EA030313B1 - СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ IgM, IgG И IgA У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО СПОСОБА - Google Patents

Abstract

Изобретение касается способа и композиции для снижения уровней IgM, IgG или IgA у млекопитающих. Причем этот способ предполагает введение антагониста BLyS, который является слитым протеином TACI-Fc, включающим последовательность полипептида, представленную в SEQ ID NO: 23, где из указанной последовательности полипептида удалена модифицированная сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (SEQ ID NO: 41), и микофенолятмофетила (MMF). Указанные антагонист BLyS и MMF вводят в количестве, которое действует синергетически в отношении снижения уровней иммуноглобулина, а именно антагонист BLyS вводят в дозе 0,25-25 мг/кг, a MMF вводят в дозе 500-1000 мг. При этом указанное млекопитающее имеет регулируемое В-клетками аутоиммунное расстройство, обусловленное антителами, которые направлены против собственных антигенов или тканей млекопитающего. Используемая для снижения уровней иммуноглобулинов композиция включает данный антагонист BLyS и микофенолятмофетил.

Description

Область изобретения

Изобретение касается снижения уровней иммуноглобулина (1дМ, 1дО и 1дА) у млекопитающих используемой при этом композиции, которая включает антагонист ВЬу§ и микофенолятмофетил (ММР) в синергетически эффективном количестве.

Предпосылки создания изобретения

Лимфоциты - одна из нескольких популяций лейкоцитов; они специфично распознают и отвечают на инородный антиген. Три главных класса лимфоцитов: В-лимфоциты (В-клетки), Т-лимфоциты (Тклетки) и природные клетки-киллеры (ΝΚ). В-лимфоциты - клетки, которые отвечают за выработку антител и обеспечивают гуморальный иммунитет. В-клетки созревают в пределах костного мозга и покидают костный мозг, экспрессируя связывающее антиген антитело на клеточной поверхности. Когда наивная В-клетка впервые сталкивается с антигеном, для которого ее мембраносвязанное антитело является специфичным, клетка начинает быстро делиться, и ее потомство дифференцируется на В-клетки памяти и эффекторные клетки, названные плазменными клетками. В-клетки памяти имеют более длинную продолжительность жизни и продолжают экспрессировать мембраносвязанное антитело с той же специфичностью, как оригинальная родительская клетка. Плазменные клетки не вырабатывают мембраносвязанное антитело, но вместо этого производят секретированную форму антитела. Секретированные антитела - главные эффекторные молекулы гуморального иммунитета. Группа рецепторов фактора некроза опухоли (ΤΝΕ), обнаруженных на поверхности В-клеток при различных условиях, принадлежит к клеточным регуляторам функции В-клеток в иммунной системе. В частности, три рецептора ΤΝΕ: трансмембранный активатор и интерактор САМЬ (ТАС1), активатор В-клеток, принадлежащий к рецептору семейства ΤΝΕ (ВАРР-К), и белок созревания клеток В (ВСМА), как известно, связывают один или оба лиганда ΤΝΡ - стимулятор В-лимфоцитов (ВЬу§, также известный как ВАРР, ТАЬЬ-1, ζίηί4 и ΤΗАNΚ) и вызывающий пролиферацию лиганд (АРК1Ь). Определенно ΤΛί'.Ί и ВСМА, как известно, связывают и ВЬу§ и АРК1Ь, а ВАРР-К связывает только ВЬу§.

