoglobulina TACI. Um exemplo de um éster PEG activado é um PEG esterificado para N-hidroxisuccinimida. Conforme utilizado aqui, o termo "acilação" inclui os seguintes tipos de ligações entre imunoglobulina TACI e um polímero solúvel em água: amida, carbamato, uretano, e assim por diante. Métodos para preparar imunoglobulina TACI peguilada por acilação normalmente compreendem as etapas de (a) reagir um polipeptídeo de imunoglobulina TACI com PEG (como um éster reactivo de um aldeído derivado do PEG), em condições que permitam a um ou mais grupos PEG anexar imunoglobulina TACI, e (b) a obtenção do produto de reacção. Geralmente, as condições óptimas da reacção para as reacções acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e os resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a proporção de PEG:imunoglobulina TACI, maior o percentual de produto de imunoglobulina TACI peguilada. 0 produto da PEGuilação por acilação é tipicamente um produto de imunoglobulina TACI polipeguilada, onde os grupos ε-amino da lisina são peguilados através de um grupo de ligação acilo. Um exemplo de uma ligação de conexão é uma amida. Normalmente, a imunoglobulina TACI resultante 76 será, no mínimo, 95% mono-, di-ou tri-peguilado, embora algumas espécies com maiores graus de PEGuilação possam ser formadas, dependendo das condições de reacção. As espécies peguiladas podem ser separadas dos polipeptídeos de imunoglobulina TACI não conjugados utilizando métodos de purificação padrão, tais como diálise, ultrafiltração, cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade, e assim por diante. A PEGuilação por alquilação geralmente envolve reagir um aldeído terminal de derivados de PEG com imunoglobulina TACI na presença de um agente redutor. Os grupos PEG podem ser ligados ao polipeptídeo através de um grupo CH2-NH.
Derivatização via alquilação redutiva para produzir um produto monoPEGuilado aproveita a reactividade diferencial dos diferentes tipos de grupos amino primários disponíveis para derivatização. Normalmente, a reacção é realizada a um pH que permite aproveitar as diferenças de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do resíduo N-terminal da proteína. Por tal derivatização selectiva, é ligado um polímero solúvel em água que contém um grupo reactivo como um aldeído, para a proteína ser controlada. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-terminal da proteína, sem alteração significativa de outros grupos reactivos, como os grupos de aminoácidos da cadeia lateral da lisina. A presente invenção fornece uma preparação substancialmente homogénea de conjugados de monopolímeros de imunoglobulina TACI. 77
Alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea de molécula de conjugado de monopolimeros de imunoglobulina TACI pode incluir as etapas de: (a) reagir um polipeptídeo de imunoglobulina TACI com um PEG reactivo sob condições de alquilação redutiva a um pH adequado para permitir a modificação selectiva do grupo α-amino no terminal amino da imunoglobulina TACI, e (b) a obtenção do produto de reacção. 0 agente redutor utilizado para a alquilação redutora deve ser estável em solução aquosa e capaz de reduzir apenas a base de Schiff formada no processo inicial de alquilação redutiva. Agentes de redução ilustrativos incluem borohidreto de sódio, cianoborohidreto de sódio, dimetilamina borane, trimetilamina borane e piridina borane.
Para uma população substancialmente homogénea de conjugados de monopolimeros de imunoglobulina TACI, as condições de reacção de alquilação redutiva são aquelas que permitem a fixação selectiva da molécula de polímero solúvel em água ao N-terminal da imunoglobulina TACI. Tais condições de reacção geralmente provêm de diferenças de pKa entre os grupos amino da lisina e do grupo α-amino no N-terminal. 0 pH também afecta a relação do polímero para a proteína a ser usada. Em geral, se o pH é menor, um maior excesso de polímero para a proteína será desejado, porque quanto menos reactivo for α-grupo do N-terminal, mais polímero é necessário para alcançar as condições ideais. Se o pH é mais elevado, o polímero de imunoglobulina TACI não precisa ser tão grande, porque os grupos mais reactivos estão disponíveis. Normalmente, o pH vai cair dentro do intervalo de 3 a 9, ou 3 a 6. 78
Outro factor a considerar é o peso molecular do polímero solúvel em água. Geralmente, quanto maior o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas de polímero que podem ser associadas à proteína. Para reacções de PEGuilação o peso molecular típico é de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, aproximadamente 5 kDa a cerca de 50 kDa, ou cerca de 12 kDa a 25 kDa. A razão molar de polímero solúvel em água para a imunoglobulina TACI será geralmente no intervalo de 1:1 a 100:1. Normalmente, a razão molar do polímero solúvel em água para a imunoglobulina TACI será de 1:1 para 20:1 para a poliPEGuilação, e 1:1 para 5:1 para monoPEGuilação. Métodos gerais para a produção de conjugados compreendendo um polipeptídeo e moléculas de polímero solúvel em água são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente US 5,382,657, Greenwald et al., Patente US 5,738,846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). A presente invenção contempla composições farmacêuticas compreendendo uma proteína de fusão, tal como definido nas reivindicações e um veículo farmaceuticamente aceitável. O transportador pode ser um transportador orgânico ou inorgânico convencional. Exemplos de transportadores incluem água, solução tampão, álcool, propilenoglicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho, e assim por diante. 79
7. Isolamento de Polipeptídeos de Imunoglobullna TACI
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados até, pelo menos, cerca de 80% de pureza, pelo menos, cerca de 90% de pureza, pelo menos, cerca de 95% de pureza, ou superior a 95% de pureza com relação à contaminação de macromoléculas, especialmente proteínas e outros ácidos nucleicos, e livre de agentes infecciosos e pirogénicos. Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser purificados até um estado farmaceuticamente puro, que é maior do que 99,9% de pureza. Em algumas preparações, o polipeptídeo purificado é substancialmente livre de outros polipeptídeos, especialmente outros polipeptídeos de origem animal. Métodos convencionais de purificação e/ou fraccionamento podem ser usados para a obtenção de preparações de polipeptídeos de imunoglobulinas TACI sintéticas, e polipeptídeos recombinantes de imunoglobulina TACI purificadas a partir de células hospedeiras recombinantes. Em geral, a precipitação de sulfato de amónio e de ácido ou a extração caotrópica podem ser utilizadas para o fraccionamento de amostras. Exemplos de etapas de purificação podem incluir a hidroxiapatita, exclusão de tamanho, FPLC e fase reversa da cromatografia líquida de alto desempenho. Os meios adequados de cromatografia em fase gasosa incluem dextranos derivatizados, agarose, celulose, poliacrilamida, sílicas especiais, e assim por diante. Os derivados PEI, DEAE, QAE e Q são adequados. Exemplos de meios cromatográficos incluem os meios derivatizados com grupos fenilo, butilo, octilo ou, tais 80 como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) e semelhantes; ou resinas poliacrílicas, tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e similares. Suportes sólidos adequados incluem contas de vidro, resinas sílicas, resinas celulósicas, contas de agarose, esferas de agarose reticuladas, esferas de poliestireno, ligações cruzadas de resinas de poliacrilamida e afins que sejam insolúveis nas condições em que estão a ser utilizadas. Esses suportes podem ser modificados com grupos reactivos que permitem a fixação de proteínas por grupos amino, grupos carboxílicos, grupos sulfidrilo, grupos hidroxila e/ou moléculas de carboidratos.
Exemplos de ligação química incluem activação de cianogénio de brometo, activação de N-hidroxipucanimida, activação de epóxido, activação de sulfidrilo, activação de hidrazida e derivados carboxila de amino de químicas de engate carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e amplamente utilizado na técnica, e estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais. A selecção de um método específico para o isolamento e purificação de polipeptídeos é uma questão de concepção de rotina e é determinado em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Veja, por exemplo, Affinity Chromatography: Principies and Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) , e Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).
Variações adicionais no isolamento e purificação da imunoglobulina TACI podem ser planeadas pelos peritos na 81 técnica. Por exemplo, anticorpos anti-TACI ou anti-Fc podem ser usados para isolar grandes quantidades de proteína por purificação de imunoafinidade.
Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser isolados por exploração de propriedades particulares. Por exemplo, a cromatografia de adsorção de iões metálicos imobilizados (IMAC) pode ser usada para purificar proteínas ricas em histidina, incluindo as que compreendem marcas de polihistidina. Resumidamente, um gel é o primeiro carregado de iões metálicos divalentes para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Proteínas ricas em histidina serão absorvidas a esta matriz com diferentes afinidades, dependendo do ião metálico utilizado, e serão eluídas por eluição competitiva, a redução do pH, ou a utilização de fortes agentes quelantes. Outros métodos de purificação incluem a purificação de proteínas glicosiladas por cromatografia de afinidade com lectinas, cromatografia de proteína A, e cromatografia de troca iónica (Deutscher M., (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)) .
Polipeptídeos de imunoglobulina TACI ou seus fragmentos podem também ser preparados através de síntese química, como descrito acima. Os polipeptídeos de imunoglobulina TACI podem ser monómeros ou multímeros; glicosilados ou não-glicosilados; peguilados ou não peguilados; e pode ou não incluir um resíduo de aminoácidos de metionina inicial. A proteína de fusão de imunoglobulina TACI pode ser não-glicosilada, glicosilada, ou glicosilada apenas na metade TACI ou na metade da imunoglobulina. A molécula de 82 imunoglobulina pode ser obtida a partir de um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal quimérico, ou um anticorpo humanizado.
8. Usos Terapêuticos de Polipeptídeos de Imunoglobulina TACI
As proteínas de imunoglobulina TACI podem ser usadas para modular o sistema imunológico, através da vinculação de ZTNF4 ou ZTNF2, e assim, impedindo a ligação destes ligantes com os receptores endógenos TACI ou BCMA. Assim, a presente descreve especificamente o uso de proteínas de imunoglobulina TACI num sujeito, que carece de uma quantidade adequada de receptores TACI ou BCMA, ou que produz um excesso de ZTNF4 ou ZTNF2. Essas moléculas podem ser administradas a qualquer sujeito que necessite de tratamento. A presente invenção contempla tanto usos terapêuticos veterinários como humanos, como definido nas reivindicações, os sujeitos ilustrativos incluem mamíferos, tais como os animais de fazenda, animais domésticos e os pacientes humanos.
Os polipeptídeos de imunoglobulina TACI podem ser usados para o tratamento de doenças auto-imunes, cancros das células B, imunomodulação, patologias mediadas de IBD e qualquer anticorpo (por exemplo, ITCP, miastenia grave e similares), doenças renais, resposta imune indirecta de células T, rejeição de enxerto e doença do enxerto contra hospedeiro. Os polipeptídeos da presente invenção podem 83 ser direccionados especificamente para regular as respostas das células B durante a resposta imune. Além disso, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para modular o desenvolvimento das células B, o desenvolvimento de outras células, a produção de anticorpos e a produção de citocinas. Os polipeptídeos da presente invenção também podem modular a comunicação das células T e B, neutralizando os efeitos proliferativos do ZTNF4.
Os polipeptídeos de imunoglobulina TACI da presente invenção podem ser úteis para neutralizar os efeitos da ZTNF24 para o tratamento de leucemia de células pré-B ou B, como a leucemia de células plasmáticas, leucemia linfocítica aguda e crónica e mielomas, como o mieloma múltiplo, mieloma de células plasmáticas, mielomas endoteliais e mieloma de células gigantes e, linfomas tais como o linfoma não-Hodgkin, para o qual um aumento de polipeptídeos ZTNF4 está associado. 0 ZTNF4 é expressa em células CD8+' monócitos, células dendríticas, monócitos activados, o que indica que, em certas doenças auto-imunes, as células T citotóxicas podem estimular a produção de células B através do excesso de produção de ZTNF4. Proteínas imunossupressoras que selectivamente bloqueam a acção dos linfócitos B seriam de utilizar no tratamento da doença. A produção de auto-anticorpos é comum a várias doenças auto-imunes e contribui para a destruição dos tecidos e exacerbação da doença. Os auto-anticorpos também podem levar à ocorrência de complicações derivadas da deposição de complexos imunes e levar a muitos sintomas de lúpus eritematoso sistémico, 84 incluindo insuficiência renal, sintomas nevrálgicos e morte. A modulação da produção de anticorpos independentemente da resposta celular também seria benéfica em muitos estados da doença. As células B também foram mostradoas a desempenhar um papel na secreção de imunoglobulinas artritogénicas na artrite reumatóide. Como tal, a inibição da produção de anticorpos ZTNF4 seria benéfica no tratamento de doenças auto-imunes como a miastenia grave, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, e artrite psoriática. A terapêutica imunossupressora tal como as proteínas de imunoglobulina TACI que selectivamente bloqueam ou neutralizam a acção dos linfócitos B seriam úteis para tais fins. A invenção fornece o uso empregando proteínas de imunoglobulina TACI para bloquear selectivamente ou neutralizar as acções das células B, em associação com a fase final de doenças renais, que podem ou não estar associadas a doenças auto-imunes. Tais métodos também seriam úteis para tratar doenças imunológicas renais. Tais métodos seriam úteis para tratar a glomerulonefrite associada a doenças tais como nefropatia membranosa, nefropatia por IgA ou doença de Berger, nefropatia de IgM, a doença de Goodpasture, glomerulonefrite pós-infecciosa, doença mesangioproliferative, leucemia linfóide crónica, e sindrome nefrótico minimal. Tais métodos também serviriam como aplicações terapêuticas para o tratamento secundário da glomerulonefrite ou vasculite associada a doenças como o lupus, poliarterite, Schõnlein-Henoch, esclerodermia, doenças relacionadas com o HIV, amiloidose ou sindrome hemolitico-urémico. Os usos da presente invenção também seriam úteis como parte de uma aplicação terapêutica para o 85 tratamento da nefrite intersticial ou pielonefrite associada com pielonefrite crónica, abuso de analgésicos, nefrocalcinose, nefropatia causada por outros agentes, nefrolitiase, ou nefrite intersticial crónica ou aguda A especificação descreve o uso proteínas de imunoglobulina TACI no tratamento das doenças hipertensivas ou doenças dos grandes vasos, incluindo estenose da artéria renal ou oclusão e êmbolos de colesterol ou embolia renal. A presente invenção também fornece usos para tratamento de neoplasias renais ou urológicas, mieloma múltiplo, linfomas, neuropatia cadeia leve ou amiloidose. A invenção também fornece o uso para bloquear ou inibir as células B activadas usando proteínas de imunoglobulina TACI para o tratamento da asma e outras doenças respiratórias crónicas, como bronquite e enfisema. As proteínas de imunoglobulina TACI aqui descrias também pode ser usadas para tratar a síndrome de Sjõgren.
