UA82830C2

UA82830C2 - Taci-immunoglobulin fused protein

Info

Publication number: UA82830C2
Application number: UA20031110605A
Authority: UA
Inventors: Jane A Gross
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2008-05-26
Also published as: EP1436003A2; NO20035173L; JP2009232856A; DK2116259T3; AU2002305646C1; HRP20030948A2; EA200301146A3; US20100183609A1; EA007275B1; US9346878B2; CN1612750A; US20110229473A1; IL158920A0; WO2002094852A2; MXPA03010687A; SI2116259T1; DK1436003T3; US20090209006A1; US20100129384A1; NO337295B1

Description

Даний винахід відноситься до поліпшених злитих білків, що включають частку рецептора фактора пухлинного некрозу та імуноглобулінову частку. Зокрема, даний винахід стосується поліпшених злитих білків

ТАСІ-імуноглобулін.

Цитокіни - це невеликі розчинні білки, які є посередниками багатьох біологічних дій, в тому числі регулювання росту та диференціювання багатьох типів клітин І(див., наприклад, Агаї еї а)І., Аппи.Кеу.Віоспет. 59:783 (1990); Мо5тапп, Сигт. Оріп. Іттипої. 3:311 (1991); Раш апа Зедег, Сеї! 76:241 (1994)). Білки, які складають групу цитокінів, включають інтерлейкіни, інтерферони, колонієстимулюючі фактори, фактори пухлинного некрозу та інші регуляторні молекули. Наприклад, інтерлейкін-17 людини - це цитокін, який стимулює експресію інтерлейкіну-6б, молекули 1 внутрішньоклітинної адгезії, інтерлейкіну-8, колонієстимулючого фактора макрофага гранулоциту та експресію простагландину та відіграє певну роль у селективному дозріванні кровотворних попередників СОЗ4ж у нейтрофіли (Мао еї аї.,». Іттипої. 155:5483 (1995); Бозвіє? єї аї, У. Ехр. Мед. 183:2593 (1996)|.

Рецептори, які зв'язують цитокіни, складаються, як правило, з одного або більше інтегральних мембранних білків, які зв'язують високоафінний цитокін і трансдукують цей акт зв'язування до клітин через цитоплазматичні ділянки конкретних субодиниць рецептора. Рецептори цитокіну було згруповано в декілька класів на основі подібності їхніх позаклітинних доменів зв'язування ліганду. Наприклад, ланцюги рецептора, які відповідають за зв'язування та/або трансдукцію ефекту інтерферонів, є членами сімейства рецепторів цитокіну типу ІЇ, яке базується на позаклітинному домені з характерним залишком 200.

Клітинні взаємодії, які відбуваються під час імунної реакції, регулюються членами декількох сімейств рецепторів клітинних поверхонь, в тому числі сімейства рецептора фактора пухлинного некрозу (РФПН).

Сімейство РФПН складається з ряду інтегральних мембранних глікопротеїдних рецепторів, багато з яких, у поєднанні з їх відповідними лігандами, регулюють взаємодії між різними послідовностями поколінь кровотворних клітин Ідив., наприклад, Созтап, 5іет Сеї5 12:440 (1994); УМазапі еї аІ., СуюКкіпе Огоулп Расіог

Нем. 10:15 (1999); Меп еї аї., Іттипо! Нему. 169:283 (1999); Ідгівв апа Маївтіїй, Місго5с. Нев5. Тесп. 50:184 (20003).

Одним таким рецептором є ТАСІ, трансмембранний активатор та САМІ--інтерактор (моп Впом/ апа Вгат,

Зсіепсе 228:138 (1997); Вгат апа моп Виїом, 05 Раїепі Мо. 5969102 (1999)). ТАСІ є зв'язаним з мембраною рецептором, який має позаклітинний домен, що містить два збагачені цистеїном псевдо-повтори, трансмембранний домен та цитоплазматичний домен, який взаємодіє з САМІ. (кальцій-модулятор та циклофіліновий ліганд), інтегральний мембранний білок, розташований у внутрішньоклітинних везикулах, який є ко-індуктором МЕ-АТ активації при надекспресії у клітинах дигкаї. ТАСІ є асоційованим з В-клітинами та субпопуляцією Т-клітин. Нуклеотидні послідовності, що кодують ТАСІ та його відповідну амінокислотну послідовність, позначені в даному описі ЗЕО ІЮ МОБ: 1 і 2, відповідно.

Рецептор ТАСІ зв'язує два члени сімейства лігандів фактора пухлинного некрозу (ФПН). Окремо один ліганд позначено як 2ТМЕ4, "ВАРЕ", "нейтрокін-о", "Віув", "ТАС -1" ї "-«НАМК" (Ти еї аІ., международная заявка

МеУУО98/18921 (1998), Мооге еї аїЇ., зсіепсе 285:269 (1999); МиКпорааднуау еї аї., У. Віої. Снет. 274:15978 (1999); Зсппеїдег еї аї, У. Ехр. Мей. 189:1747 (1999); Зпи еї аї., У.ГеиКос. Віо!. 65:680 (1999)). Амінокислотна послідовність 2ТМЕ4 позначена як 5ЕО ІО МО:3. Інший ліганд позначили як "7ТМЕ2", "АРІ" і "смертельний ліганд-ї ТМАЕ" |Нанпе еї аї., У. Ехр. Мей 188:1185 (1998); КеїПу єї аї., Сапсег Нез. 601021 (2000)|.

Амінокислотна послідовність 7ТМЕ2 позначена як 5ЕО ІО МО:4. Обидва ліганди також зв'язані рецептором дозрівання В-клітин (ВСМА) (Ого55 еї аІ. Майиге 404:995 (2000))|. Нуклеотидна та амінокислотна послідовності

ВСМА позначені як ЗЕО ІЮ МО:26 і 5ЕО ІО МО: 27, відповідно.

Виявлена іп мімо активність рецепторів фактора пухлинного некрозу ілюструє клінічний потенціал розчинних форм цього рецептора. Розчинні форми рецептора ТАСІ генерували у вигляді злитих білків імуноглобуліну. Первинні варіанти дали в результаті гетерогенний білок з низькою експресією. Гетерогенність спостерігали на амінокінці ТАСІ, на Ес-карбоксильному кінці та в області стебла ТАСІ. Тому існує потреба у створенні фармацевтично корисних композицій рецептора ТАСІ.

Даний винахід пропонує поліпшені злиті білки ТАСІ-імуноглобулін, прийнятні як терапевтичні препарати.

Стислий опис графічних матеріалів

Фіг.1 - амінокислотна послідовність ТАСІ людини. Розташування збагачених цистеїном псевдо-повторів показано затемненням, трансмембранний домен обведено рамкою, а стебло позначено знаками х. фіг.2 - схематична діаграма імуноглобуліну підкласу досі. Сі - константна зона легкого ланцюга; Сни, Снг,

Снз - константні зони важкого ланцюга; МІ - варіабельна зона легкого ланцюга; Мп - варіабельна зона важкого ланцюга; СНО - карбогідрат; М - амінокінець; С - карбоксильний кінець.

Фіг.зА, ЗВ, ЗС і 30 показують порівняння Рс-амінокислотної послідовності людської константної зони у дикого типу з варіантами Рс-488, ЕРс4, Рс5, Рсб, Ес7 і Рс8. Домен Сні константної зони у! людини не є частиною

Ес і тому не показаний. Показано розташування шарнірної зони, доменів Снг і Снз. Позначені також цистеїнові залишки, нормально включені до дисульфідного зв'язку з константною зоною легкого ланцюга (ІС) і константною зоною важкого ланцюга (НС). Символ "-" означає ідентичність дикому типу в цій позиції, а символ "яхх" вказує положення карбоксильних кінців і демонструє відмінність карбоксильного кінця Есб від інших варіантів Ес. Розташування амінокислот позначені позиціями індексу ЄЮ. фіг.4 показує конкретний зв'язок 125І1-2ТМЕ4 з різними структурними компонентами ТАСІ-Ес. Злиті білки

ТАСІ-Рс мали частини ТАСІ, в яких не вистачало перших 29 амінокислотних залишків амінокислотної послідовності БЕО ІЮ МО:2. Один із злитих білків мав частину ТАСІ з інтактним стеблом (ТАСІ(а1-29)-Ес5), тоді як три злиті білки ТАСІ-Рс мали частини ТАСІ з різними делеціями в стеблі (ТАСІ(а1-29, а107-154)-Ес5;

ТАСЦа1-29, а111-154)-Рс5; ТАСЦа1-29, а120-154)-Ес5). Деталі експериментів описані в Прикладі 4.

Як описано нижче, даний винахід пропонує злиті білки трансмембранний активатор і кальцій-модулятор та циклофіліновий ліганд-інтерактор (ТАСІ)-імуноглобулін і спосіб використання злитих білків ТАСІ-імуноглобулін.

Наприклад, даний винахід пропонує способи інгібування проліферації пухлинних клітин, який передбачає введення в ці пухлинні клітини композиції, яка містить злитий білой ТАСІ-імуноглобулін. Таку композицію можна вводити в клітини, культивовані іп міго. З іншого боку, згадана композиція може бути терапевтичною композицією, яка містить фармацевтично прийнятний носій і злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, і цю фармацевтичну композицію можна вводити суб'єкту, який має пухлину. Таким суб'єктом може бути ссавець.

Введення такої фармацевтичної композиції може інгібувати, наприклад, проліферацію В-лімфоцитів у ссавця.

Даний винахід також пропонує способи інгібування активності 2ТМЕ4 у ссавця, які передбачають введення ссавцю композиції, що містить ТАСІ-імуноглобулін. Активність 2ТМЕ4 може бути пов'язана з різними хворобами та порушеннями. Наприклад, фармацевтичну композицію, що містить злитий білок ТАСІ- імуноглобулін, можна застосовувати для лікування аутоїмунної хвороби, наприклад системного червоного вовчака, міастенії гравіс, розсіяного склерозу, інсулінозалежного цукрового діабету, хвороби Крона, ревматоїдного артриту, багатосуглобного підліткового ревматоїдного артриту і псоріатичного артриту. Як варіант, фармацевтичну композицію, що містить ТАСІ-імуноглобулін, можна застосовувати для лікування таких захворювань, як астма, бронхіт, емфізема та ниркова недостатність в кінцевій стадії. Фармацевтичну композицію, що містить ТАСІ-імуноглобулін, можна також використовувати для лікування хвороб нирок, наприклад гломерулонефриту васкуліту, нефриту, амілоїдозу та пієлонефриту, або такого захворювання, як неоплазма, хронічний лімфолейкоз, множинна мієлома, лімфома не Ходжкіна, посттрансплантаційна лімфопроліферація і гаммапатія легкого ланцюга. В певних випадках активність 7ТМЕ4 може бути пов'язана з

Т-клітинами. Фармацевтичну композицію, яка містить ТАСІ-імуноглобулін, можна також використовувати для лікування хвороб або порушень, пов'язаних з імуносупресією, відторгненням трансплантата, реакцією "трансплантат проти хазяїна" та запаленням. Наприклад, фармацевтичну композицію, що містить ТАСІ- імуноглобулін, можна використовувати для зменшення запалення і лікування таких захворювань, як суглобний біль, здуття, анемія та септичний шок.

Даний винахід також пропонує способи зниження циркулюючих рівнів 2ТМЕ4 в крові ссавця, які передбачають введення ссавцю фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятний носій і злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, при цьому введення такої фармацевтичної композиції знижує циркулюючий рівень 2ТМНА4 в крові ссавця. Наприклад, введення такої фармацевтичної композиції може знизити циркулюючі рівні 7ТМРЕ4 в крові принаймні на 1095, принаймні на 2095, принаймні на 10-6095, принаймні на 20-5095 або принаймні на 30-4095 порівняно з рівнем 2ТМН4 в крові перед уведенням згаданої фармацевтичної композиції.

Фахівці в цій галузі можуть виміряти циркулюючі рівні 2ТМЕ4. Ілюстративні способи описані в Прикладах 4 і 5.

Як описано нижче, ілюстративні злиті білки ТАСІ-імуноглобулін включають: а) частину рецептора ТАСІ, яка складається з фрагмента поліпептиду, що має амінокислотну послідовність амінокислотних залишків 30-154 послідовності 5ХЕО ІО МО:2, причому ця частина рецептора

ТАСІ включає принаймні один з ї) амінокислотних залишків 34-66 послідовності ЗЕО ІО МО2 та ії) амінокислотних залишків 71-104 послідовності БЕО ІЮО МО:2, при цьому згадана частина рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з 2ТМЕ2 або 2ТМЕ4; і б) імуноглобулінову частину, яка містить константну зону імуноглобуліну. Відповідні частини рецептора

ТАСІ включають: поліпептиди, які містять амінокислотні залишки 34-66 послідовності 5ЕО ІЮО МО2 і амінокислотні залишки 71-104 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2; поліпептиди, які містять амінокислотні залишки 34- 104 послідовності ЗЕО ІО МО:2, поліпептиди, які містять амінокислотну послідовність амінокислотних залишків 30-110 послідовності ЗЕО ІО МО:2; і поліпептиди з послідовністю, яка складається з амінокислотних залишків 30-110 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2.

Імуноглобулінова частина злитого білка ТАСІ-імуноглобулін може включати константну зону важкого ланцюга, наприклад константну зону важкого ланцюга людини. Константна зона важкого ланцюга досі - це один приклад придатної константної зони важкого ланцюга. Показовою константною зоною важкого ланцюга

ІДСІ є Гс-фрагмент Ідсі, який включає домени Снг і Снз. Цей Ес-фрагмент Ід! може бути Рс-фрагментом ІдОІ дикого типу або мутованим Ес-фрагментом ІдсіІ, наприклад Ес-фрагментом, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО:33. Одним прикладом злитого білка ТАСІ-імуноглобулін є білок, що має амінокислотну послідовність, яка включає амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО:54.

Описані тут злиті білки ТАСІ-імуноглобулін можуть бути полімерами, наприклад димерами.

Даний винахід також пропонує молекули нуклеїнової кислоти, які кодують злитий білок ТАСІ- імуноглобулін. Показову нуклеотидну послідовність, яка кодує злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, позначено як

ЗЕО ІЮ МО:53.

Даний винахід також включає розчинні рецептори ТАСІ, які складаються з фрагмента поліпептиду, що має амінокислотну послідовність амінокислотних залишків 30-154 послідовності ЗЕБЕО ІО МО:2, при цьому розчинний рецептор ТАСІ містить принаймні один з ї) амінокислотних залишків 34-66 послідовності зЕО ІЮ

МО2 та ії) амінокислотних залишків 71-104 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2, причому розчинний рецептор ТАСІ зв'язує принаймні один з 7ТМЕ2 або 2ТМЕ4. Додаткові розчинні рецептори ТАСІ описуються тут як відповідні частини рецепторів ТАСІ для злитих білків ТАСІ-імуноглобулін. Більш того, розчинні рецептори ТАСІ можна використовувати в способах, описаних стосовно до злитих білків ТАСІ-імуноглобулін.

Ці та інші аспекти даного винаходу стануть очевидними з наступного детального опису та малюнків. Крім того, нижче розкрито ряд термінів.

В наведеному нижче описі використано ряд термінів. Для полегшення розуміння даного винаходу наведені наступні визначення.

Використаний тут термін "нуклеїнова кислота" або "молекула нуклеїнової кислоти" відноситься до полінуклеотидів, наприклад дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або рибонуклеїнової кислоти (РНК), олігонуклеотидів, фрагментів, генерованих ланцюговою реакцією полімерази (ЛРП), і фрагментів, генерованих будь-якою з дій: зшивання, розщеплення, дія ендонуклеази та дія екзонуклеази. Молекули нуклеїнової кислоти можуть складатися з мономерів, які є нуклеотидами, що зустрічаються у природі (наприклад, ДНК і РНК), або аналогами нуклеотидів, що зустрічаються у природі (наприклад, с-енантіомерні форми нуклеотидів, що зустрічаються у природі), або комбінацією обох. Модифіковані нуклеотиди можуть мати зсуви в цукрових частинах та/або частинах піримідинової або пуринової основи. Цукрові модифікації включають, наприклад,

заміщення однієї або більше гідроксильних груп галогенами, алкільними групами, амінами та азидогрупами, або цукри можна функціоналізувати як прості або складні ефіри. Більш того, всю цукрову частину можна замінити стерично або електронно подібними структурами, наприклад аза-цукрами та карбоциклічними аналогами цукру. Прикладами модифікацій в частині основи є алкіловані пурини та піримідини, ацильовані пурини або піримідини, або інші добре відомі гетероциклічні замісники. Мономери нуклеїнової кислоти можуть бути зв'язані фосфодіефірними зв'язками або аналогами таких зв'язків. Аналоги фосфодіефірних зв'язків включають фосфоротіоат, фосфородитіоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфоранілідат, фосфорамідат тощо. Термін "молекула нуклеїновой кислоти" також включає так звані "пептидні нуклеїнові кислоти", які містять ті основи нуклеїнової кислоти, що зустрічаються у природі, або модифіковані, які прикріплені до поліамідного скелету. Нуклеїнові кислоти можуть бути або одноланцюговими, або дволанцюговими.

Термін "комплемент молекули нуклеїнової кислоти" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що має комплементарну нуклеотидну послідовність і зворотну орієнтацію порівняно з контрольною нуклеотидною послідовністю. Наприклад, послідовність 5 АТОСАСОосо 3 (5БО ІО МО:57) є комплементарною до 5'

СССОатТасСАТ 3 (5ЕО ІЮ МО:58).

Термін "контиг" означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка має фрагмент секвенування ідентичної або комплементарної послідовності, суміжний з іншою молекулою нуклеїнової кислоти. Кажуть, що суміжні послідовності "перекривають" даний фрагмент секвенування молекули нуклеїнової кислоти.

Термін "вироджена нуклеотидна послідовність" означає послідовність нуклеотидів, яка включає один або більше вироджених кодонів порівняно з контрольною молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид.

Вироджені кодони містять різні триплети нуклеотидів, але кодують один і той самий амінокислотний залишок (тобто триплети САШ і САС, кожний, кодують Авр).

Термін "структурний ген" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка транскрибується в матричну

РНК (мРНК), яка потім транслюється у послідовність амінокислот, характерну для конкретного поліпептиду. "Виділена молекула нуклеїнової кислоти" - це молекула нуклеїнової кислоти, неінтегрована в геномній

ДНК організму. Наприклад, молекула ДНК, що кодує фактор росту, яку було відокремлено від геномної ДНК клітини, є виділеною молекулою ДНК. Інший приклад виділеної молекули нуклеїнової кислоти - хімічно синтезована молекула нуклеїнової кислоти, неінтегрована в геномі організму. Молекула нуклеїнової кислоти, яку було виділено з конкретного виду, є меншою, ніж повна молекула ДНК хромосоми з цього виду. "Структурний компонент молекули нуклеїнової кислоти" - це молекула нуклеїнової кислоти, одно- або дволанцюгова, яка була модифікована шляхом втручання людини, щоб вмістити сегменти нуклеїнової кислоти, скомбіновані і складені в порядку, не існуючому у природі. "Лінійна ДНК" означає молекули некільцевої ДНК, які мають вільні 5- і 3-кінці. Лінійну ДНК можна сформувати із молекул замкненої кільцевої ДНК, наприклад плазмід, шляхом ферментативного перетравлення або фізичного розриву. "Комплементарна ДНК (кКДНК)" - це молекула одноланцюгової ДНК, яка утворилася із матриці мРНК в результаті зворотної транскрипції ферменту. Як правило, для ініціювання зворотної транскрипції використовують праймер, комплементарний до ділянок мРНК. Фахівці також використовують термін "к«ДНК" для позначення молекули дволанцюгової ДНК, яка складається з такої молекули дволанцюгової ДНК і ланцюга її комплементарної ДНК. Термін "к«ДНК" також позначає клон молекули кДНК, синтезований з матриці

РНК. "Промотор" - це нуклеотидна послідовність, яка спрямовує транскрипцію структурного гена. Як правило, промотор знаходиться в некодуючій 5'-зоні гена, найближче до сайту ініціації транскрипції структурного гена.

Елементи послідовності в межах промоторів, які функціонують при ініціації транскрипції, часто характеризуються узгодженими нуклеотидними послідовностями. Такі елементи промоторів включають сайти зв'язування РНК-полімерази, послідовності ТАТА, послідовності СААТ, специфічні до диференціювання елементи (О5Е5; МесСепее еї аї., Мої. Епаосгіпої. 7:551 (1993)|, циклічні реагуючі на АМФ елементи (СКЕЗ5), елементи, реагуючі на сироватку (ЗКЕ5; Тгеізтап, Ззетіпагз5 іп Сапсег Віої. 7:47 (1990)), елементи, реагуючі на глюкокортикоїд (ЗКЕв5) і сайти зв'язування для інших факторів транскрипції, наприклад СКЕ/АТЕ (О"Кейу еї а, у. Віої. Спет. 267:19938 (1992)), АР2 (Ме еї аї., 9. Віої Спет. 269:25728 (1994))|, ЗР; білок, що зв'язує елемент, реагуючий на КАМФ |СКЕВ; І оеКеп, Сепе Ехрг. 3:253 (1993)| і октамерні фактори Ідив. Умаїзоп еї аї., едв., Моіесшіаг Віоюду ої Ше Сепе, 4" ей. (Тпе Вепіатіп/Ситтіпдв Рибіїзйіпд Сотрапу, Іпс. 19871, апа

Гетаїдге апа Коивззеац, Віоспет. У. 303 А (1994)Ї. Якщо промотором є індукований промотор, швидкість транскрипції зростає у відповідь на індукуючий агент. | навпаки, швидкість транскрипції не регулюється індукуючим агентом, якщо промотор є конститутивним. Відомі також промотори, що репресуються. "Кор-промотор" містить незамінні нуклеотидні послідовності для промоторної функції, в тому числі ТАТА- блок та ініціацію транскрипції. Згідно з цим визначенням кор-промотор може мати або не мати виявної активності за відсутності конкретних послідовностей, які можуть підсилювати цю активність або надавати тканині питомої активності. "Регуляторний елемент" - це нуклеотидна послідовність яка модулює активність кор-промотора.

Наприклад, регуляторний елемент може містити нуклеотидну послідовність, яка зв'язується з клітинними факторами, надаючи можливість транскрипції відбуватись виключно або вибірково в конкретних клітинах, тканинах або органелах. Ці типи регуляторних елементів, як правило, асоціюються з генами, які експресуються в "клітинно-специфічній", "тканино-специфічній" або "органело-специфічній" манері. "Енхансер" - тип регуляторного елемента, який може підсилювати ефективність транскрипції незалежно від відстані або орієнтації цього енхансера відносно сайту ініціації транскрипції. "Гетерологічна ДНК" відноситься до молекули ДНК або сукупності молекул ДНК, яка природно не існує всередині заданої клітини-хазяїна. Молекули ДНК, гетерологічні до конкретної клітини-хазяїна, можуть містити

ДНК, отриману з виду згаданої клітини-хазяїна (тобто ендогенну ДНК), поки та ДНК-хазяїн комбінується з ДНК, що не є хазяїном (тобто екзогенною ДНК). Наприклад, молекулу ДНК, яка містить сегмент ДНК-нехазяїна, що кодує поліпептид, функціонально зв'язаний з сегментом ДНК-хазяїна, який включає промотор транскрипції, вважають молекулою гетерологічної ДНК. І навпаки, молекула гетерологічної ДНК може включати ендогенний ген, функціонально зв'язаний з екзогенним промотором. Ще один приклад, молекулу ДНК, що містить ген, отриманий з клітини дикого типу, вважають гетерологічною ДНК, якщо цю молекулу ДНК вводять в клітину- мутант, якій не вистачає гена дикого типу. "Поліпептид" - це полімер амінокислотних залишків, з'єднаних пептидними зв'язками незалежно від того, створені вони природним шляхом чи штучно. Поліпептиди із менш ніж 10 амінокислотних залишків зазвичай називають "пептидами". "Білок" - це макромолекула, що включає один або більше поліпептидних ланцюгів. Білок може також включати непептидні компоненти, наприклад карбогідратні групи. Карбогідрати та інші непептидні замісники можуть додаватися до білка через клітину, в якій цей білок продукується, і будуть варіюватися в залежності від типу клітини. В даному описі білки визначено, виходячи з їх амінокислотних скелетних структур; замісники, наприклад карбогідратні групи, взагалі не визначені, але тим не менш можуть бути присутніми.

Пептид або поліпептид, кодований молекулою ДНК-нехазяїна, є гетерологічним пептидом або поліпептидом. "Інтегрований генетичний елемент" - це сегмент ДНК, який було включено в хромосому клітини-хазяїна, після чого цей елемент вводять в цю клітину шляхом маніпуляції людини. В межах даного винаходу інтегровані генетичні елементи найчастіше є отриманими з переведених в лінійну форму плазмід, уведених в ці клітини електропорацією або іншим методом. Інтегровані генетичні елементи пропускають від первинної клітини-хазяїна до її нащадка. "Клонуючий вектор" - це молекула нуклеїнової кислоти, наприклад плазміда, косміда або бактеріофаг, здатна до автономної реплікації в клітині-хазяїні. Клонуючі вектори, як правило, містять один сайт розпізнавання рестрикційних ендонуклеаз або невелику кількість таких сайтів, які дають можливість вводити молекули нуклеїнової кислоти методом, що піддається вимірюванню, без втрати незамінної біологічної функції цього вектора, а також нуклеотидні послідовності, що кодують маркерний ген, придатний для використання при ідентифікації та селекції клітин, трансформованих за допомогою цього клонуючого вектора. Маркерні гени зазвичай включають гени, які забезпечують стійкість до тетрацикліну або стійкість до ампіциліну. "Вектор експресії" - це молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує ген, експресований в клітині-хазяїні. Як правило, вектор експресії включає промотор транскрипції, ген і термінатор транскрипції. Експресію гена зазвичай віддають під контроль промотора, і про такий ген кажуть, що він "функціонально зв'язаний" з промотором. Аналогічним чином, функціонально зв'язаними є регуляторний елемент і кор-промотор, якщо цей регуляторний елемент модулює активність кор-промотора. "Рекомбінантний хазяїн" - це клітина, яка містить молекулу гетерологічної нуклеїнової кислоти, наприклад клонуючий вектор або вектор експресії. В даному контексті прикладом рекомбінантного хазяїна є клітина, яка продукує злитий білок ТАСІ-Ес із вектора експресії. "Інтегративні трансформанти" - це рекомбінантні клітини-хазяї, в яких гетерологічна ДНК інтегрувала в геномну ДНК цих клітин. "Злитий білок" - це гібридний білок, експресований молекулою нуклеїнової кислоти, який містить нуклеотидні послідовності принаймні двох генів. Нариклад, злитий білок ТАСІ-імуноглобулін містить частину рецептора ТАСІ та імуноглобулінову частину. В даному описі термін "частина рецептора ТАСІ" - це ділянка позаклітинного домену рецептора ТАСІ, яка зв'язує принаймні один з 72ТМЕ2 або 2ТМЕ4. Термін "Імуноглобулінова частина" відноситься до поліпептиду, який включає константну зону імуноглобуліну.

Наприклад, імуноглобулінова частина може включати константну зону важкого ланцюга. Термін злитий білок "ТАСІ-Ес" позначає злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, в якому імуноглобулінова частина включає константні зони, Снг І Снз, важкого ланцюга імуноглобуліну.

Термін "рецептор" означає клітинно-асоційований білок, який зв'язується з бідсзактивною молекулою, що називається "лігандом". Ця взаємодія опосередковує вплив ліганду на клітину. В контексті зв'язування рецептора ТАСІ термін "специфічно зв'язується" або "специфічне зв'язування" означає здатність ліганду конкурентно зв'язуватись з рецептором. Наприклад, 2ТМЕ4 специфічно зв'язується з рецептором ТАСІ, їі це можна показати шляхом спостерігання конкуренції для рецептора ТАСІ між виявно міченим 2ТМН4 і неміченим 7ТМЕ4.

Рецептори можуть бути мембранозв'язаними, цитозольними або нуклеарними; мономерними (наприклад, рецептор гормону, стимулюючого щитовидну залозу, бета-адренергічний рецептор) або полімерними (наприклад, рецептор РОСЕ, рецептор гормону росту, рецептор І--3, рецептор ОМ-С5Е, рецептор О-С5БЕ, рецептор еритропоетину та рецептор 1-6). Мембранозв'язані рецептори характеризуються багатодоменною структурою, яка включає позаклітинний домен ефектора, який зазвичай бере участь в сигнальній трансдукції.

В певних мембранозв'язаних рецепторах позаклітинний домен зв'язування ліганду і внутрішньоклітинний домен ефектора знаходяться в окремих поліпептидах, які включають повний функціональний рецептор.

Як правило, зв'язування ліганду з рецептором призводить до конформаційної зміни в рецепторі, яка викликає взаємодію між доменом ефектора та іншою молекулою(молекулами) в клітині, що, в свою чергу, веде до зміни в метаболізмі клітини. Метаболічні акти, які часто пов'язані з взаємодіями рецептор-ліганд, включають транскрипцію генів, фосфорилування, дефосфорилування, збільшення утворення циклічного АМФ, мобілізацію клітинного кальцію, мобілізацію мембранних ліпідів, клітинну адгезію, гідроліз ліпідів інозиту та гідроліз фосфоліпідів.

Термін "секреторна сигнальна послідовність" означає послідовність ДНК, яка кодує пептид ("секреторний пептид"), який як компонент більшого поліпептиду спрямовує цей більший поліпептид по секреторному шляху клітини, в якій він синтезується. Цей більший поліпептид зазвичай розщеплюється і виводить згаданий секреторний пептид під час проходження по секреторному шляху.

Термін "виділений поліпептид" - це поліпептид, який є, головним чином, вільним від забруднюючих клітинних компонентів, наприклад карбогідрату, ліпіду або інших білкових домішок, які по природі асоціюються з поліпептидом. Як правило, препарат виділеного поліпептиду містить цей поліпептид у високочистій формі, тобто принаймні з 8095-ною чистотою, принаймні з 90956-ною чистотою, принаймні з 95956-ною чистотою, більш ніж 9595-ною чистотою або більш ніж 9995-ною чистотою. Один шлях показати, що конкретний препарат білка містить виділений поліпептид - по виникненню єдиного диску, який з'являється після електрофорезу білкового препарату на поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію і витримування цього гелю в кумасі бриліантовому зеленому. Однак термін "виділений" не виключає присутності того самого поліпептиду в іншій фізичній формі, наприклад у вигляді димерів або іншим чином глікозильованих або отриманих шляхом заміщення форм.

Терміни "амінокінцевий" і "карбоксикінцевий" використані в даному описі для позначення положень всередині поліпептидів. Там, де дозволяє контекст, ці терміни використано з посиланням на конкретну послідовність або ділянку поліпептиду для позначення просторової близькості або відносного положення.

Наприклад, певна послідовність розташована карбоксикінцево до контрольної послідовності всередині поліпептиду, знаходиться найближче до карбоксильного кінця контрольної послідовності, але необов'язково на карбоксильному кінці повного поліпептиду.

Термін "експресія" відноситься до біосинтезу генного продукту. Нариклад, коли йдеться про структурний ген, експресія включає транскрипцію цього структурного гена в мРНК і трансляцію мРНК в один або більше поліпептидів.

Термін "сплайсваріант" використано в даному описі для позначення альтернативних форм РНК, транскрибованих з гена. Сплайсваріація зростає природно завдяки використанню альтернативних сплайсинг- сайтів всередині молекули транскрибованої РНК або, не так часто, між молекулами окремо транскрибованих

РНК ї може дати в результаті декілька мРНК, транскрибованих з того самого гена. Сплайсваріанти можуть кодувати поліпептиди, які мають змінену амінокислотну послідовність. Термін "сплайсваріант" також використано тут для позначення поліпептиду закодованого сплайсваріантом мРНК, транскрибованої з гена.

Використаний в даному описі термін "Іімуномодулятор" включає цитокіни, фактори росту вихідних клітин, лімфотоксини, ко-стимулюючі молекули, кровотворні фактори та синтетичні аналоги цих молекул.

Термін "пара комплемент-антикомплемент" означає неідентичні частини, які за відповідних умов утворюють нековалентно зв'язану стабільну пару. Наприклад, біотин та авідин (або стрептавідин) є прототипними членами пари комплемент-антикомплемент. Іншими прикладами пар комплемент- антикомплемент є пари: рецептор-ліганд, антитіло-антиген (або гаптен, або епітоп), змістовий поліпептид- безглуздий поліпептид тощо. У тих випадках, коли необхідна наступна дисоціація пари комплемент- антикомплемент, краще щоб вона мала спорідненість зв'язування менш ніж 109М'. "Фрагмент антитіла" - це ділянка антитіла, наприклад К(ар)2, Р(ар)2, Рар Рар і т.п. Незалежно від структури фрагмент антитіла зв'язується з тим самим антигеном, який був розпізнаний інтактним антитілом.

Термін "фрагмент антитіла" також включає синтетичний або отриманий шляхом генетичної інженерії поліпептид, який зв'язується зі специфічним антигеном, наприклад поліпептиди, що складаються з варіабельної зони легкого ланцюга, "Гм'-фрагменти, що складаються з варіабельних зон важкого та легкого ланцюгів, молекули рекомбінантного одноланцюгового поліпептиду, в яких варіабельні зони легкого і важкого ланцюгів з'єднані пептидним лінкером ("5сЕм-білки"), і мінімальні одиниці розпізнавання, що складаються з амінокислотних залишків, які удають гіперваріабельну зону. "Химерне антитіло" - це рекомбінантний білок, який містить варіабельні домени і комплементарні детермінуючі зони, отримані з антитіла гризуна, тоді як решта молекули цього антитіла є отриманою з антитіла людини. "Олюднені антитіла" - це рекомбінантні білки, в яких мишині комплементарні детермінуючі зони моноклонального антитіла було перенесено з важкого та легкого варіабельних ланцюгів імуноглобуліну миши у варіабельний домен людини.

Використаний в даному описі термін "терапевтичний агент" означає молекулу або атом, який кон'югували з частиною антитіла, щоб утворити кон'югат, корисний для лікування. Прикладами терапевтичних агентів є лікарські препарати, токсини, імуномодулятори, хелати, сполуки бору, фотоактивні агенти, або барвники та ізотопи. "Виявна мітка" - це молекула або атом, який можна кон'югувати з частиною антитіла для утворення молекули, корисної для діагнозу. Прикладами виявних міток є хелати, фотоактивні агенти, радіоізотопи, флуоресцентні агенти, парамагнітні іони та інші маркерні частини.

Термін "мітка спорідненості" позначає сегмент поліпептиду, який можна прикріплювати до другого поліпептиду для забезпечення очищення або виявлення цього другого поліпептиду, або створення сайтів для прикріплення цього другого поліпептиду до субстрату. В принципі, будь-який пептид або білок, для якого є антитіло або інший специфічний зв'язуючий агент, можна застосовувати як мітку спорідненості. Мітки спорідненості включають полігістидинову ділянку, А-білок ІМії55оп еї аіІ., ЕМВО 3. 4:1075 (1985); Міївзоп еї аї..

Мещшод5 Епгутої. 198:3 (1991)), глютатіон-5-трансферазу (Зтйй апа Одопп5оп, Сепе 67:31 (1988)|, мітку спорідненості Сіш-Сіш |сгпиззептеуег єї аї, Ргос. Майї! Асай. сі. ОБА 82:7952 (1985)), Р-субстанцію, пептид

ЕГАС |Норр еї а!ї., Віотесппоїоду 6:1204 (1988)), пептид, зв'язуючий стрептавідин, або інший антигенний епітоп або зв'язуючий домен. Див. Рога еї аї., Ргоївіп Ехргезвзіоп апа Ригійсайоп 2:95 (1991)). Молекули ДНК, які кодують мітки спорідненості, можна придбати у комерційних постачальників (наприклад, ф. "Рпагтасіа

Віотесі", Різсагамау, М). "Голе антитіло" - це все антитіло, на відміну від фрагмента антитіла, яке не кон'югується з терапевтичним агентом. Голі антитіла включають і поліклональні, і моноклональні антитіла, а також певні рекомбінантні антитіла, наприклад химерні та олюднені антитіла.

Використаний тут термін "компонент антитіла" включає і все антитіло, і фрагмент антитіла. "Імунокон'югат" - це кон'югат компонента антитіла з терапевтичним агентом або виявною міткою. "Поліпептид-мішень" або "пептид-мішень" - це амінокислотна послідовність, яка містить принаймні один епітоп і яку експресують на клітині-мішені, наприклад пухлинній клітині, або клітині, яка несе антиген інфекційного агента. Т-клітини розпізнають епітопи пептиду, представлені молекулою головного комплексу гістосумісності (ГКГС) поліпептиду-мішені або пептиду-мішені і, як правило, лізують клітину-мішень або набирають нові інші імуноклітини на сайт клітини-мішені, таким чином вбиваючи цю клітину-мішень. "Антигенний пептид" - це пептид, який зв'яже молекулу ГКГО для утворення комплексу ГКГо-пептид, який розпізнається Т-клітиною, викликаючи в результаті реакцію цитотоксичного лімфоциту після представлення Т- клітині. Таким чином, антигенні пептиди здатні прив'язуватись до відповідної молекули ГКГОС і викликати реакцію на цитотоксичні Т-клітини, наприклад лізис клітини або специфічний викид цитокіну напроти клітини- мішені, яка (реакція) зв'язує або експресує антиген. Антигенний пептид може бути зв'язаним в середовищі молекули ГКГС класу І або класу ІІ, на клітині, що представляє антиген, або на клітині-мішені.

В еукаріотах РНК-полімераза ІІ каталізує транскрипцію структурного гена для утворення мРНК. Можна сконструювати так, щоб молекула нуклеїнової кислоти містила матрицю РНК-полімерази Ії, в якій транскрипт

РНК має послідовність, яка є комплементарною до послідовності конкретної мРНК. Транскрипт РНК називають "безглуздою РНК", а молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує цю безглузду РНК, називають "безглуздим геном". Молекули безглуздої РНК здатні прив'язуватись до молекул мРНК, в результаті чого інгібується трансляція МРНК.

Слід розуміти, що через неточність стандартних аналітичних методів молекулярні маси та довжини полімерів є приблизними величинами. Якщо таку величину виражено у вигляді "приблизно Х", то слід розуміти, що точність величини Х має похибку ж10905. 3. Продукування молекул нуклеїнової кислоти, які кодують білки ТАСІ- імуноглобулін

На Фіг.1 показана спрогнозована амінокислотна послідовність ТАСІ людини (моп Виомжм апа Вгат, зсіепсе 278:138 (1997))Ї. Поліпептид ТАСІ містить наступні спрогнозовані елементи: а) дві структури збагачених цистеїном псевдо-повторів, характерні для доменів зв'язування ліганду фактора пухлинного некрозу; б) "стебло" із 62 амінокислот, яке знаходиться між доменами зв'язування ліганду і трансмембранним доменом; в) трансмембранний домен із 20 амінокислот і г) внутрішньоклітинний домен із 120 амінокислот. Ця амінокислотна послідовність не містить прогнозованої гідрофобної амінокінцевої сигнальної послідовності.

Для створення розчинної форми ТАСІ людини для використання як інгібітора взаємодії нативний ліганд- нативний рецептор генерували злитий білок позаклітинний домен ТАСІ-імуноглобулін Ес людини. Цю доступну послідовність ТАСІ людини використали як відправну точку для конструювання молекули злитого білка |(моп

ВшШом/ апа Вгат, Зсіепсе 278:138 (1997). Цей вихідний структурний компонент, позначений "ТАСІ-Ес4", включав амінокислотні залишки 1-154 поліпептиду ТАСІ та модифіковану зону Ес людини, що описується нижче. Точку злиття в залишку 154 вибрали, щоб включити якомога більше "стебла" ТАСІ, не включаючи при цьому жодної потенційної ділянки прогнозованого трансмембранного домену.

Оскільки нативний поліпептид ТАСІ не містить амінокінцевої сигнальної послідовності, її додали до ТАСІ, щоб генерувати секретовану форму злитого білка ТАСІ-Ес. Ця сигнальна послідовність являла собою пре-про- послідовність, модифіковану з активатора плазміногена тканини людини. Ці модифікації включили для підсилення розщеплення сигнальної пептидази та специфічного до фуринової протеази процесингу, і з цієї причини цю послідовність назвали "оптимізованою ІРА (0оїРА)-лідерною послідовністю". Ця оїРА-послідовність (ЗЕО ІЮ МО:25) показана нижче; модифіковані амінокислотні залишки зетемнені. Послідовність, яка кодує рекомбінантний злитий білок ТАСІ-Ес, ввели у вектор експресії, який трансфекували в клітини яєчника китайського хом'яка. -45 -0 ма АвроАіа Ме їх Ат (і фе буз Сує Уві Гн бен іхц Су» свт розикилених. сигвильх поятцлазя -2о | -15 ск дів Удаі рій Уді бе Бек бееб Сім Се Пе За АВ СО Бе

Сип ревцеянених фупноу

Ага Ат Р Ат ня .

Трансфековані клітини яєчника китайського хом'яка продукували білок ТАСІ-Рс4 на низькому рівні, приблизно 0,3 пг на клітину в день. Вестерн блот-аналіз білка ТАСІ-Ес з антисироватками Ес кози проти людського (ДС виявив два диски, один диск був менший за очікуваний розмір приблизно на 48кДа. Аналіз амінокислотних послідовностей очищених білків показав, що цей менший диск відбивав розщеплення злитих білків ТАСІ на різних сайтах в межах стебла ТАСІ. Щодо 5ЕО ІО МО:2, то головні кінці були виявлені на амінокислотних залишках 118 і 123, хоча білки були розщеплені також в амінокислотних позиціях 110, 139 і 141.

Додатково до гетерогенності, викликаної розщепленням у стеблі, гетерогенність також спостерігали на аміно- і карбоксильних кінцях. В послідовності ЗЕО І МО:2 головні амінокінці виявили на амінокислотних залишках 1, 10 і 13. Відмінності в карбоксильному кінці відбивають природну гетерогенність рекомбінантних імуноглобулінів та злитих білків імуноглобулінів, яка включає неповне видалення залишку лізину, кодованого на карбоксикінці Інше джерело гетерогенності виявили в мінливій природі карбогідратної структури, прикріпленої до домену Ст імуноглобуліну, кодованого Ес.

Щоб звернутися до гетерогенності, яку спостерігали, генерували нові варіанти ТАСІ-Ес. Сконструювали структурні компоненти, які включали принаймні одну з наступних змін в частині ТАСІ: 1) ділянки стебла ТАСІ були делетовані; 2) одна ділянка стебла ТАСІ була замінена ділянкою стебла ВСМА; 3) залишок аргінін в позиції 119 було мутовано для виключення потенційного сайту розщеплення фурину; 4) залишок глутамін в позиції 121 було мутовано для виключення потенційного сайту розщеплення фурину; 5) залишок аргінін в позиції 122 було мутовано для виключення потенційного сайту розщеплення фурину; 6) амінокислотні залишки в позиціях 123 і 142 було мутовано в амінокислотні залишки, виявлені у відповідних позиціях ТАСІ миши; 7) сигнальна оЇРА-послідовність людини була замінена сигнальною послідовністю варіабельної зони важкого ланцюга людини; 8) залишок валін в позиції 29 було мутовано в метонін, і сигнальну оїЇРА-

послідовність було з'єднано в амінокінцевій позиції з цим залишком, і 9) сигнальну оЇРА-послідовність було з'єднано на амінокінці із залишком аланін в позиції 30.