Был разработан ряд антагонистов ВЬу§ и/или АРК1Ь, чтобы блокировать различные функции ВЬу§, которые включают, кроме прочих, костимуляцию В-клеток, выживание плазмабластов и плазменных клеток, переход класса 1д, увеличение клеточной функции представления В-клеточного антигена, выживание злокачественных В-клеток, развитие функции В-Ι клеток, развитие В-клеток вне стадии Т-Ι и полное формирование зародышевого центра. Некоторые из этих молекул могут также связывать АРК1Б и заблокировать его эффект на В-клетки и другие компоненты иммунной системы (Όίΐΐοη с1 а1. (2006) Ναι. Кеу. Игид Όίδ. 5, 235-246). Молекулы, которые были разработаны для влияния на функцию В-клеток путем препятствования ВЬу§ и/или АРК1Ь связыванию, включают антитела ВЬу§, такие как лимфостат-В (Белимумаб) (Вакег е1 а1, (2003) АйЬгШк КЬеиш, 48, 3253-3265 и АО 02/02641); слитые белки рецептор внеклеточный домен/Рс домен, такие как ТАС1-1д, включая один специфический вариант осуществления, атацицепт (патентная заявка США № 20060034852), ВАРР-К-Рс (АО 05/0000351) и ВСМА-1д или другие слитые белки, использующие рецепторные внеклеточные домены. Дальнейший класс антагонистов ВЬу§ и/или АРК1Ь включает другие молекулы, полагающиеся на связывающую способность ВЬу§ блокировать связывание с его рецепторами, такими как АМО 623, рецепторные антитела и другие молекулы, раскрытые в АО 03/035846 и АО 02/16312.

Текущий подход к лечению аутоиммунных болезней - угнетение нежелательной иммунной реакции. Например, при лечении волчаночного нефрита (ЬЦ), серьезного осложнения, вовлекающего почку пациентов, страдающих от системного волчаночного нефрита (8ЬЕ), имеют доказанную эффективность несколько иммуносупрессивных препаратов. Эти препараты включают циклофосфамид (СУС), азатиоприн (А2А), циклоспорин (С8А), и микофенолятмофетил (ММР) (для общих обзоров см., Мок е1 а1. (2003) Апп КЬеиш Όίδ 62, 799-804 апб 1ассаппо е1 а1. (2007) Аи1о1ттиш1у КеОе\У5 6, 190-195). Хотя эти препараты эффективны, остается потребность в данной области в улучшении ответа на иммунные супрессивные препараты для эффективного лечения аутоиммунной болезни.

Короткое описание изобретения

Одним из аспектов настоящего изобретения является способ снижения уровней 1дМ, 1дО или 1дА у млекопитающих, включающий введение антагониста ВЬу§ и микофенолятмофетила (ММР), причем указанный антагонист ВЬу§ является слитым протеином ТАС1-Рс, включающим последовательность полипептида, представленную в §ЕЦ ГО ЦО: 23, где из указанной последовательности полипептида удалена модифицированная сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (8ЕЦ ГО ЦО: 41), причем антагонист ВЬу§ и указанный ММР вводят в количестве, которое действует синергетически в отношении снижения уровней иммуноглобулина, а именно антагонист ВЬу§ вводят в дозе 0,25-25 мг/кг, а ММР вводят в дозе 500-1000 мг. Причем в предпочтительном варианте антагонист ВЬу§ вводят в дозе 75-150 мг, а микофенолятмофетил (ММР) вводят в дозе 500-750 мг дважды в день или дозе 1000 мг трижды в день.

При этом указанное млекопитающее имеет регулируемую В-клетками аутоиммунную болезнь, обусловленную антителами, которые направлены против собственных антигенов или тканей млекопитающего, а аутоиммунная болезнь представляет собой болезнь, выбранную из группы, состоящей из ювенильного ревматоидного артрита, болезни Вегенера, воспалительной болезни кишечника, идиопатиче- 1 030313

ской тромбоцитопенической пурпуры (ΙΤΡ), тромбической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), аутоиммунной тромбоцитопении, рассеянного склероза, псориаза, нефропатии 1§Л, полиневропатии 1дМ, миастении гравис, васкулита, диабета сахарного, синдрома Рейно, гломерулонефрита, аутоиммунного гепатита и аутоиммунного тироидита.

В предпочтительных вариантах осуществления этого изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой волчаночный нефрит или системный волчаночный эритематоз (8ЬЕ), или синдром Шегрена.

Антагонист ВЬу8 и ММР можно вводить в комбинации со вторым иммуносупрессивным препаратом, выбранным из группы: нестероидные противовоспалительные препараты (Ν8ΑΙΌ) и глюкокортикоид.