Também são fornecidas para inibir ou neutralizar uma resposta das células T efectoras usando proteínas de imunoglobulina TACI para uso em imunossupressão, em particular para uso terapêutico na doença de enxerto-versus-hospedeiro e rejeição do enxerto. Além disso, as proteínas de imunoglobulina TACI seriam úteis em protocolos terapêuticos para o tratamento de tais doenças auto-imunes 86 como diabetes mellitus insulino-dependente (DMID) e doença de Crohn. Usos da presente invenção teriam valor terapêutico adicional para tratar doenças inflamatórias crónicas, em particular para diminuir dores nas articulações, inchaço, anemia e outros sintomas associados, bem como tratamento do choque séptico.
Modelos animais bem estabelecidos estão disponíveis para testar a eficácia in vivo das proteínas de imunoglobulina TACI da presente invenção em alguns estados de doença. Em particular, as proteínas de imunoglobulina TACI podem ser testadas in vivo numa série de modelos animais de doenças auto-imunes, como a MRL-lpr/lpr ou linhagens de ratos congénicos NZB x NZW F1 que servem como um modelo de LES (lúpus eritematoso sistémico). Tais modelos animais são conhecidos na técnica.
Descendentes de um cruzamento entre os ratos New Zealand Black (NZB) e o New Zealand White (NZW) desenvolvem uma forma espontânea do LES que se assemelha ao LES em seres humanos. Os ratos descendentes, conhecidos como NZBW começam a desenvolver anticorpos IgM contra as células-T com 1 mês de idade, e por volta dos 5-7 meses de idade, os auto-anticorpos Ig anti-ADN são a imunoglobulina dominante. A hiperactividade das células B policlonais leva à superprodução de auto-anticorpos. A deposição desses auto-anticorpos, particularmente aqueles dirigidos contra o ADN de fita simples está associada com o desenvolvimento de glomerulonefrite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azoternia e morte por insuficiência renal. A insuficiência renal é a principal causa de morte em 87 ratinhos afectados com LES espontâneo, e na estirpe NZBW, este processo é crónico e obliterante. A doença é mais rápida e grave nas fêmeas do que machos, com sobrevivência média de apenas 245 dias, em comparação com 406 dias para os machos. Embora muitos dos ratos fêmeas irão ser sintomáticos (proteinúria) por volta dos 7-9 meses de idade, algumas podem ser muito mais jovens ou mais velhas quando desenvolvem sintomas. A nefrite imune fatal vista nos ratos NZBW é muito semelhante à merulonefrites vista no LES humano, tornando este modelo murino espontânea útil para testar o potencial da terapêutica SLE.
Modelos de ratos para encefalomielite alérgica experimental (EAE) têm sido utilizados como uma ferramenta para investigar os mecanismos da doença imune-mediada, e métodos de intervenção terapêutica potencial. O modelo assemelha-se à esclerose múltipla humana, e produz desmielinização como resultado da activação de células T para as neuroproteinas tais como a proteína básica da mielina (MBP), ou proteína proteolipídica (PLP). A inoculação de antígeno leva à indução de células CD4+, células T MHC restritas de classe II (Thl). As mudanças no protocolo para o EAE podem produzir transferência de variantes do modelo aguda, crónica recidivante, ou passiva.
No modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), os ratos desenvolvem artrite inflamatória crónica, que se assemelha à artrite reumatóide humana (RA). Uma vez que a CIA partilha com a AR semelhantes características imunológicas e patológicas, isso faz com que o modelo seja ideal para a selecção de anti-inflamatórios compostos potenciais 88 humanos. Outra vantagem em utilizar o modelo CIA é que os mecanismos de patogénese são conhecidos. Os epitopos de célula T e B no colágeno tipo II, foram identificados, e vários parâmetros imunológicos (hipersensibilidade retardada e anticorpo anti-colágeno) e inflamatórios (citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz) relativos ao sistema imunológico mediando artrite foram determinados, e podem ser usados para avaliar a eficácia do composto de ensaio nos modelos. A miastenia gravis (MG) é outra doença auto-imune em que os modelos murinos estão disponíveis. A MG é um distúrbio da transmissão neuromuscular que envolve a produção de anticorpos dirigidos contra o receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) A MG é adquirida ou herdada com características clínicas, incluindo fraqueza e fadiga anormal no esforço. Um modelo do rato da MG foi estabelecido. A miastenia gravis auto-imune experimental (EAMG) é uma doença mediada por anticorpos, caracterizada pela presença de anticorpos para AChR. Esses anticorpos destroem o receptor levando a impulsos eléctricos neuromusculares defeituosos, resultando em fraqueza muscular. No modelo EAMG, os ratos são imunizados com o receptor de acetilcolina. Os sinais clínicos da MG tornam-se evidentes semanas após a segunda imunização. 0 EAMG é avaliado por vários métodos, incluindo a medição dos níveis séricos de anticorpos AChR por radioimunoensaio, medindo o AChR muscular, ou eletromiografia.
Geralmente, a dosagem da proteína de imunoglobulina TACI administrada irá variar dependendo de factores tais como a 89 idade do sujeito, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica anterior. Normalmente, é desejável fornecer ao destinatário uma dose de proteina de imunoglobulina TACI, que está na faixa de cerca de 1 pg/kg para 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal do indivíduo), apesar de uma menor ou maior dose também poder ser administrada conforme as circunstâncias o exigirem. A administração de uma proteína de imunoglobulina TACI numa pessoa pode ser por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por meio de um cateter de perfusão regional, ou por injecção intralesional directa. Ao administrar as proteínas terapêuticas, por injecção, a administração pode ser feita por infusão contínua ou bolus único ou múltiplo.
Vias complementares de administração incluem oral, mucosa-membrana, pulmonar e transcutânea. A entrega oral é adequada para microesfereas de poliéster, microesferas zein, microesferas proteinóides, microesferas policianoacrilatas e sistemas baseados em lipídos (ver, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A viabilidade de uma entrega intranasal é exemplificada por tal modo de administração de insulina (ver, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Partículas líquidas ou secas compreendendo imunoglobulina TACI podem ser preparadas e inaladas com a ajuda de dispersores de pó seco, geradores de aerossóis líquidos, ou nebulizadores (por ex., Pettit e 90
Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de gestão da diabetes AERX, que é um inalador de mão electrónico que fornece insulina em aerossol nos pulmões. Estudos têm demonstrado que proteínas tão grandes como como 48.000 kDa foram entregues através da pele em concentrações terapêuticas, com a ajuda de ultra-sons de baixa frequência, o que ilustra a viabilidade da administração transcutânea (Mitragotri et al. Science 269:850 (1995)). Entrega transdérmica usando electroporação prevê outro meio para administrar uma proteína de imunoglobulina TACI (Potts et al. Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)) .
Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de imunoglobulina TACI pode ser formulada de acordo com métodos já conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, através do qual as proteínas terapêuticas são combinados numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição é dita ser um "transportador farmaceuticamente aceitável" se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. O tampão de fosfato salino estéril é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros portadores apropriados são bem conhecidas pelos peritos na técnica. Veja, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995) .
Para fins de terapia, as proteínas de imunoglobulina TACI são administradas a um paciente numa quantidade 91 terapeuticamente eficaz. A proteína de imunoglobulina TACI e um veículo farmaceuticamente aceitável é dito ser administrado numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada é fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo, se a sua presença resultar numa mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar a inflamação é fisiologicamente significativo, se a sua presença diminuir a resposta inflamatória. Como outro exemplo, um agente usado para inibir o crescimento de células tumorais é fisiologicamente significativo se a administração do agente resultar numa diminuição no número de células do tumor, diminuição das metástases, uma diminuição no tamanho de um tumor sólido, ou aumento da necrose de um tumor. Além disso, um agente usado para tratar lúpus eritematoso sistémico é fisiologicamente significativo se a administração do agente resultar numa diminuição da circulação de anticorpos de ADN anti-dupla hélice, ou uma diminuição de pelo menos um dos seguintes sintomas: febre, dores articulares, lesões eritematosas da pele ou outras características do lúpus eritematoso sistémico. Um exemplo de uma indicação geral de que uma proteína de imunoglobulina TACI é administrada numa quantidade terapeuticamente eficaz é que, após a administração a um sujeito, há uma diminuição nos níveis circulantes de ZTNF4 (BLyS).
Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de imunoglobulina TACI pode ser fornecida em forma líquida, num aerossol, ou em forma sólida. Formas líquidas, são ilustradas por soluções injectáveis e suspensões orais. Exemplos de formas sólidas incluem cápsulas, comprimidos, e 92 formas de liberação controlada. Esta última forma é ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al. Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivey", in Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", em Protein DFelivery: Physical System, Sanders e Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)).
Os lipossomas fornecem um meio para entregar polipeptideos terapêuticos a um sujeito por via intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutânea ou por administração oral, inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas compostas de uma ou mais bicamadas lipídicas em torno de compartimentos aquosos (ver, em geral, Bakker-Woudenberg et al. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," in Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são similares na composição às membranas celulares e, como resultado, os lipossomas podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares e os lipossomas podem variar de tamanho, com diâmetros variando de 0,02 ym a maior do que 10 ym. Uma variedade de agentes pode ser encapsulada em lipossomas: partição de agentes hidrofóbicos em bicamadas e partição de 93 agentes hidrofílicos no espaço interior aquoso (ver, por exemplo, Machy et al., Liposomes in Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987), e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado através da variação do tamanho dos lipossomas, o número de bicamadas, composição lipídica, assim como a carga e as características superficiais dos lipossomas.
Os lipossomas podem absorver praticamente qualquer tipo de célula e então lentamente soltar o agente encapsulado. Alternativamente, um lipossoma absorvido pode ser sujeito a endocitose por células que são fagocíticas. A endocitose é seguida pela degradação de lipídios lipossomais intralisosomal e libertação dos agentes encapsulados (Scherphof et al. Ann. NY Acad. Sei. 446:368 (1985)). Após a administração intravenosa, os lipossomas pequenos (0,1-1,0 pm) são normalmente assimilados pelas células do sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente no fígado e baço, enquanto que os lipossomas maiores do que 3,0 pm depositados no pulmão. Esta captação preferencial de lipossomas menores pelas células do sistema reticuloendotelial tem sido utilizada para entregar agentes quimioterápicos para macrófagos e para os tumores do fígado. O sistema reticuloendotelial pode ser contornado por vários métodos, incluindo a saturação com altas doses de partículas de lipossomas, ou inactivação selectiva de macrófagos por meios farmacológicos (Claassen et al. Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Além disso, a 94 incorporação de fosfolípidos derivatizados de glicolipídeo ou polietileno glicol nas membranas dos lipossomas foi mostrado resultar num consumo significativamente reduzido pelo sistema reticuloendotelial (Allen et al. Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Os lipossomas também podem ser preparados para atingir células ou órgãos, nomeadamente através da variação da composição fosfolipídea ou inserindo receptores ou ligantes nos lipossomas. Por exemplo, lipossomas, preparados com um alto conteúdo de um surfactante não-iónico, têm sido utilizados para atingir o fígado (Hayakawa et al. Patente JP 04-244,018 ; Kato et al., Biol. Phann. Buli. 16:960 (1993)). Estas formulações foram preparadas através da mistura de soja fospatidilcolina, α-tocoferol, óleo de castor etoxilado e hidrogenado (HCO-60) em metanol, concentrando-se a mistura sob vácuo e em seguida, reconstituindo a mistura com água. A formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), com uma mistura de derivados de soja esterilglucoside (SG) e colesterol (Ch) também foi mostrada para atingir o fígado (Shimizu et al. Biol. Pharm. Buli. 20:881 (1997)).
Alternativamente, vários ligantes podem ser ligados à superfície dos lipossomas, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpos, carboidratos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem ser modificados com derivados galactosilipídeos ramificados para atingir a asialoglicoproteína (galactose), os quais são exclusivamente expressos na superfície das células 95 hepáticas (Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al. Biol. Pharm. Buli.20: 259 (1997)). Da mesma forma, Wu et al. Hepatology 27:772 (1998), têm demonstrado que os lipossomas marcados com asialofetuina levaram a um tempo de semi-vida encurtado dos lipossomas e bastante reforçada absorção de asialofetuina marcada com lipossomas pelos hepatócitos. Por outro lado, a acumulação hepática dos lipossomas compreendendo derivados galactosilipídeos do tipo ramificado pode ser inibida por pré-injecção de asialofetuina (Murahashi et al. Biol. Pharm. Buli.20: 259 (1997)). Lipossomas de albumina humana sérica poliaconitilatada fornecem uma outra abordagem para a segmentação por lipossomas para as células do fígado (Kamps et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 94:11681 (1997)). Além disso, Geho, et al., Patente US 4,603, 044, descrevem um hepatócito dirigido ao sistema de entrega de lipossomas de vesícula, que tem especificidade para receptores hepatobiliares associados com as células especializadas metabólicas do fígado.
Numa abordagem mais geral para o tecido alvo, as células-alvo são pré-marcadas com anticorpos de biotina específicos para um ligante expressos pela célula-alvo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Após a eliminação do plasma de anticorpo livre, são administrados os lipossomas conjugados de estreptavidina. Em outra abordagem, os anticorpos estão directamente ligados aos lipossomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). 96
As proteínas de imunoglobulina TACI podem ser encapsuladas em lipossomas usando técnicas padrão de microencapsulação de proteínas (ver, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Câncer Res. 50:1853 (1990), e Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", em Liposonae Technology, 2nd Edition, vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como mencionado acima, lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem incluir os derivados poli de lipídios (etileno glicol) ( Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Microesferas de polímero degradáveis foram projectadas para manter os elevados níveis sistémicos das proteínas terapêuticas. As microesferas são preparadas a partir de polímeros biodegradáveis, tais como poli (ácido lático-co-ácido glicólico) (PLG), polianidridos, poli (ésteres orto), polímeros não biodegradáveis de acetato etilvinil, no qual as proteínas são aprisionadas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney e Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Nanoesferas de polietileno glicol (PEG) revestidas também 97 podem fornecer veículos para a administração intravenosa de proteínas terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)). A especificação descreve proteínas de imunoglobulina TACI quimicamente modificadas em que o polipeptídeo é ligado com um polímero, como discutido acima.