Модифікації також здійснили в імуноглобуліновій частині. У вищих хребетних ідентифіковано п'ять класів імуноглобуліну: Ідс, ДА, ЗМ, ДО та ЧЕ. Білки дб, ДО та ІДЕ - це типово дисульфідно зв'язані гетеротетрамери, які складаються з двох ідентичних важких ланцюгів і двох ідентичних легких ланцюгів. ІМ, як правило, виявляють у вигляді пентамеру тетрамеру, тоді як ІдА зустрічається у вигляді димеру тетрамеру.

ІДС являє собою головний клас, оскільки він нормально існує як другий найбільш поширений білок, знайдений в плазмі. У людей дО складається з чотирьох підкласів, позначених Ідс1, Ідс2, ДОЗ та Ідс4. Як показано на Фіг.2, важкий ланцюг кожного імуноглобуліну має константну зону, яка складається з доменів білка константної зони (Сні, шарніра, Снг і Снз), які є інваріантними для даного підкласу. Константні зони важкого ланцюга класу (До позначають грецьким символом у. Наприклад, імуноглобуліни підкласу до містять константну зону важкого ланцюга у1.

Ес-фрагмент, або домен Ес, складається з дисульфідно зв'язаних шарнірних зон важкого ланцюга, доменів Снг і Снз. В злитих білках імуноглобулінів домени Ес підкласу ДС! часто використовують як імуноглобулінову частину, бо (До1 має найдовший період напіврозпаду сироватки будь-якого з сироваткових білків. Надто довгий період напіврозпаду сироватки може бути бажаною характеристикою білка для вивчення тварин і потенційного терапевтичного застосування для людини. Крім того, підклас До1 має найбільшу здатність здійснення функцій ефектора, опосередкованих антитілом. Первинною функцією ефектора, яка може бути найбільш корисною у злитому білку імуноглобуліну, є здатність антитіла (901 опосередковувати залежну від антитіла клітинну цитотоксичність. З іншого боку, це може бути і небажаною функцією для злитого білка, який діє, в першу чергу, як антагоніст. В підкласі Ідс1 ідентифіковано декілька специфічних амінокислотних залишків, важливих для активності, опосередкованої константною зоною антитіла. Тому включення або виключення цих специфічних амінокислот створює можливість включення або виключення специфічної активності, опосередкованої константною зоною імуноглобуліну.

Для створення злитих білків Ес генерували шість варіантів модифікованого Ес ІдДс1 людини. Ес-488 було сконструйовано для зручного клонування злитого білка, який містить зону уїЕс людини, і його було сконструйовано за допомогою константної зони у! людського імуноглобуліну дикого типу. Тривога з приводу потенційного шкідливого впливу через непарний цистеїновий залишок привела до рішення замінити цистеїн (амінокислотний залишок 24 послідовності ЗЕО 0 МО:б), який нормально дисульфідно зв'язується з константною зоною легкого ланцюга імуноглобуліну, на сериновий залишок. Щоб ввести сайт розпізнавання рестрикційного ферменту Ва щ для полегшення майбутніх маніпуляцій з ДНК, в позицію 218 (амінокислотний залишок 22 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:6) індексу Б), який кодує згаданий колон, було введено додаткову зміну.

Ці зміни були введені в продукт реакції преципітації (РПЦ), кодований на РПС-праймерах. Через положення сайту Ва 7 І ї з метою закінчення шарнірної зони Ес кодони для позицій 216 і 217 індексу БО (амінокислотні залишки 20 і 21 послідовності БЕО ІЮ МО:6) були введені в послідовності-партнери злитого білка.

Ес4, Рс5 і Роб містять мутації для зниження функцій ефектора, опосередкованих Ес, шляхом зниження зв'язування з ЕсукіІ і зв'язування комплемента С1д. Ес4 містить такі самі амінокислотні заміни, які було введено в Ес-488. Для зниження потенційних функцій ефектора, опосередкованих Ес, були введені додаткові амінокислотні заміни. Зокрема, для зменшення зв'язування з ЕсугіІ були введені три амінокислотні заміни. Це заміни в позиціях індексу ЄЮ 234, 235 і 237 (амінокислотні залишки 38, 39 і 41 послідовності ЗЕО І МО:6).

Було виявлено, що заміни в цих позиціях зменшують зв'язування з ЕсуВіІ |Оипсап еї аї., Машге 332:563 (1988)|.

Ці амінокислотні заміни можуть також зменшити зв'язування з ЕсукПа, а також зв'язування з Есув!

Ібопаєттапт сеї аї., Майте 406:267 (2000); М/іпез еї аї., 9. Іттипої! 164:5313 (20003).

Декілька груп вчених описали релевантність позицій 330 і 331 індексу ЄШ (амінокислотні залишки 134 і 135 послідовності ЗЕО ІЮО МО:6б) в зв'язуванні комплемента Сід і наступній фіксації комплемента ІСапітеїй апа

Могтгізоп, У. Ехр. Мей. 173:1483 (1991); Тао еї аІ..4. Ехр. Мей. 178:661 (1993)). Амінокислотні заміни в цих позиціях були введені в Ес4 для зменшення фіксації комплемента. Домен Снз Ес4 є ідентичним домену, виявленому у відповідному поліпептиді дикого типу, за винятком термінуючого кодону, який був змінений з

ТА в ТАА для виключення потенційного сайту метилування дат, коли клоновану ДНК вирощують в дат плюс штам БЕ. соїї.

В Ес5 аргініновий залишок в позиції 218 індексу БО мутували назад в лізин, бо в злитих білках, що містять цей конкретний Ес, не було застосовано схему клонування Ва 7. Решта послідовності Рс5 співпадає з наведеним вище описом Ес4.

Есб є ідентичною Ес5, за винятком того, що карбоксикінцевий лізиновий кодон було виключено. С-кінцевий лізин зрілих імуноглобулінів часто видаляють із зрілих імуноглобулінів пост-трансляційно перед секрецією з В- клітин або видаляють під час циркуляції сироватки. Отже, С-кінцевий лізиновий залишок, як правило, не знаходять на циркулюючих антитілах. Як і в описаних вище Еса4 і Ес5, термінуючий кодон у послідовності Есб замінили на ТАА.

Ес7 є ідентичною Есу! дикого типу, за винятком того, що амінокислотні заміни в позиції 297 індексу Є), розміщеній в домені Снг. Позиція А5п-297 індексу ЄЮ (амінокислотний залишок 101 послідовності ЗЕО ІЮ

МО:6) - це сайт прикріплення М-зв'язаного карбогідрату. М-зв'язаний карбогідрат вводить потенційне джерело варіабельності в рекомбінантно експресований білок через потенційні варіації від групи до групи в структурі карбогідрату. З метою виключити цю потенційну варіабельність, щоб запобігти прикріпленню М-зв'язаного карбогідрату в позиції того залишку, А5п-297 мутували в глутаміновий залишок. Цей карбогідрат в залишку 297 також бере участь в зв'язуванні Есб з Есукії! (Бопадегтапп еї аї., Мате 406:267 (2000)). Тому, видалення карбогідрату зменшило б зв'язування рекомбінантних злитих білків, що містять Ес7, з Есувк взагалі. Як вже описувалось, термінуючий кодон у послідовності Ес7 мутували в ТАА.

Ес8 є ідентичною зоні у! імуноглобуліну дикого типу, показаної в ЗЕО ІО МО:6, з тією різницею, що цистеїновий залишок в позиції 220 індексу ЄЮ (амінокислотний залишок 24 послідовності ЗЕО ІЮ МО:6)

замінили сериновим залишком. Ця мутація виключала згаданий цистеїновий залишок, який нормально дисульфідно зв'язується з константною зоною легкого ланцюга імуноглобуліну.

В Таблиці 1 показані приклади структурних компонентів ТАСІ-Ес.

Табхним

Мрнкходн сурухтурюхх комент тантаго их ТАКЕ. : іпжрідокюйхь ТАС Я Бема те

Біда ти ння вдт ел о о нав по с: и І А

ОХАСТК УС МЕР, КІЗ, ЗА, ! і ев ЯК КІЕМІ рок і

СТАС, Маму ! Ко. ! теки всих о мин З пив

Епос жли: и пи ся

ТАС АХ 010 : Коу ! 7 Дянсеори похяєхі, Муг: ІЗ нелефбї зміокхисличех пІМФ(ЛОКИОУВЙ дакелеві ск дужех ГУМОКИо же амінохисаєткої шкхідоннені ХО 15 КО 2 " Вспючаєяоювахосмює ві якими 12155 зазожасюткатй ЩО НЯ МО. 7 Цез структурній коєоюнемс менючке йсоноєтсястВ ЗМхмімен 1105 попліловнесті.

ВЕУ Є Ме: З СТАС) та змінохнелоумі дазніим 42-34 послідонвиюмті МЕС МКУ? см,

Білки ТАСІ-Ес продукували за допомогою рекомбінантних клітин яєчника китайського хом'яка, виділяли і аналізували методом вестерн блот-аналізу та аналізу амінокислотної послідовності. Як не дивно, делеція перших 29 амінокислот від М-кінця поліпептиду ТАСІ дала в результаті 10-кратне зменшення в продукуванні злитих білків ТАСІ-Єс при використанні клітин яєчника китайського хом'яка. Ця делеція також зменшила розщеплення повномірного стебла. Крім того, розщеплення всередині стебла ТАСІ пригнічували або відсіканням стебла ТАСІ, або заміною стебла ТАСІ всередині іншої амінокислотної послідовності (наприклад, амінокислотної послідовності стебла ВСМА).

Як описано в Прикладі 4, функціональні аналізи структурних компонентів ТАСІ-Єс показують, що злиті білки ТАСІ(а1-29)-Рс5, ТАСЦа1т-29, а107-154)-Рс5, ТАСІ(а1-29, а111-154)-Рс5 і ТАСца1-29, а120-154)-Рс5 мають аналогічні спорідненості до зв'язування для 2ТМЕ4. Однак виявилось, що структурні компоненти

ТАСЦІ(а1-29)-Рс5, ТАСЦа1-29, а111-154)-Рс5 і ТАСЦа1-29, а120-154)-Рс5 зв'язують більше 2ТМЕ4 на моль ТАСІ-

Ес, ніж структурний компонент ТАСІ(а1-29, а107-154)-Рс5. В залежності від передбачуваного застосування (наприклад, терапевтичного, діагностичного або дослідницького) можна використовувати або високу, або низьку ємність злитих білків ТАСІ-Ес. Крім того, поєднання високої ємності та низької ємності злитих білків

ТАСІ-Ес дає можливість титрування 2ТМЕ2 або 24.

Даний винахід розглядає злиті білки ТАСІ-імуноглобулін, які містять частину рецептора ТАСІ, що складається з амінокислотних залишків 30-106 послідовності 5ХЕО ІЮ МО:2, 30-110 послідовності 5ЕО ІЮ МО2, 30-119 послідовності ЗЕО ІО МО:2 або 30-154 послідовності ЗЕО ІЮО МО:2. Даний винахід також включає злиті білки ТАСІ-імуноглобулін, які містять частину рецептора ТАСІ, що складається з амінокислотних залишків 31- 106 послідовності БЕО 10 МО:2, 31-110 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2, 31-119 послідовності ЗЕО ІО МО:2 або 31- 154 послідовності ЗЕО ІО МО:2.

Більш узагальнено, даний винахід включає злиті білки ТАСІ-імуноглобулін, в яких частина рецептора ТАСІ складається з фрагмента амінокислотних залишків 30-154 послідовності 5ЕО ІО МО:2 і в яких частина рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з 2ТМЕ2 або 2ТМЕ4. Такі фрагменти містять зону збагаченого цистеїном псевдо-повтору і, необов'язково, можуть включати принаймні один М-кінцевий сегмент, який знаходиться в амінокінцевій позиції відносно зони збагаченого цистеїном псевдо-повтору, і сегмент стебла, який знаходиться в карбоксикінцевій позиції відносно зони збагаченого цистеїном псевдо-повтору. Відповідні зони збагачених цистеїном псевдо-повторів включають поліпептиди, які: а) містять принаймні один з амінокислотних залишків 34-66 послідовності ЖЕО ІЮ МО:2 і амінокислотних залишків 71-104 послідовності 5ЕО ІЮ МО 2; б) містять і амінокислотні залишки 34-66 послідовності ЗХЕО ІЮО МО:2, і амінокислотні залишки 71- 104 послідовності ЗЕО ІЮ МО:2, або в) містять амінокислотні залишки 34-104 послідовності БЕО ІЮ МО:2.

Відповідні М-кінцеві сегменти включають наступні залишки послідовності «ЕО ІЮ МО:2: амінокислотний залишок 33, амінокислотні залишки 32-33, амінокислотні залишки 31-33 і амінокислотні залишки 30-33.

Відповідні сегменти стебла включають одну або більше амінокислот амінокислотних залишків 105-154 послідовності 5ЕО І МО:2. Наприклад, сегмент стебла може складатися з наступних амінокислотних залишків послідовності ЗЕО І МО:2: амінокислотного залишку 105, амінокислотних залишків 105-106, амінокислотних залишків 105-107, амінокислотних залишків 105-108, амінокислотних залишків 105-109, амінокислотних залишків 105-110, амінокислотних залишків 105-111, амінокислотних залишків 105-112, амінокислотних залишків 105-113, амінокислотних залишків 105-114, амінокислотних залишків 105-115, амінокислотних залишків 105-116, амінокислотних залишків 105-117, амінокислотних залишків 105-118, амінокислотних залишків 105-119, амінокислотних залишків 105-120, амінокислотних залишків 105-121,

амінокислотних залишків 105-122, амінокислотних залишків 105-123, амінокислотних залишків 105-124, амінокислотних залишків 105-125, амінокислотних залишків 105-126, амінокислотних залишків 105-127, амінокислотних залишків 105-128, амінокислотних залишків 105-129, амінокислотних залишків 105-130, амінокислотних залишків 105-131, амінокислотних залишків 105-132, амінокислотних залишків 105-133, амінокислотних залишків 105-134, амінокислотних залишків 105-135, амінокислотних залишків 105-136, амінокислотних залишків 105-137, амінокислотних залишків 105-138, амінокислотних залишків 105-139, амінокислотних залишків 105-140, амінокислотних залишків 105-141, амінокислотних залишків 105-142, амінокислотних залишків 105-143, амінокислотних залишків 105-144, амінокислотних залишків 105-145, амінокислотних залишків 105-146, амінокислотних залишків 105-147, амінокислотних залишків 105-148, амінокислотних залишків 105-149, амінокислотних залишків 105-150, амінокислотних залишків 105-151, амінокислотних залишків 105-152, амінокислотних залишків 105-153 та амінокислотних залишків 105-154.

Додаткові відповідні сегменти стебла включають одну або більше амінокислот стебла ВСМА (наприклад, амінокислотні залишки 42-54 послідовності ЗЕО ІЮ МО:27). Наприклад, сегмент стебла може складатися з наступних амінокислотних залишків послідовності зЗЕО ІЮО МО:27: амінокислотного залишку 42, амінокислотних залишків 42-43, амінокислотних залишків 42-44, амінокислотних залишків 42-45, амінокислотних залишків 42- 46, амінокислотних залишків 42-47, амінокислотних залишків 42-48, амінокислотних залишків 42-49, амінокислотних залишків 42-50, амінокислотних залишків 42-51, амінокислотних залишків 42-52, амінокислотних залишків 42-53 та амінокислотних залишків 42-54.

Більш узагальнено, сегмент стебла може складатися з 2-50 амінокислотних залишків.

Імуноглобулінова частина злитого білка, що тут описується, містить принаймні одну константну зону імуноглобуліну. У кращому варіанті імуноглобулінова частина являє собою сегмент імуноглобуліну людини.

Послідовність імуноглобуліну людини може бути амінокислотною послідовністю дикого типу або модифікованою амінокислотною послідовністю дикого типу, яка має принаймні одну з обговорених вище амінокислотних мутацій.

Амінокислотна послідовність імуноглобуліну людини може також відрізнятися від дикого типу тим, що має одну або більше мутацій, характерних для відомої алотипічної детермінанти. В Таблиці 2 показані алотипічні детермінанти константної зони ІДСу! людини (Ршітап, Тпе Ріазта Ргоїеіп5, МоІ.М, раде5 49-140 (Асадетіс

Ргез5, Іпс. 1987)|. Позиції 214, 356, 358 і 431 індексу ЄЮ визначають відомі алотипи Ідсу!ї. Позиція 214 знаходиться в домені Сні константної зони ІдСу! і тому не знаходиться в межах послідовності Ес.

Послідовність Ес послідовності ХЕО ІЮО МО:6 дикого типу включає алотипи сіт(1) і Сіт(2-). Однак Ро-частину білка ТАСІ-Ес можна модифікувати для відображення будь-якої комбінації цих алотипів.

Тимеин а азетмигані доукраікаттю кілзсьдаз звнм і імувтлейуліну люзном

Я Алое : Акжецноьнй : Льцнокнерцума пахтою :

Я Тож 010 мижу зветамай й ПЕС МВ М ОНА Пе

ТЗ» : Сн, Ме : ЗАбЯ У і 160,35 Н

Гещ5 НЕ ЗМИН УО с нини ЛИЙ

Гб КО ї І : ща і

Описані тут приклади білків ТАСІ-Ес містять константні зони ІДС людини. Однак придатні імуноглобулінові частини включають також поліпептиди, що містять принаймні одну константну зону, наприклад константну зону важкого ланцюга з будь-якого з наступних імуноглобулінів: Ідс2, дез, Ід, ІДдАЇ, ІдАг, ІдО, І9Е та ІЗ9М.

Вигідним є те, що імуноглобулінові частини, отримані з І(Д052 дикого типу або Ідб4 дикого типу, пропонують знижену функцію ефектора порівняно з дО дикого типу або ІдоЗ дикого типу. Даний винахід також розглядає злиті білки, які містять частину рецептора ТАСІ, описану вище, і будь-який альбумін або р2-макроглобулін.

Іншим типом рецепторного злитого білка, який зв'язує 2ТМЕ2 або 2ТМЕ4, є злитий білок ВСМА- імуноглобулін. Були проведені дослідження із злитим білюм ВСМА-Ес4, в якому частина ВСМА складається з амінокислотних залишків 1-48 послідовності ЗЕО ІЮО МО:27. Як не дивно, фармакокінетичні дослідження на мишах показали, що злитий білок ВСМА-Ес4 мав період напіврозпаду приблизно 101 годину, тоді як білок

ТАСІ-Ес мав період напіврозпаду 25 годин. Таким чином, при певних клінічних установках перевагу можуть віддавати введенню злитого білка ВСМА-імуноглобулін. Більш того, для лікування певних станів вигідною може бути комбінація злитих білків ТАСІ-імуноглобулін і ВСМА-імуноглобулін. Цієї комбінаційної терапії можна досягти введенням злитих білків ТАСІ-імуноглобулін і ВСМА-імуноглобулін або введенням гетеродимерів злитих білків ТАСІ-імуноглобулін і ВСМА-імуноглобулін.

Іншим типом рецепторно злитого білка, який зв'язує 7ТМЕ4, є злитий білок імуноглобуліну, що містить позаклітинний домен рецептора, позначеного "2піт12". Амінокислотна і нуклеотидна послідовності рецептора гдпї12 представлені як 5ЕО І МО:59 і 5ЕБО ІЮО МО:60, відповідно. Відповідні частини рецептора Апі12 включають поліпептиди, що містять амінокислотні залишки 1-69 послідовності 5ЕО 10 МО:60 або амінокислотні залишки 19-35 послідовності ЗЕО ІО МО:60.

Запропоновані даним винаходом злиті білюи можуть мати форму одноланцюгових поліпептидів, димерів, тримерів або множин димерів або тримерів. Димери можуть бути гомодимерами або гетеродимерами, а тримери можуть бути гомотримерами або гетеротримерами. Прикладами гетеродимерів можуть служити поліпептид ТАСІ-імуноглобулін з поліпептидом ВСМА-імуноглобулін, поліпептид ТАСІі-імуноглобулін з поліпептидом 2піг12-імуноглобулін і поліпептид ВСМА-імуноглобулін з поліпептидом 2іпіт12-імуноглобулін.

Приклади гетеротримерів включають поліпептид ТАСІі-імуноглобулін з двома поліпептидами ВСМА- імуноглобулін, поліпептид ТАСІ-імуноглобулін з двома полпептидами 2іпіт12-імуноглобулін, поліпептид ВСМА- імуноглобулін з двома пполіпептидами 2піт12-імуноглобулін два поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін з поліпептидом ВСМА-імуноглобулін, два поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін з поліпептидом 2іпіт12-імуноглобулін, два поліпептиди ВСМА-імуноглобулін з поліпептидом 2іпіт12-імуноглобулін, а також тример з поліпептиду

ТАСІ-імуноглобулін, поліпептиду ВСМА-імуноглобулін та поліпептиду 2піг12-імуноглобулін.

В таких злитих білках частина рецептора ТАСІ може містити принаймні одну з наступних амінокислотних послідовностей послідовності ЗЕО ІЮО МО:2: амінокислотні залишки 30-154, амінокислотні залишки 34-66, амінокислотні залишки 71-104, амінокислотні залишки 47-62, амінокислотні залишки 986-100. Частина рецептора ВСМА може містити принаймні одну з наступних амінокислотних послідовностей послідовності ХЕО

ІО МО:27: амінокислотні залишки 1-48, амінокислотні залишки 8-41 і амінокислотні залишки 21-37. Частина рецептора 21піт12 може містити принаймні одну з наступних амінокислотних послідовностей послідовності

ЗЕО ІЮО МО:60: амінокислотні залишки 1-69 та амінокислотні залишки 19-35.

Злиті білюим можна продукувати, використовуючи методи реакції преципітації (РПЦ), застосовані для конструювання ілюстративних молекул ТАСІ-Ес, які описані в прикладах. Однак фахівці в цій галузі можуть використовувати інші стандартні методи. Наприклад, молекули нуклеїнової кислоти, що кодують ТАСІ, ВСМА, гпіт12, або поліпептиди імуноглобуліну можна отримати, ретельно перевіряючи бібліотеки КДНК людини або геномні бібліотеки, використовуючи полінуклеотидні зонди, що базуються на описаних тут послідовностях. Ці методи є стандартними і добре адаптованими |див., наприклад, А!йзибреї еї аї., (ед5.), Зпогі Ргоїосої5 іп

Моїесшаг Віоіоду, 3 Еайіоп, радев 4-1 -4-6 ЮШопп Умієу 5 Зопв 1995) ("Аивиреї! (1995)"); УУи еї а. Метод іп

Сепе Віоїтесппоіоду, раде5 33-41 (САС Ргевзв, Іпс. 1997) ("УМи (1997)"); Аизиреї! (1995) аї радев 5-1 - 5-6; УМи (1997) ах радез 307-327)|.

Як варіант, молекули для конструювання злитих білків імуноглобуліну можна отримати, синтезуючи молекули нуклеїнової кислоти, використовуючи довгі олігонуклеотиди і описані вище нуклеотидні послідовності, які служать взаємним праймером (|див., наприклад, А!йзире! (1995) аг раде5 8-8 - 8-9).

Адаптований метод використання ланцюгової реакції полімерази дає можливість синтезувати молекули ДНК довжиною принаймні дві тисячі гетероциклічних основ нуклеїнової кислоти І(Адапд еї аї.. Ріапі Моїес. Віо! 27:1131 (1993), Ватбої єї аі., РОСА Меїпод» апа Арріїсайопз 2:266 (1993), ОПоп еї а!., "Ове ої Ше Роіутегазе

Спаїп Аеасіп г Ше Нарій Сопвіписіоп ої бЗупіпейс Сепев", іп Мейо» іп МоїІесціаг Віоіоду, Мої. 15:РСА

Ргоїосоїв: Сштепі МеїШоаз апа Арріїсайопе, МУ/піе (еа.), раде5 263-268, (Нитапа Ргев5, Іпс. 1993), апа

Ноіосжасник єї аії, РОСА Меїподз Аррі 4:299 (1995)|.

Запропоновані даним винаходом молекули нуклеїнової кислоти також можна синтезувати, застосовуючи протоколи використання "синтезатора полінуклеотидів" , наприклад методу фосфорамідиту. Якщо, наприклад, для синтезу гена або фрагмента гена необхідна хімічно синтезована дволанцюгова ДНК, тоді кожний комплементарний ланцюг створюють окремо. Продукування коротких генів (60-80 пар азотистих основ) є технічно простим і його можна здійснювати шляхом синтезу комплементарних ланцюгів і наступної їх гібридизації. Однак для продукування довгих генів (2300 пар азотистих основ) можуть знадобитися спеціальні стратегії, оскільки ефективність спряження кожного циклу під час хімічного синтезу ДНК рідко буває 10095-ною.

Для подолання цієї проблеми синтетичні гени (дволанцюгові) збирають у модулярну форму із одноланцюгових фрагментів довжиною 20-100 нуклеотидів. Про синтез нуклеотидів І(див., наприклад, сііскК апа Рахіегпак,

Моїіесшіаг Віоїесппоіоду, Рііпсірієз апа Арріїсайопе5 ої Несотбіпапі ОМА (АБЗМ Ргезг5 1994), Цакига єї а, Апті.

Веу. Віоспет. 53:323 (1984), апа Сіїтіє еїаї, Ргос. Маг! Асай. 5сі. ОБА 87:633 (1990)|. 4. Продукування поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін

Запропоновані даним винаходом поліпептиди можна продукувати в рекомбінантних клітинах-хазяях відомими методами. Для експресії послідовності, що кодує ТАСІ-імуноглобулін, можна молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує цей поліпептид, функціонально зв'язати з регуляторними послідовностями, які контролюють транскрипційну експресію у векторі експресії а потім увести в клітину-хазяїн. Крім транскрипційних регуляторних послідовностей, наприклад промоторів та енхансерів, вектори експресії можуть включати трансляційні регуляторні послідовності та маркерний ген, придатний для селекції клітин, які несуть цей вектор експресії.

Вектори експресії, придатні для продукування стороннього білка в еукаріотних клітинах, як правило, містять: 1) прокаріотні елементи ДНК для кодування бактеріального реплікатора і маркер стійкості до антибіотика для забезпечення росту і селекції вектора експресії в бактеріальному хазяїні, 2) еукаріотні елементи ДНК, що контролюють |ініціацію транскрипції наприклад промотор, і 3) елементи ДНК, що контролюють процесонг транскриптів, наприклад послідовність термі нації транскрипції/поліаденилування.

Вектори експресії можуть також включати нуклеотидні послідовності, які кодують секреторну послідовність, що спрямовує гетерологічний поліпептид в секреторний шлях клітини-хазяїна. Вектор експресії може, наприклад, містити нуклеотидну послідовність яка кодує ТАСі-імуноглобулін, і секреторну послідовність, отриману з будь-якого секретованого гена. Як обговорювалось вище, однією придатною сигнальною послідовністю є сигнальна ІРА-послідовність. Прикладом сигнальної ІРА-послідовності є ЗЕО ІЮ

МО:25. Іншою придатною сигнальною послідовністю є сигнальна послідовність 26-10 Мн миши. Мишине антитіло 26-10 описується, наприклад, у Меаг еї аї., Мої. Іттипої. 27:901 (1990). Описувані амінокислотна та нуклеотидна послідовності сигнальної послідовності 26-10 Мн миши представлені послідовностями ЗЕО ІЮ

МО:61 і 5БЕО ІЮО МО:65, відповідно. 5ХЕО ІЮ МО:62 показує амінокислотну послідовність злитого білка ТАСІ-Ес5, який містить сигнальну послідовність 26-10 Мн миши.

Запропоновані даним винаходом білки ТАСІ-імуноглобулін можна експресувати в клітинах ссавців.

Прикладами придатних клітин-хазяїв ссавців є клітини нирки африканської зеленої мавпи (Мего; АТСС СЕ 1587), клітини нирки ембріону людини (293-НЕК; АТСС СВІ 1573), клітини нирки маляти хом'яка (ВНК-21, ВНК- 570; АТС СК 8544, АТСС СК 10314), клітини нирки псових (МОСК; АТОСС СС 34), клітини яєчника китайського хом'яка (ІСНО-К1І; АТОС СС 61; СНО 044 (Спавіп еї аї,, 5от. СеїЇ Моїес. сепеї. 12:555, (1986)|,

клітини гіпофізу щура (ЗНІ1; АТСС СС 82), клітини НеГа 53 (АТСС СС 2.2), клітини гепатоми щура (Н-4-ІІ-Е;

АТС СВІ 1548), трансформовані клітини 5-40 нирки мавпи (СО5-1; АТОС СВІ 1650) і клітини ембріону миши (МІН-3Т3; АТСС СВ. 1658).

Для хазяїна-ссавця транскрипційні та трансляційні регуляторні сигнали можна отримати з вірусного джерела, наприклад аденовірусу, вірусу папіломи великої рогатої худоби, мавп'ячого вірусу тощо, в яких регуляторні сигнали асоційовані з конкретним геном, що має високий рівень експресії. Відповідні транскрипційні та трансляційні регуляторні послідовності також можна отримати з генів ссавців, наприклад генів актину, колагену, міозину та металотіонеїну.

Транскрипційні регуляторні послідовності включають зону промотора, достатню для спрямування ініціації синтезу РНК. Відповідні еукаріотні промотори включають промотор гена металотіонеїн | миши І(Натег еї аї, 9.

Моїес. Аррі. сепеї/ 7:273 (1982)), ТК-промотор вірусу гкрпксу |МеКпідні, Сеї! 37:355 (1982)|, ранній промотор ЗМ 40 |Вепоїві еї аї!., Маїшге 290:304 (1981)|, промотор вірусу саркоми Рауса І(Согтап еї аїЇ, Ргос. Маг! Асай 5сі. ОБА 70:6777 (1982)), промотор цитомегаловірусу (РоескКіпд еї аІ., сепе 45:101 (1980)) і промотор онкогенного вірусу молочної залози миши (Ідив., ЕЇспемеггу, "Ехргеззіоп ої Епдіпеегей Ргоїеіп5 іп Матітаїйап Сеї! Сийиге", іп Ргоїевіп

Епдіпеегіпд: Ргіпсірієх апа Ргасіїсє, Сієїапа еї аї., (едв.), раде5 163-181 (Чопп УМієу 5 опе, Іпс. 1996).

Прикладом корисної комбінації промотра та енхансера є комбінація промотора вірусу мієлопроліферативної саркоми та енхансера цитомегаловірусу людини.

Як варіант, для контролювання продукування білків ТАСІ-імуноглобулін в клітинах ссавців можна використати прокаріотний промотор, наприклад промотор Т3 РНК-полімерази, якщо цей прокаріотний промотор регулюється еукаріотним промотором (2пои еї аї, Мої. СеїІ. Віо! 70:4529 (1990) апа Кашятанп еї аї., мисі, Асіа5 Нез. 19:4485 (1991)|.

Вектор експресії можна вводити в клітини-хазяї кількома стандартними методами, в тому числі трансфекцією фосфату кальцію, трансфекцією, опосередкованою ліпосомами, методом введення за допомогою налітаючих мікрочастинок, електропорацією тощо. Трансфековані клітини можна селектувати і розмножити для створення рекомбінантних клітин-хазяїв, які містять вектор експресії, стабільно інтегрований в геном клітини-хазяїна. Методи введення векторів в еукаріотні клітини і методи селектування таких стійких трансформантів з використанням домінантного селектованого маркера описуються, наприклад, в роботі

А!Їйзибе! (1995) та Мигтау (ед.), сепе Тгапзвтег апа Ехргезвіоп Ргоїосої!5 (Нитапа Ргез5 1991).

Одним придатним селектованим маркером є, наприклад, ген, який забезпечує стійкість до антибіотичного неоміцину. В цьому випадку селекцію проводять у присутності лікарського засобу типу неоміцину, наприклад (-418 або йому подібного. Селекційні системи можна також використовувати для підвищення рівня експресії гена, що становить інтерес, і процес цей називають "ампліфікацією". Ампліфікацію здійснюють шляхом культивування трансфектантів у присутності невеликої кількості селективного агента і наступного збільшення кількості селективного агента для селектування клітин, які продукують високі рівні продуктів уведених генів.

Придатним ампліфікованим селектованим маркером є дигідрофолатредуктаза, яка надає стійкості до метотрексату. Можна також застосовувати й інші гени, що надають стійкості до лікарського засобу (наприклад, пуроміцин-ацетилтрансферазу, що надає стійкості до гігроміцину і до багатьох лікарських засобів). З іншого боку, маркери, які вводять змінений фенотин, наприклад зелений флуоресцентний білок або білки поверхонь клітин, наприклад СО4, СО8, Сіаз5 | МНС, плацентарна лужна фосфатаза, можна використовувати для сортування трансфекованих клітин від нетрансфекованих клітин, наприклад, за допомогою клітинного сортера із збудженням флуоресценції або методом розділення за допомогою магнітних гранул. Поліпептиди ТАСІ- імуноглобулін можна також продукувати за допомогою культивованих клітин, використовуючи вірусну систему транспортування. Прикоадами вірусів для цієї мети є аденовірус, вірус герпесу, вірус коров'ячої віспи та аденоасоційований вірус (ААМ). Аденовірус, вірус з дволанцюговою ДНК. На сьогодні є найбільш дослідженим вектором переносу гена для транспортування гетерологічної нуклеїнової кислоти |див., Вескег еї а!., Мей. СеїЇ

Віої!. 43:161 (1994), апа Ооцдіа5 апа Сигівї, Зсіепсе «Є Медісіпе 4:44 (1997)). Перевагами аденовірусної системи є пристосування відносно великих вставок ДНК, здатність рости до високого титру, здатність інфекувати широкий розмах типів клітин ссавців і гнучкість, що дає можливість використання з великою кількістю доступних векторів, які містять різні промотори.

В результаті делеції ділянок аденовірусного генома можна пристосовувати більші вставки (до 7 тисяч пар нуклеотидів) гетерологічної ДНК. Ці вставки можна включати у вірусну ДНК прямим зшиванням або гомологічною рекомбінацією з ко-трансфекованою плазмідою. Як варіант можна делетувати незамінний ген ЕЇ з вірусного вектора, що веде до нездатності відтворювання, поки клітина-хазяїн не дасть цей ген ЕЇ. Інфіковані аденовірусним вектором людські клітини 293 ІАТСС МоМо СКІ-1573, 45504, 45505), наприклад, можна виростити як прирослі клітини або в суспензійній культурі при відносно високій щільності клітин для продукування значних кількостей білка Ідив., сагпієге еї. аіІ., Суюїесппої. 15:145(1994)|.

Фахівці в цій галузі можуть розробити відповідні вектори експресії для продукування описаних тут злитих білків за допомогою клітин ссавців. Ознаки одного вектора експресії описані в Прикладі 4. Як інший приклад, вектор експресії може містити двоцистронну касету експресії яка включає ділянку енхансера цитомегаловірусу людини, промотор вірусу мієлопроліферативної саркоми, нуклеотидну послідовність, що кодує злитий білок, поліовірусні внутрішні рибосомні сайти входження, нуклеотидну послідовність, що кодує дигідрофолатредуктазу мишей, за якою йде додаткова послідовність ЗМ40-полі А. Нуклеотидна послідовність

ЗБО 10 МО69 показує структурний компонент "енхансер цитомегаловірусу-(промотор ІТК вірусу мієлопроліферативної саркоми", в якому енхансер цитомегаловірусу тягнеться від нуклеотиду 1 до нуклеотиду 407. Промотор І ТК вірусу мієлопроліферативної саркоми, який не має зони негативної регуляції, тягнеться від нуклеотиду 408 до нуклеотиду 884 послідовності ЗЕО ІЮ МО:69. Нуклеотидна послідовність промотора ТК вірусу мієлопроліферативної саркоми без зони негативної регуляції знаходиться в послідовності ЗЕО ІЮ

МО.70.

У Прикладі 1 описано вектор експресії, який містить промотор цитомегаловірусу для спрямування експресії трансгена рекомбінантного білка, інтрон імуноглобуліну, сигнальну послідовність активатора плазміногена тканини. Прикладом придатного інтрону імуноглобуліну є інтрон 26-10мн мишей. Послідовність

ЗЕБЕО ІЮ МО:6б ілюструє нуклеотидну послідовність інтрону 26-10 Мн мишей. Вектор експресії може також включати нетрансльовану 5'-область (ТК), розміщену вище від нуклеотидної послідовності, яка кодує білок

ТАСІі-імуноглобулін. Відповідну 5-0ТЕ можна отримати з гена 26-10 Мн мишей. Послідовність БЕО ІЮ МО:63 показує нуклеотидну послідовність корисної нативної 5'-0ОТА 26-10 Мн мишей, а послідовність ЗЕО ІЮ МО:64 показує нуклеотидну послідовність 5'-0ТА 26-10 Мн мишей, яку було оптимізовано на 3'"-кінці.

Наприклад, 5ЕО ІО МО:67 являє собою нуклеотидну послідовність, яка включає такі елементи: нативну 5'- тА 26-10 Мн мишей (нуклеотиди 1-51), сигнальну послідовність 26-10 Мн мишей (нуклеотиди 52-97 і 182-192), інтрон 26-10 Мн мишей (нуклеотиди 98-181), нуклеотидну послідовність, яка кодує ТАСІ-частину (нуклеотиди 193-435) і нуклеотидну послідовність, яка кодує Гс5-частину (нуклеотиди 4436-1131).

Нуклеотидна послідовність ЗЕО І МО:68 відрізняється від ЗЕО ІЮ МО:67 завдяки заміні оптимізованої 5'- тА 26-10 Мн мишей (нуклеотиди 1-51) на нативну послідовність.

Білки ТАСІ-їмуноглобулін можна також експресувати в інших вищих еукаріотних клітинах, наприклад клітинах птахів, грибів, комах, дріжджів або рослин. Бакуловірусна система забезпечує ефективний засіб введення клонованих генів в клітини комах. Відповідні вектори експресії базуються на вірусі множинного ядерного поліедрозу Ашіодгарпа саїїйогпіса (АСММУРМУ) і містять добре відомі промотори, наприклад промотор хітшокового білка (хтб) Огозорпіїа 70, промотор предраннього гена вірусу ядерного поліедрозу Ашодгарпа саїйогпіса (іе-1) і сповільнений ранній 39К-промотор, бакуловірусний ріО-промотор і промотор Огозорпіїа теїаПоїпіопеїіп. Другий спосіб створення рекомбінантного бакуловірусу використовує систему, що базується на транспозоні, описану в роботі І иском/ (ГисКком еї аї., у. Мігої, 67:4566 (1993)). Ця система, яка використовує вектори переносу, продається в комплекті ВАС-о-ВАС ІСіїє Тесппоіодіе5, КоскміШе, МО). В цій системі застосований вектор переносу РЕАЗТВАС (Гіте Тесппоіодіе5), що містить транспозон Тп7 для переміщення

ДНК, яка кодує поліпептид ТАСІ-імуноглобулін у бакуловірусний геном, що зберігається в Е. соїї як велика плазміда під назвою "бакміда". Див. НІЇП-РегКкіпз апа Рогзее, .). С(з4еп. Міго!. 77:971 (1990), Воппіпод еї. аї., 9. Сеп.

Мігої. 75:1551 (1994), апа СпаепраїкК, апа Каророгпі, У. Віої. Спет. 279:1543 (1995)). Крім того, вектори переносу можуть включати внутрішньоскелетне злиття з ДНК, яка кодує мітку епітопа на С- або М-кінці експресованого поліпептиду ТАСІ-імуноглобулін, наприклад мітку СіІш-сїЇм епітопу |Сгиззептеуег еї аї., Ргос. масі Асай. зсі. 82:7952 (1985)Ї. Використовуючи відомий в цій галузі метод, вектор переносу, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок ТАСІ-імуноглобулін, трансформують в Е. соїї та перевіряють на виявлення бакмід, які містять перерваний ген Іас7, що є ознакою рекомбінантного бакуловірусу. Бакмідну ДНК, яка містить геном рекомбінантного бакуловірусу, потім виділяють, застосовуючи відомий метод.

Ілюстративний вектор РЕАЗТВАС можна значною мірою модифікувати. Наприклад, промотор поліедрин можна видалити і замінити промотором головного білка бакуловірусу (також відомим як Ресог, рб.9 або МР- промотор), який експресують раніше при зараженні бакуловірусом і який показав себе кращим для експресії секретованих білків І(див., наприклад, НІЇІ-РеїКкіп5 апа Роззеє, у. (зеп. Мігої. 71:971 (1990), Воппіпо еї аї., 9. (еп.

Мігої. 75:1551 (1994) апа Спагтпраїк апа Варорогі, 9. Віої. Спет. 2701543 (1995)). В таких структурних компонентах вектора переносу можна використовувати короткий або довгий варіант промотора головного білка. Більш того, можна побудувати вектори переносу, використовуючи секреторні сигнальні послідовності, отримані з білків комах. Як такі структурні компоненти можна використати, наприклад, секреторну сигнальну послідовність з екдистероїд-глюкозилтрансферази (ЕСТ), мелітину медоносної бджоли (Іпмігодеп Согрогаїйоп;

Сапзрад, САЇ або бакуловірусу 9рб7 (РпагМіпдеп; Зап Оіедо, САЇ.

Цей рекомбінантний вірус або бакміду використовують для трансфекування клітин-хазяїв. Відповідні клітини-хазяї включають клітинні лінії, отримані з ІРІ.В-51-21, пупальну яєчникову клітинну лінію, наприклад 59 (АТС СІ 1711), 59У21АЕ та 5121 (Іпмігодеп Согроганоп; Зап Оіедо, СА), а також клітини Шнайдера-2

Огозорпйа і клітинну лінію НІСН РІМЕО (Іпмігідеп), отриману з Тгіспоріизіа пі (Пат. США Ме5300435). Для вирощування і зберігання цих клітин можна використати комерційно доступні безсироваткові середовища.

Придатними середовищами для клітин 519 є 51900 ІІ м (І бе ТесппоіІодіеєз) або ЕЕ 921 м (Ехргеззіоп Зувіетв); для клітин Т. пі - середовища ЕхсеО4057м (ЕН Віозсіепсе5, Іепеха, К5) або Ехргез5 Рімео"м (їе

Тесппоіодіе5). При використанні рекомбінантного вірусу клітини, як правило, вирощують від щільності інокуляції приблизно 2-5х105 клітин до щільності 1-2х109 клітин і в цей час додають рекомбінантний вірусний штам при множинності зараження 0,1-10, частіше приблизно 3.

Відомі адаптовані методи продукування рекомбінантних білків в бакуловірусних системах описані авторами: Вайеу еї ап, "Мапіршайоп ої Васшоміги5 Месіоге" іп Меїпоав5 іп МоїІесшіаг Віоіїоду, Моїште 7: Сепе

Тгапегег апа Ехргеззіоп Ргоїюосоїв, Митау (еа.), раде5 147-168 (Те Нитапа Ргезз, Іпс. 1991); Раїеї єї аї., "Те расшомігив ехргезвіоп зувіет", іп ОМА Сіопіпд 2: Ехргезвіоп Зувієтв, 279 Еайоп, Сіомег єї ай, (едвз.), радез 205- 244 (Охога Опімегейу Ргезз 1995); Айвибе! (1995) аї раде5 16-37 (о 16-57; Віспагазоп (еа.), Васшиомігив

Ехргеззіоп Ргоїосоїз (Тпе Нитапа Ргезв, Іпс. 1995), апа І иском, "Іпзесі СеїЇ Ехргезвіоп Тесппоіоду", іп Ргоїєїп

Епадіпеегіпд: Ргіпсірієз апа Ргасіїсе, СівЇіапа еї аї., (едз.), радез 183-218 Юопп Ул/ієу 5 5опв, Іпс. 1996).