Вторым объектом данного изобретения является композиция, включающая антагонист ВЬу8 и микофенолятмофетил (ММР) в эффективном количестве, причем указанный антагонист ВЬу8 содержит слитый протеин ТАС1-Рс, включающий последовательность полипептида, представленную в 8ЕО ГО N0: 23, где из указанной последовательности полипептида была удалена модифицированная сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (8Е0 ГО N0: 41).

Эта композиция применяется для снижения уровня 1дМ, Ι§0 или Ι§Α.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 изображает в виде графика среднее значение (± стандартное отклонение) Ι§0 для четырех групп лечения: носитель, только ММР, только атацицепт и атацицепт с ММР. Все попарные сравнения этих значений были статистически значимыми (р <0,05) с использованием преобразованных в логарифмы данных, кроме носителя в сравнении только с ММР.

Фиг. 2 изображает в виде графика среднее значение (± стандартное отклонение) 1дМ для четырех групп лечения: носитель, только ММР, только атацицепт и атацицепт с ММР. Все попарные сравнения этих значений были статистически значимыми (р <0,05) с использованием преобразованных в логарифмы данных, кроме носителя в сравнении только с ММР.

Фиг. 3 изображает в виде графика среднее значение (± стандартное отклонение) 1дА для четырех групп лечения: носитель, только ММР, только атацицепт, и атацицепт с ММР. Все попарные сравнения этих значений были статистически значимыми (р <0,05) с использованием преобразованных в логарифмы данных, кроме носителя в сравнении только с ММР.

Детальное описание предпочтительных вариантов осуществления

"Аутоиммунная болезнь", описанная авторами, представляет собой доброкачественную болезнь или расстройство, возникающие вследствие выработки антител, которые направлены против собственного антигена и/или ткани пациента.

Используемый авторами термин "истощение В-клеток" касается снижения уровней В-клеток у животного или человека после лечения препаратом или антителом по сравнению с уровнем перед лечением. Уровни В-клеток определяются с помощью известных испытаний, таких как общий анализ крови, окрашивание анализа РАС8 для известных маркеров В-клеток и методами, такими как описано в экспериментальных примерах. Истощение В-клеток может быть частичным или полным. У пациента, получающего препарат, истощающий В-клетки, В-клетки, как правило, истощены на период времени, в течение которого препарат циркулирует в организме пациента, и времени для восстановления В-клеток.

"Иммуносупрессивные препараты" представляют собой любые молекулы, которые взаимодействуют с иммунной системой и притупляют ее ответ на инородные или собственные антигены. Циклофосфамид (СУС) и микофенолятмофетил (ММР) являются двумя такими видами молекул. Этот термин охватывает любой препарат или молекулу, полезную в качестве терапевтического агента в подавляющем регулировании иммунной системы. В частности, это препараты, которые использовались для лечения аутоиммунных болезней, таких как ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, системная красная волчанка (8ЬЕ), волчаночный нефрит (ΕΝ), болезнь Вегенера, воспалительная болезнь кишечника, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ΙΤΡ), тромбическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР), аутоиммунная тромбоцитопения, рассеянный склероз, псориаз, нефропатия Ι§Α, полиневропатии 1дМ, миастения гравис, васкулит, сахарный диабет, синдром Рейно, синдром Шегрена и гломерулонефрит. Несколько испытаний, полезных для тестирования антагонистов ВЬу8, таких как испытание пролиферации В-клеток, описанное в \У0 00/40716 среди остальных, известны специалисту с обычными навыками в данной области. Кратко описывая, человеческие В-клетки отделяют от клеток-мононуклеаров периферической крови с помощью магнитных гранул СГО 19 и магнитной системы разделения УапоМаск (МШсиу1 Вю1сс АиЬиги, СА) согласно инструкциям производителя. Очищенные В-клетки смешивают с растворимым ВЬу8 (25 нг/мл) и рекомбинантным человеческим ГО-4 (РНагпипдсп 10 нг/мл) и клетки наносят на круглодонные 96-лунковые планшеты при 1х10⁵ клеток на лунку. Антагонист ВЬу8, который будет подвергаться испытанию, может быть разведен приблизительно от 5 мкг/мл приблизительно до 6 нг/мл, и инкубируется с В-клетками в течение пяти дней, при пропускании в течение ночи в день четыре с 1 шкС1 ³Н-тимидина на лунку. В качестве контроля антагонист ВЬу8 может также инкубироваться с Вклетками и ГО-4 без ВЬу8. Урожай с планшетов собирают, используя прибор для сбора Раскагб, и подсчитывают, используя ридер Раскагб.