Outras formas de dosagem podem ser planeada pelos peritos na técnica, como mostrado, por exemplo, em Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sth Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995), e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) .
Como ilustração, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit composto por um recipiente que compreende uma proteína de imunoglobulina TACI. Polipeptídeos terapêuticos podem ser fornecidos sob a forma de uma solução injectável para administração de doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que vai ser reconstituído antes da injeção. Como alternativa, tal kit pode incluir um dispersor de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou um nebulizador para a administração de um polipeptídeo terapêutico. Tais kitsd podem ainda incluir uma informação escrita sobre as indicações e uso da composição farmacêutica. Além disso, essas informações podem incluir uma declaração de que a composição da 98 proteína de imunoglobulina TACI é contra-indicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida tanto ao receptor TACI ou à imunoglobulina.
9. Usos Terapêuticos das sequências de nucleotídeos de imunoglobulina TACI A especificação descreve a utilização de moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão de imunoglobulina TACI para fornecer estas proteínas de fusão para um sujeito em necessidade de tal tratamento. Para utilização terapêutica veterinária ou uso terapêutico no homem, tais moléculas de ácido nucléico podem ser administradas a um sujeito com uma desordem ou doença, como discutido acima. Como um exemplo discutido anteriormente, moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI podem ser usadas para o tratamento a longo prazo do lúpus eritematoso sistémico.
Existem várias abordagens para a introdução de um gene de imunoglobulina TACI num sujeito, incluindo a utilização de células hospedeiras recombinantes que expressam imunoglobulina TACI, entrega de ácidos nucleicos nus codificando imunoglobulina TACI, uso de um transportador de lipídios catiónicos com uma molécula de ácido nucléico que codifica imunoglobulina TACI, bem como a utilização de vírus que expressam imunoglobulina TACI, tais como retrovírus recombinante, vírus recombinante adeno-associado, adenovírus recombinante, e vírus do Herpes 99 simplex recombinante (ver, por exemplo, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al. Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Breakfield e Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). Numa abordagem "ex vivo", por exemplo, as células são isoladas a partir de um sujeito, transfectadas com um vector que expressa um gene da imunoglobulina TACI e, em seguida transplantadas para o sujeito. A fim de afectar a expressão de um gene de imunoglobulina TACI, é construído um vector de expressão em que uma sequência de nucleotídeos codificando um gene de imunoglobulina TACI liga-se operacionalmente a um promotor do núcleo, e, opcionalmente, a um elemento regulador, para controlar a transcrição de genes. Os requisitos gerais de um vector de expressão são descritos acima.
Alternativamente, um gene de imunoglobulina TACI pode ser fornecido utilizando vectores virais recombinantes, incluindo, por exemplo, vectores adenovirais (por ex., Kass-Eisler et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 90:11498 (1993) , Kolls et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 91:215 (1994) , Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993), e Zabner et al., Cell 75:207 (1993)), vectores virais de adenovírus associado (Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 90:10613 (1993)), alfavírus como o vírus Semliki Forest e o vírus Sindbis (Hertz e Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju e Huang, J. Vir. 65:2501 (1991), e Xiong et al., Science 243:1188 (1989)), vectores virais do herpes (por ex., 100
Patentes US 4,859,587, 5,288,641 e 5,328,688), vectores parvovírus (Koering et al., Hum. Gene Yherap. 5:457 (1994)), vectores do vírus da varíola (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali e Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 79:4927 (1982)), vírus da varíola, tais como o vírus da varíola dos canários ou vírus vaccinia (Fisher-Hoch et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 86:317 (1989), e Flexner et al., Ann. NY Acad. Sei. 569:86 (1989)), e os retrovírus (por ex., Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al., Câncer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493 (1992), Vil e Hart, Câncer Res. 53:962 (1993), Vil e Hart, Câncer Res. 53:3860 (1993), e Anderson et al., Patente US 5,399,346). Dentro de várias modalidades, seja o vector virai em si, ou uma partícula virai que contenha o vector virai podem ser utilizadas nos métodos e composições descritos abaixo.
Como uma ilustração de um sistema, adenovírus, um vírus de ADN de dupla fita, é um vector de transferência de genes bem caracterizado para a entrega de uma molécula de ácido nucléico heterólogo (para uma revisão, veja Becker et al., Meth. Biol Cell. 43:161 (1994); Douglas e Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). O sistema de adenovírus oferece várias vantagens, incluindo: (i) a capacidade de acomodar inserções de ADN relativamente grandes, (ii) a capacidade de ser cultivadas para alto-título, (iii) a capacidade de infectar uma grande variedade de tipos de células de mamíferos, e (iv) a capacidade de ser usado com muitos promotores diferentes, incluindo tecidos específicos ubíquos, e os promotores reguláveis. Além disso, o 101 adenovírus pode ser administrado por injecção intravenosa, porque o virus é estável na corrente sanguínea.
Usando vectores de adenovírus em que partes do genoma do adenovírus são eliminadas, as inserções são incorporadas ao ADN virai pela ligadura directa ou por recombinação homóloga com um plasmídeo co-transfectado. Num exemplo de sistema, o gene essencial EI é excluído do vector virai, e o vírus não vai replicar a menos que o gene El seja fornecido pela célula hospedeira. Quando administrado por via intravenosa a animais intactos, o adenovírus visa, primordialmente, o fígado. Embora um sistema de entrega adenoviral com uma delecção do gene El não possa replicar em células hospedeiras, o tecido hospedeiro irá expressar e processar uma proteína heteróloga codificada. Células hospedeiras também secretam a proteína heteróloga, se o gene correspondente incluir uma sequência sinal secretora. Proteínas secretadas entrarão na circulação do tecido que expressa o gene heterólogo (por ex., o fígado altamente vascularizado).
Além disso, os vectores adenovirais contendo supressões de vários genes virais podem ser usados para reduzir ou eliminar a resposta imune ao vector. Tais adenovírus têm o El excluído, e, além disso, contêm exclusões de E2A ou E4 (Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). A supressão do E2b também tem sido relatada para reduzir a resposta imune (Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)). Ao apagar todo o genoma do adenovírus, podem ser acomodadas grandes inserções de ADN heterólogo. A geração dos chamados adenovírus 102 "cobardes", onde todos os genes virais são excluídos, são particularmente vantajosos para a inserção de grandes inserções do ADN heterólogo (para uma revisão, veja Yeh. e Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).
Fornecimentos de virus recombinantes de elevada titulação capazes de expressar um gene terapêutico podem ser obtidos a partir de células de mamíferos infectados, usando métodos padrão. Por exemplo, o virus recombinante do herpes simplex pode ser preparado em células Vero, como descrito por Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli e Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 30:2474 (1989), Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992), e por Brown e MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997) .
Alternativamente, um vector de expressão contendo um gene de imunoglobulina TACI pode ser introduzido células de um sujeito por lipofecção in vivo utilizando lipossomas. Lipídios catiónicos sintéticos podem ser usados para preparar lipossomas para a transfecção in vivo de um gene que codifica um marcador (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc.
Nat'l Acad. Sei. USA, 85:8027 (1988)). O uso de lipofecção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo tem certas vantagens práticas. Os lipossomas podem ser usado para a transfecção directa para os tipos de célula particulares, o que é particularmente vantajoso num tecido com heterogeneidade celular, como o pâncreas, fígado, rim e cérebro. Os lipídios podem ser 103 quimicamente ligados a outras moléculas para fins de segmentação. Peptideos específicos (por ex., hormonas ou neurotransmissores) , proteínas, tais como anticorpos, ou moléculas não-peptídicas podem ser ligados quimicamente a lipossomas. A electroporação é um outro modo alternativo de administração. Por exemplo, Aihara e Miyazaki, Nature Biotec/mology 16:867 (1998), têm demonstrado a utilização da electroporação in vivo para a transferência de genes no músculo.
Em geral, a dosagem de uma composição compreendendo um vector terapêutico com uma sequência de nucleotídeos de imunoglobulina TACI, tal como um vírus recombinante, irá variar dependendo de factores tais como a idade do sujeito, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica prévia. Vias adequadas de administração de vectores terapêuticos incluem a injecção intravenosa, a injecção intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, injecção intratumoral e injecção numa cavidade que contém um tumor. Como ilustração, Horton et al. Proc. Nat'l Acad. USA, 96:1553 (1999), demonstraram que a injecção intramuscular de plasmídeo de ADN codificando interferãon-α produz potentes efeitos anti-tumorais em tumores primários e metastáticos num modelo murino.
Uma composição compreendendo vectores virais, vectores não-virais, ou uma combinação de vectores virais e não-virais 104 pode ser formulada de acordo com métodos já conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que os vectores ou vírus são combinados numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como mencionado acima, uma composição, tal como o tampão fosfato salino é dito ser um "transportador farmaceuticamente aceitável" se a sua administração poder ser tolerada por um sujeito destinatário. Outros portadores apropriados são bem conhecidos pelos peritos na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. 19. (Mack Publishing Co. 1995), e Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 7 a ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)).
Para fins de terapia, um vector de expressão do gene terapêutico, ou um vírus recombinante que compreende tal vector, e um veículo farmaceuticamente aceitável são administradas a um sujeito numa quantidade terapeuticamente eficaz. Uma combinação de um vector de expressão (ou vírus) e um veículo farmaceuticamente aceitável é dita ser administrada numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo, se a sua presença resultar numa mudança detectável na fisiologia de um sujeito destinatário. Por exemplo, um agente usado para tratar a inflamação é fisiologicamente significativo, se a sua presença diminuir a resposta inflamatória. Como outro exemplo, um agente usado para inibir o crescimento de células tumorais é fisiologicamente significativo se a administração do agente resultar numa diminuição no número de células do tumor, diminuição da metástase, diminuição no tamanho de um tumor sólido, ou aumento da necrose de um tumor. 105
Quando o sujeito tratado com um vector da expressão do gene terapêutico ou um vírus recombinante é um ser humano, então a terapia é de preferência a terapia genética em células somáticas. Isto é, o tratamento preferencial de um ser humano com um vector da expressão do gene terapêutico ou um vírus recombinante não implica a introdução em células de uma molécula de ácido nucléico que pode fazer parte de uma célula germinal humana e ser passada para as gerações sucessivas (isto é, terapia genética germinal humana). 10. Produção de ratos transgénicos
Ratos transgénicos podem ser concebidos para sobre-expressar ácidos nucleicos codificando proteínas de fusão de imunoglobulina TACI em todos os tecidos, ou sob o controlo de um tecido específico ou de elemento preferencial de regulação de tecidos. Estes super-produtores de proteínas de fusão de imunoglobulina TACI podem ser utilizados para caracterizar o fenótipo resultante da sobre-expressão, e os animais transgénicos podem servir como modelos para doenças humanas causadas por excesso de proteína de receptor TACI. Ratos transgénicos que sobre-expressam proteínas de fusão de imunoglobulina TACI também fornecem modelos de bioreactores para a produção de proteínas de fusão de imunoglobulina TACI no leite ou sangue de animais maiores. Métodos para produzir ratos transgénicos são bem conhecidos pelos peritos na técnica (ver, por exemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", em Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky e 106
Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995), e Abbud e Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", em Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez e Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)) .
Por exemplo, um método para produzir um rato transgénico que expressa uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI pode começar com adultos, machos férteis (reprodutores) (B6C3F1, de 2 a 8 meses de idade (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (ineficazes) (B6D2fl, de 2 a 8 meses, (Taconic Farms)), pré-adolescentes do sexo feminino fértil (doadores) (B6C3F1, 4 a 5 semanas, (Taconic Farms)) e fêmeas adultas férteis (receptores) (B6D2fl, de 2 a 4 meses, (Taconic Farms)). As doadoras são aclimatadas por uma semana e depois injetacdas com cerca de 8 Ul/rato de gonadotrofina Pregnant Mare Serum (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) I.P., e 46 a 47 horas mais tarde, 8 Ul/rato de gonadotrofina coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para induzir a superovulação. As doadoras são acasaladas com reprodutores posteriormente às injecções de hormona. A ovulação geralmente ocorre dentro de 13 horas após a injecção de hCG. A cópula é confirmada pela presença de um tampão vaginal, na manhã seguinte ao acasalamento.
Os ovos fertilizados são recolhidos num âmbito cirúrgico. As tubas uterinas são colectadas e os ovos são libertados em placas de urinálise contendo hialuronidase (Sigma). Os ovos são lavados uma vez em hialuronidase, e duas vezes em 107 meio de Whitten W640 (descrito, por exemplo, em Menino e 0'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986), e Dienhart e Downs, Zygote 4:129 (1996)) que foi incubado com 5% de CO2, 5% de O2, e 90% de N2 a 37°C. Os ovos são então armazenados numa incubadora a 37°C/5% de CO2 até à microinjecção.
Dez a vinte microgramas de ADN plasmidial contendo uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI codificando uma sequência é linearizado, purificado com gel, e ressuspenso em 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,25 mM EDTA (pH 8,0), na concentração final de 5 a 10 nanogramas por microlitro de microinjecção. Por exemplo, a proteína de fusão de imunoglobulina TACI codificando sequências pode codificar um polipeptídeo TACI com eliminação de resíduos de aminoácidos 1 a 29 e 111 a 154 da SEQ ID NO: 2, e uma molécula de imunoglobulina FC5. O ADN plasmidal é microinjectado em ovos colhidos contidos numa gota de meio W640 sobrepostas por óleo mineral CO2 equilibrado morno. O ADN é extraído numa agulha de injecção (puxado de um ID de 0,75 mm, 1 mm OD de borosilicato capilar de vidro), e injectado em ovos individuais. Cada ovo é penetrado com a agulha de injecção, num ou ambos os pró-núcleos haplóides.