Для експресування описаних тут генів можна використовувати грибкові клітини, в тому числі дріжджові клітини. Дріжджі, які становлять особливий інтерес, включають Засспаготусез сегемізіає, Ріспіа равіогіз та

Ріспіа темШапоїїса. Придатними промоторами для експресування в дріжджах є промотори з СА (галактози),

РОК (фосфогліцераткінази), АН (алкогольдегідрогенази), АОХ1 (алкогольоксидази), НІЗН (гістидинолдегідрогенази) тощо. Сконструйовано багато векторів, клонуючих дріжджі, які легко придбати.

Можна сконструювати вектор для генерації структурних компонентів, використовуючи необхідні елементи для здійснення гомологічної рекомбінації в дріжджах Ідив., наприклад, Каутопа еї аї!., Віотесппідиез 26:134 (1999)). Такий вектор експресії, наприклад, може включати послідовності ШКАЗ та СЕМ-АКЗ (автономно реплікуюча послідовність), необхідні для селекції та реплікації в 5. сегемізіає. Інші придатні вектори включають вектори на основі МІр, наприклад Хірб5; вектори на основі Угр, наприклад Мгр17; вектори на основі Мер, наприклад ХУер 13, і вектори на основі Уср, наприклад Хер 19. Методи трансформування клітин 5. сегемізіає за допомогою екзогенної ДНК і продукування рекомбінантних поліпептидів із цих клітин описуються, наприклад,

Камжазакі (пат. США Ме45993111), Каугазакі еї аІ, пат. США Ме4931373, Вгаке, пат. США Ме4870008, УМеїсп еї аї, пат. США Ме5037743 та Мигтау еї аЇ, пат. США Ме4845075.

Трансформовані клітини селектують за фенотипом, визначеним селектованим маркером, зазвичай стійкістю до лікарського препарату або здатністю рости за відсутності конкретної поживної речовини (наприклад, лейцину). Придатною векторною системою для використання в Засспаготусе5 сегемізіае є векторна система РОТІ, описана Кауазакі еї аї. (пат. США Ме4931373|, яка дає можливість трансформувати клітини, які слід селектувати, шляхом вирощування в середовищах, що містять глюкозу. Додаткові придатні промотори і термінатори для використання в дріжджах включають промотори і термінатори з генів гліколітичних ферментів (див., наприклад, Каугазакі, пат. США Ме4599311, Кіпдтап еї аї!., пат. США Ме4615974 та Війцег, пат. США Ме4977092| та генів алкогольдегідрогенази. Див. також патенти США МоМе: 4990446, 5063154, 5139936 та 4661454.

Відомі також трансформаційні системи для інших дріжджів, в тому числі Напзепша роїутогрпа,

Зепігозасспаготусез ротбре, Кіпумхеготусез Іасіїв, Кіпухеготусез Ігадіїїз, О5йШадо тауаїв, Ріспіа равіогів, Ріспіа теїпапоїїса, Ріспіа дийПегтопай та Сапаїда тапйоза. Див., наприклад, Сіеезоп еї аї., У. Сеп. Місгобіо!. 132:3459 (1986) апа Стедд, 05 Раїепі Мо. 4882279. Можна використовувати клітини Азрегоіїпі5 згідно з методами

МекКпідні еї аї., 5 Раїепі Мо. 4935349. Методи трансформування Асгетопішт спгузодепит описані Зитіпо еї а (05 Раїепі Мо. 5162228). Методи трансформування Меигозрога описані Гатром/ії: в пат. США Ме4486533.

Використання Ріспіа теїПпапоїїса як хазяїна для продукування рекомбінантних білків описано в (патентах

США МоМо5716808 і 5736383 (Каутопа), Каутопа еї аїЇ, Меаві 14:11-23 (1998) та в міжнародних заявках

МоМеууО 97/17450, УМО 97/17451, УМО 98/02536 та УМО 98/02565)|. Молекули ДНК для використання в трансформуванні Р. теїпапоїїса можна звичайно отримати у вигляді дволанцюгових кільцевих плазмід, які у кращому варіанті лінеаризують перед трансформацією. При продукуванні поліпептиду в Р.тейапоїса промотор і термінатор в цій плазміді можуть бути промотором і термінатором гена Р.тейапоїїса, наприклад алкоголь використовуючого гена Р.теїШапоїса (АОСїЇ або АШО2). Інші придатні промотори включають промотори генів дигідроксиацзетонсинтази (ОНАБ), форміатдегідрогенази (ЕМО) та каталази (САТ). Для полегшення інтеграції ДНК в хромосому-хазяїн краще мати повний сегмент експресії плазміди, фланкованої з обох кінців послідовностями ДНК-хазяїна. Для використання в Ріспаії теїпапоїса кращим селектованим маркером є ген Р.теїпапоїса АОЕ2, який кодує фосфорибозил-5-аміноїмідазолкарбоксилазу (АІКС; ЕС 4.1.1.21) і який дає можливість клітинам-хазяям аде2 рости за відсутності аденіну. Для великомасштабних промислових процесів, де необхідно мінімізувати використання метанолу, можна застосовувати клітини-хазяї, в яких делетовано обидва гени, що використовують метанол (АОС! та АЦО2). Для продукування секретованих білків клітини-хазяї можна розбавити в генах вакуолярної протеази (РЕРА4 та РЕВІ1). Для полегшення інтродукції в клітини Р.теїпапоїїса плазміди, що містить ДНК, яка кодує поліпептид, що становить інтерес, застосовують електропорацію. Клітини Р.теїмШапоїса можна трансформувати електропорацією, використовуючи експоненціально згасаюче імпульсне електричне поле з напруженістю 2,5-4,5кВ/см, краще приблизно 3,75кКВ/см, та сталою часу () 1-40 мілісекунд, краще приблизно 20 мілісекунд.

Вектори експресії можна також вводити в протопласти рослин, інтактну рослинну тканину або виділені рослинні клітини. Методи введення векторів експресії в рослинну тканину включають пряме зараження рослинної тканини бактерією Адгорасіепит іштеїасіеп5 або ко-культивацію рослинної тканини разом із згаданими бактеріями; метод введення за допомогою налітаючих мікрочастинок, ін'єкцію ДНК, електропорацію тощо. Див., наприклад, Ногзсп еї а!., Зсіепсе 227:1229 (1985), Кіеїп еї а!., Відтесппоіоду 70:268 (1992) апа мікі еї аї., "Ргоседигез г Іпігодисіпд ЕБогеідп ОМА іп Ріапів", іп Меїйойв5 іп Ріапі Моіесшаг Віоіюду апа

Віоїесппоіоду, С1ЇїскК еї аї., (єд5.), радез 67-88 (СВС Ргезвв, 1993).

Як варіант, білки ТАСІ-іїімуноглобулін можна продукувати в прокаріотних клітинах-хазяях. Відповідні промотори, які можна застосовувати для продукування поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін в прокаріотному хазяїні, добре відомі фахівцям і включають промотори, здатні розпізнавати полімерази Т4, Т3, 5рб та 17, Рв- та Рі-промотори бактеріофага лямбда, промотори ігр, гесА, хітшокові промотори, Іасум5-, їас-, Ірр-Іасорг-, рпоА- та Іас/-промотори Е.соїї, промотори В.5!йбій5, промотори бактеріофагів Васійи5, промотори

Змперіотусе5, іпі-промотор бактеріофага лямбда, Біа-промотор рВвк322 та САТ-промотор гена хлорамфеніколацетилтрансферази. Прокаріотні промотори описано в роботах (|ВіїсК, 9. Іпа. Місгобіої. 7:277 (1987), У/аїзоп еї а)!., Моіесшіаг Віоіоду ої те Сепе, 4!" Ед. (Вепіатіп Ситтіпе 1987) апа Аизибеї еї а. (1995)).

Придатними прокаріотними хазяями є Е.соїї та Васіїи5 зибійи5. Придатними штамами Е.соїї є: ВІ 21(ОЕ3),

ВІ21(ОЕЗ)рГуз5, ВІ 21(ОЕЗ)рУзЕ, ЮНІ, ОНЯ1, ОН5, ОН5І, ОН5ОТЕ, ОнН5ЗІМосА, ОоНнтТОов, оНтТОв/р3, ОоНнІ15,

Сб600, НВІТО1, УМ101, УМ105, УМ109, УМ110, К38, КК, М1088, М1089, С5НІ8, ЕК1451 та ЕРК1647 |(див., наприклад, Вгом/п (ед.), Моіесшаг Віоіоду Габтах (Асадетіс Ргез5 1991)). Придатними штамами Васі зибрійи5 є: ВК151, уВ886, МІ119, МІ120 та 8170 Ідив., наприклад, Нагау, "Васійи5 Сіопіпд Меїйпоавз", іп ОМА Сіопіпд: А

Ргасіїса! Арргоасі, Сіомег (єд.) (ІВІ. Ргезв 1985)).

При експресуванні білка ТАСІ-імуноглобулін в бактерії, наприклад Е.соїї, поліпептид можна утримувати в цитоплазмі, як правило, у вигляді нерозчинних гранул, або можна спрямовувати у періплазматичний простір за допомогою бактеріальної секреторної послідовності. У першому випадку клітини лізують, і гранули видаляють і денатурують, використовуючи, наприклад, ізотіоціанат гуанідину або сечовину. Денатурований поліпептид можна потім повторно скласти та димеризувати шляхом розбавлення денатуранту, наприклад шляхом діалізу поруч з розчином сечовини та комбінацією відновленого та окисленого глутаніону та наступного діалізу поруч з буферним сольовим розчином. У другому випадку поліпептид можна видалити з періплазматичного простору в розчинній та функціональній формі шляхом розривання клітин (наприклад, в результаті обробки ультразвуком або осмотичного шоку), щоб вивільнити вміст періплазматичного простору та видалити білок, виключаючи таким чином необхідність денатурації та повторного складання.

Методи експресування білків у прокаріотних клітинах добре відомі фахівцям (Ідив., наприклад, УМІПатв»в еї а!І., "Ехргевзвіоп ої їогеїдп ргоїеїпз іп Е. соїї ивіпуд ріазтій месіогз апа ригіісайоп ої зресіїйс роїусіопа! апііроаіев", іп ОМА Сіопіпд 2: Ехргеввіоп бувівєтв, 279 Едійоп, Сіомег єї аї. (єдв), раде 15 (Охіога Опімегейу Ргев5 1995), УМага еї аї,, "Сепеїййс Мапіршайоп апа Ехргезвіоп ої Апіїродієв", іп Мопосіопа! Апіїбодієв: Ргіпсірієз апа Арріїсайопв, раде 137 |ММіеєу-Іів5, Іпсо. 1995) апа Сеогдіоу, "Ехргеззіоп ої Ргоїєїп5 іп Васієпа", іп Ргоїєїп Епдіпеегіпо:

Ріїіпсірієз апа Ргасіїсе, СієїЇапа еї аї., (єдв.), раде 101 (опп Ул/ієу 5 бопв, Іпс. 1996)).

Стандартні методи введення векторів експресії в бактеріальні, дріжджові клітини та клітини комах і рослин можна знайти, наприклад, у А!изибеї (1995).

Загальні методи експресування та вилучення стороннього білка, продукованого за допомогою клітинної системи ссавців описані, наприклад, (Еіспеме!їту, "Ехргезвіоп ої Епдіпеегей Ргоїєїп5 іп Маттаїап Сеї! Сшиге", іп Ргоївїп Епдіпеегіпд: Рііпсірієз апа Ргасіїсе, Сіеїапа еї аї., (єдв.), раде 163 (УМієу-І із5, Іпс. 1996)). Стандартні методи вилучення білка, продукованого за допомогою бактеріальної системи, описані, наприклад,

ІСгівзпаттег еї аї., "Ригпйсайоп ої омег-ргодисей ргоїєїп5 йот БЕ. соїї сеїЇїв", іп ОМА Сіопіпд 2: Ехргеззвіоп

Зувієтв, 274 Еайоп, Сіомег еї аї. (єдв.), раде5 59-92 (Охіога Опімегейу Ргезв 1995)). Адаптовані методи виділення рекомбінантних білків з бакуловірусної системи описані Кіспагазоп (ейд.), Васшоміги5 Ехргезвіоп

Ргоюсоїв (Те Нитапа Ргезв Іпс. 1995).

Як варіант, запропоновані даним винаходом поліпептиди можна синтезувати ексклюзивним твердофазним синтезом, методом часткової твердої фази, конденсацією фрагментів або класичним синтезом в рідкій фазі. Ці способи синтезу добре відомі (див., наприклад, Ме!гтійейа, У. Ат. Спет. ос. 85:2149 (1963), 5іемагі еї аї!., "Зоїїд

Рназе Реріїде Зупіпевів" (279 Едйіоп), (Рієгсе Спетіса! Со. 1984), Вауег апа Варр. Спнет. Рері. Ргої. 3:3 (1986),

АїШепогп еї а!., 50ЇЇй Ріазе Реріїде Зупіпевів: А Ргасіїса! Арргоасі (ІВІ. Ргевз 1989), Рієїдв апа Соіоміск, "Зоїїа-

Рпазе Реріїде бЗупіпезів", Меїпоав іп ЕпгутоЇоду Моїште 289 (Асадетіс Ргез5 1997) апа Поруа-УлЛіїйатве еї аї.,

Спетіса! Арргоаспез о І(ШПпе Зупіпезіз ої Реріїде5 апа Ргоївіп5 (СКС Ргевз5, Іпс. 1997)). Стандартними також є варіації в загальній стратегії хімічного синтезу, наприклад "нативне хімічне зшивання" та "зшивання експресованого білка" І(див., наприклад, Юамузоп еї аї, Зсіепсе 266:776 (1994), НаскКепо еї аї, Ргос. Маг! Асад.

Зсі. ОБА 94:7845 (1997), Юамувоп, Меїйоаз Епгутої. 287:34 (1997), Миїг єї аї., Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОБА 95:6705 (1998) апа бемеїіпом апа Миїг, у. Віої Снет. 273:16205(1998)). 5. Аналіз злитих білків ТАСІ-імуноглобулін

Функцію злитих білків ТАСІ-імуноглобулін для оцінки їхньої здатності зв'язувати 7ТМЕ4 або 2ТМЕ2 можна досліджувати багатьма методами. Для наочності в Прикладі 4 описуються способи вимірювання спорідненості до зв'язування 2ТМН4 та зв'язуючої здатності 2ТМЕ4.

З іншого боку, злиті білки ТАСІ-імуноглобулін можна ідентифікувати за здатністю інгібувати стимуляцію В- клітин людини за допомогою розчинного 2ТМЕ4, як описується в міжнародній заявці МеУМО 00/40716 (Сго55 еї а!). Стисло, В-клітини людини виділяють з периферійних кров'яних мононуклеарних клітин, використовуючи магнітні гранули СО 19 і систему магнітної сепарації МагіоМас5 (Мімкепуї Віоїесп А!йбигп, СА) за інструкціями виробника. Очищені В-клітини змішують з розчинним 2ТМЕ4 (25нг/мл) і рекомбінантним 1--4 людини (1Онг/мл

Рпагтіпдеп), і ці клітини висівають на круглодонні 96-ямкові планшети по 1х105 клітин на ямку.

Розчинні білки ТАСІ-імуноглобулін можна розбавляти від приблизно 5мкг/мл до приблизно бнг/мл та інкубувати разом з В-клітинами протягом 5 днів, на четвертий день піддаючи вібрації всю ніч, використовуючи

Тис ЗН-тимідину на ямку. Для контрою білок ТАСІ-імуноглобулін можна також інкубувати з В-клітинами та 1І-4 без 2ТМЕ4. Клітини з планшетів збирають за допомогою харвестера Пакарда і рахують за допомогою планшет-ридера Пакарда.

Цей загальний метод використовували для дослідження трьох злитих білків ТАСІ-Ес. Хоча всі злиті білки інгібували проліферацію В-клітин, структурні компоненти ТАСІ (01-29, а111-154)-Рс5 та ТАСІ(а1-29, ат120-154)-

Ес5 були сильнішими, ніж ТАСЦа1-29, а107-154)-Рс5.

Існують добре адаптовані тваринні моделі для тестування іп мімо ефективності білків ТАСІ-імуноглобулін при певних станах хвороби. Наприклад, білки ТАСІ-імуноглобулін можна тестувати на ряді тваринних моделей аутоїмунної хвороби, наприклад штамах МЕ --Ірг/рг або Е1 НЗУХНЗБ мишей, які належать одному роду, які служать моделлю системного червоного вовчака (СЧВ). Такі тваринні моделі відомі (див., наприклад, Сопеп апа міПег (Еадз.), Ашоїттипе Оізеазе Модеї!5: А Сиідероок (Асадетіс Ргезв, Іпс. 1994)).

Нащадки схрещування між новозеландською чорною (НЗЧ) та новозеландською білою (НЗБ) мишами розвивають спонтанну форму СЧВ, яка дуже нагадує СЧВ у людей. Миші-нащадки, відомі як НЗЧБ, починають розвивати аутоантитіла ДМ проти Т-клітин на одному місяці життя, і к 5-7 місяцям аутоантитіла проти ДНК є домінантним імуноглобуліном. Гіперактивність поліклональних В-клітин веде до надсинтезу аутоантитіл.

Відкладення цих аутоантитіл, особливо тих, що спрямовані проти одноланцюгової ДНК, асоціюється з розвитком гломерулонефриту, який проявляється клінічно як протеінурія, азотемія і смерть від ниркової недостатності.

Ниркова недостатність - головна причина смерті мишей, уражених спонтанним СЧВ, і в штамі НЗЧБ цей процес є хронічним і облітеруючим. Ця хвороба протікає скоріше і важкіше у самиць, ніж у самців, із середньою тривалістю життя тільки 245 днів порівняно з 406 днями у самців. Хоча багато з мишей-самиць будуть симптоматичними (протеїнурія) к семи-дев'яти місяцям життя, деякі можуть бути значно молодшими або старшими, коли в них розвинуться симптоми. Смертельний імунонефрит, який спостерігають у НЗЧБ мишей, дуже схожий на гломерулонефрит, який спостерігають при СЧВ людини, що робить цю спонтанну мишину модель дуже привабливою для тестування терапії потенційного СЧВ ІРийегтап апа Марагеїек, "Мигіпе Моде!5 ої б5ропіапеоив І ирив Егуїпетаїйозив", іп Ашіоіттипе Оізеазе Модеїв: А Сцпідерсок, радев 217- 234 |Асадетіс Ргевв5, Іпс. 1994); Монап еї аї., ). Іттипої. 154:1470 (1995); апа Баїки еї аї., 9. Іттипої, 159:3104(1997)|.

Як описують Ого55 еї а)Ї. в міжнародній заявці МеУуУО 00/40716, білки ТАСІ-імуноглобулін можна вводити

НЗЧБ мишам для перевірки його пригнічуючого ефекта на В-клітини упродовж 5-тижневого періоду, коли, в середньому, як вважають, продукування В-клітинних аутоантитіл знаходиться на високих рівнях у НЗЧБ мишей. Стисло, 100 д8-тижневого віку мишей-самиць (НЗУХНЗБ) ЕТ можна поділити на б груп по 15 мишей.

Перед лікуванням у цих мишей перевіряють один місяць білок сечовини, беруть кров на клінічний аналіз і заготовку сироватки. Сироватку можна перевірити на наявність аутоантитіл. Оскільки протеінурія - це ознака-

критерій гломерулонефриту, рівні білка сечовини перевіряють за допомогою показника рівня через регулярні інтервали впродовж усього курсу дослідження. Лікування мишей можна розпочинати приблизно у 5-місячному віці. Миші приймають інтраперитонеальні ін'єкції тільки наповнювача (фізіологічний розчин з фосфатним буфером) або ТАСІ-імуноглобуліну (контрольний білок), або білка ТАСІ-імуноглобулін (наприклад, 20-100мкг контрольного білка на дозу) три рази на тиждень упродовж 5 тижнів.

Кров беруть двічі під час лікування, і візьмуть принаймні двічі після лікування. Величини показника рівня сечовини для протеінурії і масу тіла визначають кожні два тижні після початку лікування. Беруть кров, знімають величину показника рівня сечовини і визначають масу тіла під час еутаназії. Селезінку і тимус розділяють для сортинг-аналізу збуджених флуоресцентних клітин та гістології. Для гістології також беруть піднижньощелепні слинні залози, ланцюг мезентериального лімфовузла, долку печінки з жовчним міхурем, сліпу і товсту кишки шлунок, тонку кишку, підшлункову залозу, праву нирку, надниркову залозу, язик з трахеєю і стравоходом, серце і легені.

Мишині моделі для експериментального алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ) використали як інструмент для дослідження і механізму імунопатологічної хвороби і методів потенційного терапевтичного втручання.

Модель нагадує множинний склероз людини і викликає демієлінізацію як результат активації Т-клітин до нейробілків, наприклад мієлінового головного білка або протеоліпідного білка. Інокуляція з антигеном веде до індукції СО4ж, Т-клітин (ТП1), рестриктованих ГКГ (головним комплексом гістосумісності) І класу. Зміни в протоколі ЕАЕ можуть викликати гострий, хронічнорецидивний або пасивно-перехідний варіанти моделі

ЇМУєїпрего еї аї., У. Іттипої. 162:1818 (1999); Мі)аба еї аї., СеїЇ. Іттипої, 186:94 (1999); апа Спаріпекі, Мей.

Епгут. 288:182 (1997)|.

В міжнародній заявці МеУМО 00/40716 Сго55 еї ам. описують один метод оцінювання ефективності білків

ТАСІ-імуноглобулін в зменшенні інтенсивності симптомів, асоційованих з ЕАЕ. Стисло, 25 самицям мишей

РІХБУОЇ Е1 (12-тижневого віку) роблять підшкірну ін'єкцію 125мкг/мишу антигена (мієліновий протеоліпідний білок (ПЛБ), залишки 139-151), приготованого в повному ад'юванті Фрейнда. Мишей ділять на п'ять груп по 5 мишей. Інтраперитонеальні ін'єкції токсину коклюшу (40Онг) роблять на день 0 і день 2. Групам вводять 1х, 10х або 100х дозу білка ТАСІ-імуноглобулін, одна група буде приймати тільки наповнювач, і одна група не буде приймати лікування. Профілактичну терапію починають з дня 0, втручальну терапію починають на день 7 або при появі клінічних ознак. Ознаки хвороби, втрата ваги і параліч, проявляються приблизно через 10-14 днів і тривають приблизно один тиждень. Тварин щоденно оцінюють шляхом збирання крові і визначення клінічного індексу, щоб співвіднести зі ступенем їхніх симптомів. Клінічні ознаки ЕАЕ з'являються в межах 10-14 днів інокуляції і зберігаються приблизно один тиждень. Наприкінці дослідження всіх тварин безболісно умертвляють наддозою газу і роблять розтин. Мозок і хребет беруть на гістологію або заморожують для аналізу МРНК. По даним про масу тіла і клінічному індексу будують криві по кожній особині і по групах.

В моделі артриту, викликаного колагеном (АВК), миші розвивають хронічний запальний артрит, який дуже нагадує ревматоїдний артрит (РА) людини. Оскільки АВК має аналогічні з РА імунологічні та патологічні ознаки, це робить цю модель ідеальною для перевірки потенційних протизапальних композицій для людини.

Іншою перевагою використання моделі АВК є те, що механізми патогенезу відомі. Ідентифіковано епітопи Т- і

В-клітин на колагені Ії типу, визначено різні імунологічні показники (гіперчутливість сповільненого типу і антитіло проти колагену) і показники запалення (цитокіни, хемокіни і матрицеруйнуючі ферменти), які відносяться до імунопатологічного артриту, і їх можна використовувати для оцінки ефективності композицій в цих моделях (Му/осіеу, Сигт. Оріп. Кпешт. 3:407 (1999); УМіПатє»х еї аї., Іттипої. 89:9184 (1992); Муег»5 еї аї., Се

Зсві. 61:1861 (1997); апа У/апо еї а!., Іттипої!. 92:8955 (1995)|.

У міжнародній (заявці Мо МУО 00/40716 Сго55 еї а.) описують спосіб оцінювання ефективності злитих білків

ТАСІ-імуноглобулін в зменшенні інтенсивності симптомів, асоційованих з АВК. Стисло, самці мишей ОВАЛ. (Часквоп І арв) 8-тижневого віку ділять на групи по 5 мишей і роблять дві підшкірні ін'єкції дозою 50-100мкл колагену концентрації 1Імг/мл (курчачого або бичачого походження) з інтервалами З тижні. Одній контрольній групі ін'єкцій колагену не роблять. Першу ін'єкцію готують в повному ад'юванті Фрейнда, а другу - в неповному ад'юванті Фрейнда. Білок ТАСІ-імуноглобулін вводять профілактично з другою ін'єкцією або перед нею, або після того, як тварина розвине клінічний індекс 2 або більше, який триває принаймні 24 години. Тварини починають виявляти симптоми артриту після другої ін'єкції колагену, як правило, в межах 2-3 тижнів.

Наприклад, контрольний білок ТАСІ-Рс ІДЕсС людини або фізіологічний розчин з фосфатним буфером (наповнювач) можна вводити профілактично, починаючи за 7 днів до другої ін'єкції (день -7). Білки можна вводити по 100мкг три рази на тиждень у вигляді інтраперитонеальної ін'єкції об'ємом 200мкл, і продовжують це робити чотири тижні.

В моделі АВК ступінь хвороби оцінюють в кожній лапі, використовуючи штангенциркуль для виміряння товщини лапи, і встановлюють клінічний індекс для кожної лапи. Наприклад, клінічний індекс "0" означає нормальну мишу, індекс "1" означає, що один або більше пальців стопи запалені, індекс "2" означає легке запалення лапи, індекс "3" означає помірне запалення лапи, і індекс "4" означає сильне запалення лапи.

Тварин безболісно умертвляють після того, як хворобу було встановлено за певний період часу, як правило, це 7 днів. Лапи забирають на гістологію або аналіз мРНК, а сироватку беруть на аналіз імуноглобуліну та цитокіну.

Міастенія гравіс (МГ) - ще одна хвороба, для якої підходять моделі мишей. МГ -це розлад нервово- м'язової передачі в якому бере участь продукування аутоантитіл, спрямованих проти нікотинного ацетилхолінового рецептора. Ця хвороба набуває клінічних ознак або наслідує клінічні ознаки, в тому числі ненормальну слабкість і втому при напруженні.

Мишину модель міастенії гравіс встановлено (СПпгієтадов55 еї аї., "Евіарізптепі ої а Моизе Модеї! ої

МуазШепіа дгаміє м/піспй Мітісв Нитап Муавіпепіа дгаміє Раїйодепевзіє г Іттипе Іпіег/епіоп", іп

Іптптобіоіоду ої Ргоїєїп5 апа Реріїде5 МІ, Агавзві апа Віхіег (еадз.), раде5 195-199 (1995)). Експериментальна аутоїмунна міастенія гравіс - це опосередкована антитілами хвороба, яка характеризується наявністю антитіл до ацетилхолінового рецептора. Ці антитіла руйнують згаданий рецептор, призводячи до дефективних нервово-м'язових електричних імпульсів, і в результаті - до м'язової слабкості. В моделі експериментальної аутоїмунної міастенії гравіс мишей імунізують за допомогою нікотинного ацетилхолінового рецептора. Клінічні ознаки міастенії гравіс стають явними через тижні після другої імунізації. Експериментальну аутоіїмунну міастенію гравіс оцінюють кількома методами, в тому числі вимірюванням рівнів антитіл ацетилхолінового рецептора в сироватці шляхом радіоіїмунного аналізу (Спгізтадоз5 апа Оаимирпіпее, у. Іттипої. 136:2437 (1986);

І Іпазігот еї аїЇ., Меїйоа5з Еплутої. 74:432 (1981)), вимірюванням ацетилхолінового рецептора м'язів або електроміографією (Соїїдап еї а!. (Едв.), Ргоїюсої5 іп Іттипоіоду. Мої. 3, раде 15.8.1 (Чонп УЛієу в Зопв, 1977)|.

Вплив ТАСІ-імуноглобуліну на експериментальну аутоїмунну міастенію гравіс можна визначати шляхом введення злитих білків упродовж протікання клінічної міастенії гравіс у мишей ВО. Наприклад, 100 мишей ВО імунізують за допомогою 20мкг ацетилхолінового рецептора в повному ад'юванті Фрейнда на день 0 і 30.

Приблизно 40-6095 мишей розвинуть помірну (ступінь 2) - важку, (ступінь 3) клінічну міастенію гравіс після повторної імунізації адцетилхоліновим рецептором. Мишей з клінічною хворобою ступеней 2 і З ділять на три групи (з однаковими ступенями слабкості), зважують (миші зі слабкістю також втрачають вагу, оскільки мають утруднення із споживанням їжі та води) і беруть кров для сироватки (для попереднього введення антитіл проти ацетилхолінового рецептора та ізотопів). Групі А вводять інтраперитонеально фізіологічний розчин з фосфатним буфером, групі В вводять інтраперитонеально ІдДО-Ес людини як контрольний білок (100мкг), і групі С вводять 100мкг ТАСІ-Рс три рази на тиждень упродовж чотирьох тижнів. Мишей перевіряють на клінічну м'язову слабкість двічі на тиждень, зважують і беруть кров для сироватки на день 15 і день 30 після початку лікування. Всю кров збирають на день 15 для визначення співвідношення Т-клітин і В-клітин методом аналізу за допомогою клітинного сортера з активацією флуоресценції, використовуючи маркери 8220 і СО5.

Мишей, які вижили, вбивають через 30-45 днів після початку лікування, і їхні тушки заморожують для наступної екстракції м'язового ацетилхолінового рецептора і визначення втрати м'язового ацетилхолінового рецептора, головну патологію при міастенії гравіс (див., наприклад, Соїїдап еї аї. (Ед5.), Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, Мо!.3, раде 15.8.1 (онп УЛієу в Зопв, 1997)).

Сироваткові антитіла проти м'язового ацетилхолінового рецептора можна визначити традиційним радіоїмунним аналізом, а ізотопи (9М, ІдС1, Ідс2Б6 та Ідс2с) антитіл проти ацетилхолінового рецептора виміряють, використовуючи ферментний імуносорбентний тест (ЕГІ5А). Ці методи відомі. Визначають вплив

ТАСІ-імуноглобуліну на протікання клінічної міастенії гравіс, рівень антитіл проти ацетилхолінового рецептора та ізотопів і втрату м'язового ацетилхолінового рецептора.

На день 0 і день 30 можна імунізувати приблизно 100 мишей за допомогою 20мкг ацетилхолінового рецептора, приготованого в повному ад'юванті Фрейнда. Мишей з клінічною міастенією гравіс ділять на чотири групи. Групі А вводять інтраперитонеально 100мкг контрольного Ес, групі В-20мкг контрольного Ес, групі С - 100Омкг ТАСІ-Ес і групі О-20мкг ТАСІ-Ес три рази на тиждень упродовж чотирьох тижнів. Мишей зважують і беруть кров для сироватки на день 15 і день 30 після початку лікування. Сироватку перевіряють на антитіла проти ацетилхолінового рецептора та ізотопи, як описувалось вище. Можна також виміряти втрату м'язового ацетилхолінового рецептора.

Фахівці в цій галузі можуть застосовувати інші придатні методи аналізу злитих білків ТАСІ-імуноглобулін. 6. Продукування кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін

Даний винахід включає хімічно модифіковані композиції ТАСІ-імуноглобулін, в яких поліпептид ТАСІ- імуноглобулін зв'язаний з полімером. Як правило, цей полімер є водорозчинним, так що кон'югат ТАСІ- імуноглобулін не осаджується у водному середовищі, наприклад фізіологічному середовищі. Прикладом придатного полімеру є полімер, модифікований так, щоб мати одну реакційну групу, наприклад активний складний ефір для ацилювання або альдегід для алкілування. Таким шляхом можна контролювати ступінь полімеризації. Прикладом реактивного альдегіду є поліетилен глікольпропіональдегід або його моно-(С1-

Сіо)алкокси- або арилоксидеривати (див., наприклад, Нагтіз еї аІ., О5 Раїепі Мо. 5252714). Цей полімер може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Більш того, для продукування кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін можна застосовувати суміш полімерів.

Кон'югати ТАСІ-імуноглобулін, застосовувані для лікування, можуть містити частини фармацевтично прийнятних водорозчинних полімерів. Придатними водорозчинними полімерами є поліетиленгліколь (ПЕГ), монометокси-ПЕГ, моно-(С1-С1о)далкокси-ПЕГ, арилокси-ПЕГ, полі-(М-вінилпіролідон)ПЕГ, тресилмонометокси-

ПЕГ, пропіональдегід-ПЕГ, бБібз-сукцинімідилкарбонат-ПЕГ, гомополімери поліетиленгліколю, співполімер поліпропіленоксиду і етиленоксиду, поліоксиетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт, декстран, целюлоза або інші полімери на основі карбогідрату. Придатний ПЕГ має молекулярну масу приблизно 600-60000, в тому числі, наприклад, 5000, 12000, 20000 їі 25000. Кон'югат ТАСІ-імуноглобулін може також містити суміш таких водорозчинних полімерів.

Один приклад кон'югату ТАСІ-імуноглобулін містить ТАСІ-імуноглобулінову частину і поліалкілоксидну частину, прикріплену до М-кінця ТАСІ-імуноглобуліну. ПЕГ є одним таким придатним поліалкілоксидом.

Наприклад, ТАСІ-імуноглобулін можна модифікувати за допомогою ПЕГ, цей процес відомий як "поліетиленгліколізація". Поліетиленгліколізацію ТАСІ-імуноглобуліну можна здійснювати будь-якою з відомих реакцій поліетиленгліколізації (див., наприклад, ЕР 0154316, Оеїдадо еї аї., Стйіса! Кеміему5 іп Тнегарешіс Огид

Сатег Зузієтвз 9:249 (1992), ЮОипсап апа 5ргеєаїйсо, Сіїп. Рпаппасокмєї. 27:290 (1994), апа Ргапсів еї аї., п. У

Нетаїйо! 68:1 (1998)). Наприклад, поліетиленгліколізацію можна здійснювати реакцією ацилювання або алкілування за допомогою реакційної молекули поліетиленгліколю. В іншому методі кон'югат ТАСІ- імуноглобулін формують, конденсуючи активований ПЕГ, в якому кінцеву гідрокси- або аміногрупу ПЕГ було замінено активованим лінкером (див., наприклад, Когавзіеміс еї аІ., О5 Раїепі Мо. 5382657).

Поліетиленгліколізація шляхом ацилювання, як правило, потребує взаємодії активного складного ефіру, деривату ПЕГ, з поліпептидом ТАСІ-імуноглобулін. Прикладом ефіру активованого ПЕГ є ПЕГ, естерифікований до М-гідроксисукциніміду. Використаний тут термін "ацилювання" включає наступні типи зв'язків між ТАСІ-імуноглобуліном і водорозчинним полімером: амід, карбамат, уретан тощо. Методи отримання поліетиленгліколізованого ТАСІ-імуноглобуліну шляхом ацилювання, як правило, передбачають етапи: а) взаємодію поліпептиду ТАСІ-імуноглобулін з ПЕГ (наприклад, реакційним ефіром альдегіду, похідного ПЕГ) за умов, за яких одна або більше груп ПЕГ прикріплюються до ТАСІ-імуноглобуліну, і б) отримання продукту (продуктів) реакції. Взагалі ж, оптимальні реакційні умови для реакцій ацилювання визначатимуть на основі відомих параметрів і заданих результатів. Наприклад, чим більше співвідношення

ПЕГ:ТАСІ-імуноглобулін, тим більше процентний вміст продукту поліетиленгліколізований ТАСІ-імуноглобулін.

Продуктом поліетиленгліколізації шляхом ацилювання є, як правило, продукт поліетиленгліколізований

ТАСІ-імуноглобулін, в якому лізинові є-аміногрупи поліетиленгліколізують через ацильну зв'язуючу групу.

Прикладом з'єднувального зв'язку є амід. Як правило, отриманий в результаті ТАСІ-імуноглобулін буде принаймні на 9595 моно-, ди- або триполіетиленгліколізованим, хоча можна формувати деякі види з більшими ступенями поліетиленгліколізації в залежності від реакційних умов. Поліетиленгліколізовані види можна відокремлювати від некон'югованих полі пептидів ТАСІі-імуноглобулін, застосовуючи стандартні методи очищення, наприклад діаліз, ультрафільтрування, іонообмінну хроматографію, афінну хроматографію тощо.

Поліетиленгліколізація шляхом алкілування, як правило, включає в себе взаємодію кінцевого альдегіду, похідного ПЕГ, з ТАСІ-імуноглобуліном у присутності відновника. Групи поліетиленгліколю можна прикріплювати до поліпептида через групу -СНо-МН.

Отримання шляхом заміщення через відновлювальне алкілування для створення монополіетиленгліколізованого продукту використовує різну реакційну здатність різних типів первинних аміногруп, доступних для реакції заміщення. Як правило, реакцію здійснюють при рН, який дає можливість скористатися різницями в ступенях кислотності між є-аміногрупами лізинових залишків та с-аміногрупою М- кінцевого залишку білка. Шляхом такої вибіркової реакції заміщення керують прикріпленням водорозчинного полімеру, що містить реакційну групу, наприклад альдегід, до білка. Кон'югація з полімером відбувається, головним чином, на М-кінці білка без значної модифікації інших реакційних груп, наприклад аміногруп бічного ланцюга лізину. Даний винахід пропонує, головним чином, однорідну композицію монополімерних кон'югатів

ТАСІ-імуноглобулін.

Відновлювальне алкілування для продукування, головним чином, однорідної сукупності молекул монополімерного кон'югату ТАСІ-імуноглобулін може включати етапи: а) взаємодію поліпептиду ТАСІ- імуноглобулін з реакційним ПЕГ за умов відновлювального алкілування при рН, придатному для здійснення селективної модифікації с-аміногруп на амінокінці ТАСІ-імуноглобуліну, і б) отримання продукту (продуктів) реакції. Відновник, застосовуваний для відновлювального алкілування, повинен бути стабільним у водному розчині і здатним відновлювати тільки шифову основу, утворену напочатку відновлювального алкілування.

Прикладами відновників є борогідрид натрію, ціаноборогідрид натрію, боран диметиламіну, боран триметиламіну і боран піридину.

Для однорідної, головним чином, сукупності монополімерних кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін реакційні умови для відновлювального алкілування є такими, що дають можливість селективного прикріплення частини водорозчинного полімеру до М-кінця ТАСІ-імуноглобуліну. Ці реакційні умови, як правило, передбачають різницю між ступенями кислотності лізинових аміногруп і а-аміногруп на М-кінці рН також впливає на співвідношення полімер-білок, яке необхідно застосувати. Як правило, якщо рН нижче, то для досягнення оптимальних умов буде необхідний більший надлишок полімеру відносно білка, тому що чим менш реакційною є М-кінцева а-аміногрупа, тим більше необхідно полімеру. Якщо рН вище, співвідношення полімер-

ТАСІ-імуноглобулін може не бути таким великим, бо реакційні групи доступні. Зазвичай рН знаходиться в межах 3-9 або 3-6.

Іншим фактором є молекулярна маса водорозчинного полімеру. Як правило, чим вище молекулярна маса полімеру, тим менше кількість полімеру, яку можна прикріплювати до білка. Для реакцій поліетиленгліколізації типовою молекулярною масою є приблизно 2-100кДа, приблизно 5-50кДа або приблизно 12-25кДа. Молярне відношення водорозчинного полімеру до ТАСІ-імуноглобуліну знаходиться, як правило, в межах 1:1-100:1.

Типово, молярне відношення водорозчинного полімеру до ТАСІ-імуноглобуліну становитиме 1:1-20:1 для поліполіетиленгліколізації і 1:1-5:1 для монополіетиленгліколізації.

Загальні методи продукування кон'югатів, що містять частини поліпептиду і водорозчинного полімеру, в галузі відомі. Див., наприклад, (Кагазієміс: єї аі., О5 Раїєпі Мо. 5382657, Стгеепмжаїй еї аі., 05 Раїєпі Мо. 5738846, Мієтоп еї аї., Сіїп. Рнагтасої. ТНег. 59:636 (1996), Мопкагзн еї а!., Апаі. Віоснет. 247:434 (1997)).

Даний винахід розглядає композиції, що містять описаний тут пептид або поліпептид. Такі композиції можуть додатково містити носій. Носієм може бути традиційний органічний або неорганічний носій, наприклад вода, буферний розчин, спирт, пропіленгліколь, макроголь, кунжутна олія, кукурудзяна олія тощо. 7. Виділення поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін

Запропоновані даним винаходом поліпептиди можна очистити до чистоти принаймні 8095, принаймні 90905.

Принаймні 9595 або більше стосовно до забруднюючих макромолекул, зокрема інших білків та нуклеїнових кислот, та звільнити від інфекційних та пірогенних агентів. Запропоновані поліпептиди можна також очистити до фармацевтично чистого стану, тобто більш ніж до 99,995 чистоти. В деяких композиціях очищений поліпептид здебільшого не містить інших поліпептидів, зокрема інших поліпептидів тваринного походження.

Для отримання композицій синтетичних поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін та рекомбінантних поліпептидів

ТАСІ-імуноглобулін, очищених від рекомбінантних клітин-хазяїв, можна використовувати методи фракціонування та/(або звичайного очищення. Для фракціонування зразків, як правило, можна використовувати преципітацію сульфату амонію та кислотне або хаотропне екстрагування. Наприклад, етапи очищення можуть включати гідроксиапатит, розмірну ексклюзію, рідинну хроматографію високого розділення та рідинну хроматографію високого розділення з оберненою фазою. Відповідні хроматографічні середовища включають отримані шляхом заміщення декстрани, агарозу, целюлозу, поліакриламід, спеціалізовані оксиди кремнію тощо. Придатними є похідні поліетиленгліколю (ПЕГ), діетиламіноетилу (ДЕАЕ), глутамінаміноетилу (ГАЕ) та глутаміну (Г). Прикладами хроматографічних середовищ є середовища, отримані за допомогою фенілових, бутилових або октилових груп, наприклад феніл-сефароза ЕЕ (Рпагтасіа), тойопербутил 650 (То50

Наах, МопідотегуміПе, РА), октил-сефароза (Рпагтасіа) тощо; або поліакрилатні смоли, наприклад амберхром

Со 71 (То5о Наах) тощо. Відповідні тверді носії включають скляні гранули, смоли на основі оксиду кремнію, целюлозні смоли, гранули агарози, гранули зшитої агарози, гранули полістиролу, смоли зшитого поліакриламіду тощо, які є нерозчинними в умовах, в яких їх слід використовувати. Ці носії можна модифікувати реакційними групами, які роблять можливим прикріплення білків аміногрупами, карбоксильними групами сульфгідрильними групами, гідроксильними групами та/або карбогідратними частинами.

Прикладами хімічних технологій спряження є активація бромціану, активація М-гідроксисукциніміду, активація епоксисполуки, сульфгідрильна активація, активація гідразиду, та карбоксильні та амінопохідні для хімічних технологій спряження карбодиіміду. Ці та інші тверді середовища добре відомі, широко застосовуються в цій галузі і їх можна придбати у фірм-постачальників. Вибір конкретного методу виділення поліпептиду та очищення - справа звичайного плану досліду і визначається частково властивостями вибраного носія. Див., наприклад, Айпйу Спготайодгарпу: Ргіпсірієз 85 Меї/оаз (Рпагтасіа І КВ Віоїесппоіоду 1988) апа Ооопап, Ргоївїп Рипісайоп Ргоїосоїв (Те Нитапа Ргевв 1996).