- 2 030313

"Нативная последовательность" полипептида включает полипептид, который имеет ту же аминокислотную последовательность, что и полипептид, полученный из природы. Такие полипептиды нативной последовательности могут быть выделены из природы или могут быть получены рекомбинантным или синтетическим путем. Термин "нативная последовательность" полипептида специфично охватывает природные укороченные, растворимые или секретированные формы (например, последовательность внеклеточного домена), природные вариантные формы (например, альтернативно соединенные сплайсингом формы) и природные аллельные варианты полипептида.

Вообще, "варианты" полипептидов для любого из полипептидов, раскрытых в настоящей спецификации, включают полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавлены или удалены на Ν- и/или С-конце, а также в пределах одного или нескольких внутренних доменов полноразмерной или "нативной последовательности" аминокислотной последовательности. Обычно, вариант полипептида будет иметь по крайней мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 81% идентичность последовательности аминокислоты, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 82% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 83% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 84% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 85% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 86% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 87% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 88% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 89% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 91% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 92% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 93% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 94% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 95% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 96% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 98% идентичность аминокислотной последовательности и все же более предпочтительно по крайней мере приблизительно 99% идентичность аминокислотной последовательности с полипептидом или его указанным фрагментом. Вообще, варианты полипептидов не охватывают нативную последовательность полипептида. Обычно, длина вариантов полипептидов составляет по крайней мере приблизительно 10 аминокислот, часто по крайней мере приблизительно 20 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 30 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 40 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 50 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 60 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 70 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 80 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 90 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 100 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 150 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 200 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 250 аминокислот, чаще по крайней мере приблизительно 300 аминокислот или больше.

Как упомянуто выше, антагонист ВЬу§ может функционировать прямо или косвенно, чтобы частично или полностью заблокировать, ингибироваить или нейтрализовать передачу сигналов ВЬу§, ίη νίίτο или ίη νίνο. Например, антагонист ВЬу§ может непосредственно связывать ВЬу§. Например, прямое связывающее вещество полипептид, включающий внеклеточный домен (ΕΟΌ) рецептора ВЬу§, такого как ТАС1, ВАРР-К и ВСМА.

ВЬу§ связывающий участок рецептора ВЬу§ (например, внеклеточный домен или фрагмент ВАРРК, ВСМА или ТАС1) может быть слит с частью Рс-молекулы иммуноглобулина, чтобы облегчить ее растворимость ίη νίνο. Термин "антитело" авторами используется в самом широком смысле и определенно охватывает, например, моноклональные антитела, поликлональные антитела, антитела с полиэпитопной специфичностью, одноцепочечные антитела и фрагменты антител. Антитела могут быть химерными, гуманизироваными или человеческими или его фрагментом. Альтернативно, антитело может производиться путем иммунизации животного полипептидом этого изобретения.

Используемый авторами термин "моноклональное антитело" предпочтительно касается антитела, полученного из популяции практически гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природно происходящих мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах.

Моноклональные антитела являются очень специфичными будучи направленным против единственного антигенного участка. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлоналыных) антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каж- 3 030313

дое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела выгодны в том, что их можно синтезировать культурой гибридомы, незагрязненными другими иммуноглобулинами. Модификатор "моноклональный" указывает на природу антитела, как получаемого из практически гомогенной популяции антител, и не должен рассматриваться как требование к производству антитела каким-либо специфическим методом. Например, моноклональные антитела могут быть получены методом гибридомы, впервые описанным в КоЫег е! а1., №1игс. 256: 495 (1975), или могут быть получены известными методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4816567). Моноклональные антитела могут также быть выделены из фаговых библиотек антител с помощью методов, описанных в С1аск8оп е! а1., №!иге, 352:624-628 (1991) апй Магкк е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ., 222:58, 1-597(1991), например.