Picolitros de ADN são injectados nos pró-núcleos, e a agulha de injecção retirada sem entrar em contacto com o nucléolo. O procedimento é repetido até que todos os ovos estejam injectados. Os ovos microinjectados com sucesso são 108 transferidos para um tecido do órgão, prato de cultura com pré-meio W640 para armazenamento de noite numa incubadora a 37°C/5% C02.
No dia seguinte, duas células de embriões são transferidas para destinatárias pseudo-grávidas. As beneficiárias são identificadas pela presença de velas de cópula, após copular com vasectomizados. As destinatárias são anestesiadas e rapadas no dorsal do lado esquerdo e transferidas para um microscópio cirúrgico. Uma pequena incisão é feita na pele e através da parede muscular no meio da área abdominal delineada pela caixa torácica, o selim, e as pernas traseiras, a meio caminho entre o joelho e o baço. Os órgãos reprodutivos são exteriorizados numa cortina de pequena cirurgia. A almofada de gordura é estendida sobre o campo cirúrgico, e um bébé serrefina (Roboz, Rockville, MD) é anexado ao bloco de gordura e deixado em suspenso sobre a parte traseira do rato, impedindo que os órgãos deslizem para trás.
Com uma pipeta de transferência fina contendo óleo mineral seguida alternando W640 e bolhas de ar, 12-17 embriões de duas células saudáveis da injecçâo do dia anterior são transferidos para o destinatário. A ampola fica inchada e segura o oviduto entre a ampola e a bursa, um ninho no oviduto é feito com uma agulha 28g perto da bursa, tomando cuidado para não rasgar a ampola ou bolsa. 109 A pipeta é transferida para o ninhono oviduto e os embriões são sopradas para dentro, permitindo que a primeira bolha de ar escape da pipeta. A almofada de gordura é delicadamente empurrada para o peritoneo, e aos órgãos reprodutivos é permitido deslizar. A parede peritoneal é fechada com uma sutura e a pele fechada com um agrafo. Os ratos recuperam numa superfície a 37°C por um mínimo de quatro horas.
As destinatárias são devolvidas às gaiolas aos pares, e permitidos 19-21 dias de gestação. Após o nascimento, é permitido 19-21 dias após o parto antes do desmame. Os recém desmamados são separados por sexos e colocados em gaiolas, e uma biópsia de 0,5 cm (usado para genotipagem) é cortada no rabo com uma tesoura limpa. ADN genómico é preparado a partir de recortes da cauda, utilizando, por exemplo, um kit QIAGEN DNEASY seguindo as instruções do fabricante. O ADN genómico é analisado por PCR utilizando iniciadores concebidos para amplificar uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de fusão de imunoglobulina TACI ou um gene marcado seleccionado que foi introduzido no mesmo plasmídeo. Depois que os animais são confirmados ser transgénicos, estão de volta cruzados numa linhagem pura, colocando uma fêmea transgénica com um macho selvagem, ou um macho transgénico com uma ou duas fêmeas do tipo selvagem. As crias nascem e são desmamadas, os sexos são separados, e cortado o rabo para genotipagem. 110
Para verificar a expressão de um transgene num animal vivo, é realizada uma hepatectomia parcial. A preparação cirúrgica é feita no abdómen superior directamente abaixo do processo zifóide. Utilizando uma técnica estéril, é feita uma incisão pequena 1,5-2 centímetros abaixo do esterno e do lobo lateral esquerdo do figado exteriorizado. Utilizando seda 4-0, é feita uma gravata em torno do lobo inferior prendendo-o fora da cavidade corporal. Uma pinça atraumática é usada para segurar a gravata, enquanto um segundo ciclo de Dexon absorvível (American Cyanamid; Wayne, NJ) é colocado próximo à primeira gravata. Um corte distai é feito a partir da gravata de Dexon e cerca de 100 mg do tecido do fígado cortado é colocado numa placa de Petri estéril. A secção do fígado extirpado é transferida para um tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 ml e congelado em nitrogénio líquido e armazenadas em gelo seco. O local da intervenção cirúrgica é fechado com sutura e agrafos, e a gaiola do animal colocada sobre uma almofada de aquecimento a 37°C por 24 horas de pós-operatório. O animal é verificado diariamente no pós operatório e os agrafos removidos 7-10 dias após a cirurgia. O nível de expressão da de proteína de fusão de imunoglobulina TACI mRNA é examinado para cada rato transgénico usando um ensaio de solução de hibridização de RNA ou reacção em cadeia de polimerase.
Usando a abordagem geral descrita acima, foram produzidos ratos transgénicos que expressam níveis significativos de proteína de fusão de imunoglobulina TACI no leite. Neste caso específico, a proteína de fusão de imunoglobulina TACI codificando uma sequência que codifica um polipeptideo TACI 111 com eliminação de resíduos de aminoácidos 1 a 29 e 111 a 154 da SEQ ID NO: 2, e uma molécula de imunoglobulina Fc5. A presente invenção, em geral, será mais facilmente compreendida por referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a ser uma limitação da presente invenção. EXEMPLO 1
Construção de Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Proteínas TACI-Fc
Moléculas de ácido nucléico codificando TACI humana foram obtidas durante a clonagem de expressão dos receptores para ZTNF4 como descrito por Gross et al., Nature 404:995 (2000). A codificação de sequências contidas nas construções de expressão TACI-Fc foi gerada pela sobreposição de PCR, usando técnicas padrão (ver, por exemplo, Horton et al., Gene 77:61 (1989)). A TACI humana do ADN e Fc cADN foram utilizados como modelos para as amplificações de PCR. Iniciadores de PCR foram projectados para produzir a sequência de codificação desejada das extremidades 5' e 3' e para introduzir restrições locais de reconhecimento da enzima para facilitar a inserção dessas sequências de codificação para os vectores de expressão. As sequências codificantes TACI-Fc foram inseridas em vectores de expressão, que incluiu um gene funcional murino redutase. Um vector de expressão também continha um promotor citomegalovírus para direccionar a expressão do 112 transgene da proteína recombinante, um intron de imunoglobulina, uma sequência de sinal de tecido activador do plasminogénio, uma sequência de entrada interna do ribossoma, um cistron CD8 excluído para a selecção de superfície das células transfectadas, e os elementos de expressão de levedura para o crescimento do plasmídeo em células de levedura.
Uma abordagem que foi utilizada para produzir proteínas de fusão TACI-Fc é ilustrada pelo método usado para construir TACI-FC4. Outras proteínas de fusão TACI-Fc foram produzidas pela inserção de sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão TACI-Fc num vector de expressão de mamífero, e introduzem este vector de expressão em células de mamíferos. A. Construção de Fragmento Ig yl FC4
Para preparar proteína de fusão TACI-FC4, a região Fc do IgGl humano (região da dobradiça e de domínios CH2 e CH3) foi modificada para remover o receptor Fcyl (FcyRI) e as funções de ligação do complemento (Clq). Esta versão modificada do IgGl humano Fc foi designada "Fc4". A região Fc foi isolada de uma biblioteca de fígado fetal humano (Clontech) PCR utilizando iniciadores oligo 5'ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3' (SEQ ID NO: 7) e 5' GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3' 113 (SEQ ID NO: 8) . Mutações na região Fc foram introduzidas pela PCR para reduzir o FcyRI vinculativo. 0 sitio de vinculação FcyRI (Leu-Leu-Gly-Gly; resíduos de aminoácidos 38 a 41 da SEQ ID NO: 6, que correspondem às posições do índice UE 234 a 237) foi transformado para Ala-Glu-Gly-Ala para reduzir o FcyRIvinculativo (ver, por exemplo, Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Baum et al. EMBO J. 13:3992 (1994)). Iniciadores de oligonucleotideos 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (SEQ ID NO: 9) e 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ ID NO: 10) foram utilizados para introduzir a mutação. Para um volume final de 50 μΐ foi adicionado 570 ng de IgFc modelo, 5 μΐ de lOx Pfu de tampão de reacção (Stratagene) , 8 μΐ de 1,25 mM de dNTPs, 31 μΐ de água destilada, 2 μΐ de 20 mM de iniciadores de oligonucleotideos. Igual volume de óleo mineral foi adicionado e a reação foi aquecida a 94°C por 1 minuto. A polimerase Pfu (2,5 unidades, Stratagene) foi adicionada seguida por 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, seguido de uma extensão de 7 minutos a 72°C. Os produtos da reacção foram fraccionados por eletroforese, e a banda correspondente ao tamanho previsto de cerca de 676 pares de base foi detectada. Esta banda foi excisada do gel e recuperada através de um Kit de extracção de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. A PCR também foi usada para introduzir uma mutação da Ala para Ser (residuos de aminoácidos 134 de SEQ ID NO: 6, que corresponde à posição do índice UE 330) e Pro para Ser (resíduos de aminoácidos 135 de SEQ ID NO: 6, que corresponde a posição do índice UE 331) para reduzir a 114 ligação do complemento Clq ou fixação de complemento (Duncan e Winter, Nature 332:788 (1988)). As duas primeiras reacções foram realizadas utilizando o lado vinculativo FcyRI da sequência IgFc mutada como um modelo. Para um volume final de 50 μΐ foi adicionado 1 μΐ de sitio de ligação transformado FcyRI de modelo IgFc, 5 μΐ de lOx Pfu de tampão de reacção (Stratagene), 8 μΐ de 1,25 mM de dNTPs, 31 μΐ de de água destilada, 2 μΐ de 20 mM 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC 3 ' (SEQ ID NO: 11), um iniciador 5' começando no nucleotideo 36 de SEQ ID NO: 5, e 2 μΐ de 20 mM 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEQ ID NO: 12), um iniciador 3' começando no complemento de nucleotideo 405 da SEQ ID NO: 5. A segunda reacção continha 2 μΐ cada uma das 20 mM unidades de iniciadores de oligonucleotideos 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' (SEQ ID NO: 13), um iniciador 5' começando no nucleotideo 388, SEQ ID NO: 5 e 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3 ' (SEQ ID NO: 14), um iniciador 3', para introduzir a Ala para a mutação de Ser, sitio de restrição Xba e códon de paragem. Igual volume de óleo mineral foi adicionado e as reacções foram aquecidas a 94 °C por 1 minuto. Foi adicionada Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene) seguido por 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos, seguidos de uma extensão de 7 minutos a 72°C. Os produtos da reacção foram fraccionados por eletroforese, e as bandas correspondentes ao tamanho previsto, cerca de 370 e cerca de 395 pares de bases, respectivamente, foram detectadas. As bandas foram excisados do gel e extraídos usando um Kit de extracção de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) , de acordo com as instruções do fabricante. 115
Uma segunda rodada da reacção foi realizada para juntar os fragmentos acima e adicionada a um sitio de restrição 5 ' Bam Hl e uma sequência de sinal da imunoglobulina humana JBL 2’CL da região de cadeia pesada variável (Cogne et al., Eur. J. Immunol. 18:1485 (1988)). Para um volume final de 50μ1 foi adicionado 30 μΐ de água destilada, 8 μΐ de 1,25 mM de dNTPs, 5 μΐ de lOx Pfu de tampão de reacção de polimerase (Stratagene) e 1 μΐ de cada um dos dois primeiros produtos de PCR. Igual volume de óleo mineral foi adicionado e a reação foi aquecida a 94°C por 1 minuto. Foi adicionada Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene) seguido por 5 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72 °C por 2 minutos. A temperatura foi novamente levada a 94 °C e 2 μΐ de cada uma das 20 mM unidades de 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ ID NO: 14), um iniciador 5' começando no nucleotideo 1 da SEQ ID NO: 5 e 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ ID NO: 10) foram adicionados seguido por 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 2 minutos, e uma extensão final de 7 minutos a 72°C. Uma parte da reacção foi visualizada por eletroforese em gel. A banda de 789 pares de bases do tamanho correspondente previsto foi detectada. B. Construção do Vector de Expressão TACI-FC4
Plasmideos de expressão compreende uma região que codifica para a proteína de fusão TACI-FC4 foram construídos através de recombinação homóloga em levedura. Um fragmento TACI de ADN foi isolado por PCR, que incluiu a sequência de nucleótidos a partir de nucleotideo 14 para nucleotideo 475 116 da SEQ ID NO: 1. Os dois iniciadores utilizados na produção do fragmento TACI foram: (1) um iniciador contendo 40 pares de base da sequência de acompanhamento do vector 5' e 17 pares de base correspondente ao terminal amino do fragmento TACI (5' CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG 3 SEQ ID NO: 15); (2) 40 pares de base da extremidade 3' correspondente à sequência de acompanhamento Fc4 e 17 pares de base correspondentes ao terminal carboxila do fragmento TACI (5 'GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3 SEQ ID NO: 16) . Para um volume final de 100 μΐ foi adicionado 10 ng do modelo TACI, 10 μΐ de lOx Taq de tampão de reacção de polimerase (Perkin Elmer), 8 μΐ de 2,5 nM dNTPs, 78 μΐ de água destilada, 2 μΐ de cada uma das 20 mM unidades de iniciadores de oligonucleotideos, e Taq polimerase (2,5 unidades, Life Technology). Igual volume de óleo mineral foi adicionado e a reacção foi aquecida a 94°C por 2 minutos, seguido de 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 65°C por 30 segundos, 65°C por 30 segundos, 72°C para 1 minuto, seguido por uma extensão de 5 minutos a 72°C. O fragmento contendo cADN codificando o fragmento Fc4 foi construído de uma maneira similar. Os dois iniciadores utilizados na produção do fragmento Fc4 foram (a montante e a jusante), um iniciador oligonucleotídeo contendo 40 pares de base da sequência de acompanhamento TACI 5' e 17 pares de base correspondentes ao terminal amino do fragmento FC4 (5' GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3 SEQ ID NO: 17) e um oligonucleotídeo contendo 40 pares de base da extremidade 3' correspondente à sequência de vectores de acompanhamento e 17 pares de base correspondente ao terminal carboxila do fragmento Fc4 117 (5' GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3 SEQ ID NO: 18). Para um volume final de 100 μΐ foi adicionado 10 ng do modelo Fc4 descrito acima, 10 μΐ lOx Taq de tampão de reacção de polimerase (Perkin Elmer), 8 μΐ de 2,5 nM dNTPs, 78 μΐ de água destilada, 2 μΐ de cada uma das 20 mM unidades de oligonucleotideos e Taq polimerase (2,5 unidades, Life Technology). Igual volume de óleo mineral foi adicionado e a reacção foi aquecida a 94°C por 2 minutos, 25 ciclos a 94°C por 30 segundos, 65°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, seguido de uma extensão de 5 minutos a 72°C.