Фахівці в цій галузі можуть розробити додаткові варіанти виділення і очищення ТАСІ-імуноглобуліну.

Наприклад, для виділення великих кількостей білка шляхом імуноафінного очищення можна застосувати антитіла проти ТАСІ або проти Ес.

Запропоновані даним винаходом поліпептиди можна також виділяти, використовуючи конкретні властивості. Наприклад, для очищення білків з високим вмістом гістидину, в тому числі білків, що містять полігістидинові мітки, можна застосувати адсорбційну хроматографію імобілізованих іонів металу. Стисло, спочатку заряджають гель іонами двовалентного металу, щоб утворити хелат |ЗийЇКомувКі, Тгтепаз іп Віоспет. 31 (1985)). Білки з високим вмістом гістидину будуть адсорбуватись в цю матрицю з різними ступенями спорідненості в залежності від використаного іону металу, і будуть вимиватися в результаті конкурентної елюції знижуючи рН, або використання сильних хелатоутворюючих агентів. Інші способи очищення включають очищення глікозильованих білків афінною хроматографією лектину, хроматографією білка А та іонообмінною хроматографією |М.Оецізснетг, (єед.),Меїн. Епгутої!. 182:559 (1990).

Поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін або їх фрагменти можна також утворити хімічним синтезом, як вже описувалось. Поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін можуть бути мономерами або полімерами; глікозильованими або неглікозильованими, поліетиленглікозильованими або неполіетиленглікозильованими, і можуть включати залишок початкової метіонінової амінокислоти або не включати його. Злитий білок ТАСІ-імуноглобулін може бути неглікозильованим, глікозильованим або глікозильованим лише в частині ТАСІ або в імуноглобуліновій частині. Імуноглобулінову частину можна отримати з антитіла людини, химерного антитіла або олюдненого антитіла. 8. Терапевтичне застосування поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін

Білки ТАСІ-імуноглобулін можна використовувати для модуляції імунної системи шляхом зв'язування 7ТМЕ4 або 2ТМЕ2, і, таким чином, запобігаючи зв'язуванню цих лігандів з ендогенними рецепторами ТАСІ або

ВСМА. В зв'язку з цим даний винахід включає застосування білків ТАСІ-імуноглобулін до суб'єкту, якому не вистачає адекватної кількості рецепторів ТАСІ або ВСМА, або який виробляє надлишок 2ТМЕ4 або 7ТМЕ2. Ці молекули можна вводити будь-якому суб'єкту, що потребує лікування, і даний винахід розглядає і ветеринарне терапевтичне застосування, і терапевтичне застосування для людини. Суб'єкти включають суб'єктів-ссавців, наприклад сільськогосподарських тварин, домашніх тварин і пацієнтів-людей.

Поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін можна використовувати для лікування аутоімунних хвороб, видів раку В- клітин, імуномодуляції, хвороб, що розповсюджуються комахами, та будь-яких патологій, пов'язаних з антитілами (наприклад, непрямої Т-клітинної патології, міастенії гравіс тощо), ниркових хвороб, непрямої Т- клітинної імунної реакції, відторгнення трансплантата і реакції "трансплантат проти хазяїна". Запропоновані даним винаходом поліпептиди можуть бути мішенями, зокрема для регулювання гуморальних імунних реакцій під час імунної реакції. Крім того, запропоновані поліпептиди можна використовувати для модуляції розвитку

В-клітин, розвитку інших клітин, продукування антитіл і цитокінів. Запропоновані поліпептиди можуть також модулювати комунікацію Т- і В-клітин шляхом нейтралізації проліферативних ефектів 4ТМЕ4.

Запропоновані поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін можуть бути корисними для нейтралізації ефектів 2ТМЕ4 при лікуванні пре-В- або В-клітинних лейкозів, наприклад плазмоцитарного лейкозу, хронічного або гострого лімфолейкозу, мієлом, наприклад множинної мієломи, дифузної ендотеліоми кісток та гігінтоклітинної остеобластоми, та лімфом, наприклад лімфоми не Ходжкіна, з якою пов'язане збільшення поліпептидів 7ТМРА. 2ТМЕ4 експресується в клітинах СОвж, моноцитах, дендритних клітинах, активованих моноцитах, що означає, що при певних аутоїмунних розладах цитотоксичні Т-клітини могли стимулювати продукування В- клітин через надлишкове продукування 2ТМЕ4. Білки імунодепресантів, які селективно блокують дію В- лімфоцитів, стали б у пригоді для лікування хвороби. Продукування аутоантитіл є загальним для кількох аутоїмунних захворювань і сприяє пошкодженню тканини та загостренню хвороби. Аутоантитіла можуть також привести до виникнення ускладнень у вигляді відкладення імунних комплексів і привести до багатьох симптомів системного червоного вовчака, в тому числі ниркової недостатності, невралгічних симптомів і смерті. В багатьох станах хвороби також було б вигідним модулювання продукування антитіл незалежно від клітинної реакції. Виявили також, що В-клітини відіграють роль в секреції артритогенних імуноглобулінів при ревматоїдному артриті. Як таке, інгібування продукування антитіл 7ТМЕ4 було б корисним в лікуванні аутоїмунних хвороб, таких як міастенія гравіс, ревматоїдний артрит, багатосуглобна хвороба Стила та псоріатичний артрит. Для таких цілей корисним було б лікування імунодепресантами, наприклад білками ТАСІ- імуноглобулін, які селективно блокують або нейтралізують дію В-лімфоцитів.

Даний винахід пропонує способи застосування білків ТАСІ-імуноглобулін для селективного блокування або нейтралізації дій В-клітин на кінцевій стадії ниркових хвороб, які можуть бути пов'язані або непов'язані з аутоїмунними хворобами. Ці способи також були б корисними для лікування імунологічних ниркових хвороб. Ці способи також були б корисними для лікування гломерулонефритів, пов'язаних з такими хворобами, як мембранна нефропатія, нефропатія, пов'язана з ІДА, або хвороба Бергера, нефропатія, пов'язана з ІМ,

хвороба Гудпасчера, постінфекційний гломерулонефрит, мезангіопроліреративна хвороба, хронічний лімфолейкоз, нефротичний синдром з мінімальними змінами. Ці способи могли б також служити терапевтичними аплікаціями для лікування вторинного гломерулонефриту або васкуліту, пов'язаному з такими хворобами, як звичайний вовчак, поліартеріїт, хвороба Геноха-Шенлейна, склеродермія, ВІЛ-пов'язані хвороби, амілоїдоз або гемолітикоуремічний синдром. Запропоновані даним винаходом способи були б також корисними як частина терапевтичної аплікації для лікування інтерстиціального нефриту або пієлонефриту, пов'язаному з хронічним пієлонефритом, зловживання аналгетиками, нефрокальциноз, нефропатія, викликана іншими агентами, нирковокам'яна хвороба або хронічний чи гострий інтерстиціальний нефрит.

Запропоновані способи можуть також включати використання білків ТАСІ-імуноглобулін в лікуванні гіпертонічної хвороби або хвороби крупних судин, в тому числі стеноз або закупорювання ниркової артерії та холестеринові емболи або ниркові емболи.

Даний винахід також пропонує способи лікування ниркових або урологічних пухлин, множинних мієлом, лімфом, нейропатії легкого ланцюга або амігоідозу.

Винахід також пропонує способи блокування або інгібування активованих В-клітин за допомогою білків

ТАСІ-імуноглобулін для лікування астми або інших хронічних хвороб дихальних шляхів, наприклад бронхіту та емфіземи. Описані тут білки ТАСІ-імуноглобулін також можна використати для лікування синдрому Шегрена.

Винахід також пропонує способи інгібування або нейтралізації Т-клітинної імунної реакції ефектора за допомогою білків ТАСІ-імуноглобулін, для використання в імуносупресії, зокрема для лікування реакції "трансплантат проти хазяїна" та відторгнення трансплантата. Більш того, білки ТАСІ-імуноглобулін були б корисними для лікування таких аутоїмунних хвороб, як інсулінозалежний цукровий діабет або хвороба Крона.

Запропоновані способи мали б додаткову терапевтичну цінність при лікуванні хронічних запальних хвороб, зокрема для зменшення болю в суглобах, припухлості, анемії та інших асоційованих симптомів, а також для лікування септичного шоку.

Існують адаптовані тваринні моделі для тестування іп мімо ефективності запропонованих білків ТАСІ- імунолобулін при певних станах хвороби. Зокрема, білки ТАСІ-імуноглобулін можна тестувати іп мімо в ряді тваринних моделей аутоіїмунної хвороби, наприклад лініях МР -Ірг/рг мишей або лініях НЗУХНЗБ Е1 конгенних мишей, які служать моделлю системного червоного вовчака (СЧВ). Такі тваринні моделі відомі.

Нащадки схрещування між новозеландськими чорними (НЗУ) і новозеландськими білими (НЗБ) мишами розвивають спонтанну форму СЧВ, яка дуже нагадує СЧВ у людей. Миші-нащадки, відомі як НЗЧБ, починають розвивати аутоантитіла класів (ДМ проти Т-клітин в одномісячному віці і к 5-7 місяцям аутоантитіла Ід проти

ДНК є домінантним імуноглобуліном. Поліклональна гіперактивність В-клітин призводить до перевиробництва аутоантитіл. Відкладення цих аутоантитіл, зокрема тих, що спрямовані проти одноланцюгової ДНК, асоціюються з розвитком гломерулонефриту, який клінічно проявляється як протеінурія, азотемія і смерть через ниркову недостатність. Ниркова недостатність - головна причина смерті мишей, уражених спонтанним

СЧВ, і в лінії НЗ3ЧБ цей процес є хронічним і облітеративним. Хвороба протікає швидше і важкіше у самиць, ніж у самців, з середньою тривалістю життя лише 245 днів у самиць порівняно з 406 днями у самців. Хоча багато з мишей-самиць будуть симптоматичними (протеїнурія) к 7-9 місяцям життя, деякі можуть бути значно молодшими або старшими, коли в них розвинуться симптоми. Смертельний імунонефрит, який спостерігають у НЗЧБ мишей, дуже схожий на гломерулонефрит, який спостерігають при СЧВ людини, що робить цю спонтанну мишину модель дуже привабливою для тестування потенційної терапії СЧВ.

Мишині моделі для експериментального алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ) використали як інструмент для дослідження і механізмів імунопатологічної хвороби, і методів потенційного терапевтичного втручання.

Модель нагадує множинний склероз людини і викликає демієлінізацію як результат активації Т-клітин до нейробілків, наприклад мієлінового головного білка або протеоліпідного білка. Інокуляція з антигеном веде до індукції СО4- ГКГ(головним комплексом гістосумісності)-рестриктованих Т-клітин (ТА1). Зміни в протоколі ЕАЕ можуть викликати гострий, хронічно-рецидивний або пасивно-перехідний варіанти моделі.

Іншою перевагою використання моделі АВК є те, що механізми патогенезу відомі. Ідентифіковані епітопи Т- |і

В-клітин на колагені ІІ типу, визначені різні імунологічні показники (гіперчутливість сповільненого типу та антитіло проти колагену) і показники запалення (цитокіни, хемокіни і матрицеруйнуючі ферменти), які відносяться до імунопатологічного артриту, і їх можна використовувати для оцінки ефективності композицій в цих моделях.

Міастенія гравіс (МГ) - ще одна аутоїмунна хвороба, для якої підходять моделі мишей. МГ - розлад нервово-м'язової передачі, в якій бере участь продукування аутоантитіл, спрямованих роти нікотинного ацетилхолінового рецептора (АХР). МГ набуває клінічних ознак або наслідує клінічні ознаки, в тому числі слабкість і втому при напруженні. Мишину модель МГ установлено. Експериментальна аутоїмунна міастенія гравіс (ЕАМГ) - це опосередкована антитілами хвороба, яка характеризується наявністю антитіл до АХР. Ці антитіла руйнують згаданий рецептор, призводячи до дефективних нервово-м'язових електричних імпульсів, і в результаті до м'язової слабкості. В моделі ЕАМГ мишей імунізують за допомогою нікотинного АХР. Клінічні ознаки МГ стають явними через тижні після другої імунізації. ЕАМГ оцінюють кількома методами, в тому числі вимірюванням рівнів антитіл АХР в сироватці шляхом радіоіїмунного аналізу, вимірюванням АХР м'язів або електроміографією.

Взагалі, доза білка ТАСІ-імуноглобулін, яку вводять, буде мінятися в залежності від таких факторів, як вік суб'єкту, вага, зріст, стать, загальний медичний стан і попередня історія хвороби. Як правило, необхідно ввести пацієнту дозу білка ТАСІ-імуноглобулін, яка знаходиться вмежах 1пг/кг-1Омг/кг (кількість агента на масу суб'єкту), хоча в залежності від обставин можна також вводити меншу або більшу дозу.

Введення білка ТАСІ-імуноглобулін суб'єкту може бути внутрішньовенним, внутрішньоартеріальним, інтраперитонеальним, внутрішньом'язовим, підшкірним, інтраплевральним, внутрішньооболонковим, шляхом перфузії через катетер або шляхом ін'єкції прямо всередину ураження. Введення терапевтичних білків шляхом ін'єкції може бути у вигляді безперервного вливання або одноразового чи багаторазових болюсів.

Додаткові шляхи введення включають пероральний, в мембрану слизової оболонки, легеневий та черезшкірний. Пероральне введення підходить для поліефірних мікросфер, зеінових мікросфер, протеіноїдних мікросфер, поліціаноакрилатних мікросфер і систем на основі ліпідів (див., наприклад, біВвазе апа Мо!гтеї, "Огаї

Оеєїїмегу ої Місгтоепсаргшаїеа Ргоїеїпв", іп Ргоїєїп Оєїїмегу: Рпузіса! Зузіеєтв, Запаегз апа Непагеп (едвз.), радез 255-288 (Ріеєпит Ргезв 1997)Ї. Прикладом внутрішньоносового введення може служити введення інсуліну

Ідив., наприклад, Ніпспсійе апа Шит, Адм. Огид Оеїїм. Кем. 35:199 (1999)).Сухі або рідкі частинки, що містять

ТАСІ-імуноглобулін, можна готувати та вдихати у вигляді дисперсій сухого порошку, за допомогою рідких аерозольних генераторів або розпилювачів |наприклад, Рейй апа ботброї, ТІВТЕСН 16:343 (1998); Рацоп єї а!І., Аду. Огид Оеєїїм. ВНеу. 35:235 (1999)). Прикладом цього методу є система АЕКХ для лікування діабету, яка являє собою електронний інгалятор, що утримується рукою і транспортує інсулін у формі аерозолю в легені.

Дослідження показали, що білки розміром 48000кДа транспортуються крізь шкіру в терапевтичних концентраціях за допомогою низькочастотного ультразвуку, що ілюструє можливість черезшкірного введення

ІМіїгадоїгі еї аІ., зсіепсе 269:850 (1995))Ї. Трансдермальне транспортування з використанням електропорації забезпечує інший метод введення білка ТАСІ-імуноглобулін (Ройз еї а!., Рпагт. Віоїеснпої!. 70:213 (1997).

Фармацевтичну композицію, що містить білок ТАСІ-імуноглобулін, можна приготувати за відповідними методами приготування фармацевтично корисних композицій, згідно з якими терапевтичні білки поєднують у вигляді суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Композицію називають "фармацевтично прийнятним носієм", якщо її введення переноситься пацієнтом-реципієнтом. Одним прикладом фармацевтично прийнятного носія є стерильний фізіологічний розчин з фосфатним буфером. Фахівцям в цій галузі відомі й інші придатні носії. Див., наприклад, |Сеппаго (єд.), Ветіпдіюоп'є Рнагтасеціїса! Зсієпсев, 1917 Едійоп (Маск

Рибіїзпіпда Сотрапу 1995))|.

З лікувальними цілями білки ТАСІ-імуноглобулін вводять пацієнту в терапевтично ефективній кількості.

Кажуть, що білок ТАСІ-імуноглобулін і фармацевтично прийнятний носій вводять у "терапевтично ефективній кількості", якщо кількість, яку вводять, є фізіологічно значущою. Агент є фізіологічно значущим, якщо його присутність дає в результаті виявну зміну у фізіології пацієнта-реципієнта. Наприклад, застосований для лікування запалення агент є фізіологічно значущим, якщо його присутність зменшує запальну реакцію. Ще один приклад: агент, застосований для інгібування росту пухлинних клітин, є фізіологічно значущим, якщо введення цього агента веде до зменшення кількості пухлинних коїтин, зменшення метастазу, зменшення розміру твердої пухлини або збільшення некрозу пухлини. Далі, агент, використаний для лікування системного червоного вовчака, є фізіологічно значущим, якщо введення цього агента веде до зменшення циркулюючих антитіл проти дволанцюгової ДНК або до зменшення принаймні одного з наступних симптомів: лихоманки, болю в суглобах, патологічних змін еритематозної шкіри або інших ознак системного червоного вовчака.

Прикладом загального показника того, що білок ТАСІ-імуноглобулін введено у терапевтично ефективній кількості є те, що після введення суб'єкту спостерігають зменшення циркулюючих рівнів 2ТМЕ4 (ВІУБ).

Фармацевтичну композицію, що містить білок ТАСІ-імуноглобулін, можна приготувати в рідкій формі, у вигляді аерозолю або в твердій формі. Рідкі форми являють собою впорскувані розчини і суспензії для перорального введення. Тверді форми включають капсули, таблетки і форми з контрольованим вивільненням.

Прикладом останньої форми є мініосмотичні насоси та імплантати (Вгетег еї аї., Рнапт. Віоїесппої. 10:239 (1997); Вападе, "Ітріапів іп Огид Оеєїїмегу", іп Опд Оеєїїмегу бувіетв, Нападе апа Ноїїпдег (едз.), радез 95-123 (САС Ргезз 1995); Вгетег еї аї., "Ргоїєїп Оєїїмегу мйй Іпбивіоп Ритрв", іп Ргоїєїп Оеєїїмегу: Рпузіса! бЗувіетв,

Западеге апа Непагеп (едв».), раде5 239-254 (Рієпит Ргев5 1997); Мемєу еї аї., "ОєвіІїмегу ої Ргоїєїп5 Пот а

Сопігоїей Реїєазе Іпіесіаріє Ітріапі", іп Ргоїєїп ОєїЇїмегу: Рпузіса! Зузієтв, Запаегв5 апа Непагеп (єаз.), раде5 93-117 (Ріепит Ргевзв 1997))|.

Одним з засобів введення суб'єкту терапевтичних поліпептидів, внутрішньовенно, інтраперитонеально, внутрішньооболонково, внутрішньом'язово, перорально, вдиханням або інтраназально, є ліпосоми. Ліпосоми - це мікроскопічні бульбашки, які складаються з одного або більше ліпідних бішарів, що оточують водні компартменти |див., Ваккег-У/оцаепбего еї аї, Єшиг. у. СіІїп. Місгобіо!. Іпбесі. Оів. 12 (Биррі. 1):561 (1993), Кіт,

Огидв 46:618 (1993), апа НКападе, "Зпйе-Зресійс Огид ОеїЇїмегу Овіпда Прозотез аз Саїптієгв", іп Огид Оеєїїмеїу

Зувієтв», Нападе апа Ноїїіїпдег (єдз.), раде5 3-24 (САС Ргез5 1995)). Ліпосоми схожі за складом на клітинні мембрани, в результаті чого їх можна безпечно вводити, і є такими, що біодеградують. В залежності від способу приготування ліпосоми можуть бути одноламелярними або багатоламелярними, можуть бути різними за розміром, з діаметрами 0,02мкм -210мкм. В ліпосоми можна інкапсюлювати різноманітні агенти: розділення гідрофобних агентів у бішарах і розділення гідрофільних агентів всередині внутрішнього водного простору (просторів) |див., наприклад, Маспу еї аї, Гірозотез Іп СеїІ Віоїоду Апа Рпагтасоїоду (допп Гірреу 1987), апа

Озіго єї аі., Атегісап .). Нозр. Рпагт. 46:1576 (1989)). Більш того, можна регулювати терапевтичну доступність інкапсульованого агента, змінюючи розмір ліпосом, кількість бішарів, ліпідний склад, а також наповнення та поверхневі властивості ліпосом.

Ліпосоми можуть адсорбуватись фактично в будь-який тип клітин і потім повільно вивільняти інкапсульований агент. З іншого боку, абсорбована ліпосома може бути ендоцитозована клітинами, які є фагоцитарними. За ендоцитозом відбувається внутрішньолізосомна деградація ліпосомних ліпідів і вивільнення інкапсульованих агентів |Зспегрпої еї аЇ., Апп. М.М. Асай. сі. -446:368 (1985)). Після внутрішньовенного введення маленькі ліпосоми (0,1-1,0мкм), як правило, захоплюються клітинами ретикулоендотеліальної системи, які знаходяться, головним чином, в печінці та селезінці, тоді як ліпосоми розміром більш ніж З,0мкм відкладаються в легені. Це вибіркове захоплення менших ліпосом клітинами ретикулоендотеліальної системи було використане для транспортування хемотерапевтичних агентів в макрофаги і в пухлини печінки.

Ретикулоендотеліальну систему можна перехитрувати кількома способами, в тому числі насиченням великими дозами ліпосомних частинок або селективною інактивацією макрофагів фармакологічними засобами

ІСіааззеп еї аї., Віоспіт. Віорпух. Ада 802:428 (1984)). Крім того, включення фосфоліпідів, похідних від гліколіпідів або поліетиленгліколю, в мембрани ліпосом показало, що в результаті це значно зменшує захоплення ретикулоендотеліальною системою |ЦАЇеп еї а!., Віоспіт. Віорпуз. Асіа 1068:133 (1991); АМеп еї аї.,

Віоспіт. Віорпуз Ада 1150:9 (1993)).

Можна приготувати ліпосоми так, щоб вони націлювались на конкретні клітини або органи, шляхом замінення фосфоліпідного складу або вставляння рецепторів або лігандів в ліпосоми. Наприклад, ліпосоми, приготовані з високим вмістом неіонного сурфактанта, застосували, щоб поцілити в печінку (Науакауча еї аї.,

Уарапезе Раїепі 04-244018; Ка еї аї., Віої. Рпагт. Виїї. 9У6:960 (1993)). Ці композиції готували, змішуючи фосфатидилхолін сої, с-токоферол та етоксильовану гідрогенізовану касторову олію (НСО-60) в метанолі, концентруючи цю суміш у вакуумі а потім відновлюючи цю суміш водою. Ліпосомна композиція дипалмітойлфосфатидилхолін (ДПФХ) із сумішшю стерилглюкозиду, отриманого з сої, і холестерину також була націлена на печінку (Зпітіги еї а)!., Віо., Рнагпт. ВиїІ. 20:881 (1997)).

З іншого боку, до поверхні ліпосоми можуть прив'язуватись різні ліганди, які можна націлювати, наприклад антитіла, фрагменти антитіл, карбогідрати, вітаміни і транспортні білки. Наприклад, ліпосоми можна модифікувати за допомогою галактозилліпідних похідних розгалуженого типу, щоб націлити на рецептори азіалоглікопротеїну (галактози), які експресуються виключно на поверхні клітин печінки (Каїо апа Зи!идіуата,

Ст. Аеу. Тпег. Опд Сапіег Зузі. 14:287 (1997); Миганавні еї аї., Віо! Рнагт. ВиїЇ. 20:259 (1997)). Аналогічним чином УмМи еї аї., Нерашюіоду 27:772 (1998) виявили, що мічення ліпосом азіалофетуіїном призвело до скорочення періоду напівжиття плазми ліпосоми і дуже посилило захоплення ліпосоми, поміченої азіалофетуіїном, гепатоцитами. З іншого боку, печінкову акумуляцію ліпосом, які містять галактозилліпідні похідні розгалуженого типу, можна інгібувати попереднім упорскуванням азіалофетуіну (Мигапавні еї а!., Віо!.

РНаг. Вшїї. 20:259 (1997)). Іншим засобом націлювання ліпосом на печінкові коїтини є поліаконітильовані ліпосоми сироваткового альбуміну людини (Катр5 еї аї., Ргос. Маг! Асай. сі. ОБА 94:11681 (1997)). Більш того, |Зепо єї аі. в патенті США Ме4603044| описують систему транспортування бульбашок ліпосом, спрямованих на гепатоцити, яка має специфічність до гепатобіліарних рецепторів, пов'язаних із спеціалізованими метаболічними клітинами печінки.

У найбільш загальному методі націлювання на тканину клітини-мішені попередньо мітять біотинильованими антитілами, специфічними до ліганду, що експресується клітиною-мішенню (Нагазут еї аї.,

Аду. Огид Оеїїм. Неум. 32:99 (1998)). Після елімінації плазми вільного антитіла вводять ліпосоми, кон'юговані зі стрептавідином. В іншому методі антитіла проти клітини-мішені прикріплюють безпосередньо до ліпосом

ІНагазут еї аї., Адм. Огид Оєїїм. Нем. 32:99 (1998)|.

Білки ТАСІ-імуноглобулін можна інкапсулювати всередині ліпосом, використовуючи стандартні методи мікрокапсулювання білків (див., наприклад, Апдегзоп еї аї., ІпТесі. Іттип. 31:1099 (1981), Апдегзоп еї аї.,

Сапсег Невз. 50:1853 (1990) апа Сонеп еї а/!., Віоспіт. Віорнувз. Асіа 1063:95 (1991), Аміпад єї аі., "Ргерагайноп апа

Ове ої Гірозотез іп Іттипоіодіса! Зшаїев", іп Гірозоте Тесппоіоду, 279 Едйіоп, Мої. І, (гедогіадів (єд.), раде 317 (САС Ргезз 1993), Мазвеї еї аІ., Мей. Епгутої. 149:124 (1987)). Як зазначалось вище, терапевтично корисні ліпосоми можуть містити ряд компонентів. Наприклад, ліпосоми можуть містити ліпідні похідні (полі(етиленгліколю) (Аїеп еї а!., Віоспіт. Віорпуз. Асіа 1150:9(1993)|.

Були розроблені здатні розкладатися полімерні мікросфери для підтримання високих системних рівнів терапевтичних білків. Мікросфери готують із здатних розкладатися полімерів, наприклад полі(лактид-ко- гліколід) (ПЛГ), поліангідриди, полі(орто складні ефіри), не здатні біорозкладатися полімери етил вінілацетату, в яких білки є захопленими в полімері |ботброї апа Реції, Віосопіпдаїє Спет. 6:332 (1995); Нападе, "Воїє ої

Роїутегз іп Огид Оеєїїмегу", іп Огид Оєїїмегу Зузіетв, ВНападе апа Ноїїйїпдег (єдвз.), радез5 51-93 (САС Ргевз 1995);

Возкоз апа Мазкіємісг, "Оедгадаріє Сопігоїїєйд РеІєазе бузієтве Овейці ог Ргоїєїп Оеєїїмегу", іп Ргоїєїп Овєїїмегу:

Рпузіса! Зувієтв, Запаєг5 апа Непагеп (едвз.), радез 45-92 (Рієпит Ргезз 1997); Вапиз еї аї!., Зсіепсе 257:1161 (1998); Ршїпеу апа Вигке, Майте Віоїесппоіоду 16:153 (1998); Риїпеу, Сип: Оріп. Спет. Вісі. 2:548 (1998).

Наносфери з поліетиленгліколевим (ПЕГ) покриттям можуть також служити носіями для внутрішньовенного введення терапевтичних білків |див., наприклад, сгеї еї а!., Рпагт. Віотесппо!. 10:167 (1997)|.

Даний винахід також розглядає хімічно модифіковані білки. ТАСІ-імуноглобулін, в яких поліпептид є зв'язаним з полімером, обговореним вище.

Фахівці в цій галузі можуть розробити інші лікарські форми, як описані, наприклад, Апзеї! апа Ророміси,

Рпагтасешіса! Юозаде Еопт5 апа Огпид Оеєїїмегу Зузієтв, 5" Еййоп (Геа 85 Еерідег 1990), Сеппаго (ед.),

Ветіпдіюп'є Рпаптасецшіїса! Зсіепсев, 1917 Едійоп (Маск Рибіїєніпд Сотрапу 1995), апа Вападе апа Ноїїпдег",

Ота Оеєїїмегу Зузієтв (СВО Ргевз 1996).

Наприклад, фармацевтичні композиції можуть бути представлені у вигляді комплекту, який включає ємкість, що містить білок ТАСІ-імуноглобулін. Терапевтичні поліпептиди можуть мати форму упорскуваного розчину для однієї дози або багатьох доз, або у вигляді стерильного порошку, який потрібно буде відновити перед ін'єкцією. Як варіант, такий комплект може включати диспергатор сухого порошку, генератор рідкого аерозолю або розпилювач для введення терапевтичного поліпептиду. Такий комплект може додатково містити письмову інформацію щодо показань та застосування фармацевтичної композиції. Більш того, ця інформація може включати попередження про те, що дана композиція білка ТАСІ-імуноглобулін протипоказана хворим з відомою гіперчутливістю або до частини рецептора ТАСІ, або до імуноглобулінової частини. 9. Терапевтичне використання нуклеотидних послідовностей ТАСІ-імуноглобуліну

Даний винахід включає використання молекул нуклеїнової кислоти, які кодують злиті білки ТАСІ- імуноглобулін, для введення останніх пацієнту, який потребує лікування. При ветеринарному терапевтичному використанні або при лікуванні людини ці молекули нуклінової кислоти можна вводити суб'єкту з розладом або хворобою, описаними вище. Наприклад, молекули нуклуїнової кислоти, що кодують злитий білок ТАСІ- імуноглобулін, можна використовувати для довготривалого лікування системного червоного вовчака.

Існує багато методів уведення гена ТАСІ-імуноглобуліну суб'єкту, в тому числі використання клітин-хазяїв,

які експресують ТАСІ-імуноглобулін, введення голої нуклеїнової кислоти, яка кодує ТАСІ-імуноглобулін, використання катіонного ліпідного носія з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує ТАСІ-імуноглобулін, та використання вірусів, які експресують ТАСІ-імуноглобулін, наприклад рекомбінантних ретровірусів, рекомбінантних аденоасоційованих вірусів, рекомбінантних аденовірусів та рекомбінантних вірусів простого герпесу Ідив., наприклад, Миїїдап, Зсіепсе 260:296 (1993), Козепрего еї аі!., Зсіепсе 242:1575 (1988), І азайІє єї а!і., Зсіепсе 259:988 (1993), МОЇЙ єї аі!., 5сієпсе 247:1465 (1990), Вгеакпєій апа Оєішса, Тне Мем Віоіодіві 3:203 (1991)). При методі ех мімо, наприклад, клітини виділяють із суб'єкта, трансфекують вектором, який експресує ген ТАСІ-імуноглобуліну, і потім пересаджують тому самому суб'єкту.

Щоб здійснити експресію гена ТАСІ-імуноглобуліну, конструюють вектор експресії, в якому нуклеотидна послідовність, яка кодує ген ТАСІ-імуноглобуліну, функціонально зв'язана з кор-промотором і, необов'язково, з регуляторним елементом для контролювання транскрипції гена. Загальні вимоги щодо вектора експресії описувались вище.

Як варіант, ген ТАСІ-їімуноглобуліну можна вводити, використовуючи вірусні вектори, втому числі, наприклад, аденовірусні вектори (Каз5-ЕЇвіеєг єї аі., Ргос. МагіАсай сі. ОБА 90:11498 (1993), Коїз еї аї!., Ргос. масі Асад. 5сі. ОБА 91:215 (1994), Ії еї аІ., Нит. Сепе ТНег. - 4:403 (1993), Міпсепі еї аї., Маї, Сепеї. 5:130 (1993), апа 7арпег еї аї., Сеї! 75:207 (1993)), аденовірусасоційованих вірусних векторів (Ріої еї аї., Ргос. Маг!

Асад. Осі. ОБА 90; 10613 (1993)), такі альфавіруси, як вірус Зетіїкі Рогеві і вірус Зіпірів (Негі2 апа Ниапо, ».

Міг. 66:857 (1992), На)и апа Ниапо, 9. Міг. 65:2501 (1991), апа Хіопд еї аіІ., 5сіеєпсе 243:1188 (1989)), вірусні вектори герпесу |наприклад, пат. США МоМое: 4769331, 4859587, 5288641 та 5328688), вектори парвовірусу

ІКоегіпо єї аІ., Нит. Седе ТПпегар. 5:457 (1994), вектори покевірусу (Олакі еї а!., Віоспет. Віорпу5. Ке5. Сотт. 193:653 (1993), Рапісаїї апа Раоіейі, Ргос. Маг! Асай. зсі. ОБА 79:4927 (1982)|, поксвіруси, наприклад поксвірус канарейки або вірус коров'ячої віспи (Різпег/-Носі еї аї., Ргос. Маг! Асай. сі. ОБА 86:317 (1989) апа Рієхпег єї а!І.,, Аті М.У. Асай. сі. 569:86 (1989)), та ретровіруси |Ваба еї а/., У. Мейгозиго 79:729 (1993), Ват еї а!ї., Сапсег

Вез. 53:83 (1993), Такатіуа еї а!., У. Мешиговсі. Нез. 35:493 (1992), Міє апа Наїї, Сапсег Вев. 53:962 (1993), Міїє апа Наїгї, Сапсег Нез. 55:3860 (1993), апа Ападегзоп еї а)., О5 Раїепі Мо. 5399346). В межах різних варіантів або сам по собі вірусний вектор або вірусна частинка, яка містить такий вірусний вектор, може бути використаний в способах і композиціях, описаних нижче.

Як приклад однієї системи, аденовірус, вірус дволанцюгової ДНК, є добре охарактеризованим вектором переносу гена для введення молекули гетерологічної нуклеїнової кислоти (ВескКег еї а!., Меп. Сеї! Вісі. 43:161 (1994); Ооцидіаз апа Сипієї, Зсіепсе 85. Медісіпе 4:44 (1997)). Ця аденовірусна система має декілька переваг, в тому числі: ї) здатність акомодувати відносно великі вставки ДНК, ії) здатність вирощуватись до високого титру, ії) здатність заражати широке коло типів клітин ссавців, і ІМ) здатність застосовуватись з багатьма різними промоторами, в тому числі убіквітарним, тканиноспецифічним та регулятабельним промоторами. Крім того, аденовіруси можна вводити внутрішньовенно, оскільки ці віруси є стабільними у кров'яному руслі.

При використанні аденовірусних векторів, в яких ділянки аденовірусного геному делетовані, вставки включають у вірусну ДНК прямим зшиванням або гомологічною рекомбінацією з ко-транфекованою плазмідою.

Наприклад, незмінний ген ЕТ! делетують з вірусного вектора, і цей вірус не буде реплікуватися, якщо тільки клітина-хазяїн не дасть ген Е1. При внутрішньовенному введенні інтактній тварині аденовірус, головним чином, націлюється на печінку. Хоча аденовірусна система доставки з делецією гена Еї не може реплікуватися в клітинах-хазяях, тканина клітини буде експресувати і обробляти закодований гетерологічний білок. Клітини-хазяї будуть також секретувати гетерологічний білок, якщо відповідний ген включає секреторну сигнальну послідовність. Секретовані білки увійдуть в кровообіг з тканини, яка експресує цей гетерологічний ген (наприклад, дуже васкуляризованої печінки).

Більш того, аденовірусні вектори, що містять різні делеції вірусних генів, можна застосовувати для зменшення або виключення імунних реакцій на цей вектор. Такі аденовіруси є Е1 -делетованими і, крім того, містять делеції Е2А або Е4 |і ивкКу еї аї., у. Мігої. 72:2022 (1998); Нарег еї аІ., Нитап Сепе Тнегару 9:671 (1998)).

Як стало відомо, зменшує імунні реакції і делеція Е25 |Атаййнапо еї аї., 9. Міго!. 72:926 (1998)). В результаті делеції всього аденовірусного геному можна акомодувати дуже великі вставки гетерологічної ДНК. Особливо вигідним для вставляння великих вставок гетерологічної ДНК є генерування так званих "безкишкових" аденовірусів, в яких всі вірусні гени делетовані (Уеп апа Регтісацдеї, РАБЕВУ. 11:615 (1997)|.

Високотитрові штами рекомбінантних вірусів, здатних експресувати терапевтичний ген, можна отримати з клітин заражених ссавців, використовуючи стандартні методи. Наприклад, рекомбінантний вірус простого герпесу можна приготувати в клітинах Мего, як описано Вгапаї еї аї, 9. сбеп. Міго!. 72:2043 (1991), Негоїга еї аї., у.

Сеп. Мігої. 75:1211 (1994), МізаїІї апа Вгапаї, Мігоюду 185:419 (1991), Стац еї аї., Іпмезі. Орпіна!тої. Мів. зві. 30:2474 (1989), Вгапаї еї аї, 9. Міго!. Мей. 36:209 (1992), апа Вгомп апа Масі єап (єдв.), НОМ Мігив Ргоїюосоїв (Нитапа Ргезв 1997).

Як варіант, вектор експресії, який містить ген ТАСІ-імуйоглобуліну, можна вводити суб'єкту шляхом ліпофекції іп мімо з використанням ліпосом. Для приготування ліпосом для трансфекції іп мімо гена, кодуючого маркер, можна застосовувати синтетичні катіонні ліпіди (Редпег еї аї, Ргос. Ма?! Асай. сі. ОБА 84:7413 (1987);

Маскеу еї аї., Ргос. Маг! Асад. сі. ОБА 85:8027 (1988)). Застосування ліпофекції для введення екзогенних генів в конкретні органи /// мімо має певні практичні переваги. Ліпосоми можна використовувати для спрямування трансфекції в конкретні типи клітин, що є особливо вигідним в тканині з клітинною гетерогенністю, наприклад в підшлунковій залозі, печінці, нирці і мозку. Ліпіди можна хімічно з'єднувати з іншими молекулами з метою націлювання. Націлені пептиди (наприклад, гормони або нейропередавачі), білки (наприклад, антитіла або непептидні молекули) можна з'єднувати з ліпосомами хімічно.

Іншим альтернативним методом уведення є електропорація. Використання іп мімо електропорації для переносу гена в м'яз описане, наприклад в Іроботі Аіпага та Міуагакі (Майшге ВіоїесппоІоду 16:867 (1998).

Взагалі дозування композиції, що містить терапевтичний вектор, який має послідовність нуклеїнової кислоти ТАСІ-імуийоглобуліну, наприклад рекомбінантний вірус, буде мінятися в залежності від таких факторів, як вік суб'єкта, вага, зріст, стать, загальний медичний стан та попередня історія хвороби. Придатними шляхами введення терапевтичних векторів є внутрішньовенна, внутрішньоартеріальна, інтраперитонеальна, внутрішньом'язова, внутрішньопухлинна ін'єкції та ін'єкція в порожнину, що містить пухлину. Наприклад,

ІНопоп єї аї., Ргос. Маг! Асай. 5сі. ОБА 96:1553 (1999)|), показали, що внутрішньом'язова ін'єкція плазмідної

ДНК, кодуючої інтерферон-с, створює сильні протипухлинні ефекти на первинні та метастатичні пухлини в мишиній моделі.

Запропоновану даним винаходом композицію, що містить вірусні вектори, невірусні вектори або комбінацію вірусних і невірусних векторів, можна приготувати за відомими методами приготування фармацевтично корисних композицій, за якими вектори або віруси об'єднують в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. Як зазначалось вище, кажуть, що композиція, наприклад фізіологічний розчин з фосфатним буфером, є "Фармацевтично прийнятним носієм", якщо суб'єкт-реципієнт може переносити її введення. В галузі добре відомі й інші придатні носії (див., наприклад, НКетіпдіоп'є Рпагтасецшціїса! 5сієпсев, 197 Ей. (Маск Рибіїєпіпд Со., 1995) апа Сіїтап'є РпаптасоїодісаІ Вавів ої Тпегарешіісв, 7" Ей. (Масміап

Рибіїзпіпод Со., 1985).

В лікувальних цілях вектор експресії терапевтичного гена або рекомбінантний вірус, що містить такий вектор, і фармацевтично прийнятний носій вводять суб'єкту в терапевтично ефективній кількості. Кажуть, що комбінація вектора експресії (або вірусу) і фармацевтично прийнятного носія введена в терапевтично ефективній кількості, якщо введена кількість є фізіологічно значущою. Агент є фізіологічно значущим, якщо його присутність дає в результаті виявну зміну у фізіології суб'єкта-реципієнта. Наприклад, агент, використаний для лікування запалення, є фізіологічно значущим, якщо його присутність зменшує запальну реакцію. Інший приклад, агент, використаний для інгібування росту пухлинних клітин, є фізіологічно значущим, якщо введення цього агента зменшує в результаті кількість пухлинних клітин, зменшує метастаз і розмір твердої пухлини або збільшує некроз пухлини.

Якщо суб'єктом, якого лікують вектором експресії терапевтичного гена або рекомбінантним вірусом, є людина, тоді перевагу слід віддати лікуванню генами соматичних клітин. Тобто таке лікування людини вектором експресії терапевтичного гена або рекомбінантним вірусом не передбачає введення в клітини молекули нуклеїнової кислоти, яка може утворити частину лінії патогенних мікроорганізмів людини і передатися наступним поколінням (тобто терапія геном лінії патогенних мікроорганізмів людини). 10. Створення трансгенних мишей

З метою надекспресії послідовностей нуклеїнової кислоти, які кодують злиті білки ТАСІ-імуноглобулін у всіх тканинах або під контролем тканиноспецифічного регуляторного елемента, або регуляторного елемента, що віддає перевагу тканинам, можна створити трансгенних мишей. Цих надпродуцентів злитих білків можна використовувати для ідентифікації фенотипу, який є результатом надекспресії, і трансгенні тварини можуть служити моделями хвороби людини, викликаної надлишком білка рецептора ТАСІ. Трансгенні миші, які надмірно експресують злиті білки ТАСІ-імуноглобулін, також утворюють модель біореакторів для продукування злитих білків ТАСІ-імуноглобулін в молоці або крові більших тварин. Методи створення трансгенних мишей добре відомі в цій галузі |див., наприклад, Часор, "Ехргезвіоп апа Кпоскоші ої Іпіепегопв іп

Тгапздепіс Місе", іп Омегехргеввіоп апа КпоскКоці іп СугоКіпев5 іп Тгапздепіс Місе, дасоь (єд.), радез 111-124 (Асадетіс Ргезз, ЦИ. 1994), Мопавіег5Кку апа Роббі (едз.), біга(едієв іп Тгапздейс Апіта! 5сіеєпсе (АЗМ Ргев5 1995) апа Аррица апа Міїзоп, "Несотбіпапі Ргоїєїп Ехргезвіоп іп Ттапздепіс Місе", іп Сепе Ехргезвіоп Зувіетв:

Овіпу Майте ог Шйе Ап ої Ехргеззіоп, Регпападе: апа Ноейег (еав.), радез 367-397 (Асадетіс Ргезз, Іпс. 1999)|.