Моноклональные антитела, определенно включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов, или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, пока они демонстрируют желательную биологическую активность (патент США № 4816567; Моткоп е! а1., Ргос. Ν;·ιΙ. Асай. δει., υδΑ, 81:68516855 (1984)). Методы для получения химерных антител известны в данной области. "Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Ρν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело реципиент), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (СОК) реципиента заменены остатками из СОК нечеловеческого вида (антитела донора), такого как мышь, крыса или кролик, имеющего желательную специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасного участка (РК) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаружены в антителе реципиента, ни в импортированном СОК или каркасных последовательностях. Эти модификации сделаны для дальнейшей очистки и максимизации эффективности антитела. Вообще, гуманизированное антитело будет включать практически все из по крайней мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина и все или практически все из РК участков являются таковыми из последовательности человеческого иммуноглобулина, хотя РК участки могут включать одну или несколько аминокислотных замен, которые улучшают связывающую аффинность. Число этих аминокислотных замен в РК типично не больше, чем 6 в цепи Н, а в цепи Ь не больше чем 3. Гуманизированное антитело произвольно также будет включать по крайней мере часть иммуноглобулинового константного участка (Рс), типично из человеческого иммуноглобулина. Для ознакомления с дальнейшими деталями, см. 1опе8 е! а1., №!иге, 321: 522-525 (1986); КеюЬтапп е! а1., Шине, 332: 323-329 (1988); и Рге8!а, Сигг. Ор. δίιυεΐ. Вю1, 2: 593-596 (1992). Гуманизированное антитело включает приматизированное антитело, в котором антиген-связывающий участок антитела получен из антитела, произведенного, например, путем иммунизации обезьян макак рассматриваемым антигеном. Методы для получения гуманизированных антител известны в данной области. Человеческие антитела могут также быть произведены, используя различные методы, известные в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. НоодепЬоот апй ХУпНее 1. Мо1.ВюЬ, 227: 381 (1991); Магкк е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222: 581 (1991). Методы Со1е е! а1. и Воегпег е! а1. также доступны для подготовки человеческих моноклональных антител. Со1е е! а1., Мопос1опа1 АпйЬоФек апй Сапсег ТЬегару, А1ап К. Ь188, р. 77 (1985); Воегпег е! а1., 1. 1ттипо1, 147(1): 86-95 (1991).

"Функциональные фрагменты" связывающих антител изобретения являются фрагментами, которые сохраняют связывание с ВЬлб практически с той же самой аффинностью, как и интактная полноразмерная молекула, из которой они получены, и могут истощать В-клетки, что определяется испытаниями щ νί!ΐΌ или щ νίνΌ, такими как описаны авторами.

"Эффекторные функции" антитела касаются тех биологических активностей, которые относятся к участку Рс (участок Рс нативной последовательности или вариантный участок Рс аминокислотной последовательности) антитела, и меняются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание С1с| и комплементзависимую цитотоксичность; связывание рецептора Рс; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АОСС); фагоцитоз; нисходящее регулирование рецепторов клеточной поверхности (например, рецептор В-клеток); и активация Вклеток. "Антителозависимая клеточно-опосередованная цитотоксичность" или "АОСС" касается формы цитотоксичности, в которой секретированный 1д, связанный с Рс рецепторами (РсКк), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, природных клетках-киллерах (ΝΚ), нейтрофилах и макрофагах) разрешает этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфично связываться с клеткой мишени, несущей антиген, и впоследствии убивать клетку мишень цитотоксинами. Антитела "воо- 4 030313

ружают" цитотоксические клетки и абсолютно необходимы для такого убийства. Первичные клетки для опосредования АЭСС. клетки ΝΚ. экспрессируют только РсуКШ. тогда как моноциты экспрессируют РсуК1. РеуКИ и РсуКШ. Экспрессия Рс на гематопоэтических клетках подытожена в табл. 3 на стр. 464 Кауе1ск апб Кшер Аппи. Кеу. 1ттипо1 9:457-92 (1991). Чтобы оценить активность ЛЭСС молекулы. которая рассматривается. может быть выполнено испытание ЛЭСС ш νίΐτο, такое как описанное в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для такого испытания включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (ΝΚ). Альтернативно или дополнительно. активность ЛЭСС молекулы. которая рассматривается. может быть оцененная ш νίνο, например. на животной модели. такой как описанная в С1упез е1 а1. ΡΝΑδ (υδΑ) 95:652-656 (1998).