Dez microlitros de cada uma das 100 μΐ de reacções PCR acima descritas foram executados num 0,8% LMP de gel de agarose (Seaplaque GTG) com lx TBE tampão para análise. Os restantes 90 μΐ de cada reacção de PCR foi precipitado com a adição de 5 de 1 M de cloreto de sódio e 250 μΐ de etanol absoluto. O plasmideo pZMP6 foi clivado com Smal para o linearizar no poli-ligante. O plasmideo pZMP6 foi derivado do plasmideo pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC # 98668) e é um vector de expressão de mamífero contendo uma cassete de expressão com o promotor de citomegalovírus de inicio imediato, um intron de consenso da região variável do locus da cadeia pesada de imunoglobulina do rato, vários sítios de restrição para a inserção de sequências de codificação, um códon de paragem e um terminador da hormona de crescimento humano. O plasmideo também tem uma origem de replicação E. coli, uma unidade de expressão de marcador de mamífero seleccionável tendo um promotor SV40, um potenciador e origem de replicação, um gene de diidrofolato redutase e o terminador SV40. O vector pZMP6 foi construído a partir do pCZRl99 118 pela substituição do promotor de metalotioneína com o promotor citomegalovírus de inicio imediato, e as sequências Kozac na extremidade 5' do quadro de leitura aberta.
Cem microlitros de células de levedura (S. cerevisiae) foram combinados com 10 μΐ contendo cerca de 1 pg do dominio extracelular TACI e os fragmentos FC4 PCR, e 100 ng de Sma I digerido do vector ρΖΜΡβ e transferido para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm. A levedura/misturas de ADN foram electropulsadas em 0,75 kV (5 kV/cm) , °°ohms, 25 pF. A cada cubeta foi adicionado 600 pl de 1,2 M de sorbitol e a levedura foi semeada em duas aliquotas de 300 pl para placas URA-D e incubada a 30°C.
Após cerca de 48 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa foi ressuspenso em 1 ml de água e girada rapidamente para sedimentar as células de levedura. O sedimento celular foi ressuspenso em 1 ml de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0,1 mM EDTA). Quinhentos microlitros da mistura de lise foi adicionada a um tubo Eppendorf contendo 300 pl de esferas de vidro ácido lavadas e 200 pl de fenol-clorofórmio, centrifugadas por 1 minuto de intervalo por duas ou três vezes, seguido de uma agitação por 5 minutos numa centrifugadora Eppendorf na velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foram transferidos para um novo tubo e o ADN precipitado com 600 pl de etanol, seguido por centrifugação durante 10 minutos a 4°C. O sedimento de ADN foi ressuspenso em 100 pl de água. 119 A transformação de células de E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) foi realizada com 0,5-2 prep ml de ADN de levedura e 40 μΐ de células DH10B. As células foram electropulseadas a 2,0 kV, 25 MF e 400 ohms. Na sequência de electroporação, 1 ml de SOC (2% Bacto-Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% de extrato de levedura (Difco), 10 mM de NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04 20 mM de glicose) foram semeadas em aliquotas de 250 μΐ em quatro placas LB AMP (caldo LB (Lennox) , 1,8% Bacto-Agar (Difco), 100 mg/L de Ampicilina).
Clones individuais arigando a expressão correcta para construir TACI-Fc4 foram identificados por restrição de digestão para verificar a presença da inserção e para confirmar que as diversas sequências de ADN foram juntas correctamente umas às outras. A inserção de clones positivos foi submetida à análise de sequência. ADN plasmidial em larga escala é isolado usando o kit Qiagen Maxi (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. C. Construção de FC5f o FC6 e FC7
Em FC5, o resíduo de Arg na posição do índice UE 218 foi alterado novamente para um resíduo Lys. A Ig γΐ humana de tipo selvagem contém uma lisina nesta posição. Resumidamente, as moléculas de ácido nucleico codificando Fc5 foram produzidas usando os iniciadores de oligonucleotídeos 5'. 120 GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA 3' (SEQ ID NO: 19) e 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO: 20). As condições de amplificação de PCR foram as seguintes. Para um volume final de 50 μΐ foi adicionado 236 ng do modelo FC4, 5 μΐ de 10 Pfu do tampão de reacção (Stratagene), 4 μΐ de 2,5 mM de dNTPs, 1 μΐ de 20 μΜ de cada um dos oligonucleotídeos, e 1 μΐ de Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico de amplificação consistiu em 94°C por 2 minutos, 5 ciclos de 94°C por 15 segundos, 42°C por 20 segundos, 72°C durante 45 segundos, 20 ciclos a 94°C por 15 segundos, 72°C para 1 minuto e 20 segundos, seguido por uma extensão de 7 minutos a 72°C. O produto da reacção foi fraccionado por eletroforese em gel, e a banda correspondente ao tamanho previsto de cerca de 718 pares de base foi detectada. A banda foi excisada do gel e recuperada através de um Kit de extracção de gel QIAGEN QiaQuick (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. FC6 é idêntico ao Fc5 excepto que o códon de lisina carboxila terminal foi eliminado. Como no FC4 e FC5 acima, o códon de paragem na sequência Fc6 foi mudado para TAA. O Fc6 foi gerado a partir do modelo de ADN que codifica Fc5 usando iniciadores de oligonucleotídeos 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEQ ID NO: 19) e 5'GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGG GAGAGGC 3' (SEQ ID NO: 21) . O FC7 é idêntico ao γΐ Fc do tipo selvagem excepto para uma substituição de aminoácido na posição índice da UE Asn 297 localizado no domínio C H2. O Asn 297 foi transformado 121 para um resíduo Gin para impedir a fixação do carboidrato N-ligante nessa posição de resíduo. Como acima, o códon de paragem na sequência Fc7 foi mudado para TAA. 0 Fc7 foi gerado pela sobreposição de PCR usando um IgCyl· Fc cADN humano de tipo selvagem como modelo e os iniciadores de oligonucleotídeos 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEQ ID NO: 22) e 5' GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3' (SEQ ID NO: 23) para gerar a metade 5' do Fc7 e iniciadores de oligonucleotídeos 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3' (SEQ ID NO: 24) e 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3'(SEQ ID NO: 20) para gerar a metade 3' do Fc7. Os dois produtos de PCR foram combinados e amplificados utilizando iniciadoresde de oligonucleotídeos 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEQ ID NO: 22) e 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID NO: 20).
Todos os produtos resultantes da PCR foram purificados em gel, clonados e verificados pela análise da sequência do ADN. D. Construção de Proteínas de Fusão Amino-truncadas TACI-Fc
Quatro versões de terminais amino truncadas da TACI-Fc foram geradas. Todos os quatro tiveram um activador de sequência do sinal de tecido humano plasminogénio (SEQ ID NO: 25) fundido aos resíduos de aminoácidos número 30 de SEQ ID NO: 2. No entanto, as quatro proteínas diferem na localização do ponto em que o Fc5 foi fundido com a 122 sequência de aminoácidos TACI de SEQ ID NO: 2. A Tabela 3 apresenta as estruturas das quatro proteínas de fusão.
Tabela 3
Proteínas de Fusão TACI Designação de TACI-Fc Resíduos de aminoácidos TACI TACI(dl — 2 9)-Fc5 30 a 154 da SEQ ID NO: 2 TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5 30 a 106 da SEQ ID NO: 2 TACI(dl — 29, dlll-154)Fc5 30 a 110 da SEQ ID NO: 2 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 30 a 119 da SEQ ID NO: 2
As proteínas codificando cassetes de expressão foram geradas pela sobreposição de PCR usando técnicas padrão (ver, por exemplo, Horton et al., Gene 77:61 (1989)). Uma molécula de ácido nucléico codificando TACI e uma molécula de ácido nucléico codificando Fc5 foram usadas como modelos PCR. Os iniciadores de oligonucleotídeos são identificados nas Tabelas 4 e 5.
Tabela 4
Iniciadores de Oligonucleotídeos Usados para Produzir Proteínas de Fusão TACI Designação de TACI-Fc Designações de Oligonucleotídeos 5' TACI 3' TACI 5' Fc5 3' Fc5 TACI(dl-29)-Fc5 ZC24,903 ZC24,955 ZC24,952 ZC24,946 TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5 ZC24,903 ZC24,951 ZC24,949 ZC24,946 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 ZC24,903 ZC28,978 ZC28,979 ZC24,946 TACI(dl-29, dl20-154)Fc5 ZC24,903 ZC28,981 ZC28,980 ZC24,946 123
Tabela 5
Sequências de Oligonucleotideos Iniciador Sequência de Oligonucleotideo SEQ ID NO. ZC24,903 5'TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3' 40 ZC24,955 5'TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3' 41 ZC24,952 5'TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3' 42 ZC24,946 5'TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' 20 ZC24,951 5'TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3' 43 ZC24,949 5'ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3' 44 ZC28,978 5'TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3' 45 ZC28,979 5'CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 46 ZC28,981 5'TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3' 47 ZC28,980 5'GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 48 A primeira ronda de amplificações de PCR consistiu em duas reacções para cada um das quatro versões truncadas dos terminais amino. As duas reações foram realizadas separadamente, usando oligonucleotideos TACI 5' e 3' numa reacção, e os oligonucleotideos Fc5 5' e 3' em outra reacção para cada versão. As condições da primeira ronda de amplificação PCR foram como segue. Para um volume final de 25 μΐ foram adicionados aproximadamente 200 ng do modelo de ADN, 2,5 μΐ ΙΟχ Pfu de tampão de reacção (Stratagene), 2 μΐ de 2,5 mM dNTPs, 0,5 μΐ de 20 mM de cada oligonucleotideo 5' e 3', e 0,5 μΐ Pfu Polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico de amplificação consistiu em 94°C por 3 minutos, 35 ciclos de 94°C por 15 segundos, 50°C por 15 segundos, 72°C por 2 minutos, seguido por uma extensão de 2 minutos a 72°C. Os produtos da reacção foram fraccionados por eletroforese em gel, e as bandas correspondentes aos tamanhos previstos foram excisados do 124 gel e recuperados usando um Kit de extracção em gel QIAGEN QiaQuick, de acordo com as instruções do fabricante. A segunda ronda de amplificação por PCR, ou sobreposição da reacção de amplificação PCR, foi realizada por meio dos fragmentos de gel purificado da primeira ronda PCR do ADN modelo. As condições da segunda ronda de amplificação da PCR foram como segue. Para um volume final de 25 μΐ foram adicionados aproximadamente 10 ng de modelo de ADN de cada um dos fragmentos TACI e o fragmento Fc5, 2,5 μΐ lOx Pfu de tampão de reacção (Stratagene) , 2 μΐ de 2,5 mM dNTPs, 0,5 μΐ de 20 mM cada ZC24,903 (SEQ ID NO: 40) e ZC24,946 (SEQ ID NO: 20) e 0,5 μΐ Pfu Polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico de amplificação consistiu em 94°C por 1 minuto, 35 ciclos de 94°C por 15 segundos, 55°C por 15 segundos, 72°C por 2 minutos, seguido por uma extensão de 2 minutos a 72°C. Os produtos da reacção foram fraccionados por eletroforese em gel, e as bandas correspondentes aos tamanhos previstos foram excisadas do gel e recuperadas usando um Kit de extracção em gel QIAGEN QiaQuick (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.
Cada uma das quatro versões truncadas dos produtos do terminal amino TACI-Fc de PCR foi clonada separadamente usando o kit de clonagem ZEROBLUNT TOPO PCR Invitrogen seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A Tabela 6 identifica o nucleotideo e a sequência de aminoácidos destas construções TACI-Fc. 125
Tabela 6
Variantes das sequências TACI-Fc Designação de TACI-Fc SEQ ID Nos. Nucleotideo Aminoácido TACI(dl-29)-Fc5 49 50 TACI(dl —2 9, dl07-154)-Fc5 51 52 TACI(dl —2 9, dll-154)-Fc5 53 54 TACI(dl —2 9, dl20-154)-Fc5 55 56
Após serem verificadas as sequências de nucleotideos, os plasmideos compreendendo cada uma das quatro versões das fusões do terminal amino truncado TACI-Fc foram digeridos com Fsel e ASCI para libertar o aminoácido codificando os segmentos. Os fragmentos Fsel - Asei foram ligados num vector de expressão de mamíferos contendo um promotor CMV e um segmento poli A SV40. Os vectores de expressão foram introduzidos em células de ovário de hamster chinês como descrito abaixo. EXEMPLO 2 126
Produção de proteínas TACI-Fc por células de ovário de hamster chinês
As construções de expressão TACI-Fc foram utilizadas para transfecção, através da electroporação, células DG44 da suspensão adaptada do ovário de hamster chinês (CHO) cultivadas em proteina animal de meio livre (Urlaub et al. Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)). Às células CHO DG44 falta um gene funcional redutase dihydrofolate devido a exclusões em ambas as localizações cromossómicas dihydrofolate redutase. 0 crescimento das células na presença de concentrações crescentes de metotrexato resulta na amplificação do gene dihydrofolate redutase e a proteína ligada recombinante codificando o gene da construção da expressão.