Спосіб створення трансгенної миши, яка експресує послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, можна, наприклад, розпочати з дорослих, здатних до зачаття самців (ВбСЗА, 2-8- місячного віку (Тасопіс Рагт5, Сеппапіомп, МУ)), вазектомованих самців (8602, 2-8-місячного віку (Тасопіс

Еаптв)), препубертатних здатних до зачаття самиць (донорів) (ВбСЗИ, 4-5-місячного віку (Тасопіс Рагтв)) та дорослих здатних до зачаття самиць (реципієнтів) (860211, 2-4-місячного віку (Тасопіс Рагпт»5)). Донорів аклімують упродовж одного тижня, а потім упорскують приблизно 8 імунізуючих одиниць (І) на мишу гонадотропіну сироватки вагітної кобили |(бБідта Спетіса! Сотрапу; 51. І оці, МО) І. Р., і через 46-47 годин 8 на мишу хоріонгонадотропіну людини (ПСО (5ідта)) І.Р., щоб індукувати суперовуляцію. Після впорскування гормонів донорів спаровують зі здатними до зачаття самцями. Овуляція, як правило, відбувається в межах 13 годин після впорскування ПСО. Копуляцію підтверджують наявністю вагінальної пробки наступного ранку після спаровування.

Запліднені яйцеклітини збирають за допомогою хірургічної ложки. Яйцеводи збирають та яйцеклітини випускають на предметні скельця з ямками для аналізу сечі, які містять гіалуронідазу (Зідта). Яйцеклітини промивають один раз в гаулуронідазі і двічі в середовищі Уітена (М/піШйеп) УУб640 (описаному, наприклад,

Мепіпо апа О'Сіагау, ВісоІ. Вергоа. 77:159 (1986) апа Оієепнаг апа О ом/пв, 7удоїе 41129 (1996)), яке інкубували

Бос-ним СО», Ббв-ним О» і 90956-ним М2 при 37"С. Яйцеклітини потім зберігають в термостаті з 595-ним СОг і температурою 37"С перед мікроін'єкуванням.

Для мікроін'єкції 10-20мкм плазмідної ДНК, що містить послідовність, кодуючу злитий білок ТАСІ- імуноглобулін, лінеаризують, очищують гелем і ресуспендують в л10мМ Ттібз-НСІ (рн 7,4), 0,25мММ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТК) (рН 8,0) при кінцевій концентрації 5-10 нанограмів на мікролітр.

Наприклад, послідовності, що кодують злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, можуть кодувати поліпептид ТАСІ делецією амінокислотних залишків 1-29 та 111-154 послідовності БХЕО ІО МО:2 і частиною імуноглобуліну Ес5.

Плазмідну ДНК вводять шляхом мікроін'єкції в зібрані яйцеклітини, які містяться в краплині середовища

УУ640, покритого теплим СОг-збалансованим мінеральним маслом. ДНК втягують в ін'єкційну голку (втягуали з 0,75 міліметрового капіляра із боросилікатного скла із зовнішнім діаметром 1мм), і впорскують в окремі яйцеклітини. В кожну яйцеклітину проникають ін'єкційною голкою, в один чи обидва гаплоїдні пронуклеуси.

В ці пронуклеуси впорскують піколітри ДНК, і ін'єкційну голку витягують, не контактуючи з ядерцями.

Процедуру повторюють, доки всі яйцеклітини не будуть ін'єковані. Успішно ін'єковані яйцеклітини переносять в чашку для культивування з тканиною органу з попередньо наповненим газоподібним середовищем УУ640 для зберігання всю ніч в термостаті з 595-ним СО» і температурою 3726.

Наступного дня двоклітинні зародки переносять в псевдовагітних реципієнтів. Реципієнтів ідентифікують за наявністю копуляційних пробок після спаровування з вазектомованими самцями. Реципієнтів анестезують, голять з заднього лівого боку і переносять під хірургічний мікроскоп. Роблять маленький розріз в шкірі через стінку м'яза всередину черевинної області, оточеної реберною кліткою, сідлоподібною частиною, задньою лапою, посередині між коліном і селезінкою. Репродуктивні органи тимчасово виводять на поверхню тіла на маленьку хірургічну серветку. Жирову тканину розтягують по хірургічній серветці, до жирової тканини прикріплюють дитячий судинний затискач (Кобо7, КоскміПе, МО) і звішують зліва поверх спинки миши, щоб не дати органам зісковзнути назад всередину.

За допомогою маленької переносної піпетки, яка містить мінеральне масло, за яким йдуть почергово

ММ640 і повітряні бульбашки, в реципієнта переносять 12-17 здорових двоклітинних зародків з ін'єкції попереднього дня. Набухлу ампулу розміщують і, утримуючи яйцевід між ампулою і бурсою, в яйцеводі роблять насічку за допомогою 28-грамової голки біля бурси, переконуючись, що не розірвали ампулу або бурсу.

Піпетку переносять в згадану насічку в яйцеводі, і зародки вдувають, дозволивши першій повітряній бульбашці вийти з піпетки. Жирову тканину обережно вштовхують в очеревину і дають можливість репродуктивним органам зісковзнути всередину. Одним хірургічним швом закривають перитонеальну стінку, а рану на шкірі закривають скобкою. Миші відновлюють сили на підігрівальному столику з температурою 3770 упродовж як мінімум чотирьох годин.

Реципієнтів повертають в клітини парами і чекають, поки 19-21 день триває вагітність. Після народження дають 19-21 день після пологів перед відлученням від матері. Сисунків, віднятих від матері, розділяють за статтю, розміщують в окремих клітинах і чистими ножицями відрізають 0,5см хвоста для біопсії (для визначення генотипу).

З відрізків хвостів готують геномну ДНК, використовуючи, наприклад, комплект ОІАСЕМ ОМЕАЗУ, додержуючись інструкцій виробника. Геномну ДНК аналізують шляхом реакції преципітації (РПЦ), застосовуючи праймери, призначені для посилення послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок

ТАСІ-імуноглобулін, або селектований маркерний ген, який було введено в ту саму плазміду. Після підтвердження, що тварини є трансгенними, їх зворотньо схрещують в інбредну лінію, розміщуючи трансгенну самицю з самцем дикого типу або трансгенного самця з однією або двома самицями дикого типу, Після народження і відлучення від матері мишенят розділяють за статтю, і їхні хвости відрізають для визначення генотипу.

Для перевірки експресії трансгена в живій тварині здійснюють часткову гепатектомію. Здійснюють хірургічне препарування верхнього відділу черевної порожнини прямо під зипофідним відростком.

Використовуючи стерильний інструмент, під грудниною роблять маленький, 1,5-2см, розріз і виймають на поверхню тіла ліву бічну частку печінки. Використовуючи шовк 4-0, навколо нижньої частки роблять петлю, закріплюючи її зовні порожнини на тілі. Для утримання петлі застосовують атравматичний затискач, поки поруч з першою петлею розміщують другу петлю із абсорбованого дексону (американський ціанамід; Ууаупе,

М.9У.). Від дексонової петлі роблять дистальний розріз, і приблизно 100мг вирізаної печінкової тканини поміщають в стерильну чашку Петрі. Зріз вирізаної печінки переносять в 14-міліметрову поліпропіленову круглодонну пробірку, миттєво заморожують в рідкому азоті і потім зберігають на сухому льоді. Хірургічну ділянку закривають за допомогою швів і затискачів для ран, і після операції клітку тварини поміщають на грілку-подушку з температурою 372С на 24 години. Після операції тварину перевіряють щодня і через 7-10 днів після операції знімають затискачі для ран. Рівень експресії мРНК злитого білка ТАСІ-імуноглобулін досліджують по кожній трансгенній миши, використовуючи метод гібридизації розчину РНК або ланцюгову реакцію полімерази.

При використанні вищеописаних загальних методів були створені трансгенні миші, які експресували значні рівні злитого білка ТАСІ-імуноглобулін в молоці. В цьому конкретному випадку послідовність, кодуюча злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, закодувала поліпептид ТАСІ за допомогою делеції амінокислотних залишків 1-29 та 111-154 послідовності ЗЕО ІЮО МО:2 і частини імуноглобуліну Ес5.

Даний винахід, описаний таким чином взагалі, стане більш зрозумілим при розгляданні наступних прикладів, які є лише ілюстраціями і не обмежують даного винаходу.

Приклад 1

Конструювання молекул нуклеїнової кислоти, що кодують білки ТАСІ-Ес

Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують ТАСІ людини, отримували під час експресійного клонування рецепторів до 2ТМЕ4, як описують Ого55 еї аї., Маїшге 404:995 (2000). Кодуючі послідовності, які містилися в експресійних структурних компонентах ТАСІ-Ес, генерували шляхом реакції преципітації (РІПЦ) з накладанням фракцій, використовуючи стандартні методи (див., наприклад, Нопоп еї аї., бет 77:61 (1989)). Як первинні матриці для ампліфікацій РПЦ використовували кДНК ТАСІ і кКДНК Ес людини. Праймери РПЦ були призначені дати в результаті 5'і 3 кінці заданої кодуючої послідовності і ввести сайти розпізнавання рестрикційних ферментів для полегшення вставляння цих кодуючих послідовностей у вектори експресії. Кодуючі послідовності ТАСІ-с вставляли у вектори експресії які включали мишиний функціонуючий ген дигідрофолатредуктази. Один вектор експресії також містив промотор цитомегаловірусу для спрямування експресії трансгена рекомбінантного білка, інтрон імуноглобуліну, сигнальну послідовність активатора плазміногена тканини, внутрішню послідовність входження рибосоми, делетований цистрон СО8 для поверхневої селекції трансфекованих клітин та елементи експресії дріжджів для вирощування плазміди в клітинах дріжджів.

Один з прийомів, застосованих для продукування злитих білків ТАСІ-Ес, проілюстровано методом, використаним для конструювання ТАСІ-Ес4. Інші злиті білки ТАСІ-Ес продукували, вставляючи нуклеотидні послідовності, які кодують злитий білок ТАСІ-Ес, у вектор експресії ссавців і вводячи цей вектор експресії в клітини ссавців.

А. Конструювання фрагмента Іду! Ес4

Для отримання злитого білка ТАСІ-Рс4 зону Ес людського ІДС1 (шарнірна зона і домени Снго і Снз) модифікували для виключення рецептора су! (БсукК!І) і функцій зв'язування комплементу (С14). Цей модифікований варіант людського ЇдДО1Ес позначили "Ес4".

Зону Ес виділяли з бібліотеки печінки зародка людини (Сіопіесп) за допомогою РПЦ, використовуючи олігопраймери 5 АТСАССОСАА ТТСАСАТСТТ САСАСААДААС ТСАСАСАТОС ССАС У (5ЕО ІЮ МО:7) та 5'

СОСАСТСТСТ АСАТСАТТТА СССОБАСАСА СОбБАС 3 (5БЕО Ш МО:8). Для зменшення зв'язування Есукі за допомогою РПЦ в межі зони Ес були введені мутації. Сайт зв'язування ЕсуВі (І еш-І еи-Сіу-Сіу; амінокислотні залишки 38-41 послідовності 5ЕО ІО МО:6, які відповідають позиціям 234-237 індексу ЕУ) мутували в Аїа-с1и- спу-АІа, щоб зменшити зв'язування ЕсуВІ1 |див., наприклад, Юипсап еї аї., Майте 332:563 (1988); Вашт еї аї|.,

ЕМВО у. 13:3992 (1994)) Для введення цієї мутації використовували олігонуклеотидні праймери 5

ССОТОСССАб САССТОААОС СОАБОБООСА ССОТСАСТСТ ТоСТСТТоСС С У (5БО ІО МО:9) та 5

ССАТТСТАСА ТТАТТТАССС ССАСАСАСсОоС А 3 (5ЕО ІЮО МО:10). До 50мкл кінцевого об'єму додавали 57Онг матриці ІДЕс, 5мкл 10х реакційного буфера Ріш (Зігаїадепе), вмкл 1,25мМ дезоксинуклеозидтрифосфатів (аМтТР), Зімкл дистильованої води, 2мкл 20мММ олігонуклеотидних праймерів. Додавали рівний об'єм мінерального масла і температуру реакції доводили до 947"С упродовж 1 хвилини. Додавали Ріш-полімеразу (2,5 одиниць, 5ігагадепе), після чого здійснювали 25 циклів при 94"С упродовж ЗО0сек., 5573 упродовж Збсек., 727"Сб упродовж 1 хвилини, а потім ще 7 хвилин при 72"С. Продукт реакції фракціонували методом електрофорезу і виявили диск, що відповідав передбаченому розміру, приблизно 676 пар основ (п.0о.). Цей диск ексцизували з гелю і екстрагували, застосовуючи комплект реагентів ОІАСЕМ ОІ1АдцнйскТМ для екстракції гелю (Оіадеп), додержуючись інструкцій виробника.

РПЦ також використали для введення мутації Аіа-5ег (амінокислотний залишок 134 послідовності ЗЕО ІЮ

МО:6, який відповідає позиції 330 індексу ЕУ) і Рго-Зег (амінокислотний залишок 135 послідовності ЗЕО ІЮ

МО:6б, який відповідає позиції 331 індексу ЕЮ), щоб зменшити зв'язування комплементу Сід або фіксацію комплементу (Оипсап апа УМіптег, Макиге 332:788 (1988))|. Дві перші циклічні реакції проводили, використовуючи як матрицю послідовність (ДЕС з мутованим сайтом зв'язування Есук!І. До 5О0мкл кінцевого об'єму додавали 1мкл матриці ІдЕс з мутованим сайтом зв'язування ЕсукіІ, 5мкл реакційного буфера 1ОхРіи (5ігаїадепе), вмкл 125мМ амкМтТР, Зімкл дистильованої води, 2дмкл 20мМ 5 ото оосСсТ СССАбАТОоСОо ТОСТОТССОвА

ССССАСАТСТ ТСАСАСААДАА СТСАС 3 (5БО ІЮО МО.11), 5'-праймера, що починається на нуклеотиді 36 послідовності ФЕО ІЮ МО:5, і 2мкл 20ММ 5 ТОБОдОСОСстТ ТТОТТОБА 3 (5ЕО ІО МО.12), 3'-праймера, що починається на комплементі нуклеотиду 405 послідовності ЗЕО ІЮ МО:5. Друга реакція містила 2мкл кожної з 20мММ сумішей олігонуклеотидних праймерів 5 ТССААСААДАС СССТСОССАТС СТОСАТСОАО ААААССАТСТ

СС 3 (5ЕБЕО ІО МО:13), 5-праймера, що починається на нуклеотиді 388 послідовності ЗЕО ІЮ МО:5 та 5 апвАТасАтТоС АТаААдасСАСС Татоаттст сстостаста аТтас!сайсто ССАСАТОа 3 (5ЕО ІЮ МО:14), 3- праймера для введення мутації АІа-5ег, сайту рестрикції Хвраї і термінуючого кодону. Додавали рівний об'єм мінерального масла і температуру реакції доводили до 947"С упродовж 1 хвилини. Додавали Ріш-полімеразу (2,5 одиниць, 5ігаіадепе), потім проводили 25 циклів при 947"С упродовж ЗО0сек., 55"С упродовж Зосек., 7270 упродовж 2 хвилин, а потім ще 7 хвилин при 72"С. Продукт реакції фракціонували методом електрофорезу і виявили диски, які відповідали передбаченим розмірам, приблизно 370 п.о. і приблизно 395 п.о., відповідно. Ці диски ексцизували з гелю і екстрагували, застосовуючи комплект реагентів ОІАСЕМ ОІАдинпЇскТМ для екстракції гелю (Оіадеп) згідно з інструкціями виробника.

Здійснювали другу циклічну реакцію для з'єднання вищезгаданих фрагментів і додавали сайт рестрикції 5'

Ватні і сигнальну послідовність із варіабельної зони важкого ланцюга УВІ. 2'Сі імуноглобуліну людини |Содпе еї аї., Єшиг. У. Іттипої! 18:1485 (1988)). До 5Омкл кінцевого об'єму додавали ЗОмкл дистильованої води, Змкл 1,25мМ амМтТР, 5мкл реакційного буфера 10х Ріш-полімерази (Зігаїадепе) і їмкл кожного з двох перших продуктів двох РПЦ. Додавали рівний об'єм мінерального масла і температуру реакції доводили до 947С упродовлс 1 хвилини. Додавали Ріи-полімеразу (2,5 одиниць, 5ігагадепе), після чого здійснювали 5 циклів при 94"С упродовж З0сек., 557С упродовж З0сек. і 727"С упродовж 2 хвилин. Температуру знову доводили до 947С і додавали 2мкл кожної з 20МмМ сумішей 5 ОБАТОСАТСС АТОАДАОСАСС тТотТостТІсттІ сстостТосто атааСаасСто ССАСАТО 3 (5ЕО ІЮ МО:14), 5'-праймера, що починається на нуклеотиді 1 послідовності ЗЕО

ІО МО 15, ії 5 ОБАТТСТАСА ТТАТТТАССС ССАСАСАСсОоо А 3 (5ЕО ІЮ МО.10), після чого здійснювали 25 циклів при 947"С упродовж ЗО0сек., 5572 упродовж ЗОосек. і 72"С упродовж 2 хвилин, і наприкінці ще 7 хвилин при 7270. Частину реакції візуалізували, застосовуючи гель-електрофорез. Виявили диск розміром 789 п.о., який відповідав передбаченому розміру.

Б. Конструювання вектора експресії ТАСІ-Ес4

Плазміди експресії, які містили кодуючу ділянку для злитого білка ТАСІ-Ес4, конструювали шляхом гомологічної рекомбінації в дріжджах. Виділили фрагмент КДНК ТАСІ, використовуючи РПЦ, яка включала полінуклеотидну послідовність від нуклеотиду 14 до нуклеотиду 475 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1. Двома праймерами, застосованими в продукуванні фрагмента ТАСІ, були: 1) праймер, який містив 40 п.о. фланкуючої послідовності вектора 5' і 17 п.о., які відповідали амінокінцю фрагмента ТАСІ (5 СТСАСССАСсО

АААТССАТОС СОАСТТОАСА СОСТТССОТА СААТОАСсТОос ССтосвоСсСо 3" 5ЕО ІЮО МО:15); 2) 40 п.о. 3'- кінця, що відповідали фланкуючій послідовності, і 17 п.о., що відповідали карбоксильному кінцю фрагмента

ТАСІ (5 ОСАТОТОТОА СТТТТОТСТОо ААСАТСТОоСОо СТОСТТСАСС СССОбБбАс 3 5БЕО ОО МО:16). До 100мкл кінцевого об'єму додавали 1Онг матриці ТАСІ, 1О0мкл реакційного буфера 10х Тад (Регкіп ЕІтег), Здмкл 2,58М амтТР, 7дмкл дистильованої води, 2мкл кожної з 20мММ сумішей олігонуклеотидних праймерів, і полімеразу Тад (2,5 одиниць, І їе Тесппоіодіе5). Додавали рівний об'єм мінерального масла і температуру реакції доводили до 94"С упродовж 2 хвилин, після чого здійснювали 25 циклів при 94"С упродовж зобсек., 65"С упродовж Збсек., 657С упродовж Збсек., 72"С упродовж 1 хвилини і ще 5 хвилин при 7270.

Аналогічним чином конструювали фрагмент, що містив КДНК, кодуючу фрагмент Ес4. Двома праймерами, використаними в продукуванні фрагмента Еса4, були (зліва і справа) олігонуклеотидний праймер, що містив 40 п.о. фланкуючої послідовності 5' ТАСІ і 17 п.о., що відповідали амінокінцю фрагмента Ес4 (5 ОЗСАСАСАООоС

ТСАСААОСАА СТССАОСТСТ СсССоОбОосСТо ААССАССССА САТСТТСАСА 3 5ЕБЕО І МО.17); і олігонуклеотидний праймер, що містив 40 п.о. 3-кінця, що відповідали фланкуючій послідовності вектора, і 17 п.о., що відповідали карбоксильному кінцю фрагмента Ес4 (5 ОСТ ООТА СААССССАСА ОСТОТТТТАА

ТСТАСАТТАТ ТТАСССОСБАС АСАдОоСО 3" ЗЕО І МО:18). До 100мкл кінцевого об'єму додавали 1Онг описаної вище матриці Ес4, 10мкл реакційного буфера 10х Тад-полімерази (Регкіп ЕІтег), вмкл 2,58М амтР, 7д8мкл дистильованої води, 2мкл кожної з сумішей 20мММ олігонуклеотидів і Тад-полімеразу (2,5 одиниць, Гіте

Тесппоіодієз). Додавали рівний об'єм мінерального масла, температуру реакції доводили до 94"С упродовж 2 хвилин, потім здійснювали 25 циклів при 947"С упродовж З0сек., 65"С упродовж З0сек., 727"С упродовж 1 хвилини, а потім ще 5 хвилин при 7270.

Десять мікролітрів з кожних 100мкл вищеописаних реакцій преципітації (РІПЦ) сепарували на 0,895-ному агарозному гелі ГМР (Зеаріадое СТО) за допомогою буфера 1х ТВЕ для аналізу. Решту 90мкл з кожної РПЦ преципітували з доданням 0,5мкл 1М хлориду натрію і 250мкл безводного етанолу. Плазміду раМРб розщеплювали за допомогою Зта!ї, щоб лінеаризувати її в полілінкері. Плазміду раМРб отримували з плазміди рС2К199 (Американська колекція клітинних культур, Мапазза5, МА, АККК Ме98668), і вона являє собою вектор експресії ссавця, який містить касету експресії що має проміжний ранній промотор цитомегаловірусу, консенсусний інтрон із варіабельної зони локусу важкого ланцюга Імуноглобуліну миши, багато сайтів рестрикції для вставляння кодуючих послідовностей, термінуючий кодон і термінатор гормону росту людини. Ця плазміда також має початок реплікації Е. соїї, одиницю експресії селектованого маркера ссавця, яка має промотор вірусу 5М40, енхансер та початок реплікації, ген дигідрофолатредуктази і термінатор вірусу 5М40. Вектор рАМРб конструювали з рС2К199 шляхом заміни промотора металотіонеїну на проміжний ранній промотор цитомегаловірусу і за допомогою Когас-послідовностей на 5'-кінці відкритої рамки зчитування. 100мкл компететних клітин дріжджів (5. сегемізіае) поєднували з 10 мкл, що містили приблизно 1мкг позаклітинного домену ТАСІ, фрагментами РПЦ Ес4, 100нг вектора раМРб, перетравленого за допомогою 5таї, і переносили в 0,2см кювету для електропорації. Суміші дріжджі/ДНК піддавали електровібрації при 0,75КВ (5кв/см), ссомів, 25мкФ. В кожну кювету додавали бОбмкл 1,2М сорбіту, і дріжджі висівали на чашки в двох З0Омкл аліквотних пробах на планшетах ОКА-О та інкубували при 3020.

Приблизно через 48 годин дріжджові трансформанти Ога- з одного планшету ресуспендували в їмл буфера для лізису (295 Ттйоп Х-100, 195 додецилсульфату натрію, 100мМ масі, 10мМ Тті5, рнав,0, 1їммМ етилендіамінтетраоцтової кислоти). 500мкл цієї суміші для лізису додавали в пробірку Епендорфа, яка містила

Збомкл промитих кислотою скляних гранул і 200мкл фенолхлороформу, завихрювали 2 або 3 рази по 1 хвилині, після чого центрифугували в центрифузі Епендорфа з максимальною швидкістю. З0Омкл цієї водної фази переносили в свіжу пробірку, і ДНК преципітували, застосовуючи бООмкл етанолу, після чого центрифугували упродовж 10хв. при 4"С. Осад ДНК в пробірці після центрифугування ресуспендували в 100мкл води.

Трансформацію електрокомпетентних клітин Е.соїї (ОНІТОВ, сірсовк|) здійснювали, використовуючи 0,5- 2мл препарату ДНК дріжджів і 40мкл клітин ОНІ1ТОВ. Клітини піддавали електровібрації при 2,0кВ, 25мф і 400ом. Після електропорації їмл 5ОС (295 бакто-триптону (Оіїсо, Оеїгоїї, МІ), 0,590 екстракту дріжджів (Оіїсо), 10мМ масі, 2,5мМ КСІ, 10ММ Мас», 10мММ Моз», 20мМ глюкози) висівали в чашках в 250мкл аліквотних проб на чотирьох планшетах з І В АМР (бульйон І В (І еппох), 1,890 бактоагару (Оіїсо), 100мг/л ампіциліну).

Окремі клони, які дали притулок структурному елементу з вірною експресією для ТАСІ-Ес4, ідентифікували шляхом рестрикційного травлення, щоб перевірити присутність вставки і підтвердити, що різні послідовності

ДНК приєднались правильно одна до одної. Вставки позитивних клонів піддавали секвенуванню. Більшу плазмідну ДНК виділяли, використовуючи комплект Оіадеп Махі (Оіадеп) за інструкціями виробника.

В. Конструювання Ес5, Есб та Ес7

В послідовності Рое5 залишок Аг в позиції 218 індексу БЮ знову заміняли на залишок Гуз. Іду! дикого типу людини містить в цій позиції лізин. Стисло, продукували молекули нуклеїнової кислоти, що кодують Ес5, використовуючи олігонуклеотидні праймери 5 ВАССССАААТСТТСАСАСААААСТСАСАСАТОСССА 3" (5ЕО ІЮ

МО:19) і 9 ТААТТОССОСОССТСТАСАТТАТТТАСССОСБАСАСА 3 (5ЕО ІЮО МО:20). Умови для ампліфікації

РПЦ були такими. До 50мкл кінцевого об'єму додавали 236нг матриці Ес4, 5мкл реакційного буфера 10 Ріи (5ігаїадепе), 4мкл 2,5мМ амМтТР, їмкл 20мкМ кожного із згаданих олігонуклеотидів і Імкл Ріи-полімерази (2,5 одиниць, 5ігаїадепе). Термальний профіль ампліфікації складався з 94"С упродовж 2хв., 5 циклів при 9470 упродовж 15сек., при 42"С упродовж 20сек., при 727"С упродовж 45сек.; 20 циклів при 947С упродовж 15сек., 727"Сб упродовж хв. 20сек., після чого ще 7хв. при 72"С. Продукт реакції фракціонували методом електрофорезу в агарозному гелі і виявили диск, який відповідав очікуваному розміру, приблизно 718 п.о.. Цей диск ексцизували з гелю і відновлювали за допомогою комплекту реагентів ОІАСЕМ ОІАдиїйсК для екстракції гелю (Оіадеп) за інструкціями виробника.

Есб є ідентичною Ес5 за винятком того, що карбоксикінцевий лізиновий кодон було еліміновано. Як і в описаних вище Еса і Ес5, термінуючий кодон в послідовності Есб замінили на ТАА. ЕРсб генерували з матричної

ДНК, яка кодувала РБс5, використовуючи олігонуклеотидні праймери 5САССССАААТ СТТСАСАСАА

ААСТСАСАСА ТОСССА 3 (5ЕО І МО:19) і 5 БОСОСОССтТо ТАСАТТААСС СОБАСАСАСО БАбАООС 3 (ЗЕСОІОМО:21).

Ес7 є ідентичною ЕсуЇ дикого типу за винятком амінокислотної заміни в позиції індексу БЮ Авзп 297, розміщеній в домені Ст-Азп 297 мутували в залишок Сіп, щоб запобігти прикріпленню М-зв'язаного карбогідрату в позиції цього залишку. | термінуючий кодон в послідовності Ес7 замінили на ТАА. Ес7 генерували шляхом перекриваючої РПЦ, використовуючи КДНК Ес Ідсу дикого типу людини як матрицю, олігонуклеотидні праймери 5 БАбСССААДАТСТТОССАСААААСТСАСА 3 (5БЕО 0 МОо22) і 5 атТАсатасттастТАСТаСстосСтосСасСОоасСт 3 (5БО 10 МО:23) для генерування 5'-половини послідовності Ес7, і олігонуклеотидні праймери 5 САСТАССАААССАСОТАССОТОТООТСА 3 (5ЕО ІЮ МО:24) і 5 ТААТТООСОСОсСсСТСТАСАТТАТТТАСССОСАСАСА 3 (5БО ОО МО:20) для генерування 3'-половини послідовності Ес7. Ці два продукти РПЦ поєднували і ампліфікували, використовуючи олігонуклеотидні праймери 5 САССССАААТСТТОСОАСААААСТСАСА З (ЗЕО Іо МО:22) і У

ТААТТавСЯСОаСасстотТАСАТТАТТТАСССОасАСАСА 3 (5ЕО 1О МО:20).

Всі отримані в результаті продукти РПЦ очищали від гелю, клонували і перевіряли методом секвенування днк.

Г. Конструювання злитих білків ТАСІ-Ес з відсіченими амінокінцями

Генерували чотири варіанти ТАСІ-Ес з відсіченими амінокінцями. Всі чотири мали модифіковану сигнальну послідовність (ЗЕО ІО МО:25) активатора плазміногена тканини людини, злиту з амінокислотним залишком 30 послідовності ЗЕО 10 МО:2. Однак всі чотири відрізнялись по локації точки, в якій Ес5 була злитою з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:2 ТАСІ. В Таблиці З показані структури цих чотирьох злитих білків.

Твблнох З

Зах бака ТАС

ПОЛ онахення ТАТИ Авінеєнсминіалянки БАК

Се ді ридлнис ВВ Я

СеАЕНИ ЯХТИ ЯКО квівнноня ВАТУ й ТАСНЗИ ЧИ Яр і Кенопесиштеносі ЕХО МО З :

ТАНЯ КУ МКВНИДТИ, пікова МАО НЕ

Касети експресії, кодуючі білок, генерували методом перекриваючої РПЦ, використовуючи стандартні прийоми (див., наприклад, Ногіоп еї аїЇ., Сепе 77:61 (1989)). Як матриці застосовували молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодувала ТАСІ, і молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодувала Ес5. Застосовані олігонуклеотидні праймери наведені в Таблицях 4 і 5.

Заблюнн я

Оліпоюкомеозні нурмйюкро, хястокн ог су, гуюзукувяння зактих Білюзн ТАС нин п 1 Чозмааивя ТАбюВк ГК ТАКА ГОЮ ОККО

ГЕДЕЦОХ; КЯ У УКУС ЖК Ина

Селен ОБЛ ОВК в т 0 тазаливня

Ознонуклевтивні вислідонтості

Траймер ! НПуклготизна послідовність ! 5 ! ше: ММК ее тек ЕКО вс Кк В МЕТИ

ПЕШДЕТИ ТИВНЕ АН ЕХ К КАК с жсМм їх Тааттпо ил АСОМ ТАТ МА ХОСАУ ВАЗ 1 і

ПЕН КДАВТ КАН ЯК

Ж ТКА ОКА ААУ ЕТ шок: В яке попит З М Ес

ГОЮ 100000 КСО АЦСАЙН МИСКА АВА

С 1 Коен ОвесхкА ве Ав

Перший цикл ампліфікації РІПЦ складався з двох реакцій для кожного з чотирьох варіантів з відсіченими амінокінцями. Ці дві реакції проводили окремо, використовуючи олігонуклеотиди 5' і 3' ТАСІ в одній реакції і олігонуклеотиди 5'і 3 Рс5 в іншій реакції для кожного варіанта. Умови першого циклу ампліфікації РПЦ булитакими. До 25мкл кінцевого об'єму додавали приблизно 200 нг матричної ДНК, 2,5мкл 10х реакційного буфера Рі (5ігаїадепе), 2мкл 2,5мМ аМТР, 0,5мкл по 20мкМ кожного 5'-олігонуклеотиду і 3'-олігонуклеотиду і

О,5мкл Ріш-полімерази (2,5 одиниць, 5ігаїадепе). Термальний профіль ампліфікації складався з 947"С упродовж

Зхв., 35 циклів при 94"С упродовж 15сек., при 50"С упродовж 15сек., при 727"С упродовж 2хв., після чого додатково ще 2хв. при 72"С. Продукти реакції фракціонували методом електрофорезу в агарозному гелі, і диски, які відповідали очікуваним розмірам, ексцизували з гелю і відновляли, використовуючи комплект реагентів ОІАСЕМ ОТАДОЦШІСК для екстракції гелю (Оіадеп) за інструкціями виробника.

Другий цикл ампліфікації РПЦ, або ампліфікації перекриваючої РПЦ, здійснювали, використовуючи очищені від гелю фрагменти з першого циклу РПЦ як матрицю ДНК. Умови другого циклу ампліфікації РПЦ були такими. До 25мкл кінцевого об'єму додавали приблизно по 1Онг матричної ДНК кожного ТАСІ-фрагмента і

Ре5-фрагмента, 2,5мкл 10х реакційного буфера Ріи (5ігаїадепе), 2мкл 2,5мМ амтР, 0,5мкл 20мкМ кожної з 7С24,903 (5ЕО ІЮ МО:40) ії 2024,946 (5ЕО ІЮ МО:20) і 0,5мкл Ріи-полімерази (2,5 одиниць, Зігагадепе).

Термальний профіль ампліфікації складався з 94"С упродовж 1хв., 35 циклів при 94"С упродовж 15сек., 5570 упродовж 15сек., 727"С упродовж 2хв., після чого ще 2хв. при 72"С. Продукти реакції фракціонували методом електрофорезу в агарозному гелі, і диски, які відповідали очікуваним розмірам, ексцизували з гелю і відновлювали, використовуючи комплект реагентів ОІАСЕМ ОІАОШІСК для екстракції гелю (Оіадеп) за інструкціями виробника.

Кожний з продуктів РПЦ чотирьох варіантів ТАСІ-бс з відсіченими амінокінцями окремо клонували, використовуючи коплект для клонування ЛЕКОВІОМТ ТОРО РОС ф."Іпмйгодеп" згідно з рекомендаціями виробника. В Таблиці 6 наведені нуклеотидні та амінокислотні послідовності цих структурних компонентів

ТАСІ-Ес.

Таблюйн

Песлідекогмхі каріхнтю ГАТЛОЕК (обювнннкютьСьт 000 бинти 00000 Кене птАСдаачнкої : ях т 50 Н

ТАКИМИ НЯ ЯКОЇ я І Ка :

Після перевірки нуклеотидних послідовностей плазміди, що містили кожний з чотирьох варіантів злитих білків ТАСІ-Рс з відсіченими амінокінцями, перетравлювали за допомогою Е5еі! та АвсіІ, щоб вивільнити амінокислотні кодуючі сегменти. Е5зеІ-Авсі-фрагменти вшивали у вектор експресії ссавців, який містив промотор СММ і сегмент 5У40 роїу А. Вектори експресії вводили в клітини яєчника китайського хом'яка, як описано нижче.

Приклад 2

Продукування білків ТАСІ-Ес за допомогою клітин яєчника китайського хом'яка

Вищеописані структурні компоненти експресії ТАСІ-Єс використовували для трансфекування, шляхом електропорації, суспензійно-адаптованих клітин (СНО) 0044 яєчника китайського хом'яка, вирощених у безбілковому середовищі тварини (Опацб еї аї, Зат. СеїЇ. Моке. Сепеї. 12:555 (1986)). В клітинах СНО Ос44 не вистачало функціонального гена дигідрофолатредуктази через делеції в обох хромосомних локаціях дигідрофолатредуктази. Вирощування цих клітин у присутності збільшених концентрацій метотрексату дає в результаті ампліфікацію гена дигідрофолатредуктази і з'єднаний рекомбінантний кодований білком ген на структурному компоненті експресії.

Клітини СНО 0044 переносили в середовища РЕСНО (КН Віозсіепсе5, І епеха, К5), 4мММ /-глутаміну (УВЕН Віозсіепсев) і їх добавки гіпотанксин-тимідину (іте Тесппо!одіев), і клітини інкубували при 37"С і 595 СО» у струшуваних колбах Корнінга при 120об/хв на платформі шейкера, що оберталася. Клітини трансфекували окремо за допомогою лінеаризованих експресуючих плазмід. Для гарантування стерильності один етап етанолової преципітації здійснювали на льоді впродовж 25хв., поєднуючи 200мкг плазмідної ДНК в пробірці

Епендорфа з 20мкл ДНК носія у вигляді гідродинамічно зсунутої сперми лосося (ф. "5-53 Іпс.", Вошаег, СО, 10мг/мл), 22мкл ЗМ Маодс (рн 5.2) і 4в84мкл 10095-ного етанолу |Соїа Зпівій Спетіса! Со., Наужага, СА). Після інкубації пробірку цетрифугували зі швидкістю 14000об/хв в мікроцентрифузі в холодній кімнаті з температурою 4"С, надосадову рідину видаляли, осад в пробірці після центрифугування двічі промивали за допомогою 0,5мл 7095-ного етанолу і давали висохнути на повітрі.

Поки осад ДНК сушився, клітини СНОС44 обробляли центрифугуванням 10 ітогових клітин (16,5мл) в 25- мілілітровій конічній трубці-днентрифузі при 900об/хв упродовж 5хв. Клітини СН 00544 ресуспендували в загальному об'ємі ЗОбмкл в середовищі РЕСНО для вирощування і поміщали в кювету ген-пульсатора із зазором між електродами 0,4см (Віо-Кад). Після приблизно 50хв. висушування ДНК ресуспендували в 500мкл середовища РЕСНО для вирощування і додавали до клітин в кюветі, так щоб загальний об'єм не перевищував 800 мкл, і давали осісти при кімнатній температурі впродовж 5хв., щоб зменшити утворення бульбашок.

Кювету поміщали в установку ІІ ген-пульсатора ф."Віо-Каай", налаштовану на 0,296кВ і високий ємнісний опір (0,950), і одразу здійснювали електропорацію.

Клітини інкубували 5 хвилин при кімнатній температурі перед тим, як помістити в 20мл загального об'єму середовища РЕСНО в колбі Собіаг Т-75. Колбу поміщали в термостат з температурою 37"С і 595 СО» на 48 годин, потім клітини рахували за допомогою гемоцитометра, використовуючи ексклюзію з барвником трипановим синім, і поміщали у селекційне середовище РЕСНО без гіпотанксин-тимідинової добавки, яке містило 200мММ метотрексату (Са! Віоспет).

Після виділення за допомогою процесу відбору з використанням метотрексату кондиціоновані середовища, які містили секретовані білки ТАСІ-Ес, досліджували методом вестерн блот-аналізу.

Приклад З Структурний аналіз білків ТАСІ-Ес

В деяких випадках перед аналізом злиті білки ТАСІ-Рс очищали. Кондиціоноване середовище з культур яєчника китайського хом'яка стерильно фільтрували через фільтр з розміром отворів 0,22мкм, і білок ТАСІ-ЕсС відловлювали на колонці білка А. Матеріал, зв'язаний білком А, елюювали і пропускали над ексклюзійною колонкою розміром 5-200 для кінцевого очищення.

Методом вестерн блот-аналізу досліджували і середовище з клітинами, і очищений білок, щоб оцінити структуру стабільності білків ТАСІ-Рс. Стисло, виборки білка або надосадової рідини переносили на нітроцелюлозні мембрани, і білки ТАСІ-Рс детектували за допомогою кон'югованих з пероксидазою специфічних антисироваток кози проти І(дДс52а миши (Воепгіпдег Мапппеїт) або кон'югованих з пероксидазою специфічних антисироваток кози проти людського Дос (Ріегсе).

Аналізи амінокінцевих амінокислотних послідовностей здійснювали на моделях 476А і 494 систем секвенатора білка від ф."Регкіп ЕІтег Арріїєй Віозузіет5 Оімізіоп" (Бовієг СПу, СА). Дані аналізували за допомогою моделі 610А, версії 2.1а, системи аналізу даних для секвенування білків (ф."Арріїей Віозузіет5

Іпс."). Більшу частину застосованих ресурсів і реагентів постачала ф."Арріїеа Віозузіетв Іпс.".

Приклад 4 Функціональний аналіз білків ТАСІ-Ес

Для визначення здатності чотирьох білків ТАСІ-Ес зв'язуватись з 7ТМЕ4 були застосовані два методи.

Перший: виміряли здатність структурних компонентів ТАСІ-Ес конкурувати з пластинами, покритими ТАСІ, для зв'язування 2ТМРЕ4, міченого ізотопом "25І. Другий метод: зростаючі концентрації 2ТМЕ4, міченого ізотопом 25, інкубували разом з кожним із структурних компонентів ТАСІ-Рс і визначали радіоактивність, пов'язану з осадженими комплексами 2ТМЕ4-ТАСІ-Ес. Злиті білки ТАСІ-Ес мали ТАСІ-частини, в яких не вистачало перших 29 амінокислотних залишків амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:2. Один із злитих білків мав

ТАСІ-частину з інтактним стеблом (ТАСІ(й1-29)-Рс5), тоді як три злиті білюи ТАСІ-Рс мали ТАСІ-частини з різними делеціями в стеблі (ТАСІ(а1-29, а107-154)-Рс5; ТАСІ(а1-29, а111-154)-Рс5; ТАСЦ(аІ-29, а120-154)-Ес5).

А. Метод конкурентного зв'язування

Після стандартних методів 2ТМЕ4 радіойодували за допомогою йодогранул (Ріегсе). Стисло, 50 мкг 2ТМЕ4 йодували за допомогою 4мсі ізотопу "22І, використовуючи одну йодогранулу. Реакцію згасили за допомогою 0,2595-ного розчину бичачого сироваткового альбуміну, і вільний ізотоп 125| видалили шляхом гель-фільтрації, використовуючи колонку РО-10 (Ріегсе). Специфічну радіоактивність композицій 125І1-27ТМЕ4 визначали методом осадження трихлороцтової кислоти до і після етапу знесолювання.

М-кінцевий фрагмент рецептора ТАСІ, позначений "ТАСІ-М", додавали до 96-ямкових планшетів (10Омкл при 0,1мг/мл) та інкубували всю ніч при 4"С. Планшети промивали, блокували суперблоком (Ріегсе) і знову промивали. Структурні компоненти ТАСІ-Ес при різних концентраціях, від О дої 1,5нг/мл, змішували з 125|- 2ТМЕ4 фіксованої концентрації (2Онг/мл) та інкубували впродовж 2 годин при 37"С на пластині, покритій ТАСІ-

М. Контрольні групи містили або ТАСІ-М в розчині, або не містили ТАСІ-Ес. Після інкубації планшети промивали і робили підрахунки. Кожне визначення робили тричі.

Результати показали, що всі структурні компоненти ТАСІ-Ес повністю інгібували зв'язування з 125І-27ТМЕ4 при концентраціях приблизно 11нг/мл або більше. Білки ТАСІ-Ес, а саме: ТАСЦа1-29)-Рс5, ТАСЦа1-29, а111- 154)-ГРс5 та ТАС(а1-29, а120-154)-Ес5, були більш ефективними інгібіторами, ніж структурний компонент ТАСІ-

Ес, а саме ТАСЦа1-29, а107-154)-Рс5. Ес-фрагмент сам не інгібував зв'язування. Для кожного структурного компонента в трьох експериментах обчислювали значення /ІСзо. Середні значення для структурних компонентів були такими: ТАСІ(а1-29)-Ес5: 2,07нМ; ТАСІ(а1-29, а107-154)-Рс5:4,95НМ; ТАСЦІ(ат-29, а1т11-154)-

Ес5: 2,31нМ і ТАСЦ(а1-29, а120-154)-Рс5: 2,21нМ.

Б. Аналіз на зв'язування розчину

Кожний структурний компонент ТАСІ-Ес, при концентрації 0,05нНМ, інкубували разом з 0,4пМ-1,5нМ 71251- 2ТМЕ4 упродовж ЗО0хв. при кімнатній температурі в загальному об'ємі 0,25мл на пробірку. В кожну пробірку додавали суспензію пансорбіну (гар А) і після 15хв. зразки центрифугували, двічі промивали і визначали кількість осаду в пробірці після центрифугування. Неспецифічне зв'язування визначали шляхом додання 130нМ неміченого 2ТМЕ4 до суміші 125І1-27ТМЕ4/ТАСІ-Єс. Специфічне зв'язування обчислювали шляхом віднімання граничної кількості клітин на середовище при наявності неміченого 2ТМН4 від загальної граничної кількості клітин на середовище при кожній концентрації 125І1-27ТМЕ4. Кожне обчислення робили тричі. Константи зв'язування обчислювали за допомогою програмних засобів сгарпРаа Ргізт (Масіповзі м.3.0).