As células CHO DG44 foram passadas em meio PFCHO (JRH Biosciences, Lawrence, KS) , 4 mM L-Glutamina (JRH Biosciences) e lx de suplemento hipotanxina-timidina (Life Technologies), e foram incubadas a 37°C e 5% CO2 em frascos de agitação Corning a 120 RPM numa plataforma agitadora rotativa. As células foram transfectadas separadamente com os plasmídeos de expressão linearizada. Para garantir a esterilidade, foi realizada uma etapa de precipitação única de etanol em gelo por 25 minutos através da combinação de 200 yg de ADN plasmidial num tubo Eppendorf com 20 μΐ de transportador de ADN de esperma de salmão (5'-*3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml) , 22 μΐ de 3M NaOAc (pH 5,2), e 484 μΐ de etanol a 100% (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Após a incubação, o tubo foi centrifugado a 14.000 RPM numa microcentrifugadora colocada num ambiente de 4°C, 127 o sobrenadante foi removido e o sedimento lavado duas vezes com 0,5 ml de etanol a 70% e permitido secar ao ar.
As células CHO DG44 foram preparadas enquanto o sedimento de ADN foi seco por centrifugação de 106 células totais (16,5 ml) num tubo de centrifugação cónico de 25 ml de capacidade a 900 RPM por 5 minutos. As células CHO DG44 foram ressuspensas num volume total de 300 μΐ de meio de crescimento PFCHO, e colocadas num Gene-Pulser Cuvette com uma lacuna de eléctrodo de 0,4 cm (Bio-Rad) . O ADN, após aproximadamente 50 minutos de tempo de secagem, foi ressuspenso em 500 μΐ de meio de crescimento PFCHO e adicionado às células na cubeta de modo a que o volume total não exceda 800 μΐ e permitido ficar à temperatura ambiente por 5 minutos para diminuir a formação de bolhas. A cubeta foi colocada numa unidade Pulser Gene BioRad II fixada em 0,296 kv (quilovolts) e de 0,950 HC (alta capacidade) e electroporada imediatamente.
As células foram incubadas 5 minutos em temperatura ambiente antes da colocação em 20 ml de volume total de meio de PFCHO num balão T-75 CoStar. O balão foi colocado a 37°C e 5% de CO2 por 48 horas, quando as células foram contadas por hemocitómetro utilizando exclusão de azul de tripano e colocadas em meios de selecção PFCHO sem suplemento hipotanxina-timidina e contendo 200 mM de metotrexato (Cal Biochem). 128
Após a recuperação do processo de selecção de metotrexato, o meio condicionado contendo as proteínas secretadas TACI Fc foi examinado por análise de Western Blot. EXEMPLO 3
Análise Estrutural de Proteínas TACI-Fc
Em certos casos, as proteínas de fusão TACI-Fc foram parcialmente purificadas antes da análise. 0 meio condicionado de culturas de ovário de hamster chinês foi filtrado de um modo estéril através de um filtro de 0,22 ym e a proteína TACI-Fc foi capturada numa coluna de proteína A. O material de ligação da proteína A foi eluído e passou por uma coluna de exclusão de tamanho S-200 para a purificação final. A análise de Western blot foi realizada em ambos os meios de células condicionadas e proteína purificada para avaliar a estabilidade estrutural das proteínas TACI-Fc. Resumidamente, as proteínas ou amostras de sobrenadante foram transferidas para membranas de nitrocelulose e as proteínas TACI-Fc foram detectadas utilizando peroxidase conjugada com IgG2a de cabra anti-rato (Boehringer 129
Mannheim), ou peroxidase conjugada com IgG Fc de cabra anti-humano específica (Pierce).
As análises do terminal amino das sequências de aminoácidos foram realizadas em modelos de Protein Sequencer Systems 4 76A e 494 da Perkin Elmer Applied Biosystems Division (Foster City, CA). A análise dos dados foi realizada com o Applied Biosystems Model 610A Data Analysis System for Protein Sequencing, versão 2.1a (Applied Biosystems, Inc.). A maioria das fontes e dos reagentes utilizados eram da Applied Biosystems, Inc. EXEMPLO 4
Análise Funcional de Proteínas TACI Fc
Duas abordagens foram usadas para examinar as características da ligação de quatro proteínas TACI-Fc com ZTNF4. Uma abordagem mediu a capacidade das construções TACI-Fc para competir com placas revestidas TACI para ligação de 125I marcado ZTNF4. Na segunda abordagem, concentrações crescentes de 125I marcado ZTNF4 foram incubadas com cada um das construções TACI-Fc, e a radioactividade associada com os complexos precipitados ZTNF4-TACI-Fc foi determinada. As proteínas de fusão TACI-Fc tinham metades TACI a que faltaram os primeiros 29 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Uma das proteínas de fusão teve uma fracçâo TACI com uma região de pedúnculo intacta (TACI (dl-29)-FC5) enquanto que três das proteínas de fusão TACI-Fc tinham 130 metades TACI com supressões diversas na região de pedúnculo (TACI (dl—29 , dl07-154)-FC5; TACI (dl-29, dlll -154)-FC5; TACI (dl-29, dl20-154)-FC5). A. Ensaio de Ligação Competitivo 0 ZTNF4 foi radiodinatado com Iodobeads (Pierce), seguindo métodos padrão. Resumidamente, 50 pg do ZTNF4 foi iodado com 4 mCi de 125I, utilizando uma Iodobead único. A reacção foi saciada com uma solução 0,25% de albumina de soro bovino, e o 125I livre foi removido por filtração em gel com uma coluna PD-10 (Pierce). A radioactividade especifica ds preparações de 125I ZTNF4 foi determinada pela precipitação de ácido tricloroacético antes e após a etapa de dessalinização.
Um fragmento do N-terminal do receptor TACI, designado como "TACI-N," foi acrescentado a placas de 96 poços (100 μΐ de a 0,1 pg/ml) e incubadas durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas, bloqueadas com Superblock (Pierce), e lavadas novamente. As construções TACI-Fc, em várias concentrações que variam de 0-11,5 ng/ml, foram misturadas com uma concentração fixa de 125I-ZTNF4 (20 ng/ml), e incubadas por 2 horas a 37°C na placa revestida com TACI-N. Os controlos continham quer TACI-N na solução, ou falta de TACI-Fc. Após a incubação, as placas foram lavadas e contadas. Cada determinação foi realizada em triplicado. 131
Os resultados mostraram que todos as construções TACI-Fc inibiram a ligação de I125 ZTNF4 completamente em concentrações de cerca de 100 ng/ml ou maiores. As proteínas TACI-Fc, TACI (dl-29)-FC5 TACI (dl — 29, dlll -154)-FC5, e TACI (dl—29, dl20-154)-FC5, foram inibidores mais eficazes do que os da construção TACI-Fc, TACI (dl-29, dl07-154)-FC5. Um fragmento Fc sozinho não inibiu a ligação. Valores de IC50 foram calculados para cada construção, em três experiências. Os valores médios para as construções foram: TACI (dl-29)-FC5: 2,07 nM; TACI (dl-29, dl07-154)-FC5: 4,95 nM; TACI (d-129, dlll-154) Fc5: 2,31 nm e TACI (dl-29, dl20 -154)-FC5: 2,21 nM. B.Ensaio de solução de ligação A uma concentração de 0,05 nM, cada construção TACI-Fc foi incubada com 0,4 pM a 1,5 nM 125I ZTNF4 por 30 minutos em temperatura ambiente, num volume total de 0,25 ml/tubo. A suspensão Pansorbin (Staph A) foi adicionada a cada tubo, e depois de 15 minutos, as amostras foram centrifugadas, lavadas duas vezes, e as pelotas contadas. A ligação não específica foi determinada pela adição de 130 nM de ZTNF4 não marcado à mistura 125I-ZTNF4/TACI-Fc. A ligação específica foi calculada subtraindo-se a ligação cpm na presença de ZTNF4 não marcado do cpm total ligado a cada concentração de 125I ZINF4. Cada determinação foi realizada 132 em triplicado. Constantes de vinculação foram calculadas utilizando o software GraphPad Prism (Macintosh v. 3,0). A Figura 4 ilustra a ligação especifica de 125I-ZTNF4 às várias construções TACI-Fc. A ligação parece aproximar-se da saturação de cada construção, e foi significativamente maior para construções TACI (dl-29)-FC5, TACI (dl—29, dlll-154)-FC5, TACI (dl-29, dl20-154)-FC5, em comparação com a ligação da TACI (dl-29, dl07-154)-FC5. Os valores Bmax e Kd foram calculados, e os resultados são resumidos na Tabela 7.
Tabela 7
Ligação de J"^:>I-ZTNF4 a Construções TACI-Fc ConstruçãoTACI-Fc Kd (nM) Bmax (M) TACI(dl-29)-Fc5 0.134 0.023 TACI(dl-29, dl07-154)Fc5 0.121 0.010 TACI(dl-29, dlll-154)Fc5 0.115 0.018 TACI(dl-29, dl20-154)Fc5 0.092 0.021 EXEMPLO 5
Medição de ZTNF2 circulante
Os niveis de ZTNF4 em indivíduos com uma condição da doença (como lúpus, artrite reumatóide, por exemplo) em relação aos indivíduos normais foram determinados através de um ensaio de eletroquimioluminescência. Uma curva padrão preparada a partir de ZTNF4 humano solúvel a 10 ng/ml, 1 133 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml foi preparada em tampão ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD) . As amostras de soro foram diluídas em tampão ORIGIN. Os padrões e as amostras foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas com anticorpo biotinilatado de coelho anti-humano ZTNF4 -NF BV diluído a 1 yg/ml em tampão de ensaio Origin (IGEN) e anticorpo policlonal rutinilatado de coelho anti-humano ZTNF4-NF BV diluído para 1 yg/ml no tampão de ensaio Origin (IGEN). Após a incubação, as amostras foram centrifugadas e foi adicionado 0,4 mg/ml de estreptavidina Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) a cada um dos padrões e amostras a 50 μΐ/tubo e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram então centrifugadas e lidas num Analisador Origin (Igen) de acordo com instruções do fabricante. O ensaio Origin é baseado em eletroquimioluminescência e produz uma leitura no ECL. Num estudo, um nível elevado de ZTNF4 foi detectado em amostras de soro de ambos os ratos NZBWFl/J, e MRL/ Mpj-Faslpr, que evoluíram para estágios avançados de glomerulonefrite e doença auto-imune. A ensaio ORIGIN também foi usado para medir os níveis de ZTNF4 no sangue de pacientes com LES, em relação aos níveis circulantes em indivíduos normais. Uma curva padrão preparada a partir de ZTNF4 humano solúvel a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml foi preparada em tampão ORIGIN (Igen). Todas as amostras foram realizadas em triplicado, com um volume final de 25 μΐ. Os padrões e as amostras foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas com um anticorpo de captura, um anticorpo policlonal biotinilatado de coelho anti-humano ZTNF4-NF BV onal, diluído a 1 yg/ml no tampão de ensaio Origin (IGEN) e 134 um anticorpo de detecção, um anticorpo policlonal rutinilatado de coelho anti-humano ZTNF4-NF BV, diluído a 1 yg/ml no tampão de ensaio Origin (IGEN). Após a incubação, as amostras foram centrifugadas, e foi adicionado 0,4 mg/ml de estreptavidina Dynabeads (Dynal) a cada um dos padrões e das amostras a 50 μΐ/tubo e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram então centrifugadas e analisadas usando um analizador Origin 1,5 (Igen) de acordo com instruções do fabricante.
Este ensaio contou com 28 amostras de controlo normal e amostras de 20 pacientes com diagnóstico de LES. Níveis elevados de ZTNF4 foram observados no soro de pacientes com diagnóstico de LES, quando comparados com o soro de doadores normais. Os níveis de ZTNF4 foram calculados como uma vez de aumento dos níveis de ZTNF4 no paciente ou amostras de controlo, em comparação com uma amostra de soro humano de referência arbitrário. A média das 28 amostras de controlo foi de 1,36 vezes mais do que a amostra de referência humana e à média das 20 amostras de pacientes com LES foi 4,92. Sete dos 20 pacientes com LES tinham níveis ZTNF4 que foram duas vezes maiores do que a média das amostras de controlo, enquanto houve apenas um indivíduo que tinha um controle maior do que duas vezes sobre o nível médio de controlo.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 135 <11 0» ZymoGenetk», ínc, «120» TACI-s^munc-gltibulsi íuisién Proíssis
<130.> 01-23 PC «1S0> 60/293,343 «161 >2001-05-24 'U'.C> m <170» PssíSSQ k? WVxtows Vision 3.0
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<2 Π >251 <‘212> PRT <213» ArSSiclííl Ssif|Ufíf'ftí <400> 23
Het 1 Lys His Leu Trp c Phe Phe Leu Leu teu 1 n Vai Ala Ala Pro Arg l:£ Trp 1 Vai Leu Ser Glu D Pro Arg Ser Ser Asp ly lys Thr His Thr Cys £0 Pro Prõ 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Sly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 35 40 45 Pro Lys Pro lys Asp Thr Leu Het íle Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 50 55 60 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn 65 70 75 80 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 85 90 95 Glu Slu Sln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai ISO 105 110 Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys Glu Tyr lys Cys tys Vai Ser 115 120 125 152
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys 130 135 140 Êly Sln Pro Arg 61 u Pro 61o Vai Tyr Thr Leu Pro Pm Ser Arg Asp 145 , ISO 155 160 61 u Leu thr Lys Asrt 61 n Vai Ser Leu Thr Cys Léu Vai Lys Gly Phe 165 170 175
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 61n Pro Glu 100 1,85 190
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 195 1 500 205
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 61 n Gin Gly 210 215 220
Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai ftet His Glu Ala Leu His Asn Hls Tyr 225 230 235 ’ 24Ô
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<211> 762 <Zí2> DMA <21 â» ArSfteial Ssqusnce :220:- <22â> Merfiffad iRWRjiiogSobsárs moisty. c22l>CDS <222» i7},MWi <400> 30 48 96 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc etc ctg ctg gtg gcg gct ccc Het Lys His leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aga tct tca gae aaa act cac aca tgc Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp lys Thr His Thr Cys 15 20 25 39 cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ! ggg gca ccg tca gtc ttc ctc Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Gk í Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu 35 40 45 ‘ ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc ; 3:¾ ate tcc cgg acc cct gag 144 153 192
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c2íg>PRT <21S» Articlal Ssquence <4C0> 33 157
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<211> 759 «212» DMA «215» Ál&ial Sequem» <22Q> «223* Modifietí iRWtíísagfsbaifi imíety.