На Фіг.А4 показане специфічне зв'язування 725І1-27ТМЕ4 з різними структурними компонентами ТАСІ-Ес.

Виявилось, що зв'язування наближається до насичення кожним структурним компонентом, і було значно вищим для структурних компонентів ТАСІ(а1-29)-Рс5, ТАСЦат-20, а111-154)-Рс5, ТАСЦа1-29, ат120-154)-Ес5 порівняно із зв'язуванням ТАСІ(а1-29, а107-154)-Рс5. Обчислювали значення максимального зв'язування (Втах) і зв'язувальної схожості (Ка), які наведені в Таблиці 7.

Чябожхх

Зв'язування СБЖЛМЕХ зі спруєтурниюи ваюнооентами КАСХЯС

І банук рий кокон ЯМЯЖк 1 КМ Ов

ІТК КА а м МИ: НН оо син ни п

ІКАО Но пк п : ТАСЧИБ БИ ХЯКРсЯ Н ФУЕ ПОВ

Приклад 5 Вимірювання циркулюючих рівнів 2ТМЕ4

Застосовуючи електрохіміколюмінесцентний аналіз, визначали рівні 2ТМЕ4 у хворих індивідумів (наприклад, хворих на СЧВ, ревматоїдний артрит) відносно здорових індивідумів.

Будували калібрувальну криву стосовно до розчинного людського 27ТМЕ4 при концентраціях 1Онг/мл, 1нг/мл, 0,Тнг/мл, 0,01нг/мл і Онг/мл в буфері ОВІСІМ (Ідеп, сзайпегериго, МО). Виборки сироватки розбавляли в буфері ОРІСІМ. Нормальні зразки і виборки інкубували при кімнатній температурі впродовж 2 годин разом з антитілом ВМ біотинильованого кролика проти людського 2ТМЕ4-МЕ, розбавленим в буфері Огідіп (Ідеп) до концентрації 1мкг/мл, і поліклональним антитілом ВМ кролика, обробленого рутенієм, проти людського 2ТМЕ4-

МЕ, розбавленим в буфері Огідіп (деп) до концентрації мкг/мл. Після інкубації виборки струшували і перемішували, потім до кожного нормального зразка і виборки додавали 0,4мг/мл стрептавідинових динагранул (бСупаї, О5іо, Могмау) з розрахунку 5Омкл на пробірку та інкубували впродовж ЗОхв. при кімнатній температурі. Виборки потім струшували і перемішували і потім зчитували на аналізаторі Огідіп (Ідеп) згідно з інструкціями виробника. Аналіз Огідіп базується на електрохіміколюмінесценції, і результати зчитування даних виводяться на мові супервізора (ЕС). В одному дослідженні виявили підвищений рівень 2ТМЕ4 у виборках сироватки і від мишей НХЧБ Е1/), і від мишей МЕ /Мр/-Рав'є", у яких прогресували стадії гломерулонефриту і аутоїмунної хвороби.

Аналіз за допомогою буфера ОВІСІМ також застосовували для вимірювання рівнів 7ТМЕ4 в крові хворих на СЧВ порівняно з циркулюючими рівнями 2ТМЕ4 у здорових індивідумів. Будували калібрувальну криву стосовно до розчинного людського 2ТМЕ4 при концентраціях 1Онг/мл, нг/мл, 0,Тнг/мл, 0,0М1нг/мл і Онг/мл, розчиненого в буфері ОРКІСІМ (Ідеп). Всі виборки від хворих піддавали аналізу тричі з кінцевим об'ємом 25мкл.

Нормальні зразки і виборки інкубували при кімнатній температурі впродовж 2 годин з імобілізованим антитілом, поліклональним антитілом ВМ біотинильованого кролика проти людського 2ТМЕ4-МЕ, розбавленим до 1мк/мл в буфері для аналізу Огідіп (деп), та поліклональним антитілом ВМ кролика, обробленого рутенієм, проти людського 2ТМЕ4-МЕ, розбавленим до 1мкг/мл в буфері для аналізу Огідіп (Ідеп)/ Після інкубації виборки струшували і перемішували, додавали 0,4мг/мл стрептавідинових динагранул (Оупаї) до кожного нормального зразка і виборки при 5Омкл на пробірку та інкубували впродовж ЗО0хв. при кімнатній температурі.

Виборки потім струшували і перемішували і аналізували за допомогою аналізатора Огідіп 1.5 ф."Ідеп" згідно з інструкціями виробника.

Цей аналіз включав 28 нормальних контрольних зразків і зразки від 20 хворих на СЧВ. Підвищені рівні 2ТМ4 спостерігали в сироватці хворих на СЧВ порівняно з нормальними контрольними зразками сироватки.

Рівні 7ТМЕ4 обчислювали як збільшення в декілька разів рівнів 2ТМЕ4 в зразках хворих або контрольних зразках порівняно з еталонним зразком сироватки умовної людини. Середній показник 28 контрольних зразків був у 1,36 разів більшим, ніж в еталонному зразку людини, а середній показник зразків хворих на СЧВ був більшим у 4,92 рази. Семеро із 20 хворих на СЧВ мали рівні 2ТМЕ4, які удвічі перевищували середній показник контрольних зразків, і тільки один контрольний індивідум мав рівень, що перевищував контрольний середній рівень більш ніж у два рази. вЕуОКМ Кк Пітта МмІ піз мист, Ммахк ом. шкозо, бепе А хіх АС лем орогіг Шуєїмо вісфжіох 0 ЗЛЖИ лк ТАС с мусотловуєм хі4у» ПА-ЙОРІ - лайм вИтисуонгІ1591 «іі» поб2Оп5 аАівах Ба, хіпі» попх-05- и «АБО з -ьійн БаніББО Жої Фаодовв Уекнігй Я. «ах пмА ДНЕ «ШАЗВ ис охемінко «епох їх - зусасостце ЯБа чо Я Зам сіє шо сЗи еше вс: соя ЧО ес сту ча кис дек дій би піУ бхз демокоу Мо оїу ТУ деч їх СИ 18 ха: от ЗЕ ша со але у пес МІ сем ся ес січ поч во оце 08 лпех де кі їх» зби іМм опію яка ува бло іх (у ко лкеотвх пту.

Зі пс аа опо се песо сс дхе вехсоха маг їла бат спеоеКо спо 155 ук) ваза Мек ст дет схе Рг піа баз Мі бух тро йец Хто Бей сх ах КЗ 15 зчх вс? теп аб їбс бо: водо апе ЧУЄ Бус вах сах пец дує схо косо АТ біоти бує Мої ех Суз ух ЖОх Їлое Пух хо нію бік беходіх ха зх кт М вп ст хці Чо чих тки жі ЗзшЕ МеВ омо хоп Зо сце оз хо5 лох охо злі ліс обух мів пло се Пух о зху бкс лен Бк бук асп їух біо сао лу пу за 75. ах: опІМм дії охбобвх пф соб буд зе во і: вВдє Їяї Флб «пт ояід таз

Муз пе чух ви хіх геьмобтц Кк ло Суз Ух пеу буч від Ббт Ме яз зо мое сад опоп ом; кт бах М бра Мт їх Ф3ї1 пай коло ле тт

СУБ Х бімоЧіх о бхо дує біп Сук щі Ууг ре бух Бій Ха уж Зк зм 3058

Фо висо о ціц ло сій пеФфосгя наб осзи коу зМе охб ФпЗ вач Уа Ка дІ5 ВОоКоМко МІ дедосже рій Ето зр: Бей ойкКа Ати Пій Аси бко су 115 тк. з5о пох ос охо ох ям. інф о доловко борщ уз б оспах цях ха ду ху

Зіп оба шій Ай лкпоБех хв ой Хек Фу шк бут бе о бУбу КБеи ке 375 їз хуй ка свт гак уди їта дов ев зисобсха шт сіб сс оц см гай пі м чі

Мі лює бу де біо Адбя бегобгє Віа емо Рфіц бі їжа мує демо Вк лак В 155 їса о бнЕ Єву чЕц ото соц Ус гас ве ас січ сли се їує сечо зв ЗБа дік спо овло Мхї АТх бю Хі Ту: дж боаговко СТУ бле: бух хо Сук

КАН Хек 179 чим цен остов це паз вхо сх чІФ мч Ме бе Жим Срмохех зх) 234 ЗУ ма м єм пух Сус Моска хі Кі кі зх сСух Бле ско лек їх

ІТ Б ї55 аце она челпопен рнФб пс гцФобОМУ мб оФує мов мдф осо Фе о конозні ря дтп опіу Мо 0У? бух Баот був б10 го Ву бат КЕП Отто Меу па лем і їн зо сенозте вне спбомоц сяФфодан пес бот поч дав уст ме: аби спис обу ту хо 8ію Муд хог бвж бій лвропів Мі й Мій Азіао сі бжу Бса о чві

ОЗ а ж ЗАЙ зисоесю сип пом одха сел дід дат Вбо бе кал овмсо сце сб дв т23

Жегобьє беж о Рено БАЮ Бк Усі ім УвгосСух бом обюйс Суз Еко іп одію.

Ка 15 т35 км Ма) сл охмомо ом со щей Зх цех аме ас5омоМ бчж а семоцяє за сук оАсц хіх їхо Тьх іп дім бер олію Мої Тис ого 3у т: хо ар 2533 ах Й 250 те о вст сеч пек «фу хом будо яОт Вус хох ос здо их овшк что Фі я тс Тис Шує Віт зи лоб бери БУХ Пух БХб бос дер тур ТЕ МАХ То 26 251 лем сте пус тех сяс о омо моз озне не: Бе сіІЖ бас У по Уч ніж вк пік ве Сух рхо лік хіх го ст ооне пІіУ їде У Пе хех був сом сей це о пяєм ема чец пос сіпя ца зпа хомлаццир пемипюузу ВІ уки ві пі піну оку Усассіж віх хзачакозои щозоплонІ Чохохіянто зплонухмнах мухами зару УА охозсомоїа хдвоцнохам длозлоцаот боса спляансво ядрі хсзца 308 песпаевлаце чЧащшасеояоц зкозоенеях моснбуєича Фноненсапо бхсецеслей МОНИ ясдсспохоней улучовносо уопостнцонло днхецоюнон пецпесайси фут 1152 еУчаБоцеця сецзопхожох схпзпозоса пасилатане сдейпататей чол МАМА пазупектисі Фдхщтєслодт усотецеата Чцетлі сухо бхоЧісатк зчстжевох МЕ пехаксахех счепліцсст догцеглеогя пепеспсехоа дпсссітшемт стцазмозисх 1332 авжстечсо педсішсомЕ сссбсчевха каеовеанох Зжаи лу «ВАШ» 7 - «11 ОЗ «їй вт. «ул» и паріютк хауои г. емо дер у Бецосіу вси БнкоАсж й ліу Зіш о дуй бок охио зві йо ї т. їз хе дійові бу: хту се Еко Ой ШХу Пед обкр лі сту Усе Ар кет Ах ху тк З нг пух РБевобім Зін дів ожЖук їг» Аорокхо хо Бех о сіу Тв» Пух Мке зх о. С вт пух цЦує ТВУ Тіє бух Ах» віх йіо похо діх МУ тТЬьх Су Ме ліх т АЖ ко твх Суб го Жекоїхе: Меп бух Ксф о гує бід бів оФзу Мудо ме тух Ар ої з 7 ау

ХМіх пе бец Му Яр Сує Дім Жуї бух Аза кс дія Су У Зх вв

Го Зо. Зк

Ухху пух дів бух ла тує бю тує Пр дко пує вол о лхо Бех со УМІ

Зм 182 за

Мхз озимі но го З10 цей Ме поч ІЗ ЛІ обог у ЯЗ мех бі Дом 415 їха 125

Дсгобм: Авиовчо пех О1у дгх ут осі» Піу їж З3ій Кіз Аж зу Бог ї32 315 за ців Азнобют біб віз Ом Ре іУ зиме їмо» люМм Бк: 23 Атрощіг ві хм зо ких са дія їй УКІ Лух Мют ТМх цею 2фу ме обую кец Сум дз о Маф руч бух їі55 хи 35 дух ув чо мМез Мію Мах Мій бух Це лен цуз рих ас Ам Акрогка 152 124 95 бух йко ЛЧух Хо бтлолхдо бом Му рус хо Чі бе Ухе ля бух Буг тя ой з

МІ ЙО Кжо ціх дії й діа вія ЯРУ Бкс бі ме) бюс Тех Вегоїхо я Рая їй сі йгй УВІ Сім озиИг бух ес ОМе Су Бе вс П20 бух бо Дає М дез те та кв твгопій бі думовізю тау хо бе слу Лем о Бхо дхроксо ТУнт бух Аза 25 150 КІ дія по тім щій Смик щі їх хх ТМ бом Ук юзи Бій по був їко 25а за5 то

Кіз іх го АзроЯдег піу ба пу ї3 УМ1 МуУМОМИб рхФоліх іх БА» г аб 253 піу лзу бхо у Ме 182 хуй «їі 25 хіудше риб ятКЗх Можу охріних

ОН бас мер ЗЕ обкі Мк біо лінощів бі» Хом вхо пе: ТОМ о бхо пух 1 4 в. 11 їх тук бик оАує ЗА бла мех Був бем руб бзю був Уебойпеу де сбве го то 22 3 дій Був СІц Бег Уко Щек Узі дга бек Бег бук Ар ОСКу ме їмо їм «АХ їх діа ліз тим їод їєц ібц дія їмо їеч бок о Си5 Пує їдою ліц уні Ул зи 85 о

Зно Жпеб тує дій Маї бнодія зо піз Зі1у до» опем дію г їмо ке че зу 75 в із ій Мей дій бзу віх пій ліва піц пух пем ого лів Оу вав Ііу 53 зи міх о Бспопує Хів ЗКУ сам ЧИН сХи дів вро Зіа ця)» тбголім ВІУу бку2 125 їй ма їух хіх Бі біо вго тТко Міх со біу біз слу пхо бек дом обін Мвю ліз їж 115

Жот ага зв» ут Му Мій уваії пзпосІУу ЗК БА пін те МАХ Тх біл 135 55 КУ

Авр су й дув пей хім дк Ахробег їн ЖВК Ето» ВХ ї10 с10 пух 115 353 ЕЕ її су Зшготук тег обоз Зах вго їко Бод беч Вех бе мує ха ПАУЗ і-й пута 55 а йи біз орі дух Зі яп сбуло хім беуф Уї Був сів бвк ур о ужУ. т85 Ах ла

Бре зх ї1ю Тус П5у бію уві ої; тус Тс Мко ух ис Хум Азя Ме 135 за 05 піу Ні ко її13 бів хеу рук бує Маї шіз маї ре йіУу ев біс по шу ЗІБ КУ

Яех тях МАВ Отит Ммкеа ін дсц Пую тАв Сі деп Мем біт без Тнг їж лІЗ 2за КІ зай кго ба Ако ЖегоСух отТух Ком АЗе пли 11 Аз бух ої ко біо слу и а5 Іл ча ри сія ремощуй їі дія 16 йко вхо ДІЙ дом Аза бі» Хі 5вг ої зо за5 Й Кат

Вир ОСТ Аеромаї Мус рве Бе ЗБу Аїя ЗкУ бує део сво

А зва их «218 4 хЕЛух БО «Вій ЖяТ -й1л пбео» яхрієцео «ах 4 Й

Мем: Ро Лід бех шШех буФ Бе си їх: дів ро Був Зі Кто Бе Щіу 1 5 12 Кк вп овес біу су бго ММЮ Ххж ШУс Кго Лів (ка дек ме) яза бом ти» т5 ЖЕ рн

Яке ложе тхе СІУ Міа Ззіз Топ БІТу ліз кі Мі цпуз Аіа має діа рхо зв Гу дз й ім їнс сіб пл) ток бід Зі ке Бек оїедя дтп Ат Йо» хі бог же та 5 І ве бів Зі ТагГОБіу ЩУУу бі би: іх оц біх бі осіу бу: хе теп «к Но У ЗУ сів одех ем обіє пр» піл обжс бег Хр дія ем біс ліво Ук ім дл ях 85 85

У; піс бів бех дія ую ХХ вхо АТА УХІі ша Тйг ШУМ МУнНОбіМ Пмю 54 хол и ЗУ бю бію хе сеї Уді їзи Міх їх оді Кхо хів дя) ія ЛВк пвх був

155 Й Іо її догобси Беї Аве уаї їж біз Меї Мер оуУуробій Мука Ліз саз о Ат Ак 152 135 хо іх й фу пехофій Аїз біз біу тук о біу Меї Ак ІЗ Сід одяр опію. зах 159 злу 155 сСау Мах отУх рез же луг пає 31х Мої їжи! ве піх зер Умі тех. Кох 155 Мт. ух ток Ме оску бом мої Ме Мем Ате пла ож)у Піп оку дії йіз діє тис зх 105 155 бе» бе вх Су 1 дже бик УК: Бо бек ніх Ргбоздхо Ако оліях Тух

Ах м жа Зх дом БегосСуо Тух Жех АІх БІЖ УкІ Фмо йікогюем Шіє Піх Б1у хо Ті до ве 223 їиез Пи Мої Хі тає ХО Вуз Лія доц Ах цу» ЦУуз йбо зу Шкх РІЧ

ЗВ ах ше ТА

МІБОЖТУ ТК не Демо сту іх Уггі Ууд рах 45 зо ящик Я -Щ1хк А «тіл мА ЛИХ. ххіУм Комо запівзех хто худу» ОБ сйпхи ФР: 1755, хо ях

Зцяілесозка аа опес бу Мах ес їхе біс ссу сха ат дедооЕ сот Ал и Меї Бус їх Бох ото бах тро Мо їм їмо уні Лія діх ото. 1 х 15 ца їх) пеп пед оїле баб спе ема ко Кг охо мох нс схо зи ві зе

Кк КУЮоОуУЛі бе бек ЦІМ Го Муз бат буя Ажо бук ТУ Міх так Су їй Зо їй 35. пеж сту Бе бич бе пет одех сто слу оо пада соя без бе шо сте й

Тіз тс був Ека Мі» вро суга лечо бум ШХУ ЛУ БжЖФ обеє ММ РН їму

КІ «0 а «попи спе она лем козу реп хси сс оба мепоїс суд кот пом омяу 8 пе сттбт Ето Гуз йимОо ут АБО ТВХ Зк Меї їх его АХ Лїх Різ ДА зо Ка «о чут веь що Зб Зп 55 53х ціщ ос схо щах ес спї зх 50 Ве чу хі бе бух моб ук») хе шхі леж МІкОСіІ» АфрокКтн Сів Ук фук ка ти час їхо ес жоц Мой Фкфосохе дує па поу пед сас вах штє ке сло башо ЩО Х

Ух. за тт ух МеЇ вор бу жі бі бех наз лю: Вім їх Тл: ує ах я «те слЗ си доц цем ско сс охсе зує «сл мен осі ЩІд піп хде око сл лів

Еса дл сіє сій бій ух кед охек тб ту вхо а) 31 дехозах уко

У їсте и щ й єс оціе стю от соц цен оїуз сім опкї оус хоц охе ках овяеа це охФ 354

ХлпІ А пе Нім аю йхросги іже деп пуу бує Бій Туї Бе: Пух мух 45 з 15 хХумт сс; авсоєвя бот? о сліст са чоти збе цед ака оле лтлоКес зах за ме» шиє доц Муз Ме зо Рін БХо Ктп Хзфе оба лети тв Вис вує 4їп 125 зд со ви че се сис сце Заж сла сад о чЧіц фс оком сто сло се бот КчУ

Дій Муз Ку пом Яги походу тій ціа Ух) ЖХум Тс Боморсо рхо ШКкЕ за5 6. 155 125 пе маг дат сту хекодому охо поу омеооує бу змо коп оппж опе ока та зеа ар Вів іже тв був Жжа сім оуее Ше Сей Тит Сувобм:і умі вух іо ХЕ - кто сус сіл таї спе ефе пат абс оди? б дес село пед езс вел опед се 0ОУТЄ

Зі це Чух бхо Зтс: крої вла чаї Лімо їмо бічобет Ми Су ма її зво ха 155 тецосяз або де косо ва сот су сис тес бю сф пес фссовве фото а тт біх ли лю отух був мс тру хо БудФ бо їко Ахробюх хи ПАХ 185 йо а теж овФс бо хім тах зас омю о єри з до цес охо йо вом тим ся ВЗй

Які ТБ» Ре їме тує беж їйух Се) тВу Ук) пжрозух дко й: со осі М

ЗІй ті5 235 см со вес вхо спе їбЯ хахоїнпо Мед о нсофосне уофомі обу мех кос й. бімобхіу Ах м3Х Ева фе бує ЖШтгоуді Мей Мів біо діх Бо пі3 дБ» тах 237 че сб: Мао аг бе одпош вас смт омспоска хост сет дпеомом да 10и пла Тухк Унк Зір їх Щег їмо дек обеб ме та ДІу руЖ то 3 ха «о» с ад» цп1 зай ех «ВУ» їсте вкрівне «ам Є.

Мем зує пі ехо тер ЕЖКе гот со демо дом Миі Ам одіз Ухо Бу лік

Е х 17 М ма цем оЖеК біб Кхо їухє дек бує Аг Муз їйу Мід тмІ Суб бе обо хо 25 За

Фучхобго Міо Ву бічобец бно Оіу Фіу Буо Док ук! го Меп Ках Ухо 3 яп їх бін озуг сто БУХ дер Убтг ін МОБ Уї2 Ваг хо МК Обго БІВ УуФі тот о в чо

Суб хаї У8і Уаї кхо ММ) бен мів см доп ВХео ПіцоМаї бує Бе йзи 25 7 ту ах

Тхе туМ МОЮ АхЮ Шу баї Кіо Узі НІВ Мо Віх буб Тхобун біс пох

Ер ак бін біо бі Тух'лен ет ІВЄ Хуг мул Уві Ме сет Хаї мезо тож умі заг ох НУ їж віх діполйну тТго мам оба Сіх пу ША Ху їлее бух мух чем ет хз Ка 0 ЕХ

Ак опа але ви го Аз) Кто 1Уе БІО гу ВХ Жі6 Бегоїуз Ло мує 132 хі ї89 сіу іх Хсс вхо сЗа уко б)п Хе) тує твх ех хе бус бохо Аси Мор 145. іл ЕН 159

Чікопейотит бує дж) о бім ми) сн реа лвто бух вемоУе) ув облу Не зу В жів тус ант йох дом їі Мо Ум пін їхкр пімодюг око оЛу бій Реп лу 159 ЗУ 15й дои вах оту: Мус пс. Тьх о Бсо Муо ба) бно лю бух бро б)у 5ех їпе ї55 723 та

Ура жо пут ду мух Мжі ЗМ о заїі Ах бут беж втй Ука Пів ме Ку хі віх ІЙ хо уві Же Хек Пух Шет мі Ммеї пі йіцохіз пцюко ПКе Ахи МІХ ХуХ 35 гу 235 в

Сх о щдівоьус бхт дксз бохо їжи обає со сСіу бух

УЗ; лазів я, «ТАЙ» ПИ ДЕ «ЗАД Мюю «аростя «Уййх «дух ВОХ рхімем. РИБ опхімяєр: «пах у дІіКОЦеоми ХІНФОЦуОІМЛІИХ Моцаоховає сслохтМетє лося 34 «уза» . хіх Ах зйїйе Юма Дек и хвідоминхо харак

БАКИ чиїам ШО» овУТОЮт. ПОВ при тапох В стокейсісі зеахемікій споубацене цацкФу 35 «ЕВ З хе3ї ЗА «из ПУХ Де -3узи Номо озвікам «вшох «ІЗ ВОК мпсіюєм. РОБ пуробмор. задо Я епаруслохо схпопахоує саховнсуєв спаси фибітеєоє т ЗА хЕмУухоза ех 31 «візи ха Нв - «ту том» мегісно «дій

ВЗ) КОМ длімют. ОК срашкер жасойе 1 знопісінох ЗЕакрсалеє фест зх «еВі0и -314їх Зк «пух цуж пек «тах Моне сврікех о «Дуйк сЗщах ВОК рхійет: РОЮ орхйако хе 1 Й аохписувех Сесцівезуу псестуєксоца фосоесахом мтхахоМахо спос ке дух ХЕ жакіх 18 кий» мА ЛЕ «дії МомОо охріом хо «й» РОК псіюех. СВ проймер хай» й соисгдої сУелвое 15 ху 13 «ТЕХ тА и еЕЇШУ ІА ЦК - -йЙ138 Може ехейюцю «их Й еВЖтйз ЖСЯ ргхене. КОБОправюво хапри КУ ібсвасейжу спсмостити смосор ха ехязпежтінйт си 57 «то ві Й дю «лій МВ ДК «ЦіУх Міхжт Бапрісто дк «ТІМ ВОК юмімк:. ОВ прожуюр. яри ДА пдекауамеи злакоценси рідщфпєскі: СПИСКУ ФЕФоФЦЮВ: ПОМ ї7 «жібУ 5 : ядвде З «Т3да ШКО ДНК хВіЗ» Комо «арікок кзйо» І

«ПдІ» СЕ рсзмоєт. РИ прзнмер «аййх ух слечумлаз докіІЛлОХІце споцірда «сс сопЕя пазетодсу| ссеупелеу 52 «ій 15

У

«ака» цюх лях сузУ Чопа сарієця «да. ай» жо веішек. МОВ прайкор хаади В дпомаматаа чужа сви позабомеце лсебфчемкмі: сшкдуйУх че «хо «ді па -?ійх ЮК ДИК яйУах цепез Берг «ав ейті» ОВ омігех. ШК аплеме?. «али І чспссовайс усацазулам песоманспе споцоучстя пкоцецепсх окілтнонух 55 «Із М -еі» ЗБ ейуле сх ДНК хийіх мое шедзсою и єди ліжіх шоб орхідех. ВСЯ праемеи «Аме Ах ачодчцічучичи сюевслссест чекаєте їтізовІхах кохосопов АехЯщЯ 5. хуїйУ 19 ехїха 38 сажу» МА ДК ха» по» хоріюся «тай

ВІ» тов оУімок. КОД райо хіп ХХ М сахапепоглі: спісладиммя ломіпопецо слепех 5 «йо» йо ящуюм» 15 Й аа» М ВХ. діля вишфи хойінох «ах яЛад Ме охімех. РОД прудиюо «апух ІЙ хахжемимеми: цепсоспецем комемейеси) дод З «ші 1 сте «Ул мА ДНК «Іуу» іпимі хорієпя хв «ЖІхе ПСЯ реїлех, СР прохеке я«Апо» 71 пк мстіх бпоцюїкожсе: пероцепоцае ах З «ВІ ЛЕ ейїхн пе ярах їюа ДНЄ «823» Мюсог копізха «йІйк

ЛІШУх ЖІ. ркітет. ВСЯ одяамей хайух ЖИ зазсеслалі схтуоксда сасхсвсх 75 лахох т3 «ІЗІх В худЕи УМА ДНК ейїх» пс здебел «Кох хШЗУ СВ рхзмех. РИХ пиаиМмем. «А 15 екапосостїх: сезкескцеє оссуссоцецеа лій за хз й віх І

Урзйм ших ДУХ «ЕїЗз Момо карікох й -дтйх хажа» ВИ вгімнт КБОВ праймео хапо» й «адтвствя! Чессстассу саіпуесв 18 «тїо» їх «Ар я «іврі» окт Й іт Мого херівисх «Зх . «й сх двісей МТА Мевбхс о Сицеміиювних о, піде ян В мех лзровія зму рух Мгу ЧІіхМ їмо дуз Муз УКі без ме; зем уух 1

ІЗ З 15 їз бів маї БНО. Уві аву оч ВОК Бій пло діе снів Хі Біб бен Аг Ат

КУ и 2 з ше Агц о дІц 25 «удо» йо хіїїУ оч Й «вій» шха ОДНЕ г. пів Щбсл ера жда «В -ажАВ СПО сажа ід. .,77 хупбх 6 гайаскеваа сттараяать поадЕтесто зсвшсасіся сасосткася сзбодеодаєя 5 всопобепец смпелодізец хецоисцек усекдяд спенстціко гпонентїпек ЗІ жшотдемсус пехасврсва спсісцвохе сітртоувса хаіталемак пзусромаце ЩО шик декеитлєт фрі: 1р5Ецеме ніц чо охо алу зп оце ЗА їЗкс Мк) піп Мек оАіх ШТУХ х З чаш т: мопоско зх: хе ЕХ Обі: Мас зце и ЗЕ сяф ди сце соло 8: сіб сує Вех Пій Мел осі) ТУуХ Ре ар о Беї Пеб бо щіВ Аза Су ХА

ІН 15 и птМиотадї пкФгоЄМе ста сце ссх мех вафроамє сек пси сла оса сус сх ЗА кро бух дізн Бчо Лію сжо лох йехоАхіо Тс МІ: біпоїи ТНтОоПже Хо хї хо ЗЕ пет мем Оле дя оц біл; хсломаї спо ар мах Зо спе ав для 3855 лгаочЧух був хо Мле Зі Ук) б даної УМ Лдух Щі Ткгойха ММ я «х то «ій птп о кацовле сце спа бцю см ождш їмо чіх хЕх глЬ Ббдодов єї ЗЕ те деч ти ТВу Суб це ОТу Мес беу їмо 1315 ді» Вогобей Аа Ук «5 «а б зб пі бец пех жа МЕ ОФНКаД сМе лст доку апа «рт хоч дам сом жо зако 47 пре еаА пех мех ВПО Тс) це Лімо бух їз он бех За бхо їж мух 78 її ся десоірму М до оМо опо зує соя дю схо сіб пп ту ле бле вче с 52 дво вве Ху Аа Упт Зі БШхе бзу їмо ме» Зіу Мох ді дхп Зх елН й з 185 чат оциуоцах зле бут о дца зп ох цекодно сім кім ост сему сс с х12 чо рам сім му ЖекоЖка ТИ ЗІУ ви піп ТІФ о Її6 лечо фс хм ЗУ зах 115 155 сте ось бас ясб цен це) дя Ус оп об дме дам хеб іп за ха Бач

Теуч дім ТУє Лех уві МО біц сСуз знсосук ЩІ ха без ік опдо пе їі 175 Й ЕК га мпоц язо цІЄоцемо тот ФяФ баб їм. ЗЕ хся сво сєв пев абу Фх вач цуг о гхо сут Уві лк? демо дор Мів був пе тхо Скт г АЇх мекобіц м 155 145 ї5е бак зи пед оси МІВ с охо см лоб охо со; ва цес Мамо рує зно зх ців сіу зле тв їіе бем ех Упт ТУУ Гуп Тит кп о Азр о Тух сухо Бук 155 її А доп пец о пекоцек цеквоїхо ос демо аоф о дму хіх цед зда їло зм 74

Пежобех Рі: ді вік цео бно Аік о тТім' раю Шьнобіч Тух Беготле щи 1795 с. 175 4153

Бех мхацокенсмтаєсиє «вхсцейссв хдсхакасєтхм схсмовихах соекецепод ага я Ахц кохоценамЕ дкдмемавес тперсзлухс дапецевнтх Мепедствет цаекопацете 380 шіжажесуск Ззнсбебоусо асіптбсасо щінохтокай пЕпсспФзИс сапісесоую Зав опехтномеу Меуєнюптїи пероутітс бфегсакоме сБеЕЕЕхВ спеше за35 хто» й? «ЖАХ уи ЖК Н «дій ЗК «хі» дото харієтух ти А

Мет орко Ото Ве лЛіх 1У біз Су бек б1а Зх о смі Фух тре взу БОЖЕ

А 5 15 ї5 ей тем МНіх Мі Су 116 его Сук ЗМ бач Аа Суз Зевс сш бо о тбьх й ха та

Тхо бгб біб би» пух ші ХуФ чук бу Хки вів ху Уаї Упгожев ЗК.

Зх їй ак

Мей Муз ЗМУ Тит Мяй дів дів Кей тт ТВ був мя лу паю бахобеч ау хх ка

Тлб ї15е бктоїсо» дім уві КИе Уві би Меф ийе йедобєд Адпомув її

Ж 75 7 то бех о Жех піц оси іо) Фуз йкробін о ЯБе Сує Або бог сій Бет Зіу Со. 85 СНІ Бін

Тео су ск дій хи Ж Мер цях Дій Вуз Зет йкт свробіу вер пух 195 й їзА М

Тіх хів опе вка ХЄУ О1у без жи Тух ХУ У ЗІБ З сСуз ТБо сут дій МЕ 538 іо ахросу» ІЗ бух ох туз хо пух ук) вро двк о авромія бук кра

Зо ї5а У біз їм: Рій ді Ме сів бра сі Ме ль Ізїє Ме уах тигОТвІ Буг

ІЩ5 їі її5 іс

СЖрІ йхО АХо Тує ТУЮ Лух Щем ої Фї» віх Віз їмо пнео Атю сВх бр 175 5 тів бач обує йо АТЗ ше ММ Аг 152 «аїр ДВ

АТАКИ хвхжх ПІК ОДИХ тЕАжи Мом хе й

«ЕД» й

АД» пок «вва» (71. ..4352) сепбх ЗЕ

Зпехси мох смт свсоссо їла біт ог осос ся сія Яій шоб доб ся Б мех бує ніх оїлюрокси ВНю Ябх їж; вхо Мхо Мі Азхо дів ро х У п

МІ ІУД ЗІ? су цс Ока бос аа боє са дос ве вис тФх лем іме ЗЕ бо тТхр Майї бецо деп зію мс бсу Би лох Ащ ух би Блю тьх бух 15 Ран 85 хя пебєоспд ат пса ке сис зол пес ст цей Мол феод їпе Фет піп Фес а тга Еко Сук рій АТа Кує Бім їх Бо біу бу бсб еп оту Ре Хече

КУ ма 35 с стем а3х сеє око аає кос оме бімокі: ЗОи сус есте сежкобає їв:

Хм Рій РЖе Муз біс Ху хро їх Бех Мк 136 вис Агу ЗОМ риб ім пу зх 5 білохох тде ФуЯ мед со. ве біо де сет пед пис пом цу схе ям: то хез Жах Суз хі Хі Мої дхр чої йог мів Сію Аже біт піц Уха ую за 70 тв чт доп оіпе смс І цес бо біб Моб ха сх ово оцей ходу апесимух КО рве аБи оТти Тут УЗМІі ли пів уаї За Уукі ціз йма дія рух Тргоцут - 58 за без пеу ско днй сау йои пс дує меботїкс суб би бекомом оте прп ЗЛЕ рхо Згб Мім Ши сіє Тух лез Шет ТАМ ОТук Ху ЖМ) МЖі бек. уж іо 25 т КО їхо зем ци сла схо са цап це сі кеом'осдс енф о дхя там онец вдо лав 185 тлгоукі зле: Міх Я вхо тТкрозее хз п1у вух ПЕ туї же Пух їжа по їз8 325 ше вме ох хом пес екс ба дос осот а) поп под сс акт поп гла 931 мех Жеж АБИ Пух віх жо Куб дій хо ї3іс бім бух Тех їі пох опух 135 їз їі40 схо вяа у пад пєє сце лях песх сне боб моб хеи сту сбе обся йо ЗВ дід Мун сім сій без Кже біз Рій іп Уа) тує Тс оМмец Уво бо дек їхУ їла ск пев сад соц Зо все ее мех опе Є оменохом бос «о дб ща зла

МУ дви пів ї5о ЯїЖж лук Боб сім Мей ек риб ЛИ мух Мов ОМАЇ хо 150 85 то хи ллІ захо сІж сис зай мес зи БІіУ доб їщо охо сус охох ом сх ав

ЗІ рке бух Ксо бюг бкродів Кіа Уві бі ттр цій зе вп ЗУУ БІВ

ЕТ їп5 185 з тоб мат овес лес вс код є» ех се кс ише «йо бас пшх ше бус зи

Ех Слю Ат Жепоуюр мо би ЖВр ост? бгб» МФі їжи лою шкс АМО ОЗІХ ї55 пу їла їхм: усе фпе сіл обає вол дах остео дохо збу спас ож вус яФи кб ся 87 ле лк о убв реу Тут бкт ФУ м: ХргоУВІ йЗрогувовк: ДУХ ТЦ п

Й Ка ліз то пеу пре зас бім Мін ек Мам моб кіш ФМ бо дек зБй схо азс 75 сій опіУ межа уаї ФМФ бак суз Бех Мі обет МІВ ЗІ лів ем Між доп ий КУ З» пес чає восз баз напомеєй зм оїбпо свмохох оба оч еаж сах пе бо Тух Тех щію сто ЗЕ: фме бохо їж пис обі: ЧІ Буд ї5о -. 8ч5 БАРІ «Хуст дв «2115 351 хх» ри «ВіЖе Могу? чарійия «пах 28 мат вив ОМІій цем ололу Беж о ббеозео ім б Уа лів Дів тб Аж тую

КУ 7 12 ї5 маї хе пет опіх Кто Вгф Бек Зет Язромуз Татобіз и Суз бхо о Вкт її КУ же бгм Аїв хо блю ко ме Му діу суб бек Уукі Міс фем Бе Кт

Ух зо й

Бех ру? бо Зх Мо. ЖжОк грец Мкб (ік дег лк фо ожЖтп 41 МК Те

У пз 80 сує Ма уаї Ук) ко укі пис Кін офій Ахровгн 4іц УМІ Гу хо док а 75 зе 25

ХсрожтуЄ Уна Ази Ялу Мох біз Миї Піх доц Міо руб Чі: їуз хо йо 8 я Й - У

ЗХе біс біц ту: хо бе: їнс чук жу Укі Мод Моз мя! фую вх Мод щи 155 зів їм щі Зі» Азротгр їж доп бу іду іч Ук: Шуо бух Бух ми? ше зх їт5 ЗВ йпха ук бін тю Бжеа із хо Ті бів фхо лі1єгохік его фує ліх бук

Іл Ук 143 су піп оБуФо Мід ба вто би Ома; тує бі: їм Ехо КиФ Бах дха й 145 15 її Кк німе ке лих Аа Пій Моб Штгоїслі ак (ее рез оуаї муз СТУ Су. 155 ОТО ї75

Туг г бомодхи ГІім ві. мні ЗБ; тср опію бех доп 41 Піх бти бул ів АК 125 дехобха тує мух ЛИХ ЛЬрх Біц Ре ПАЇ Би моробхт Аоюю Чі кт БНО ку ди ї95 шко лм отум вегоцув цей ТКтобаї Або су оз ВіцоУЄА Фе и ПТУ 2 ЗАВ о

Хаопожаі Епо би Суб йеж чаї Меї нхо бій пло хо біс Аби Чі ТК зх 235. Ук їм

Ти бі уж бе» удмі Ме» мч) Шжт Вгз ПА бує 5 ІМ «ЛИ Зо ех ТВ «дій ОМА рне й «ТЗ» Нє охорімх

«ищох Й хату» Ср ялтийя (Р.В хидшіх МойіЖІМЯ ігомоме міх мохету. Модидфимиманя чкстина пмумцекауйнну «доп Зб спамом ока со соє кт хай фс бю при пот схе яви цецоцетш си 4

МеЕ бує ніс їжез ТІ бло ШИМ Фхбі мі Ме УВІ 8ЗЖ Аза го ін 5 її апе см ці ост їмс бле спе лок о)ю. по Ух кох ес осяс есе се ак

Агий о теробмі хкеі бек Мід Ксп о лхя бах Бегойкрогує Три міх тик Сум 15 шо 2 зи сСса кочочмс йса сча сс ух дес цеб зо зпе пох вох зе бл с 153 гіз рев пую го ййх бго Ти Міз сім СУ Міф Бе бом май Рем цей 35 30 з піп осОс ост яд псв що дес бос сто ве ас сс соб асо ость уко 152

ЗКе бо Муф бух УФ ШуХ дор жит хм Мат іх Бмі Лу тТУх кл Ум зи Ук хо. явт хом до чен МТ БІ пас фоф во тає цох уне сот ав при охей го

МЕ) пес олух МАТ МАТ Укі вхо Моз доКовОа ЗМ Кор йиб дю) ХХ о пже та 75 ї5т оче вих їдс тд одАт лОУС ста ЗаАФо дія са вні бос зуд дом мам. СЛОВ

Жпе вх тер УЖ: Ма! але слу МОХ ЩА Укіснію ден ме їмо їх ме о ах - за сло ому зару дно ся осхо охб о яди меж о смб сує цедте ехо діобоско з

Жто кою аміно (М бур Ха Зм ТОХ Уує Мт Узі Меї ох Ух? реа зе КН зах зло вс душ зд осех сет ско є «сіб охамМ по ох ко; хес зн їце ох3 я сіє Укі ме Яке ІМ Авробсро бо Зх» Між їх Зіо Тух мук пух пух 115 ї56 КН

Ес оїгоо аб дач сло сте фем бос зго сно ках кос хіх пе аа «1 чаї бек Аме мик ліх їде: Рій Кер обно їїн Пім оїпхо Тис їі бою ех

Тл 135 Уао доходах що су хм хе ЗОМ пох схО бі мес бле сі бет мевомеи ЗВ а сук ій бів хо Ах бат око піпоуві Тух Бу реа Куб гро БЕ

АЛЕ 155 КІ сил опем зу слу асо ев ахс сат зе жим сіу хо їцб с'д щчіс хон пт пхо лу лізти Жег Оу хо сім Мах Яют ско ТВх бух їй УКІ дує їс5 Уло

Фе голе си МОМ бюєс оМо било пеш ско ца сей хоп хе дФуФфоскд. СУТ ліру Епе тих Фго бах Атр ліз Міа схі мів тур бі бах йо іх піл

Зв ї5хо КК в бе фед бат мот тат нац асо ебдопеб спо фсфосі дає еп фе фас ЗУ пуб піп йха йхю Лис дує Трхотек Вуо їт маї бо хро дьє хо 7ІУ 192 з вок без ЗБ фс сус дам ком вав міс вес фод цес вес вис ця бо су ет:

Жкс вх ром Бе тує век бух мо Ти тує) йко бив бохо Вхе Тхросіа хі її 22й сач бад мас осче спе їсе їз соб піш збшосач зе ть сле смс го тво сів опіж ве мАї Ве еко Суе Биб Чех М Міо лм діх їм ще Ва 225. 15 РК лет сад го сад вощеовом лбчобФс спе по сом зді аве спе 152 хе бух Ви Щі! пузодетоїмо шШнб й. погоду» Ж бух тло КА хо дій «віх ВІ хи КВУ вух Мехо ехрікех «мо їх мех муз Міб дя Трою тк Лечоїкю би Мої Мі мія ті» ту тт»

Кя е 12 :5 чі му: ДОК одлдьоко дже Зкі Бк Аор муз мс Міх ток СубоЖис ро

ЕЕ їх зи бух хо Мів то ім лів бін ЗУ Мівз Віс бу уче Ене ря рго «З Ах то уж го Мух виг Тгоїка Мн із Же Мі» ЛЬх бга 010 УМХ ТА:

ЗО ах Гу сту мя: хі зоз АБрозаа лах Міх сію йМмообси біо Уяї бух рою дом з У т " Км

ТуБотжю Ме кер слу уки схо чі іх вхо лік Мих о хОУ іх бко йхе ях - ВЕ Кр била бію Ту АБУ Беж Чрх тумб пуб МОаї хеі Бик умі їм очах мії їде Ав ік їтм з сп оАвротсур Ме Кат: лу зх й)и тує фух бух був укі щег 1» А 17»

Вхп ух Кіх жо ужо Бет Бинт 139 Ма 1ує ТВУ І14 Бег о уує ліа бух

НЕ 35 о

Зуб іо ко лУФ ПІ го бій Мах тУк о ТВу їбо БО гро бех джу ВИ за 150 ХА їв сім темі ЖОМ Бує Мєл сів Ухі би бен отв: бує м Ууяі їуй сім сце її ку 175 тух схо бмт дхродію дім Хеї Бій ТУЮ бРи оБег Ахе бзу З)и твор: ї5 385 152 во АМмі стук пух Тек о ЖеК рХО ско Уе3 їмо бат бех Атр Зіу БЕ ВБес хх 50 дув

Ром опер тує Ши ірую лим» Трхо Мол Мед бул Шок хе їхе біх пію у дух тв її ха МАТ тех ВОК оСух ем оУл) Би міх пфа о лЛло зом о Міх Мод оКіх туг 2ї3 до 235 532 бліх дій їмо йме мо бисохем о йеу пка тіж Тух 5 хакох За «йфке тий

«ех с дек . хЕМа» Нпйбє хоріона ліжок - хтів Ср а У НН ВН «да моб ігстооіюсьі офісу Моднфкованй засимасюуипловутєу как 3 дналеп або оако бас сто Бий бус тс сеє сіті схе КУ бет бою сус і

Мох оту пхе тд: тег Ме ом їмо 16 їв Уві ВЛЄ віх ва х В 19

Мах осн є сі Моска сом ЗА сис оз бно пл олеок ІФ Зла ие МІЯ

Ага оСтрохаї цеообет Ііц бо дуб Етї лет доро бус Тс он олвк Су х5 Зо Шо т ма смщ чем со ах сом о цле оси цем ох: пен сту їбпбозви ІЙ го 154. хо орхе сто бго Кіз ри? 2: Ме остуї П1у ЛЮ Ого ШСПОМАЮ фує кі 25 35 ях кесйосис сло кох пев ому детпомс бро абсд о бмс чстопац абс смт яму 0152 пе Яхо Еко бух си Муз Азробиг їмо Му тав лах доц бок Кк іх за. за а ціл онов Бу бі ціє зт) демо со оц сет ода дехохоє се оуте год І

Хай Тьх бух укі Ухї Мої хо Мод овех Піх ЩІЧ пхр о рко зм Меї мух

БІ то ТЕ їм кай бФу схе сдім во спро ді цем дім о покодя: опе озхнохох ха звя кпх ха бкробує мя) лег обіу МАМ М ха пі ведодії Муз ЩМх мух -

ІН зп я ста ств ша Чех сте дам овос то оц мо сах під и де ВМ тм: ще ріп обеж пі сію біх Ух: Мхо Ме їксотум яхе УМі МУ о дех укі кю» з» 1 тб8 хв коло дує сте сн сад цес ЗМЕш бій зх мас зефоозо Бас хай зво ана 0284 тп: ува пем ніх сло лю тер о фнмойои ску вух лім УуМ ууо лих Пух

Зк п 175 по Вис изс Яав дис єс пох рос соо зтс дохо вхо абс спе нах о 453 хахойек вла бує КІіх тм бФуз бомоЗкЕс сії біос фо тро пів З: бує 135 315 155 пси пом Фіз сля пеп опт. ха пев ост зд гео бі; пос Фмо спе ав

ЗА су РУ 1 РКО ами Зі. его біг осді тух жах їх сто бі Бе 3 353 УМО сне ах оя піц зис об доп сна лаб ооше ск; Меп Бе сн пі дей ЗІ

Аг кап бій ро том Буг хи Бій Уаї Щеї че Твх Ся Меса а бух Й 150 зах 325 пом ох Ме скпє мяс офчс еїл дес фу геу МФ да ядловеї сбпе сац о МІС

Зіж ве стум Бк бах деп їі ді У ти: с Слю ме йо Зі ху зх 1х0 15 пла сем чав нап дає сяє су зо апюеришх соЄ сту стю демо Жох чає до 84 всо со Ака лай тук іже їх жЖОропкб бує МОК о їбц Бор оскт аАхе ЗІЖ ї8ї 270 39: пмжм жів піп спо Кс обо: хоф о сїх хо «Бо дно ох ус поц боф осно ті

Щекоїно ме ем тух Зктс пух Мед лето моз зр оїух Зстгопхо їхропім по 5 КУ сво Ффой має чт кс сс сте м Зі віх са дв осої суд бак хапо 920 ді ру Ахю Мах бом обк: бух боб ук) мМУє МІХ піц із їмо чі» А тх5 їй БЕХ пшяс о іко 20) пац хо оце біпомоє Фі по спец у бло сце аз піз ут Упс Сі бух Зк: Ум Ям Бо пек іп Оовзу Ку.

Кан 725 250 «тА 3 кяЕїіт 25Х «вудм кт «Ух Кого херівох М ха З мох Муз мух ово стр Киев ме обох вхо рем УА Дік Кі Ехо Луч бів 1 Кк Ух. 2 кі сх» лем сі Ехо бує Я ек Аороїмо ТБ Чі лі був бхо ЕХО ях з и ЗА бун кто хів ске бро діа бій Зіу хів Бо бо ві ее Мть БНФ орЕКО аз ай 15 тхо І1Ууб г» бух мопоїнт ха: Меї 116 МеУ веп отих мхо сію хазХору

Зо пт «у т слух ЗА Майї УЮ зАхО Мо) Фото нізм ліц хр обхо п) ОА ми йо ко в в За во сбероїмї: Чаї лев осбіЖ мні іх Ма) пло Ак лін о йух того оїуа пюо Аг 2 чт го сім бід Жуї Мхо бохо Урі Тує Асу уаб УІ Бк Ма) ім ХВ Укі цоо 175 115 мі Міз ЗІіб Зхвотгц хо Ажи бік Губ опію Тух бух обух Му ух) бу

КІ з т

Меп!поїже Між їем о Коо кто беж ЖІ біз кує Ме хі ех їуа хіх мук ї30 137 ха

Іу ба реє ме Фі» Ві діо ід ту тег оїжо о бко Бо слех Ас хе 1-х іхо 55 їс5

За Ме ке уж дон сло УА Яех мо Тс бук їж: Ма) Хух ху Яе 182 їїо 15 тут хо ВЗУу Аер отТіе лін Ус: ХМ Чер ді Бетг Вхо Оу бік су ДУ ї89 185 за: два деп Хуг цу» тр трі гм біс Уяї дно льробех дер пі ме рве.

КО тп та гемсіяо Мис дех муз їм тих тах пк бух Мек кху тео чі з піу 5 тій РКО вхо уаї грн ВОК сує бом Ул) йхс Кіх Пій Вла їде 19 дом Кі ТУЄ 239 хх Ка тихолів Муз сех бо Бе: цвх дек тую іх мук 145 хви

«пійе 35

ЛТАВА

«Ва» пк Не

ВАЗ» Ниже: хоМікох -йчах хЕтів Ср «жать 857 ...1735 «ТАЗ» МОдІігАва дм роХіц моз. Кідайвкоканя чистимо міупссповулчу дра А : оенкст кгц коц пес схо буд фіто мери беб під ссу сх ума бої іх ї5 жо гую Міх Уві Тхр Фе уре брам дез беч мах іх Мі біт ї У ї5 кох тд оче см пгт олопсп о зийх В їпо хе охо яшйії хопоано бує 5 га їти узі рза Зах сі» Вуо був Же Хеїг Але ЩУо авт Бі ТВх Су хх. т 85 35 пса пбу ге сиф оз бсс дев дос охо сце пе ссдо сю би Бхс сто 4

Кгб сп Сук Еко Віа Ви) бік Аїх піц йіу хів Жуо Зно ув: ра То 75 «2 т сіло охо сит ах; цей мн: схе збе смс Фе обо ком сих ою 454 те ог Кт Вухо Ука пуг лкР ОТИХ Бей Мекотів Бек лту Умт о бто З за тп я

Вінс зез тус сема Ід Ін деп Фд оалс сно охо ахсосий цецоФфіо лоз 45

Мі Жух бух оЗаї ух) сві взрохеі Бех Ні Сіо Меройго ФУ уяв пух ви а З «міповдас їцб їЖс боб баб цей укч баку су са одІ Зоб ядц ох ам й

КМе да бр; тус уні Ахробу Мої ім уе3 Між Ака вів бух Урі Ту»

З я5 й ссу пи чкб охо сх) схо кап хай озеу с сив збе ес єди шко сме ЗУЄ тхо зга бу» піцоЗій Хуг лев ас блг тує Ати Ме єї Звт оба Бей ах з ісї6 що пом ціп спо схо сна дат козу під мої асо йла хо сс ко їпе она зва тн чаї Хуг: Мі зв АхОо Тр обех Я, бік бух піп тус пух Сувз губ іа 179 125 міс йси вти бло дис о смс ой еп ке: хіп сяг аяхз опис біс оіе охо 357 чі сет авп ому Кідоієу хо бат вс фе ЗУ; уд оТек Ууї6 бФох Буд

УКВ 15 Ук. чсх ном ши схо сце оце шхн пек омеф ЕН ої Ми суб б пово їпо лах

Хі мо бі Піп о Бтб хеу (Іо руо біб бах тує ТВгОцмей што го 5ег 145 155 ха сеч чаї чецопефФ асо зму ях: лез ЗїбохО)и сіб ом фе сія ше око зи ха пвФоОтТКі зле: Тох Був о Мее Сів уві дБ Хем ру Су руку Маї Муз їж Я т/5 сис Вт осас ос: ди пет сло Зпе ЯЗ Я соб оеу Зо 8З що соду БУК "бух вне ХУс по йех йоц ЇЛе Ало Уні бю Чьо бін: Мох оххо ОКУ піц 17 185 185 1538 Й кети цшле охе лоб Бог гео зисоєбга пе пебм охо єкт? поп їлс оде пут 34 тб Бо Ах Аме Тухоїух УВУ ТБ рБге ргт Маї ре Ахр дек Мао Бім 185 зп ок пп оку Моє ши поп озше ашФфо сто ком оцін цес ока пози ЗМО Без са ятА

Шк Мих рив о фко Тусобех Ких Мей ТБт о баї дог вух бос Ат Тс 1

КК яхо сай ча ас мес жБбоздковбБИ ЕЦе ЧІВ М се? охо Бох пбФф бно ад був сте сіу жа Уві ско беж бум бек ді Ми Мін віх іа їх міх пла

РУ 23 І сабо сон мі схЯ заз вон пп бос оскЯ сич лоз УДЕ тп 255 кіз отут тТ)Уу чіп Пуа бвх їм бек зу ШМма пі Лу х4о 45 зо хм СУ «тії ж ЖлВ «ВИХ РЕ «Мах їм охухеме и

ОеАдфи УЗ

Ме: ОСуЄ мів ім Ушю ТНФ фМе Ки мез жо аї Ат Мла РІО Вгщ ср ї 5 хо 15

ММК бю дк блю ого Кук Жем дет оУво бук МУ ніх їЬх Сук уко го 3 ча з5 бух жха лів о йсс йімх де сію біу Він Кто скт о ХаАї жа вт рве ог зе 3 45

Туз дУх уко пу АхЮ Лю: їц МОБ Тло Чет Ага тв ОТО ПМ Мав о тпг я п хх сбуз уаї чаї та Арі уж) Зо Мія Бім дод ХО Сім Мох їуа Фе Ах

Зк те па за будо тує Мої Хе СКу Мод обкмі Мої ла ло Дік мух би бух Бій беж 85 КІ за сто бін біб тує вхй Бех УВУ Тут Ах уаї Уеї Бнтг Маї Ммеи Тит чні

КБ 25 110

Тех Кіз Оїн Ар отсм їма дхо обу ух Пій тус су пух уз жі пет з ря КІ хо пух Аза жо Ху» йех бохо 12 сло гу ТВх Кім бкс бух Кіх ї1ух 1ХУ 135 1249

Су мій гро біб Зм бго 30 хі бух УОх їмо ко Бім бер бхо Ар 175 іхй ї55 155 пійІко свх мух Ах Зі 1 боу со Тис Сум обюй Уді мух чЧіж ВОК а ка 17т5

Тус біп Бе: Ако ї15 Аз Уо) Пій ла солі дех ша Оіу іп КЕ Біб ха 35 їіза

Зал АеаА ТУТ пух ХВКОЖИит бко бго оз Тон Млробпмх Ас ЗІУ окт ове 185 кра 07 тупа ка Тух Меп'гуа вм Ти ба Мхро уз лек ку їмо сам оці Піх їх Ву зо

Уха мех вКе хто бувоБек уяї мех їх біп ма мо іх ххо Бо бує 237 235. хе такое пум о Жех іх Ви: схо лдвехожЖти ЩІфМ с 5: ї5о для ДУ «Івіх тА и «ВІЗ» цюУ ДОК -йхяе о ВююмУ мзрінОВ

Ех лізі бів хто (Р... «дах Модіїіей Мого іскіх птієси, Модмбфкована хастєкя науногиобулну «мок алаїис зт вад осясосло бой бсс своп сбс бод о лепроака бслдоєко пбе ре мм опПух Мій їжи тую Ме Моз пом дома її уві Мія Вля г ї 5 Но ха пс ско о сшо Юсо хм се за зо аєоцас амооошї сет тс хе тк

Іц о бко мі їсч Веу біб ШУЗ буз Зх СУуЗ ЛЕ бух Трт Ніж ЧЛьх бук

КЕ а 5 ЗУ стеж сте куб осей цех сс фе пір се пФ зує мех ча Ффес пом лох У

Жко ті Су їхо віє Хто Щіх цем отжю Пку пПішж смо йсбх Улі То охо 7 чо зи їпе сем циб омо обєце ого цебсест пто аіц ме пмомеу мох сис зхо їх

Тех ВУуб бгломух ЕУасіже АхроУйт бен Ме о Ії1є Щек вка ТВх Хто цій о їл. ва вен ом полог чец со и де мин МАЄ бадовос ФИиї ях ці мох 45

Мі ху сує ул ау меї Мяю саі дес пів Біо АзроЄка ші Ужі ких 25 З я ОТ тт ло Ми тає ЦЯ цеє Зус ій дФау ді ся) зас пос де оса чац УО8

Жипз авмиожеи ТУ: Мі вх» Зіу ухі піз Ухі іх ко лін пух Убтгоцує ях чо й «еп ст чец шейп ся сяє чав ач яп їв соб пса дує Моб ол: схе Ме віх хо мо бі бр пуху сзію йохотмс тук йхе баї ей Бинт Мі дю: з5 її ов 110 ст що сихр ооо со час іще пфж он чес оку мон пес зха Фос ково 324

Тк: Меї їси НіЗ Сі ввробги ке овоп Сію Тих сі Тух Туз Суха у 15 д їх нс оїгт хом мем Фе сто лех діє пепоот? поп охо яге вій пес обох хх

Мей Хетг йхю бух діх Мей Кк? Кіа го Тіз см мук тот Ії бат Мук 315 235 за) тен мІіз дуд сомо о лоп поз де птх сх дб ГАТТ ОКОМ пефоспє бсгю еп, -а

Ат бух П)Ж цій йхо Рг ПІ бго цій бі Фуко тнт ой: Ксо хо вх 155 2 пе зт» пуф ода поф псу абс оха лог сх Зсе азс ста ве бує мед уко ля 0523

Ат ОМяЮрОЗам. блуз СВУ ЗУ йо САю Мі чо бюч У Сук їх Зої ує

НІ зх їм цдапомос тїйб єси дасодко кім фо Яку ми МОц Фда сосок за 575 сСфу ол: Хуг Бут бо» Ато І1їю дів ух Зі їтв міц б Аза ЗІУ бів 25 її 185 КУ сецошей ахе яйби пап озна яси зх) спе спе цЕц сна дай хе «не «ик ахе

ВМО ім деп ВО тує Мувоїкт СВУ Кі, Кто уві Усби ЗМєроблх йо СТИ 183 йо Вп жшт чт Ме сус сає сацо евя лбби оте тб дат ве опт суд пдв сю ТИ ні ж Рон оїЗко Тук дом Гуа їж: тоОх о Уе! хо лех йеї гу бір до

РК 6, хх ти сома мох хоп ато їх ех їне ех ові МЕТ сх це (хх сопе пап жо то піпсаїу Мко хох Раб обиє Пукобет УЛ Має Мих Осло АТ тей хе АЗИ 25 235 255 пеи тло ам о поу пк зує пт мс осрЯ чечопсу доб хох МА З

Ві бук тн 03 бух Бе Гб дегоуко ме Рій Цію уж

БО тах хз дала Кі «тв жі хз ТЕ «дів» им кодіКбх хатфух ЗІ шчеЕ лих Мі цею їтю бо БНО хо пі рем УМ ді Мі оз Атц о тТх 1 Ех їз ІхЗ сеї їжею Екс піц осо тус йох Гу» йхю ух: ТОМ Біо біо бух Вхю. Зі» їй 5 х зе

Пух рхо ія бгс біб бі са бім су ркмобет Ма1 Фр уєо ГМж го за «й 15 їхо Бук Рез суФ Азрожпр Ко Мем жів Беї Ак ЧУ Кхо Фіз Хоб о Упт я и чи

Сива Ме умі 0 дюн Уухі дом Ні 40 йхю він Лю У Мух Рпе лю ва "па зв хо бо Жук бах Кур, іє Узі пі Мі Яїх бок обхіа Ух ТЛУ Бує вімоВеу 85 пп я іо би» Мім Ууг б Бех пк тує яха ав ух бот ча) б БУ уХ їі58 155, ху беч Чік Біо АБроуси їмо Ден Обіуи уз омію лук Буо сук був Уха леж 115 150 КЕ дом іх віз бой што Вій бсо гі З.М пух т Тім бем му тн тух ло ї5п 45 сі» пію тт же сої Ута пло МАХ бум тах ре бгп Кхо пах оКту МЕД 425 ї50 ха їкО бім о пех тис ууко бен біо х31 йбек їжи 7МНе бух їбо У Зух лу ве 187 КІ Ка

Ух КЕха пах ати Ті Мін Ма Сім б:робіц ши дози одій сів жі Ці

Зв. тах хх зло лко сум пуб Те Жекорхе Око МА Мета Абросех хзросту БШехо Убе і85 Ко ох ве беч тус ех бук їмо Твх Меї пюроцуо Пех о Жсе бр олій сів у

Тхе 245 ІМ

Азмоме) КО бех Суд бах Мей Меї Нію бом Кіз їм Мік Ако йухотУк 159 тлу ЗА її

ТІ Сів сту Бероцюєю Зло сем Бех вхо зу Ук ла пу жу я «йїзе БА «Вік сМа щих хакі» м: вкоієцю «Вдвх Й «азів спо . ти 071... 1753) Й «дшла ситі ті2 джмисом сли іїсь ситі нку. Моджікомкма застмна імумомютУциу -йопи ЗВ лакос зго ваш теє допо Це біс хіп сбо стю січ дтф док пт сет ще

МеВ їмо Мію їх: Ус Пе Фе ср імо їме) ма Аза олія Рій

КІ х ме хах іа ст мед гос одкФ бив мом Мох ЇМО оце ом ий беспохом ро 26 вкхЯ тр; оч) ско пак Зі Кто іме Ойх Мом оАхр сук ТОК Ці стмробух їх за 25 зо сла ссец збе сле дек опсех демо схе сі под сус сим о хеж Фе і Меп 144 тп Ух бук Кто Мі рго Рі Мем опе ау МІТу Рус бах Мей Уйе ба 35 «3 3: бЕсохсм обов яз сс зд оцет вс сто киїбд зо їй зо збо спр оцад зах

РвноЕхо Боз» бум хо ув ймо Тех цез МЕ Тк йек Лую Тв Бех ста

КЗ НИ Я ке бтп сла бос пішочєд аме пас пед мес свт павхоцюс сп веу пгссако БЕ таїть Су уві бі Уві Аж Уві бах Мій біч Яви Кко Біб ові Був

У ло за

Тло до: ду зас ЯК дес сс то ЯАЗ СМ сят ес пси змо опе еп о ЖО

Та ймо Тр бу: Мні лнвоозу Мі біо УА пів хка йзв Кук отит рух що 85 5 сек ооо ца ее ому їн цеє заг озбО Камо да Бо пос ке міт. 115 жІЛодсв Сх ріс! Ууї Во осн ОМ УХІ Мій Мо» МКї бех Мох їмо, лев й КО їїї осє ціє суб жає пед оуисо фцо стю хом што ой уоу їхс охо сх око 252

Упгожа Вей Міо бім Ажробїсг пе одко Зіу Муз обро Тух пуз сує Кух ще У 325 песто ком о хло Фо сі сопох цем оспс аїб педооло хом одтс їмо як А хі Жег йхб бик вій цес ргє 319 Жхко УФ 91у Вуз й Іза Жеї цут 150 зх 115 чес вах щодо Се остє сце цач бсв см дбд бас жмося бспосма Темо 430

Лія ух БіУ би Рей беж бло хо блін Уої тує Чех їмо тує бій Бют хай Ко ї5ї «це цем» пло сом ояслпочеч зас сна чем хе сб яепоВуо со) цінова ЗАВ

Всй ойхю лм їх. їМе Бук му пів укл бе вехотнт пух Тон сухі мух

Хей їв Ух цес ше хай пес вас сайо віб рхо ма хоч вуе бах хас Зк обоє «хан ча

ОБУ Ка Тут гІТ пеу Агрошїв вза Мамо св бер іо пис доц Фу а 75 156 і5п їй сс пеф ех зас чут мех абс ост пої сб пер опо дат оси смс опо бе

МІ оСІм пбе Ахи Тує Пух отах Тих састко УЗА оп Ахю ех Кер оіу ївВх 758 ї55

Щмхоміп ої ємо сабо бо: мох сіє жо се ба: хе оце ази обющж сюж 57 х

Кеготве Ява Той ТУт Зктоїмя ро ТИХ уві йвройпух Кого оваха р ой 219 ЗІЗ 1 пе ап пох діє косо шина боб їсо піл озсу сах дез БОБ оса бетожал т7за сіпоміу ймі: 231 Рі оВе: Сую бом узі Шотокіо бів ях мез нів йб. їх за ах сс хйс сов сей нац вдо схо бог сяє їеЖ соб дих жа сца ї52

Вік Тум Ти: бло шию ех тю бе Бюх обме бтгп ЯіУ Був пхо та ІБ «сл лх «Іі» 251 лізе вРк «Бл со охоїецю лей» 15 и

Ме: бу нім пейп окКлю Мне сме Мей бо ел о УіІ ді Мі Ухо дтТЯ Ір 1 У 15 за

Мі Меч дет сію Буб БукоВеог бхє Беп пу Тьх Кіз ле: бум Рез рхо

У 25 з бух ко лік ост піч їмо фе ПТУ ЗКУ Хі Вер хі ббмотюо Бе про

КІЯ ад зх

Ета бує ого Мих Ме б. без Меб їзє Яег Мед тих Кто ЗІМ ОМі сг а 5 59 бує таї бю») Уукі кхо са1 Бех Мо пін вир сх» БІ Ухі мує ЕВя Мом ху 72 зв зи сторожу мні лю осі хеф пло чех Кло лоно АЇХ Бує ТЬх Туз хо ДФ

ЗЕ за 85 під біо вій Чух мов Меї ВУ Ууг люЯ Усі Мі бак оуаї уко тТНх Ма. ї55 105 16 ха піх Щі ахр тус ем доп слу лух іо тух вух Су бух хаї Зх ме 25 425

Воп був ія ремортє із Бус їж Біо пух ТОКОТІо Бех бух Ма тув 435 3 зм дій біб го Атт піп орсо (їмо оМой 1ут ТК пбо РО бі Щек ДУЄ дет 1 ІЙ з НщО ці пох Тв Був Аме ФІРМИ МОБ Ббко Топ Ук слух Ммоц Укі бух піу КВх

ХЕ ру ітв тк обо Жес йзрої1Уг діа кю біц Ткросіни бегоххо су й4іц ожхо іо їй х8Е. тчУ

Жоп вхо тує ких Ок бот пго ста УА1 їж лев бохо Ас Піх бах ово

ОЗ зе их.

ЖКо ех тухм Кегофуг ви том УКі АЗроімо беж вен оїко ім оп нОосІУ зі: п 222 доц Уєїх Мпо Сме Пух ех Ук) Мом Біо дім ояїх мо Ба Ме бья бух

КН 230 232 т

Лео пію зд Щек оїмо бхе Бем Бк вії паУ ую хаб . ду «бно хакі й зтійн ох лих лаїа» ною ваФфістх «Уїпя Й сзіаз шок руїлмі. РОБ Ороцйкее «опи «Е їхЕсоцемои еснонесаїцео ФмахоїхО ТВ ки30» 4 «1АВОТЯ ха» пе дНЄ «Зі вдиху зарієле «ідо «Ша ВА рать. РИН орнйнкно «апомо хі гуезхдасісу фрсптостіпе дабсідоре а «взідх АХ «Ву ва й - - яатй» уки дих «ВІЗ Момо хорікйх Р хащох «тях Ух дтікех. РОМ ловйнКе хай» 52 «ибсводіпе сзлопецене лонесніся ха кавох 44 «йїук А «ТВі» хх дих кур» Мюсе капісно. дж кий» РІВ охімег. БИК пряайико дах я - походом асшсмгйох сясхданоха зо «ром 44 клі» 31 . ейуйх юхА ДЕК «Р3ї» Немо коцієто «вій» . «ЕІ ВІК одмІіІМОТгі ЖОВ прломою «Мих й еєтлсухсмаї сошеозсоміІс сспежюстке я А «то 3 «312 ЗО хшуйх рив. дик -Зї3» вай, сзуівих «пло «124» кІК о вкієчсо. КОКдхнімеє «але «3 й скхецисМту оБломсете Епеортонсв ях «ів» ЗЕ яаУїи ХО «МІВ их пНК яд и Моє: Зхдїкая «дййх «ду» ВВ цхімег. РСВ проймор -492х Кк схохохусй Зисохазивт усевцаєе 75 «біти 47 «чЕхмію їв «ВтйнсІМА ДНК «умі» поме хорівно тео» «ЕВУУ КИ рихтеах, РІВ храйкюм «нм АТ среомеілт стдбастотя Яд КІ хи» «В здізх ХВ хаіле Ко ДНК. «Хі3» пух: сжріках .

БУК

«ВЗ ХО Фкфбет. ЕМ зряйнор ворення зайсеомермх оцеслемхси їмезуогя 28 «Жій» зм 231» ї234 шли» пк ДК «21322 Ясєкх весієая «ато «ЕІ» ШОВ «жде УР. 1352) Й «ІЗ» сеМмІММ Жецбссе ШИК о їовіса ктбкеів Кодуюву похисюоють дав бук ЕНхх харих «у сзміхцепту питає зст одЕ бся ет ома коа сс мех Це ЗІ птц ОБ

Мат Агро Ма йвк вих пу ЗІУ мем бує Пух УКІ хо х У Ко пеФостц УЧ бе псих чо бо де ссп сто яде бод дав ето са дос ї82 гмо лює: був шх» Аза умі би уші бех Мом Бмс біцобіо їїк Мі Ме з КО за пе сон сс го. сцЕ хох окт аг омах їЦПе пот смо хох це охо 148 лін оімо йго Втсц Би Меб вх Ах Ме зх хох бжо біз одіо біо ц з зх 43 «зи сно оз мем о псц о псоу ск вси зб ові Меп оїце лах во це хом ї35

Уут лтЮр о Мороумо боб) йемопіу ит бу МО: бже пух Мус лих Х1з Сув

Зк зи ак о ле о пец жує сх бе демо ій дев цес Фхб еще зе бся сом осцє 144 кзпоняе бібл охот Зі) хо ме бу Азш вік Енпе Сух зх Бе йеч хе 85 а у салосце ему дою ях щас ай чіл баб дже серб оске бій ее бат сдс тб ту? дріб їв січ Зі ку Муз це сих Вчю бач Ме ім Ако МеВ осух зи хо зе

МС пай ТІ деибосскто ді де де бо песо єс во сво «фі дев тає Зі

ІїФ ЗвкобхувоАХаМ Ше УЩо бух 21іх бі» Мі Буз дух бій Суй за тТУХ

Зх їх 155 схо їнб чен ансо вхо схе оц здоб сов оці зх єси оса соя цап ос У там оСуз бі Аоепогук їм вха Бех Ехо умі демо цке Вій Ро сію ля 11 зе ії зим оз схо сус ху цех мах зу: ул охо дам ФМ бе мес хо де А

Кс йти бін вхо бкт о дб1іу бр: ек озуо догм одне бек Керопхе Жех сіу 155 ха їУ5 їз киш не сан сша ТО Фо сос Мох мох пох диЗ дея до с щех сйє ВЕ

Зіцротуг сію біЖ їх: Зіц Хе зга Ху бат БІД Мі беж Ко Лія Мем 145 ї2и 325 ога шо сю ЗМУ що мо щвФ їй Мох бйс о хах г см: мох бує бсмо КІ ко Ку зим муз біс рМФ дув Бтк бак дхш уз ТВ оМів ТУ Суз їго

КУ їУ 179 мкФ фо пох ФМ с: Фо ст цеоу хо) цех сою ско ойкс бю пе Мем 286 око Суд о сго й) Юго Піти Аіа бю: ЗУ лм бто Зм беї Жпе ех тя 325 во НЕ сі пт опо сспошох шап о абе сб абу або бот о жо: сті дац Ко 78

ХуЄ БІТ Му Жує же ЗЕ ОУВИу Бо мух УЛО пех Ас Те Ре сло уві 155 їз хх пса сш проф стю дат ци Вус хомоухе або сбпєт фхе іс вяю бтє ТЕ

ТАЄ Шує стві Мей Узі перо ММ бог ВХо ліц Ухо до дія мм) мух виз тт 738 іїтЕ зи метоЇца поп опчо дао леп усе поп оса паї о омоосеп заФф опе ом? пси и вало ТУЄ ма) Ахо пу Уаї бім мезо віч Аа Між мух пк оїуг РКО ик 35 735 еп опой бло бес бес ває до бла чаш сус ле че сус цем тес еле 77ЙХ муФф Се па цію» туго АЖа Зви Ту Ту вуз Улі Маз сет тлі без ех хе? У з25 вес бур бог: пе дує ба схо шоу сміт або ач баг мя сло амсопепо охо оВЕ мем мя бі оАна ув опе лоп СА Бех о Слю Ух Чек був мує УВА лу то 85 їрболех са чес ше со Сет сб кс беацоана есе яїй вошова шо ВСЕ

Зчє ром їжа йієсКоч Уко бех бкт Тїіх Ше скух УЛІ ЇЇ Бех бух міо. зт ї75 758 ох апа без спе осда бохо сопо сеу зму каб осо сіцотим сла спе пеу з36 пу МІУ біо Рг хх біб без цію Мез Тух Уго оїм Фго Кхо Бет вхо пах КН У зо ах рем сов обо хоц охо са пс хди ска охепо ої см; Бе хех суб А дер сять ей Жег бю декпобіб Уеї Шесовей ТМт бук реф САТ бух БІХ зо зза зі5 пімоВНЕ еп ху оахе хіп офм бе охала му ха куп вві. дуг сх пту 1112 но ук їхо бах вом Іхе АЇХ УВІ ба строцій ях асп ЗІЖ цій рхо. й ЗІ 357 УзЗО хе пає змо сс моцооис асу дум о сеп ема пецо уче б пепоцес по хока піз ймо доп Уук Буд ФЕх Тит бгп уко Хаф.бкм Хор; Бог рхросРж Кок з32 140 и їжі «ЕП оїме єї еп Зце жов схо юсо од зос са йде хх їцО тапо осот Зої ке ожеи ОБ Тухк Мет су сец Б оугі Абу Муз Швж діт Тхр; Бу ім зхо з55 зх з хом шт фмлю Женоїе Ес цк бін о слс бес це ем балом бле ма іу кххо УА Ром дк: бух Кег мал Мет міх «10 Мік зей МЩіа Зк» кі 355 Уте З зво смс асо сач вац оку сУмоКос см їм сов (ці ох похоссавоц ухох тує ТЬх щу фує бох іо бе Гео бохо хо ПІ 1ЖЗ зя5 358 плдсденанх сх й - 414 яйте БУ т хів УВІ «фа» КЯх й «ТМІ1х псемо вже єтх кА по

Мох ахродійя Мет ут Аго сім бе Ух ус мої пох мхо мем обук 1 - з 15 15 іа хмі я туя ех ом бек дів и 24ю Міх Аа ФУ хх: Мсу Мо 5 КУ

Те МФ віт Аїє Мет йти БМт Сум га бух пів Фіп; Туготтр Млвости

Я Бо ФУ хи! ших Піх ІХкобує Ме пме обу уз ТЬх 12ю Пуз звк о Чіз сім бе: хУ хі с. св дсч кс буз Лі жів рн Сух Вухо пе: дез Звт Су Мк був ЗІ

Ко 75 І ЗЕ бімодіж бує кмеоФух МЕ оМіз лен їм їмо Хор тихо хз шк Суз Дін т со зх тек Хі» біз Ціу дій піз Кто ху біг, Суя Афо о тТух Кбе бух ім лх хво зб зо

Туз ркх Аси бмрорсо 3 дю їмо бо Тіп о біє би ЗУЄ бко МИ Вс

НЯ її ат

БегольУ Ста баз» бій коп оазп Ве КоЮ лолосвж Щі Аву отут м ПУ 333 355 135 ес біх ніх яса су бкс Ям Ліх бмє Рхо діх іх Ус фу вжи 13 545 хуй 135 зо білоЕта буч Хебт бек ляр гу сх охх тс оПуз биє Усе бух Еко лін. ї55 їн 175 тт Ва йуж ці» 01; Меч Бус де баг Мо Мед Мк Кто Фгп зує сти їі85 Ки Ме ха пхю Те уз Ме 119 5хс бго тісті біо ех тн бу ві ех 18 їз зав

Ме) но 2 пих ММо піц Ух» кс бі) УВА пуб Боб лу бджеротуж мої хів 215 294 хзвосіу Ма) бух маї Кіш доп хі вус ОБУ Цуєю Уте ах ПпІі0овім ЦІВ

Зїх 233 зу Мі лук бос шк тТБІ дух Мухр май, уз У Заз олюм Ух бах ії Дів Зах

КК з52 з55 лхрожеро рим вс Му мує пі Тух мук Суб мух Уха Жеговх: мух ік - їх зе5 соя премо Ето сах его її З)? Буг отьк 125 Ж Мув Мія Муз о сіх ців сти

ІЗ о я Й си дію Різ Фі Улі Чох о Тє їмо Рез Зк Ме ойсх Вхю Чім фем ТІ 23 235 хх

Муз вай мій бай Бог МеДОТАЕ Суб Меосхаї ую МІУ КО ЖТутг біб Бог 135 зм 3І5 зт йхю лін омМе моб цім уко біх Бнх дхю 71; бій Буд 61 вхо й. ТУє до . з3е 5 ус ТфкоТйс Репофтє Ун)З Зец йхройис Кор обту бнс бно Мен Уує зх зо зх вит зик Пе того МАХ пло муж бух Рот Укр оін сію біт Вко ме вве

СІ Кі Зх

Пех сме ек уні мес іч іо йза реп Мі деп те Хуг Зх Пів був ха ат 325 йохоїмо Вбк охо ем Вр» Ху Буй 85. 5 «Аа З дз до Н «її» вМА рук ха) помо хкоїох «їй «твіх спо яйтшУ фІ17.. -1УКОКУ «ЕЙУ» спіпт вмуіизоле ст Ковісх рултаї Момукчи гемо кчить де ялвко бихо хабо» ЗА псакЕхдотст бссясс со Феї дося віп зе оепо бпо ск? соди 15т ек) си Я

Ме. БхроВло Мох пух хе пів їбо Сук був уні їм) 3 5 ї5 ска стю піших Зде Ффсо ко БЕ о цуЄ Спб стх пос пе ЗО ср ско пев о 162 їх вец су збу жіа хі ке оаї бе то бжт біб пім Ліх НХе дію хо 5 пиФф оте ад пре ге бут пох цю змо афя бетпопем о соп пеа дец озед о 135 пім всей люд дя Кба Хо люд дів МОБ Ах бштобує бго БІ схо Би за 35 у іжсоїуд ожЕ ІМ спа сію уйх мох бує 45 пе Пен мех запо я хх 135

Туг отїто АБО Рго уєоу це Зіу ТВу Суд МУ дат бує пух г оїіе бує 4 З ї5 БО гас сщЕ сомд айс сай сус пси КЩО дий псл мій Кдоохоу іп пом захо З45 ба ків бі» ВеУ сію луєф лих Пух Аа Лія хім бух бду Бе: бом Бех ся то ть тре сце ому убф сда бою лом їх їЖе Фу: мом птп піб зма мох ха 38

Муз одту Ма ім зів Сім бує бе тус АхроМів пед бач ду вв отлух я Зк ри віє ШУ цес ФпЄб є пом ца сха сад опех кох мох ЦЕ пс аг ЗУ її БІ Сук дів чо І) бум йу бро Біх хі: бух ЗМОГУ Аза жу ах їч? 113 пл бас пе Зис бац обоє МОХ Осі бохо смо ава пек Сас ера де сте ЗЩИ те Су ІМ дсп біб Бує бук ек бно йхр мук ТЬх Віх Тв: бух Ре їй 115 125 сему рус сг про сиє дхо цес де сис см Кох цем їм бе зле зе

Тіз СУ Еко йїх Ккхо Суб лів осзх дЗіж лій вбо ВМ Заї бло їм РОУх 155 ап їх 140 пс остео ем пос ому зас ос сс ака во бсс сою вел сес о цоец сс ЗБа си хо рух Ро їуб Аху Щі зей Бк їїю йох Ат Том Бхо біх хо) 343 ої їч5 та їде 47 пс скЯ За? ати вяс сає док пестопех дод дет пед хто 532 хви осуз хр обої Ухі дке Мазі Лех Кхо Пі Ах» Рі шЕЬЧц Ма мук 8ОМ й 152 ц тт нави обху їхе Біб схо азе ду Бан оса ех ом обеєо доц змо с) оф ве

Ахпотцрожтук чаї дер іу пі бус мої Ніз зхо дів рує Мих Буг ско

АТЕ зо ТУ соч дец оно см бас авео лве онез Має оче ОБУ дис вас ооо яки ба лк осі біх бій лук доц ет ЛсотТук хг Ме уєї Зк чМеї тю ТИ зве 135 ї29 актів пен ехо поп очЧеу пп ох чому цей їюсооха пупохаа пе реа хех іх пію Бій лхротхрР демо Ас ЗіМ рує бас СТеу мух сюе м уяї доп ще А 57 бгловест ові бсо Стс сова Бле соло ато дай хе опо коло їйт МА дит та вп доцомо йліх мо Ву Як одяк ї3в Сіх бю Зб 19 бе: бух АХ

ЗІ ззї ха зе моя ско бом оса да сса св ях Її пос ств соб сей би соку У буз бду бін РхФ Ату Зі» ем: Ві уні тую Тс мен овхо віх ОВне МОХ хаб за5 ї89 цех ох сту м леу зяс соц ус оце пбмозпе чем осчю бепоохе Зх ВЕ

Зхр.оЗій їж ЖБК Туує ад ЗІ баз ех рачмоббт Суто хец ух їув ому шо У 52

ЕМбопек ост мепофяс стлодотс Фа цез ся зеу збо пох сце поем оси ЗЕ

Ера тут са сет Ат Кі дів Ме) 012 Ткр Зам Хех лк міш Сію Ка

З Кк ЧУ прохо хоп їхо язаовос ягсп пої опе см сх пейп бпе пепобце уст з т оАтА АБИ ТМЕосуУю ЖВгГОТНХ Ріш уко Уа бно ЛьзуроБек ЛБроМіу бу тво 252 255 зо тре омел осо сад овоє зобу се йсс п дає апр зу спа под смчо Зох

ЕМО прж зма Жук Кеї ую Гео це М3ї мо поем Ку лу уко ба мій

ЗИ їто Зі5 спе осас стп їмбомбя с осо пе бром бачте ск бамо же ша 115 су ва Уві По ех обу» Зеж оаі Ме: Мін пі лів їжа лін одха Нік зів з1ї 530 пає су осав зл кФфм пі Щем ПЕН ТІК соц ції ахх о снахсіноов то

Уж тТьх бла отих Ве б: Вер бю бето бхо ПІУ пуд . 335 Зі «ехмзммахи Це їот8 «дій с - «рі» ЗА «Щі Вят . кхлуд» яю» мопісле тав їй

ТИСА ММ Мей туз Мр олії їжо бух Сує ча їж фо: юю ув У 1 х (т 15

Ммізозі пе меі Хеї без Беж См: бів їі ів Але ім ах йо го

Б 25 за те вс Ахх діа Ме СВІ Жме Сук бо дім біх іє Тум ТУЮ кб Ву»: аз 2 45 цем Мей бію ог сус Мех пкт бух куп їТвх ків сут дегобім ЗІі0 Шех в па во біо хуу Твт Сук в) віз бе був худ его ем бек Суб Ас Бук пи 55. 715 ту т

Зі слу дух ою тум хе міх їмо еп зх ахропух їз Хоголух Мі

Зк зи У:

Хегоізє пух у піл опхє Укса ут ОМп Суд вій Хуг ФМе Пуг о ФіЯ Ани ке 25 п цій орто Буг бах Хе АБУ МУХОММт Вів тнє буу Кхо гоп Суєю ?со Лія 1 їхо 125

Ухо Зій зач мій бу жів хо лек ухі Коз (дю: ри гм оБсо лук ухо 132 425 135 фуУх Ахо тТвх їже Йох іо пек де Тки Буд біз Мі Трг сСуф МОЖ Ук 125 ї5 їв Мей ща. Ахромої Зуме Міх сло Азрорхо бій кі Муз М: АХОе ттроту: хі мор їх ія

Агрошу умі бах умі піж доп олія Мус ВУ Мус ро ле тіц ції б 123 їїк 130

Жут Аовобмс Ток тут йтц упі Мейо бкс Маї цех кт баз зео опію МІД зах о Кр

АУБ ОЯхо сСса йхо Фу. муз Сім МЕ рум Сус бум МБаА бетовзю був МЛ п Ах 35 цемобхо Хек Бк Дік о слю шум Тент 11 БМ Муз Лін І1У ФІУ пів ВУ хІ5 дя їх» ет акй одіо т му ме ут стви Ійго бещоВУб мех зга зер о ЛюМм їж їх

КЕР 25 Ук цув йвп пів щі дет їм бог осСую Бжо Чаї Мує ЗУ Биж бук го Вет

Км 261 ша

Жхропіх Ме Хом біо Тгродіо бех Вхо БІ цію со бух ве Ахи Туг ат "ка хх

Вус ЧЕ: ТК бос рес ХО то бор бкж дао пу Мет рАб Уже сем Хуг ач ях зт

Бе їм поч Тс чаХ вхо муж вмї Ліц тк біо обім бук лм Май КНУ 3135 зе Й Ух зха їх Сжо док кі Мей від бім ХАІ бі вів дом оміх туго Те хі ув

Й 325 аб зх пех ої: Мегогко Мехо вхо б) сут

З схзц а хахміе АПА єп хлОАчк «ВІДА Міюох Харіоню. «15пу «дим ТИР. 130591 «ТУШІ» пжщоу змоцюпсто фох гноїмо югпцехє Кадукся песпідовмтть для злого біржа жкпйе х н сассомтроєк дселест вс св лом ак засо йда ця сіє МИб еко сухо 2 матождее Меч Ме Бех ЛУФ Сук ум бух Суб Мах реа ї ЕІ 15 мій стосу заз цм. ас «Мі азс люд с: вис моц «ча ави ове чом зп

Мем м Сук біу Хре ма) ВНе ха) ме гео бех бів Прі хз піз МУ 5

ЗеП БО мох сут Мого сує хух ох асо «ово їле ба сполох пає бешо 11О

Кі уко пт Ах СРО МтО АтЯ Хіб беУ АХ се: Сез Хто дам мів дім зп й 15 зи я со авж лох спо соч УчЕ нсо ЇМ хо Ї6бх "де ках зпо мух Но їчЕ лух тую йде Бує Щех вхо б3у тс бу» Ме Як: бух Муо ТВхо Бі бух 3» з -БЕ СУ дис бас паж пе гац пас все хом дпа цес бмєс ча вуф бож пссое 254 дхо віх біпобет Се АтгцоЖн: Сук Ало Лін обме бук Ас Зке мом БУГ ак за 75 мес сис ноц ому охо шоп змФоїЕх їх кап осн мес о птФф Зм щей се їЗУ сих веж бує ЗІ ВІВ оСКу ших БКе Тим Хр оніх ко по: Во хро тую о ко й еїмовша сце ой бебодме сем Фе смол мо оха бах осі. пе їде за7 хів пох рух олія пак жзіз Су між біп кіз вт? вух Бій бе віх туК з . 155 УК че сот дя ат зах сто водоако дай ссо хан оВоЬ са ув ач ес, Р:

Ре Ук бін охо ус Лец бхо йех 430 гіпоВБУє ех Яєг о Мхробук тиг ще п 1хо песо обо сасоссе сба стул сма вок осєю ден опе дач поф оз мод обсв о 515 ніх то: уе ті обго Суб БВгпоМіЗ гіпо біо лів Зло бу Алл вхо й зах за 135 346

Фет ши сто жЕлопот сла язя сте аз бяс ком ємо бу вЕФофМмо мм 54

Мак вве пец Ве Бко Ттпомує Ріхоіще лом о тїКе зЗкбі Ме: їх йех Ас ї45 155 155 ве сет оц око ока хом Фу ЩІК ска бог ом мес ско дя мопосюг о ЗАО

Пк ожЖео проб ма) хг осСує хар умі Мої Ахо МОУ Вес ніх щТо вт Зх 150 їка Ії сах йти ох хтм ха БО хм обо мом бус він Шхе мі Ме: ох єго 88 плосхаї музогме ах см пусє мої лев обіу Її Пій МІ Зі5 Хей Мі

Я ї52 їп5 зхФ о зсх ач соя сту деп дВЯ пед їат хес есє вс бас тах всзодле ста пз отнх бух Жхо Мод оФ)н бівоб)и Ух Лечо Шес Ти Тур ОМ; Маї Уа.