«221» CDS «222» <400» 34 158 48 ggatcc atg aag cac ctg tgg tte tte ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc Het Lys His Leu Trp Phe Phe Leu teu Leu Vai AU Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc 95 Ary Trp Vai Leu Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg 9ca ccg tea gtc ttc ctc 144 Pro Pro Cys Pro 35 Pro Glu AU Glu Gly 4Θ Ala Pro Ser Vai Phe 46 Leu ttc ecc cca aaa ccc aag gac àcc ctc atg ate tcc -cós acc cct gag 192 Phe Pro Pro lys Pm Lys Asp Thr Leu Het lie Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Hl s Glu Âsp Pro Glu Vai Lys 65 * 70 7$ fctç aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Rhe Aso Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn-AU: Lys Thr Lys 80 85 90 ccc cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 Pro Arg 81 u Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu 95 100 186 110 ace gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 128 125 gtc tcç aaç aaa gcc ctç cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Vai Ser Asn Lys AU Léu Pro Ser Ser 11 e Glu Lys Thr IU Ser Lys 130 135 140 gtc aaa 999 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 159
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Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160:
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Claims (32)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e ligante interactor de ciclofilina e proteína de fusão de imunoglobulina (TACI) para a fabricação de um medicamento para inibir a proliferação de células tumorais, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste de uma sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptor TACI liga pelo menos um dos ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina.
  2. 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, onde o medicamento compreende a proteína de fusão de imunoglobulina TACI e um veículo farmaceuticamente aceitável, e onde a composição farmacêutica é para a administração a um sujeito mamífero, que tem um tumor.
  3. 3. Uso de acordo com a reivindicação 2, para inibir a proliferação de linfócitos B no mamífero.
  4. 4. Uso de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um ligante interactor de ciclofilina e uma proteína de fusão de imunoglobulina (TACI) para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença 1 auto-imune, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptor TACI liga pelo menos um dos ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina.
  5. 5. Uso de acordo com a reivindicação 4, onde a dita doença auto-imune é seleccionada do grupo consistindo em lúpus eritematoso sistémico, miastenia gravis, esclerose múltipla, diabetes mellitus insulino-dependente, doença de Crohn, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil poliarticular e artrite psoriática.
  6. 6. Uso de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um ligante interactor de ciclofilina e uma proteína de fusão de imunoglobulina (TACI) para a fabricação de um medicamento para tratar a asma, bronquite ou enfisema, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor taci que consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e 2 (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptor TACI liga pelo menos um dos ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina.
  7. 7. Uso de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um ligante interactor de ciclofilina e uma proteína de fusão de imunoglobulina (TACI) para a fabricação de um medicamento para tratar a doença renal, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptor TACI liga pelo menos um dos ZTNF2 ou ZTNF4 e; (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina.
  8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 7, onde a dita doença renal é seleccionada do grupo consistindo em insuficiência renal, glomerulonefrite, vasculite, nefrite, amiloidose e pielonefrite.
  9. 9. Uso de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um ligante interactor de ciclofilina e uma proteína de fusão de imunoglobulina (TACI) para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou 3 desordem associada a imunossupressão, a rejeição do enxerto, doença do enxerto contra hospedeiro, inflamação, dor nas articulações, inchaço, anemia e choque séptico, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptore TACI liga pelo menos um dos ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina.
  10. 10. Uso de um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um ligante interactor de ciclofilina e uma proteína de fusão de imunoglobulina (TACI) para a fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio seleccionado de neoplasia, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiplo, linfoma não-Hodgkin, doença linfoproliferativa pós-transplante e gamopatia de cadeia de luz, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI compreende: (a) uma molécula de receptor TACI que consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptor TACI liga pelo menos um da 4 os ZTNF2 ou ZTNF4; e (b) uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma região constante de uma imunoglobulina.
  11. 11. Uso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a molécula do receptor taci consiste de resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2, e em que a proteína de fusão inclui ainda um segmento de pedúnculo composto de uma série contínua de 2 a 50 resíduos de aminoácidos consecutivos a partir do resíduo de aminoácidos 105 de SEQ ID NO: 2.
  12. 12. Uso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a molécula de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada.
  13. 13. Uso de acordo com a reivindicação 12, onde a molécula de imunoglobulina humana compreende uma cadeia pesada região constante.
  14. 14. Uso de acordo com a reivindicação 13, onde a região constante de cadeia pesada é uma região constante de igGl de cadeia pesada.
  15. 15. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que a molécula de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende domínios CH2 e CH3.
  16. 16. Uso de acordo com a reivindicação 15, onde a molécula de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. 5
  17. 17. Uso de acordo com a reivindicação 16, onde a proteina de fusão de imunoglobulina TACI compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.
  18. 18. Uso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a proteina de fusão de imunoglobulina TACI é um dimero.
  19. 19. Uso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, onde o medicamento é para administração a células cultivadas in vitro.
  20. 20. Proteina de fusão que compreende: (a) um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um receptor de ligante interactor de ciclofilina (TACI), em, que a metade do receptor (TACI) consiste numa sequência de aminoácidos seleccionada de: (i) residuos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; (ii) resíduos de aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e (iii) resíduos de aminoácidos 30 a 154 da SEQ ID NO: 2; onde a metade do receptor TACI liga pelo menos um dos ZTNF2 OU ZTNF4; e (b) uma molécula de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina.
  21. 21. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 20, em que a metade do receptor TACI consiste em resíduos de aminoácidos 34 a 104 da SEQ ID NO: 2, e 6 em que a proteína de fusão inclui ainda um segmento de pedúnculo composto de uma série contínua de 2 a 50 resíduos de aminoácidos consecutivos a partir do resíduo de aminoácido 105 da SEQ ID NO: 2.
  22. 22. Proteína de fusão de acordo com as reivindicações 20 ou 21, em que a molécula de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada.
  23. 23. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 22, onde a molécula de imunoglobulina compreende uma região constante de cadeia pesada humana.
  24. 24. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 23, onde a região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgGl de cadeia pesada.
  25. 25. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 24, onde a molécula de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl que compreende domínios CH2 e CH3.
  26. 26. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 25, onde a molécula de imunoglobulina é um fragmento Fc de IgGl compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33.
  27. 27. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 26, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI tem uma sequência de aminoácidos que constituem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. 7
  28. 28. Proteína de fusão i de acordo com qualquer das reivindicações 20-27, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI é um dímero.
  29. 29. Molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 20-28.
  30. 30. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 29, onde a molécula de ácido nucléico tem uma sequência de nucleotideos compreendendo a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 53.
  31. 31. Composição farmacêutica, compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável e um activador transmembrana e um modulador de cálcio e um ligante interactor de ciclofilina e uma proteína de fusão de imunoglobulina (TACI), em que a proteína de fusão de imunoglobulina TACI tem uma sequência de aminoácidos que constituem a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.
  32. 32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31, onde a proteína de fusão de imunoglobulina TACI é um dímero. 8
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Families Citing this family (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US6969519B2 (en) 2000-03-10 2005-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods of using an agonistic antibody human tumor necrosis factor receptor (TR17)
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
KR101155294B1 (ko) * 2000-06-16 2013-03-07 캠브리지 안티바디 테크놀로지 리미티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
ATE451390T1 (de) 2000-08-18 2009-12-15 Dyax Corp Polypeptide zur bindung an das b-lymphozyten- stimulatorische protein (blys)
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
ATE542545T1 (de) * 2001-05-24 2012-02-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
CA2446734A1 (en) 2001-05-24 2002-11-28 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against tumor necrosis factor delta (april)
HUP0500992A3 (en) * 2001-08-03 2007-11-28 Genentech Inc Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
US7112410B1 (en) 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
US7256015B2 (en) * 2001-09-21 2007-08-14 Amgen Inc. TALL-1 receptor molecules and uses thereof
EP1495055B1 (en) * 2002-04-18 2013-08-14 Genencor International, Inc. Production of functional antibodies in filamentous fungi
US7262025B2 (en) * 2002-06-18 2007-08-28 Zymogenetics, Inc. Hybrid vector having a cytomegalovirus enhancer and myeloproliferative sarcoma virus promoter
JP2006502715A (ja) * 2002-10-11 2006-01-26 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ホモ３量体融合タンパク質の製造
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
US7381794B2 (en) 2004-03-08 2008-06-03 Zymogenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
ES2426005T3 (es) 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ565511A (en) 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
AR059025A1 (es) * 2005-08-09 2008-03-12 Zymogenetics Inc Metodos para el tratamiento y prevencion de proliferacion de celulas anormales utilizando moleculas de fusion taci
JP2009507777A (ja) * 2005-08-09 2009-02-26 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ＴＡＣＩ−Ｉｇ融合分子を用いたＢ細胞性腫瘍の処置方法
WO2007019618A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Garvan Institute Of Medical Research Phrophylactic and/or therapeutic method for treatment of autoimmune disease
EA015860B1 (ru) 2005-10-13 2011-12-30 Хьюман Дженом Сайенсиз, Инк. Способы лечения аутоиммунных заболеваний при использовании антагониста нейтрокина-альфа
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
CN105001320A (zh) 2005-11-23 2015-10-28 阿塞勒隆制药公司 Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
CA2629306A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
JP2009525765A (ja) * 2006-02-10 2009-07-16 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 切断型のｉｌ−１７ｒａ可溶性受容体および炎症において使用する方法
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
EA015342B1 (ru) * 2006-05-15 2011-06-30 Арес Трейдинг С.А. Способы лечения аутоиммунных заболеваний с использованием слитой молекулы taci-ig
EP2054441A1 (en) * 2006-08-25 2009-05-06 Zymogenetics, Inc. Soluble il-27 receptor
JP2010501622A (ja) * 2006-08-28 2010-01-21 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｃ−融合タンパク質の精製法
PL2061803T5 (pl) * 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
CN101541825B (zh) * 2006-08-28 2013-08-14 阿雷斯贸易股份有限公司 Fc融合蛋白的纯化方法
BRPI0716382B8 (pt) * 2006-08-28 2021-05-25 Ares Trading Sa método para reduzir o teor de porções de fc livres em um fluido compreendendo uma proteína contendo fc, e uso de cromatografia de troca catiônica
AU2007357448B2 (en) * 2006-09-18 2012-09-06 Compugen Ltd Bioactive peptides and method of using same
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EP2121931B1 (en) * 2007-01-26 2011-05-11 Merck Serono S.A. Purification of fc-tact fusion proteins using the oilbody technology
CN101835485B (zh) 2007-02-01 2016-10-26 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途
TW202021980A (zh) 2007-02-02 2020-06-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
ME02333B (me) 2007-02-09 2013-04-30 Acceleron Pharma Inc FARMACEUTSKE SMEŠE KOJE SADRŽE AKTIVIN-ActRIIA ANTAGONISTE I NJIHOVA UPOTREBA U PREVENCIJI ILI LEČENJU MULTIPLOG MIJELOMA
ES2422479T3 (es) * 2007-03-27 2013-09-11 Zymogenetics Inc Combinación de inhibición de BLyS y micofenolato de mofetilo para tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
JP2010537623A (ja) * 2007-03-27 2010-12-09 クリストファー ホーヴェンス 前立腺癌を治療する方法及び組成物
CN101323643B (zh) 2007-06-15 2010-12-01 烟台荣昌生物工程有限公司 优化的TACI-Fc融合蛋白
EP2190469B1 (en) 2007-09-04 2015-02-25 Compugen Ltd. Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
CN101861161B (zh) 2007-09-18 2017-04-19 阿塞勒隆制药公司 活化素‑actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
AU2008312406B2 (en) * 2007-10-16 2014-03-06 Ares Trading S.A. Combination of BLyS inhibition and anti-CD 20 agents for treatment of autoimmune disease
PT2219675E (pt) 2007-11-12 2013-11-18 Ares Trading Sa Formulações para proteínas de fusão de taci-imunoglobulina
WO2009062916A1 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 Ares Trading S.A. Taci-immunoglobulin fusion proteins for treatment of optic neuritis
EP2219673A1 (en) * 2007-11-12 2010-08-25 Ares Trading S.A. Taci-immunoglobulin fusion proteins for treatment of relapsing multiple sclerosis
ES2572231T3 (es) 2007-12-07 2016-05-30 Zymogenetics Inc Anticuerpos monoclonales anti-IL-21 humana
WO2009093246A2 (en) * 2008-01-22 2009-07-30 Compugen Ltd. Novel clusterin derived peptide
CA2720682A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Zymogenetics, Inc. Levels of bcma protein expression on b cells and use in diagnostic methods
US8003335B2 (en) 2008-04-30 2011-08-23 Universite Paris-SUD11 Levels of APRIL in serum and use in diagnostic methods
PL2291657T3 (pl) 2008-05-01 2016-09-30 Stężenie heterotrimerów blys/april w surowicy oraz zastosowanie w sposobach diagnostycznych
EP2313105B1 (en) 2008-06-27 2013-07-24 ZymoGenetics, Inc. SOLUBLE HYBRID Fc gamma RECEPTORS AND RELATED METHODS
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI748373B (zh) 2008-08-14 2021-12-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 使用gdf阱以增加紅血球水平
EP2343080B1 (en) 2008-09-30 2017-11-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING BONE DISEASES WHICH COMPRISES PROTEIN COMPRISING Frizzled1, Frizzled2 OR Frizzled7 EXTRACELLULAR CYSTEINE-RICH DOMAIN AND Fc PROTEIN
US20110311450A1 (en) 2008-12-08 2011-12-22 Zurit Levine Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
WO2010096394A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
US8338377B2 (en) * 2009-03-30 2012-12-25 Acceleron Pharma Inc. BMP-ALK3 antagonists and uses for promoting bone growth
MX2011013172A (es) 2009-06-08 2012-04-02 Acceleron Pharma Inc Metodos para aumentar adipocitos termogenicos.