М ї558 и їпо ло дес сіл всс дос стя теп ску цес Фото обу ене пос лях ад бас БІБ

Шхє Мак Мем ис Уаї їжа пух піп ВБрогео б Ве Сіу бух 016 тус жо» У ща Кс лк сп лад ФС їпбохес одя пес ост са боб леш або Ями ва асо 234 бух Сук бух уві Зег Звпобуб Лук отТюю пімоБх: беж ХХ тім. лУМ ВУ 215 239 235 кс їм яаж оче ахе Чец си) ком о пео ам спе ко цеФф о сКт хом под р тіж Ве бу» АТХ пув слу ІМ ВМО Аг бло Жсз піс умі жук ТІ хо 545 145 х55 песосх кос оте дах пед сля очсес оззш ес сай сс здо СМ зоб ТЦ що бгоо Куб дер хо хо бут їмо ТУ бус Мои цію бі Бог о пмо ТЬх бух

КО ео Ко сви пес оле бе хео ЖАЄ сте асо пло ве со шо че хо мом я 58

Бхт май Муа ЗУ Ре Отут гоз БУ: йзу БМ лі Улі ім жен бАв де зу 125 тай

ВИ мир сюоч см ода хоп охо поп га чего ля пет сло дл опт ас Зі йха су Піх Рг осо Ли Авц ут ФУКО ТІМ Лі біс о бсо меї ужи АБЕ ок ам ХУ за шпитобеє ца Мб Фо. шій цей їйс бе вищо бім хоп пом ос ах оо БА

Зи: ЛЮ СіУ ох Жко их бач Зуг Бак буз пвх Ту Чеї Авромув Бжс 308 з3а з1п зу пий бпоцопедх дую є: це бе їх кто сем о ціц о зщи се онО по їй вгу тхропМкУ бал СТУ Ахо бхі БфкоХег сих Яек кі Мей омх» й ОК.

Зло лт5 о пеу ся опже ба каш збе с аг ле зас б Моб ска сх ссд пах мед. їбКко їси Міз йха бхю бух Ул бою бух ВХ: мех бої мо би Вб» бьу їуз 3 зло Кан хежептаногт оутлтачх їх із яйїак ях «Мі» зах . шви БИ -йЗаг їла охріжах. тшїух еле ямі русрніх: Зимня Жлок каву» З зе дар АТХ Меї из йто ЗІЖ бно бух сут Хей ісп жо то бут юру х 5 ЕТ За діх Ує).іККо ЖХї Хо оїже Ббме пом пі їз Ніх лло Шо тнм Атц Кс та Їх: з

Уім ЛУ ВІ Я)А ММЕ ЛІіЧ ок Сх БМ ЄЇо ім бім обу уки обхр Оу»

ЗЕ, 4 р бечо оселя Зіу тс Сук Ме Беї сує бу5 ТчмЕ дз ШУб йха Віо сім бог

За п хо

Біг жаху ТІ бук мів Ме бле бух Му ог Бео пат бує йка Ху ІВ

ТА 75 я сів бу лим Кве тус дао Мі со зм о Ауд зво Пуз Хі Бсг бує вів ви 20 я дех хіх буз лу біцоМіз хо дує Яіпй шук ВХ ТУГО ЖНО Шуб Фі ОоделМ ов ІБ із

Муз їжо Ак лах пів тго Бу» йог оно дор Бус бек бік тВх дух ЕКО іх хо 125 йпхо Сус бух дів рхо сім діх сіз бу Мі» схо Шех Меф ЕВХ їйо ух 135 4і3ї 145

Він оКси Пух Вхо Мих МороїМс ях Ме 129 Хек зб смс ого рм Хе) 152 ІБ їі52 159 би су уві т33 хі Ах МЗі Кого Нік осбін хо го ЩіМм ох Пух БМ ї58 179 "б отУх вхо оІхробує ме) Мхробуу Мей СІ баг Щів ям Дік МуБ би Муйобко 152 т85 й хз

Річ б: лі іо Тух бе Жюс Те туколуч Мої Ук ше МАХ хе тек їх 2 хох Й ох. ак рето Міг сів Ас ТУЮ ем бл Оіу Муз шАю тує ух букоїжк Маї 23 МА їз

Зегодке уч АЇя бу бго Жеж Бех 118 З1із ую ТУ Хів Же: пуб В3х

СІ то У Ж

Яке о Ппі1У Чіп Ву Агцобіб хо би Ме) тує тву пей сухе бу деховех зхо з5х

Лор обі мче ТВі ууж юка бий Хеї ех мжа Тіт Па їз май ух ОКУ вка ЗУ й швм оту: ме йо: йху здо Дікоукі біт отхе доц дет Ах 21й Їх ро ш:5 56 тах із Мяи йац тує лув хо Тр Рг? Кхс умі Мео бзробех Ав ТРУ БФ ря а Зоу

Лке свя ге) о тум бксозмех о їжо ТСви УкІі деп буо бохо мс Тр» обівн о Схю лок мо ВІ З сзу Аксп М) бе Звх був бЗвх Ме) беб Мів діє Кіа Це Пух Ма 255

ЗАМ. 3хо 1зх бик отв: бім туз пох їмо лох їмо бокотко ПЗУ зу а з45 й п «тії» 1108 «т1йУ ком днх иа со харісци заЗае кулі» Спо чай (17. ТОК) «ОЙ стек хецмемое їй! ЖХозієс) джоїкій Кидуюча пуслдовекль для зпипмо иа кашах З томтвчанец опсапє ке дах уех р лох ся це спе сом зи зчгчоха лу баком пал, Ме їв Му ліу зі буе пух укі Хі ні ре 45 «ме морока дм: фі Мми хе Зі су ми зе см рек ане мат фо. 505. зенмоіжнм кує ПІ 815 Ух ббя омяу бек оіло бек дів біо ів Має АВ ті 25

Фо пМ зма сех фомопчтУ здя цех вбшоха фс Ки схо чах око сец о 316

Зі бно гц Ака бро Ат леж йім МОБ Ази Яс: Шує Жіцпоблю біз ЩА за Ка ай хек: Мяш мат оси лій кб дат ам жор ее пес Бус яамозко ам бе ї3е

Тис о тец о дхе го укм беж лу жом бує Мої ех бух їуо Тех уз Сук

Бім т. ко лю сах пед сом ге бе: бохо дес дес їхе сус саду гсе бос сце 243 дім: Кіз сус Хег біп Мо тв пуз дія МКе бра Суз Вій о беї уєм бек

С 75 ТУ то плей заз цех осхх пе ох, міс сх цес схе псом осіхромюрахе Кей 257

Пух йха пух Ср дів су мух по туко ами Кі їм) замі МФ о АМУ СуФ 9 55 5 яЕч о оде шах (ме іїшсоЗус чем зда мом осхс мох ака сені чен зло А

ІХо пох бух ліх рис тіз суєю ХУ бю Міз бу? бух біб пух хі» тух

Ко 132 ї0х чем огое дацоахе лез окт охлоу опб пев ЯМІ ха сус сов єме бе сто хйУ те лих біз са тк Мей Уо хег брє МЕжЬ Жах фа Вт зго Бі Кей т 45 Іо 6. зх цео сосоуха зе тем зу жав віх сдс ЯсА Бфчопєв тоб Боб опте 412 йти Бім жо дуз бек Зм йо МУ В: й Жчк буз діт Ехо Сх М 235 дк КІ зах дик олпсї ах ді: йо Че Фе пеш ЦЯ Фіє ЖЕ см: йо хесосекосде 84 діх біт Пі» АТО біх СЛУ Аз фо Яег Мої Фе хо Хох го Бхо бух 235 1хо 1543 сг поп ооглосмт хе ем: бе мн аит пл баб Фо ви сап ово УАЗ

Тсо сух ХхроЖег їі сво ХІіФ пах хЯ вк гг ціє Ме) тнє Сувомої

НН їх КІ

Фут це чес дій дує пес дах дкт бок дм дос под бує мас сф бат о ОУНО хаї бах Мму Уухі Яегобхо Біб 4зу Куб МІФ Тахо Мут Бог валоухр Чут ців зе 185 см цес бос од дай зту сот міг Чео пу Міо чеф сс сф оуеюд дат 03 хау азр обслу мі мій смі Кі деп мів Куз обмхг пує Хко іт пм цію

КУ 15: 15 соте пос єп Фо оче бут стою Ес гдз б пото пс брало те

ПІР оТум Ми хек сві тих АХ Майї КІ сф У. іАхоЖог Час ієм Кі ше хії 2 ти сот пл су сід ЗАЄ Фасо ом дж лес ом МУс хг Мт мте золовам 1

Тв одтр фр цех дтй З3у ко Ми Уут Муз буз бух ХЕ Фагойх мує т8ї йо лах дет дит пе Утє сб вбк цефоадя хео ау сс мих хом зма сна хай 7

Ма ге гіпо бйх бкс дів обіх туго Твх Те Яюгофух Міо Муз У біх

Ів ах за ссп сх охо чсз со хо чес обоз спеку сепоспя Моб че охо пле сти я

Зкосдса іч фі» біо Хол тує Жрм її уко со дах хо йод ФіМ їхо вка з52 «оп ази овзле бее дім азце бі оби має сру біт хе бом МпеЮ о моп па

Зке мк АМІі Ст Маї Кох мо тТвУ ФуУХ ВМО Ма) Ффух сіи Воно тзух УКО риУ Ат дао бос ах: же зог ду оч хош євю хос бок аце пео сс ве длболог о ЗМІЙ

Вис ясв ї11х Зля Укі ШУ Тхо біх омк ххо бі бжм ко 0зц Ах Ахо тва зв їз зо хах ох зосомошф сок се ЯРИ см о БеЄХ бом ошхе цеФ ЩеМотйе ХЕо «и 254

Уго їхма Тву Тє го Поле уні б Ахю хо ор зу бюх вх ім ого

Кіш Кая 315 їх: оазце все чіс Фоз се г: оме же саун ую мех см; оз хобі Ух бут пек рук му тп: ах Ве дух Бне КО тр бі ІФ Му лм МІ ато ке 535 прп їпя зе хоегодіу УКО ково охе ус соц осхе мес осолоткс деу подо 1

КО ев сум ме ма! Мех Кік Яти Мія їхе Мін йкми МіЗОТУМ М (ХО 325 КТ Й зх яедо фот ско боб пл бле пост Оу вед ТАЄ КСІЖХУаЧаг ппІСпПОгМИ А: ух вух ет бач Бях о йель дме тт піж бук О" 355 Зах «гул» хх їх 3? «йі1йх Кит хЕІїь жа хоніся «а5ох 05 6. пас дхо дія Мяеб Є ХУЮОСУУ Бео був упо юУЬ Бех беа Цке був ШІХ х З 1 15 їж уні Усе ву Ще цс о йек Паб би ТАЄ Мі піх пі їж зу М 22 25 ха тва мит ха 31 МеЖ г Мег сне со без Шу оз Кут Тр Ахе ди до «5 тез'реч ШАХ боб Сує Ме Жет о Сує Муз тв Те бук Мей Мів Піп бог 25 59 біполіЦ Тк був фа дія БНО пух йдхе Лек їмо о вег Сух де цк Іо 5. ли 73 Що біо тус пує Рем тТух дер охо лей оїко гу вхробузх 1)к о Жег сух АТО їх Ю за ве осів суч БІУ іп Ні гро мух іп Пуз 81 Тут бла сСуг бу: чи

Мб ха5 що ух зна йса Онсобсо Ух) йопоїяю и бко З2а фемодкю Фімо ре фух м ї2 че до ЗМ Акродук УпІ Пім твВу же кгц бує був ам мо єм» ВІЗОВІ х

Ук 135 заг бій ку АТЗ сто Бет бої Ха рез ба Ко Кто сих Уюбехв Мкю оба 52 зе даже зо їха йох тає бог Лін УВУ Еко б)м УКІ Тви Сук У) Моз Маю Ахю Ух ко . 175 хх ес Міх БК: Хоробій Цій Ук Хжх Уке доп тро Кут мало веробку ма) 185 їх їх сі мех пів Мо Дік вує Трх Мухо пут ху сім пію бЗійотує Ам о ЗяЖе зов те шле л7вх о Зуг й Хні сеї Зм садоїж Дт мях б ВУЄ бі Дю теп вхо жу 545 дІб лзмоцауУ Мтз сім Жуг фую Пумоїух МА Екс Абм ую ді обкм осв б чу за 235 дае

Бех Ме йх по УФ оЇї6 бек їуа ЛіА ЇХо П1у бій КхО Зб пін М? 232 Її; 255 "Ме УЗІ ЖУї ТВ фе Бра бсо Шех йса йеройлю Меч Тис Мох йхо С

Кер ї5Е 7

Мк) бах їмо ток оСує ТД мк ех ПТ Ох тує Жсиодме жов о Тію важ те а Бе

Уукі сій ту» Зімобежх дом сіу біпоКко Зіхойхи деп тує Буж ЗМ ТОК здо В. зо

КкхОо ст УМі зба ахр Ме ляр Оу Бет оба пе Вей тує Мер слре Жинх мох уко зі5 359

КІ Уеї Рв Мув'бег Ако Т2р б) бік піф йац ух) РОМ ожм Сех не

ЗЕ5 з 515

ХА МИС пІХхХ Пію Ал умо їх Мка Чім тут Том біл мух бкс бач бик 34х м зЗеВ їхкі Мвт Хто ху мух 351 туп» 1 «лізі» З . хвАШе УМА ЯН «ре Яке мМерігне. ти» «тили ІЗІОЖеТКЕКХчх Фісімогі йо. кефіотис МЮсТраємонх поло е пукхеотевк

Скриня с. еіцесачене . х «Вій» ЗК «зх я «Вуд ДМАОДНХ «ЗІЗ» Вівхі взюієох «ху» зак ЖІіЕпонсамліме Мопібнмійе змеимеке. Мміпрукикча пзспійленесю кЕсозрухд «опе. я песен х заток т -ЗА1» 585 «й1йе вик дих хі бю ожрімох. «ВШ по -ЖЕ2ух по не хЕйх 1125... ря «й у аскчихілдед споснполаєє уомиє хе оуо сао Фо моно сцю має ск опех 5А ем: Аа віп ШІіУ біз жту бих зей! ВКц чо зи цехом помовио се коч о смс ду Фк чех дме дан ле чл 151 сту вки хо Дін Ехо слім Его Тйс бін Сус Хо) ЕКО льно АЮ бохо ВО 16 х5 Й Б їх цесоткхц под ме бал осмос кто чіш дпо ласо оспу) пЕМ сте сопоама бсу 08 авроієм їко Мох Ак ніх сухо УКІі ДІ Сук обі хз Жхю: м ТК КО зу 15 2 соус пом оно чохосю Чех ом ашо хоп осн очец січе буромо меч сте 00ОХЗУ вс хо бух о пхо Ах о піу ДТа лек кт Кепойа Мінх Бо ТЬХ Мі сг ля зп як си пору са лоз Ми бу чдпи пу йбу Чис бас Чу зЗсфоциа бу сСпто УДВ

Міпй пис відо Зо бек Уві Піу 1 Зіф Кі сІ1у Під Ліс ді їЖм ого ха ко зя «пу сто ФУ о зсЕд сьо ЗШ здає єссобсе чех бефостц це сен пив єму я їмо іх ді дм їжа Вч бу Ао тій Вао бер ме сСіУ їмо зх о бко ще У Бе тт сб кою оц ріс схо Яр очі сб зум ово со есш соя пов сну ЗЕ У

Хтеі йеч кіз їж умі їйец укі З1у бно Узі пи хХспойМке ХХ Міц щи за ях 155 155 дик тод ство им ней Брбс особ одла чем дис мом схо це хай али 29 бка Зк мем Агцо ді Вій домом АЗо сб вдо їх дор ойіу Ахо лих пх зд їй дес: Фиє хсА ВО ємо су ЩоС ожт нос 21: Зм с чем пед фуо яімо 43

АвуМрокля ко смо бій, іо бврозуз чаї ЖіФ (35 Та БЕЖ ФО і 1 323 159 135

Ще ошукоєм зи дей пі єс Чех єс ії б ую око оце пек фо. 485

Зк: дко Аля ох МіО. г? ВХХ гр ОКО ?2зз Куб сту П1й Втр рЕе СЬУ зло з45 150

Фа ім юбА Мт: ЕС ФМ ОМаТ ФУ пеІ Фр сб дит кс оцец сх бут ЗА схо лізу ко сг? 2іу Міа боб Уа) біб Уві бго Міа б зм чо ОїУ 155 вач КО песо чемоухо ем Чім А оспогени Фор мс дет пт Фу тдо пе БВ

Жеготце пім овен ух) тве ха ую ЖХог дів зху рюб ові БІД щі їй з15 ай зяссацоху 586 дій ли «ті» 354 «ВАТ» РЯТ «013» мото оврімех «оби В Й

МмоОлиу АТУ ЧІ1у РХО 02; Цек ої Квсу з1у Ах вхо дію Ютоо Міо біт 1 КІ 32 15 тис вте пух оуаї о АЗК ФІ Чун ЖНю дер цею Дод оМеї Хо іх бух 25. 25 зо ж Ав осСух лу см овей дп Чого ро всаяобто Мух Кса віспу АТ зх КВ «3

Жех Бсе уз лін о бсо МуФф тах Міз дохо пім ус пло Фую Зех хе) ху по Б ко хіх осіу діло йпіу Яіз Зію МІХ Око Кт бат усо бу бе їхх: Кк ОхУ ах то 75 89 хіх Фут Аз їжи рес 73у жо йзх їмо чої уко лі под уєї рим Ха

Ба З з ді БечоУє1 Же: Ткрояєу Вт Агу сію Асу аг Мом хсу Бім вза Мем - т 195 11» бех А)А Цій Міо его Хлор бу Аж ру Ах» Дін Бо біз йуо їх хе іух ака Ех туз о маЗ 155 ї1їк о Мбо, бос Уга біу із зхє мороза Ме АР ко даю хо. 182 ї4о

Хепо уко ОО опо ціх сю: АХ вІ2 ШДу Тахо є бе обоз піу Зіх йо 147 іо Із 18

УВУ віх мак ов під чом гою ке ку Шок їм ліс цейпомех їх хех 155 175 м: ие ТВх Міх Яіу биломій са міх іо «по» ЗІ «Вії 33 . «им вх еєй1ле йсожі хявіепа

Худо» «ША ЖЯ-10 М хіцехі нано УВО МН сісмальку ема вчіть «дон ах Й мех осіу їтр обех тро дін Ром обмо Ме їхю: Ухо: ох піу Тв їх Ту х 5 їй 45

Мах тм Ве чех БИ «Вії 33 «їй РИ лів» вВоюо озріспо сих «Ваз КУвібп ріиткеїи. ЗЛЯТЯ ПНО «дп ой

МеМодіу Тхройм: Те 129 бВк лен риє ет ко опюг сію тТпт Мія ху ї ї зе 14 же їх йеом жів Мек о деу кт бує б БІ сім Біпобум тро Керовуо 7 їх зе їнта цим ФіУ ЛВж Сбуз ках одех суб пут бух 13» бух ди нік бім деу

За хо 55 міц вхо Тр Сує вла Міо гію бух Кст бик ваи о БюегоСух Кок руб ОХ» пб Ух я

Оз лу их Би Жух ой Чі мо їж вім Авропук 1рю о бех пух віх в 25 з ог ат Іза уує сій СА баб шко тя бух Су піз ТуКоОБОМ о Сув іх ка

У Й за їх ру цех Ат о пех Зі» оУ:н Пух ні Бне Авромую Тс омхю Лис бухобіт іло 5 ще си Сус хо Фла Ехо біо Ат бін і ол ре Щеом май їх їжа бно

МЕ ме із5 шко обі» мух Рімобмик дор оЖикК оїко йХхо її Межодтя твс бго Бім Мої їзе з 143

То Сус Чи) ухі Уві лвр уві Шек Кіз 014 Аве нтз Бій Ме) цуа ТБе 442 159 135 ку лхе бвротух Майї дор піу Ме біо бкї іє даю лУю фу ТВеобухо Кто

Аве ККУ Мі дец сл со сло тую анхо бас тв Жук дет маі ул) Щег Маї Бе тт

За МВ Ми.

ММ ля ніх бій одер откро Бей дно бу пух вуз хх був бух ке мех їхх зп тах

Хек ха уз Міо ке гуЗ бос Мет їі біо груз зтш зх Бас звук ЛіХ т32 я пу» БіжЖ Бій вхо вхоу 510 гу Фет маї ук Уго їец Реп бсп Яегойха я 2Уї ак лап

Азвосіо іже Тит буе 55 З УеЗ Зесопее їй Суб цче Мкї Був ОбЬУ

Я хо рен

Жпо Тис Ре ди: Ахролів Ме хз пін тбсри 01 бес Ази Пі) Хе Ко зби в зт бпіч дхо Ах» Тух уз ме сх хо хо Ухі Я; Ком сне АК» ОПІУ дет

ТУ ай зе

Жпа не бви Ухг пух бук їмо хо ах Ає фбуб Бмє діц о УєробдО зо 535 25 М соту вот Мві іс бек Сус бо Уа Ме Зію см дів мей ніс Лоп Мі.

ЗУ КІ ЗА5 Не

УукознІ бій вух кт Семохегк бе б бг» В1іУу Бух

Зо, з3а хід І схїіх щі ядкля пхщ ДНК «ШІ» Між виділ

ЕТ» хадУх ЗОЇ би За хо який сі хепсіноціє скомцілююве сспопкухсх пеоцехжеасо Махсїнехо у зі діти у ха ЗЕ хуй ШАХ ЛК «ді» Може морі

Худо «ЕІ. Мощітае ут ЩО мно ЦК. п «по» 5 ахсатчаєтдіт савсучозсг тпезсадате спадепасве бпептептмс от І «ов ся

УВіхт й? «Зі ВКА ДЮ Й «Віз муви зараєта «днах «Уві ся и хз 11.15 -амах з5-34 УК хіцовмі хоіденсяу ВИЙ ММОжИиВлюм МИУчДЗьКОТЬ «вору ве ха оце поп здо серожумоїкі схо Шк осіс прм їмо бує ас цем фі ч5

Мем ніш тїхросех св тів Обх цей рЯкб іже Суб дек піш лжне Ззх бІіу ї 5 15 ІЗ аглопіп їле З ук) баз охех Й хиїт 5 «Щ3і» Ва . «пули бе ЛЯХ «Ехал Шодее звустох клйлх - хан тан МА айежст. ЦЕ УНК ТОВ «аб 25 нсовоняані сомехційеи меоліці цех охазмомн: (аскіІЦцаМЕ пісопесцяати ВО тспапсомем сосмоглеме пек па хвайн оту . «231» 3334 7 едішУ МИКОЛІ. «ака пом соріТа «ЕЕ «ЙШАа» Токіо) мсисохмо. ВЛИТИО лок пори сленінкако санібссити Бесяхснехох сдеховоою Меомамахо ахроцюхе я сФиФНУМОСК ІХоКОЇФНЄ сссдхоходх асіценоєо оудоцемтем сбохспогмих 100 зеогпдхома копи МОсОФфаспбо вуколеАсог МОБ НосМе сгпомесяся ВИЙ зЧУцьислсї Фі етцеач хксмічесес: охоожолеси зотмоназко селом ЙО зепіцхоми: спюноно оххіпаєох сетпоцеучє меми кож мів З іпекотсса стайскцпту саомевдлох суосадетсих ведатсттле сспдайцвсл 300 чксаксевть донсскотат стисочатей охсссткаєчх касоутусиша «ппцлуємо чи посокаисох соуоцсокопе сахопелтх цескодессое Фесхіцеси МФусцуєссх КО плепткневй сспеухояс алестпецес фісстовлсс себслевяаєс сакддесяси БИ стемецеатих ссидмомФи Зеднотедсх Кусокацісн ббисемщю спаоцемжю: пол сеидеєасом з ісовсма підспіІйеМ псів суоатовсви уеоопомх СКУ. сомсткерє зуекзасно сиуовоцтуно песо (ферешоссвт тассссоєми ТМЦ пеопапсмує коноїдотлон цпеастйслом іцсолоцієт похосиовао ссхечевцим 189 сопомосих влопсамеМос слазиемоме цеусодевис зкамасизся пат нійсвоо ВО содеєсттеве песзацемеа дсіпессаяоу сессвсутса песптувесто сетоцісевмі ЯОЙ чес пхоупоасок сепошістох здох хецоисвуки увапаалахо 250 їнсохожеся потиспотсуї апсцсгстнмо целедеснс впоМмогистю беусохепсм 1970 псодіпдено сохосядікт саден асо пє пекдосссяв сасопехихд ВОМО чепстноясв апезсліхсхе пеховенаає стохосестцЕ піІподЧокох ЗЕахя 1535 «Мих с хіх Ім

ЗХїже піде ДНК Й «3 похо охріказ

Айште «айзх Бияхіпо рімсхій. Злітх біло . «це» 5 и хапетхеуйтс єміцфисьо пепопоцюсх сбохасхохє сєфесхеспеи сягав в еетврдаєст рлочевевох Епбуссяуре вспдсячиса годудстент беусксокоя ВКФ схспомноза хопезніос ібоцаніцто зснохлотоп асрлідкейіІ собсстесксов ЇВ чамаїмсюті. сто «гкспамоси змоцеауєаце кочоцяемомМ міц: поці лай

Фптуеасу: ссмуаначо сагксосези сактваивусє слстесюехя чептатечіє ЗВО зчежомссяк сездесотсц семпомочеа дичахузсех зпфжстесь сосонопщач 350 пипммоуєх зпссіномі січіцехсом паспетлоце добпобескіх скфпсчсона 22 охсмежтся цбибпсмеоце сазкхенскоо селохагмми плеслентепо пспемлаєтсй фас певсслалаоч спаде все садЕй ІЛсЦПеЄЙЕО сеподфевнех света ВІ схоже тмаоєтх вихяФооучм сюсовУМхою Мксехкідеюу Уукесрвядою КОХ тлюмодк Уйехеоткй ЧЕАХЧСФОМг и естоВА ЗЕРАХАИЄ педзгннов МИ сситяючея Єделрхєссх кефлзунтє ЗикнІєдтх чедиксос гдхостотсяс ІВ . сонні Сйх кодом иусва хоорежиєєу ЗМИбеєФото сседтамянк сомів Мей сс ПФТС пкоголтюо поточтосеє пебодтимті Ферхнксини ФА столах Зк це об ойгтвчу епвечцІєМ песідесту СУ дуюселя ЗХ

ЧУВ хжек пУХККОЗИХХ ФИМУКТОВаИХН ООН Молоко. УМооУмиве то

УхитодАі гою Шемет: Шчбидимни ММжтота пасом МУ мийжомия оМучАЧОТИ Ме. Макс КетауєьМиМЕ дУмксетлн МВ осРУКоєрох космос ЦКОдаМТЄЄ голхкстр Ксванекк ОтУнК. пІхх «вій ко Й ких нм, «ЯЗ іме дн «Мі1 Мой: плн «ТИЖ сю лпчалусвх МОУХ СТ реттюовог помсти ОМ евдига в МК СТР стекол кару «апою вх густйсролх ОМ сєух ач соку Мами ОМллжтю плиготюгися ВИ

ІМететтАх Кейвухстт кшЕТоихейо пьУккостх Кепдоаиккх сгхкоаєои 157 соти стЕотіккод ЩКодаськмо Оасхктдсюх ккстИжжик ФоахнебанноїВи ссвалчтху пост лнч сусСоАКИчо Ше АЧКУЮ ПУТ ттх САМ уНОСах 292 кигекучтхт ЗЗЕодФас Блттестьни сет яКе ЕМ кжЕЕодт зегодакеєх 109 зесерудльме ЗИХЧІМ ФоЧКеом небовамикє до'хжкмог учествмююю КО

ШКФ Мом феаюФоги: УЖ ЙОВІл кобдадАВЄ СИОІХЄОо амери КИЙ,

Моро. Фут. тля вожхсеви «тео Зете готи смохцжеов сжомухжястт взооттзиее ФзУкеоорх Хесеоайнях вику ВИ, соокАунеСІ СООоУасо ТОФУ Сг туєсєсго ПУссаодААт «огмаивосА СХ пмосумясо приссоодхм дакеїстои Човни стмхсєтоє мсоєруютсох БЕЗ ахемимнє Змсєктавкси Фозскоронн коефоанкк сеамячнест хиподжмс зи

МооФфоуит срплюдд флак гло почідектиий ВЕК дААНЧКИЙ плазтстмитї. "КО пулісвсти: Еобпкссди фот тоЕде Мосеєдах сеагухните дечххасактя ВУ соткжецоом сФфодеиморь Меса гежиотогг: зх «вух В «аку х ЧО «МІУ мкА дек «ДІЇ» Мохо: хід вас кя й «дахи бМм; Мт руєюютих ТМ Те люд тА

Ух. МКеХ УТ мррмюс ню мих кунхрий зона жАкодИАт оптику ЦО с одейии СодоАКО даачеадг ЕК сАкчккдрит сопомори Ссточмуукав кхусесе»м ХсКсфуникє Фойтевежяя ТЯ серію: ЄсодмамоУ Кессвичеке Милеєстто». ятедеасткх Ффодюеєт ПК «оайхєтсся скодаАюеро Миекамил ЗотмисеЕ пеИЕсКА хметтьмсве 230 отже ММЕММЖкх соки КСсФУМеКе до зжмеоов месаонжме ЗИ хост хм перо І ВИЩИСОр. «ФВ Цю ФРаКАЄЮеЮВ пххстгАХТІ МК пУгЄвЕ: Анти СОКОМ Нодети «КТ МКУУКИМ дою ТУ учас того месАу Ус Ф бе Й І 12 яп 30 ав Зо моснлялина сСаВЕУООННЕ РРОЗІНЯХеУА МЕБСРЕМЙОУМХ ПРУМТКОМЕК

Щи ви Б Б

МЕДИКО В МОАДЕСКоЬО ПВЕВЯНЧКЕХО ВІерсІБСА ВЕ ЮВРКОЄ

Її го 115 ї8о 145 35

ВУБСНЕМЧКІВО РУБРИК ОКЛЕПЕУЖММВ ПИСК ТОЮНЕ ПАЗВЕАЗВАЄ

ІДУ їн н ї55 з

ВОК ВООМ зихчацс ПСАМЕЛОЕЕМ АУАСЕЦЕМНИ ВЕОпООРКЕХ 215 255 ха 530 йо

РЕШЕРАЄІВО СНАМКАВОІВО БІВРБИчаАТС БЕОКРЕСИВЕ ТОКЕАУТЕОХ зе 25 Ба 55

Туш усвокУ СНЖКТТТЬОВ ПЕеТрНшсіАУ ЗУСУБАСВО ФО.

М М

М м ; т НА

А Ка ох с 0 ЧА ще ях

Б сні

Моне шва Й мая ож що я: зай й Візпмір. сви ба

Н о сво те

Св" сна ш с

Ф.г те яе в і Н і 218 Н 212 Н р азе ок. (шує тт Мух ожх пух лмкродух жВх КІЗ їх сук Рій хо Ппуз русі

Же 0. ко. щехо.00ю00у0. зх тах 1. - Аа . пех . . - я . . . : НН са 1 - . боЖего.. - : - - м " - и НН хе и. Кох нини ни ї тео? і. . ги. - чн : Р У рей п п нн с о м і і ме Мірде чи Н 835 їх 23 Ек ся ІЛ їхо м обец їн» 01у бімж бхо лех ха) ЕМФ їла ро во рез

Ши- кВ р. - . . . Е . - - : Н . з я тс К- н Ма бьо, Атк о. - - - - - - - бе ї- - А Маестро. ма . . - - - - - ясє Бе. Кз ис з мм ни пи м

Без КК. ї . . « . . - - - . - . кеВ р. - - . . . . - н - - - - фоспи сх 250 же ПУБ ОТО Дух хо ЯТ: бе мм 136 ех вже тТМт Фо опа о Мау Те гс-зВ88 пн чн нн п о п п о п в

КЕпе Кк - . - х г; м ях . - . - - сх нн нн п чн я м

Рок . « . . - - Н ї - . . ти? к . - - - . - - - . . о . кеВ - . . . - Н . .- . и - - . х - 275 хо су тях уеі Укі Аси кі лех Ніко Бі» Акбобго бімохяї пут хо к-ч8а . . 4 . : и . Н . . . . . , те - - , - - - . . . : - . . . кс - - х - . .- - , - - я и . .

Ке5 - . . . . - ї - .- . - Н . . ст пн 6» м нин ННЯ

Жива . - н . - Є - : - - . . - - .

ФІ. ЗА 235 ек ді укр отТук чо Вхрозіу тої біх Мої ЦХе Аох Має пух Уюх Вуд ксежак - - - . . . - Н . Е . « тої. - нн нн . . . .

Еш - . : - ї - . . . є - . - хе нн нн п нн а п нн хат зо5 я хо Акт БІБ біз 2іп тус лм) йсх брх ууг Агу кі хай Кох Уех же-аке нини Ин - нич жо - - х - . . . - - я - кб х - . - . . . . . . . - Н - йс юю да ої. - - то нн нн но нн о нич я мі ох т УА бем ові сфлоктр Ук їш Зо БІУ уз БІК Тух дух ке-зпв нин я нин нан тех. . ни пон ння К- сс ния нн нн нн о п

Кие 21 нин нн п п п ззи 3зі 335 з Су Був Ух) йох веб фух дія хоп Уко АІх Еко ї18 сі Бус Те

Ус-489 нн нн нн п п о р аз . . - . - - » - бек ваг. я - -

Вп . . - . я . - . с сс . - . ков - . - - - - . - Чек Бед о: - . - кет - Н х . . - - : : : . - - - сг нин чн нин нн нн нн но, п я «г. зве я Лін оЖме дух біл Хукісїу БІД Бус Якот пію Вуб піп кі їЖЕк ЖВУ пе:яв . ни нн о вед . . . н -ї. . - . . . . н н -ев К , . . м що . . г - . . . . .

ІжоЯ пн нн нн и п ни чне рек н г Н хі. - . - . . . - - ки ОВА|СМУ г з зке зе5 ме. БУ РХО Бій схе дош АБ» бій фе Тех бхо де ІМ Ук) Зжт цем ши-8я5 - пн чн п о я кю

Кез . , - . - . - - - « Н - . н ре юн нн нн нн нн я я 11 тей нин нин о о хай ж їх був ін Уві щук БІУ Ом Ту гіпобЗют Хо 138 міх хі

ЖКиевп25 - . - . . « - - - : - . , кої нин нн нн ах .- не я вих миши чи на нин - ба . ши нин нн я зх5 я тер бім Бек Ас бі іп Бухобан вхо йвлобую вує Зх Ту Буб с-ана пи и нин нн и - тей : нин чн нон п

ХЧЕ . - М . - . Й х - - , « . сх нн нн нн нн я пн а аа тя нн и п нн п п п п ктВ нн п нн п п п п чн.

ах м тес УКі оч хо Бук ВЕР ОММ Беж Ре р)х ко ЖукоБнх хив Ту

Же-39а . - . м . : . - . - : - м

Ксх и - Є є - . - . - . Н У а . тав є - - - . х . . - - - х

Кс. Я - - . є є Н - . . . . - - жест . . . . х . . . . - х

Кек . : - . . - - . : є х - з. к

Й 425

У нг бої дер Муз бо й Тхо ба ФМ ФУ Асм Ухі 5Ве Зхеобук оз . . - - - . . . - , -

Жпе - . . . х . н - Н « М н же - . . - и . «є - . . . - - ек М - ко, . 6. - . . й . -

Мат . . - , з. . . . . - -

ЖІ Н Є . Н х - - . - . Н . . . ях зх м ль меї мх: ще біо Аїв бом Жіо дед Піх Утг ву ще туз хе кт-« ВК - . . - Є - м . и - к м ся - , - . з м є н є вок нн нн п о 7 ув нин а І «г ме йнмоЖек км детовис пу сккохею

Ре-48К. . - : х - м . .

ІЧ . - . ї . х х уст х - . . . н тс 11 ще п? . . іх . я - . - кова . . - - я к .

ФГ. тн нет т - щих яко пе ТАбНЯ ою пит ш Я КАСІ -25, атох 154) кн

ПИТ ТВОНьов вт тя) Кай і

Боня ТАСТ НВО, ЯІьт я екон

Е - З ож г ж ! шою ра и те жк шт ї Ж ч й Як

Би Но г ра 1 й ше Н ї срок й і нен ой ТУТ кт етери т зстути о 1 їй 150 за жо 1 ЕХТМКа (РМ

Фіг

Claims

1. Злитий білок, що містить: а) фрагмент трансмембранного активатора і кальцієвого модулятора та взаємодіючого з циклофіліновим лігандом рецептора (ТАСІ), причому фрагмент рецептора ТАСІ являє собою поліпептид, що складається з послідовності довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з (ії) амінокислотних залишків з 34 по 66 5ЕО ІЮО МО:2 та її) амінокислотних залишків з 71 по 104 5ЕО ІО МО:2, причому фрагмент рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з 4АТМЕ2 або 2ТМЕА4, і б) фрагмент імуноглобуліну, який містить константну зону імуноглобуліну.

2. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 66 5ЕО ІО МО:2 їі амінокислотні залишки з 71 по 104 ЗЕО ІЮ МО:2.

З. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 104 послідовності 5ЕО ІЮ МО:2.

4. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ має амінокислотні залишки з ЗО по 110 послідовності 5ЕО ІЮ МО:2.

5. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга.

б. Злитий білок за п. 5, в якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга людини.

7. Злитий білок за п. б, в якому константною зоною важкого ланцюга є константна зона важкого ланцюга Ідс1.

8. Злитий білок за п. 7, в якому фрагмент імуноглобуліну являє собою Ес- фрагмент ІдсС1, який містить домени Снег і Снз.

9. Злитий білок за п. 8, в якому фрагмент імуноглобуліну являє собою Ес- фрагмент Ідсі, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:33.

10. Злитий білок за п. У, в якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:54.

11. Злитий білок за п. 17, в якому злитий білок ТАСІ-Імуноглобуліну являє собою димер.

12. Молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок за п. 1.

13. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, яка має нуклеотидну послідовність, що містить нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮО МО:53.

14. Фармацевтична композиція, що містить фармацевтично прийнятний носій і злитий білок трансмембранного активатора і кальцієвого-модулятора, взаємодіючого з циклофіліновим лігандом (ТАСІ), з імуноглобуліном, причому злитий білок ТАСІ-

імуноглобуліну має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:54.

15. Фармацевтична композиція за п. 14, в якій злитий білок ТАСІ- імуноглобуліну являє собою димер.

16. Використання злитого білка трансмембранного активатора і кальцієвого модулятора, взаємодіючого з циклофіліновим лігандом (ТАСІ) з імуноглобуліном у виробництві медикаменту для зниження рівнів 4АТМЕ4 в циркулюючій крові ссавця, при якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну містить: а) фрагмент рецептора ТАСІ, який являє собою поліпептид, що складається з послідовності довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з (ії) амінокислотних залишків з 34 по 66 5ЕО ІО МО:2 та ії) амінокислотних залишків з 71 по 104 5ЕО ІО МО:2, причому фрагмент рецептора ТАСІ зв'язує АТМЕА, і б) фрагмент імуноглобуліну, який містить константну зону імуноглобуліну.

17. Використання за п. 16, при якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 66 5ЕО ІО МО:2 їі амінокислотні залишки з 71 по 104 ЗЕО ІЮ МО:2.

18. Використання за п. 16, при якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 104 5ЕО ІЮО МО:2.

19. Використання за п. 16, при якому фрагмент рецептора ТАСІ має амінокислотну послідовність амінокислотних залишків з ЗО по 110 5ЕО ІЮО МО:2.

20. Використання за п. 16, при якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга.

21. Використання за п. 20, при якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга людини.

22. Використання за п. 21, при якому константною зоною важкого ланцюга є константна зона важкого ланцюга Ідс1.

23. Використання за п. 22, при якому фрагментом імуноглобуліну є Ес- фрагмент ІдсС1, який містить домени Снег і Снз.

24. Використання за п. 8, при якому фрагментом імуноглобуліну є Ес-фрагмент І9ДС1, який містить амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО:33.

25. Використання за п. 24, при якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:54.

26. Використання за п. 16, при якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну являє собою димер.