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
IN2012DN03025A (pt) 2009-09-09 2015-07-31 Ct Se Llc
DK2498799T3 (en) 2009-11-13 2016-12-05 Five Prime Therapeutics Inc Use of the FGFR1 ECD proteins for the treatment of cancer diseases characterized by ligand dependent activating mutations in FGFR2
EP3332796A1 (en) 2009-11-17 2018-06-13 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
EP2507265B1 (en) 2009-12-01 2016-05-11 Compugen Ltd. Antibody specific for heparanase splice variant T5 and its use.
WO2011102845A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion protein compositions and methods of use
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
EP2552947A4 (en) 2010-03-26 2013-11-13 Dartmouth College VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
RU2626537C2 (ru) 2010-06-08 2017-07-28 Дженентек, Инк. Полученные с помощью генной инженерии антитела с цистеиновыми заменами и их конъюгаты
BR112012031329A2 (pt) 2010-06-09 2016-10-11 Zymogenetics Inc proteínas de fusão diméricas vstm3 e composições e métodos relacionados
US20130189268A1 (en) 2010-06-22 2013-07-25 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
WO2016030888A1 (en) 2014-08-26 2016-03-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of autoimmune disorders
WO2012001647A2 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders
ES2719624T3 (es) 2010-09-23 2019-07-11 Prec Biologics Inc Peptidomiméticos de cáncer de colon y de páncreas
US20120258496A1 (en) * 2010-09-27 2012-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Production of low fucose antibodies in h4-ii-e rat cells
CN103298832A (zh) 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途
US8481038B2 (en) 2010-11-15 2013-07-09 Five Prime Therapeutics, Inc. Treatment of cancer with elevated dosages of soluble FGFR1 fusion proteins
ES2544608T3 (es) 2010-11-17 2015-09-02 Genentech, Inc. Conjugados de anticuerpo y de alaninil-maitansinol
EP2643016A2 (en) 2010-11-23 2013-10-02 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-il-6 antibodies for the treatment of anemia
US8951972B2 (en) 2010-12-09 2015-02-10 Five Prime Therapeutics, Inc. FGFR1 extracellular domain combination therapies for lung cancer
WO2012090150A2 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Compugen Ltd New cell-penetrating peptides and uses thereof
JP6162606B2 (ja) 2011-01-14 2017-07-12 レッドウッド バイオサイエンス， インコーポレイテッド アルデヒド−タグ付き免疫グロブリンポリペプチド及びその使用方法
CN102085367B (zh) * 2011-01-19 2012-08-22 烟台荣昌生物工程有限公司 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用
SG194099A1 (en) 2011-04-15 2013-11-29 Compugen Ltd Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof for treatment of immune related disorders and cancer
WO2012155019A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
AU2012260601B2 (en) 2011-05-25 2018-02-01 Innate Pharma, S.A. Anti-KIR antibodies for the treatment of inflammatory disorders
WO2013001517A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof for treatment of autoimmune disorders and infection
EP2750713B1 (en) 2011-10-14 2015-09-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10016484B2 (en) 2011-11-14 2018-07-10 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating lung cancer
SG2014008304A (en) 2012-02-01 2014-06-27 Compugen Ltd C10rf32 antibodies, and uses thereof for treatment of cancer
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
WO2013192504A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 The Trustees Of Dartmouth College Novel vista-ig constructs and the use of vista-ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CA2884704C (en) 2012-09-07 2023-04-04 Randolph J. Noelle Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN105102068B (zh) 2012-10-12 2018-06-01 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗体结合物
MX364329B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
AU2013328628B2 (en) 2012-10-12 2016-12-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-anti-CD22 antibody conjugates
ES2660029T3 (es) 2012-10-12 2018-03-20 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
PL2906253T3 (pl) 2012-10-12 2019-02-28 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało anty-psma
KR101819404B1 (ko) 2012-10-12 2018-02-28 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
CA2890217C (en) 2012-11-02 2021-07-20 Yifu FANG Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
CN103833856B (zh) * 2012-11-22 2017-05-03 上海康岱生物医药技术股份有限公司 抑制taci‑baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
CA2894959C (en) 2012-12-21 2022-01-11 Spirogen Sarl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
BR112015023070B1 (pt) 2013-03-13 2022-06-07 Genentech, Inc. Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica que compreende os mesmo, bem como seus usos para o tratamento de uma doença proliferativa
KR102066318B1 (ko) 2013-03-13 2020-01-14 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
BR112016002829A2 (pt) 2013-08-12 2017-09-19 Genentech Inc Composto e processo para preparar o composto de conjugado anticorpo-¿droga, composição farmacêutica, método de tratamento do câncer, kit para o tratamento do câncer, intermediário ligante¿-droga, porção e composto de porção droga de dímero cbi
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX371092B (es) 2013-12-16 2020-01-16 Genentech Inc Compuestos peptidomimeticos y conjugados de anticuerpo-farmaco de los mismos.
KR20160092024A (ko) 2013-12-16 2016-08-03 제넨테크, 인크. 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법
EA201691023A1 (ru) 2013-12-16 2016-10-31 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антитела с лекарственным средством
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
CN106661107B (zh) 2013-12-24 2021-12-24 杨森制药公司 抗vista抗体及片段
WO2015191881A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Green Kathy A Use of vista agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
EP3154566B1 (en) 2014-06-13 2022-08-03 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for the treatment or prevention of a cutaneous ulcer in a subject that has anemia
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
US10149913B2 (en) 2014-09-12 2018-12-11 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2015317653A1 (en) 2014-09-17 2017-04-06 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
JP6656243B2 (ja) 2014-10-28 2020-03-04 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 細胞表面での非共有結合Ｆｃドメイン含有タンパク質ディスプレイの方法及びそのスクリーニング方法
EP3215531A1 (en) 2014-11-03 2017-09-13 Merck Patent GmbH Methods for generating bispecific shark variable antibody domains and use thereof
CN107148285B (zh) 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
EP4233889A3 (en) 2014-12-03 2023-10-11 Celgene Corporation Activin-actrii antagonists and uses for treating myelodysplastic syndrome
CN107206101B (zh) 2014-12-03 2021-06-25 基因泰克公司 季铵化合物及其抗体-药物缀合物
CN107405398A (zh) 2014-12-05 2017-11-28 伊穆奈克斯特股份有限公司 鉴定vsig8作为推定vista受体及其用以产生vista/vsig8激动剂和拮抗剂的用途
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
DK3313882T3 (da) 2015-06-24 2020-05-11 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-VISTA antistoffer og fragmenter
US11130818B2 (en) 2015-08-07 2021-09-28 Merck Patent Gmbh Transglutamine tag for efficient site-specific bioconjugation
DK3328881T3 (da) 2015-09-08 2019-10-07 Theripion Inc Apoa-1 fusionspolypeptider og relaterede sammensætninger og fremgangsmåder
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CA3014013A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista (b7h5) antibodies
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
TWI770020B (zh) 2016-04-15 2022-07-11 丹麥商Ｈ朗德貝克公司 人類化抗pacap 抗體及其用途
CR20180537A (es) 2016-04-15 2019-03-04 Immunext Inc Anticuerpos vista antihumanos y su uso
WO2017189432A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
WO2018027042A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Bio-Techne Corporation Identification of vsig3/vista as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PL3544636T3 (pl) 2017-02-08 2021-12-06 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało
RS63502B1 (sr) 2017-04-18 2022-09-30 Medimmune Ltd Konjugati pirolobenzodiazepina
CA3057748A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
CN117683836A (zh) 2017-05-09 2024-03-12 辛利斯生物制药有限责任公司 用于修饰微囊藻毒素和节球藻毒素的方法
JP7265788B2 (ja) 2017-05-09 2023-04-27 シアノ バイオテック ゲーエムベーハー 修飾ミクロシスチンおよびノジュラリン
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
NZ761175A (en) 2017-08-18 2024-07-26 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
TW201920192A (zh) 2017-09-20 2019-06-01 韓商Ｐｈ製藥公司 泰蘭他汀（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ）類似物
CN111868082A (zh) 2018-02-02 2020-10-30 博奥泰克尼公司 调节vista和vsig3的相互作用的化合物及其制备和使用方法
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
CN114144436A (zh) 2019-07-24 2022-03-04 H.隆德贝克有限公司 抗mGluR5抗体及其用途
CA3131790A1 (en) * 2019-12-24 2021-07-01 Remegen Co., Ltd. Taci-fc fusion protein and use thereof
MX2022013998A (es) 2020-05-08 2023-02-16 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras inhibidoras de april y baff con y sin una proteina inhibidora de celulas t y metodos de uso de las mismas.
AU2021285813A1 (en) * 2020-06-02 2023-02-02 Ares Trading S.A. Methods related to the treatment of IGA nephropathy
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022178090A2 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Theripion, Inc. Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
US20240279310A1 (en) 2021-05-07 2024-08-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein
JP2024518410A (ja) 2021-05-07 2024-05-01 ビエラ バイオ インコーポレイテッド 重症筋無力症を治療するための抗ｃｄ１９抗体の使用
EP4296287A1 (en) * 2021-09-30 2023-12-27 RemeGen Co., Ltd. Method for treating sjogren's syndrome using taci-fc fusion protein
WO2023051798A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗il23抗体融合蛋白及用途
EP4442702A1 (en) * 2022-06-08 2024-10-09 RemeGen Co., Ltd. Method for treating myasthenia gravis with taci-fc fusion protein
TW202421653A (zh) * 2022-09-30 2024-06-01 大陸商榮昌生物製藥（煙臺）股份有限公司 用TACI-Fc融合蛋白治療膜性腎病的方法
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024114777A1 (zh) * 2022-12-02 2024-06-06 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 用TACI-Fc融合蛋白治疗微小病变型肾病的方法
WO2024123675A2 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Taci-fc fusion proteins for multifunctional inhibition of baff, april, and neonatal fc receptor
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US846A (en) 1838-07-17 Improvement in revolving fire-arms
US5738A (en) 1848-08-29 Francis kelsey
IE54046B1 (en) 1981-08-25 1989-05-24 Celltech Ltd Expression vectors
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4859587A (en) 1984-06-04 1989-08-22 Institut Merieux Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DE3578435D1 (de) 1984-12-06 1990-08-02 Labofina Sa Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
US4751181A (en) 1984-12-31 1988-06-14 Duke University Methods and compositions useful in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
US5861151A (en) * 1991-12-20 1999-01-19 Bristol-Myers Squibb Co Soluble fusion molecules with binding specificity for cell adhesion molecules
ZA932523B (en) * 1992-04-10 1994-10-08 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against cd33 related surface antigens
ZA932522B (en) * 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994009137A1 (en) 1992-10-15 1994-04-28 Genentech, Inc. Antibodies against type 2 tumor necrosis factor receptor
US5650550A (en) 1993-10-01 1997-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mutant mice having a deficit of functional estrogen receptors
US5523227A (en) 1994-06-17 1996-06-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univ. DNA encoding calcium-signal modulating cyclophilin ligand
ES2292172T3 (es) 1994-12-15 2008-03-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. Moduladores de la funcion de los receptores fas/apo1.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19533447C1 (de) 1995-09-09 1996-12-05 Bbs Kraftfahrzeugtechnik Verfahren und Vorrichtung zum Befüllen eines Gießwerkzeugs mit einer Metallschmelze
EP0889966A1 (en) 1995-11-09 1999-01-13 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
JP2001501453A (ja) 1996-03-14 2001-02-06 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子δおよびε
WO1998002565A1 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. TRANSFORMATION OF $i(PICHIA METHANOLICA)
IL128072A0 (en) 1996-07-17 1999-11-30 Zymogenetics Inc Preparation of pichia methanolica auxotrophic mutants
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
JP2001503263A (ja) 1996-10-25 2001-03-13 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド ニュートロカインα
WO1998027114A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
DE69838061T2 (de) * 1997-04-18 2008-03-13 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Typ ii tgf-beta receptor/immunoglobulin konstante domäne fusionsproteine
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
JP2002504818A (ja) 1997-06-06 2002-02-12 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド リガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
WO1999004001A1 (en) * 1997-07-21 1999-01-28 Zymogenetics, Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
TR200000669T2 (tr) 1997-09-12 2000-08-21 Apotech R & D Sa Büyüme etkinliğine sahip yeni bir protein-APRIL.
CZ303272B6 (cs) * 1999-01-07 2012-07-11 Zymogenetics, Inc. Farmaceutický prostredek obsahující fúzní protein, izolovaná molekula polynukleotidu, expresní vektor, kultivovaná bunka, zpusob prípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid
US20060067933A1 (en) 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
EA006108B1 (ru) 1999-01-25 2005-08-25 Байоджен, Инк. Способы стимуляции и ингибирования роста в-клеток, продуцирования иммуноглобулинов и коррекции нарушений, связанных с baff-лигандом, у животного
WO2000062790A2 (en) 1999-04-19 2000-10-26 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
BR0013391A (pt) 1999-08-17 2002-07-09 Biogen Inc Uso do receptor baff (bcma) como um agente imunoregulador
WO2001021631A2 (en) * 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
DE60028830T2 (de) 2000-02-16 2007-01-18 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-april antikörper und hybridomazellen
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
ES2271004T3 (es) * 2000-04-27 2007-04-16 Biogen Idec Ma Inc. Uso de taci como agente antitumoral.
DE60128216T2 (de) * 2000-05-12 2008-01-10 Amgen Inc., Thousand Oaks Polypeptide zum Hemmen der April-vermittelten Proliferation von B- und T- Zellen
DE60142239D1 (de) 2000-08-11 2010-07-08 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd DEN PHOSPHORSÄURE-METABOLISMUS, DEN KALZIUM-METABOLISMUS, VERKALKUNG UND DEN VITAMIN D-METABOLISMUS KONTROLLIERENDE POLYPEPTIDE SOWIE FüR DIESE KODIERENDE DNA-MOLEKÜLE
CA2428242A1 (en) 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
CA2438682A1 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
ATE542545T1 (de) 2001-05-24 2012-02-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
PT2219675E (pt) 2007-11-12 2013-11-18 Ares Trading Sa Formulações para proteínas de fusão de taci-imunoglobulina

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EA200301146A2 (ru) 2004-06-24

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