"Комплементзависимая цитотоксичность" или "СЭС" касается лизиса клетки мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется путем связывания первого компонента системы комплемента (С1с|) с антителами (соответствующего подкласса). которые связываются с их родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнено испытание СЭС. например. как описано в Оа//апо^ап1ого е1 а1.. ί. 1ттипо1. Мебюбз 202:163 (1996).

"Изолированное" антитело - антитело. которое было идентифицировано и отделено и/или восстановлено из компонента его естественной окружающей среды. Загрязняющие компоненты его естественной окружающей среды представляют собой материалы. которые типично мешали бы диагностическим или терапевтическим использованиям для антитела. и могут включать ферменты. гормоны и другие белковые или небелковые солюты. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до больше чем 95 мас.% антитела. что определяется методом Лоури. и наиболее предпочтительно больше чем 99 мас.%. (2) до степени. достаточной. чтобы получить по крайней мере 15 остатков Νтерминальной или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвенатора с чашкой. которая оборачивается. или (3) до гомогенности с помощью ДСН-ПАГ при невосстанавливающих или восстанавливающих условиях. используя Кумаси голубой или. желательно. окрашивание серебром. Изолированное антитело включает антитело ш зПи в рекомбинантных клетках. так как по крайней мере один компонент естественной окружающей среды антитела не будет присутствовать. Обычно. однако. изолированное антитело будет подготовлено. по крайней мере. с помощью одной стадии очистки. Аминокислоты могут быть сгруппированы согласно общим чертам в свойствах их боковых цепей (в А.Ь. Ьекшпдег. ш ВюскепизЩ. зесопб еб.. рр. 73-75. \Уог1к РиЬкзкегз. №\ν Уогк (1975)): (1) неполярные: А1а (А). Уа1 (V). Ьеи (Ь). Ηΐδ (I). Рго (Р). Рке (Р). Тгр (V). Ме! (М) (2) незаряженные полярные: О1у (О). δе^ (δ). Ткг (Т). Суз (С). Туг (Υ). Азп (Ν). О1п (О) (3) кислотные: Акр (О). 01и (Е) (4) основные: Ьуз (К). Агд (К). Шз (Η-). Альтернативно. природные остатки могут быть разделены на группы на основании общих свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: Норлейцин. Мер А1а. Vа1. Ьеи. Не; (2) нейтральные гидрофильные: Суз. Сер. Ткг. Азп. О1п; (3) кислотные: Азр. О1и; (4) основные: Шз. Ьуз. Агд; (5) остатки. которые влияют на ориентацию цепи: О1у. Рго; (6) ароматические: Тгр. Туг. Рке.

Используемый в пределах этого изобретения термин "консервативная" аминокислотная замена касается аминокислотных замен. которые заменяют функционально эквивалентные аминокислоты. Консервативная замена аминокислоты приводит к тихим изменениям в аминокислотной последовательности получающегося пептида. Например. одна или несколько аминокислот подобной полярности действуют как функциональные эквиваленты и приводят к тихому изменению в пределах аминокислотной последовательности пептида. Вообще. замены в пределах группы можно считать консервативными относительно структуры и функции. Однако квалифицированный специалист признает. что роль конкретного остатка определяется его контекстом в пределах трехмерной структуры молекулы. в которой он встречается. Например. остатки Суз могут встречаться в окисленной (дисульфидной) форме. которая является менее полярной. чем восстановленная (тиольная) форма. Длинная алифатическая часть боковой цепи Агд может составить критическую особенность ее структурной или функциональной роли. и это может быть лучше всего сохранено заменой неполярного. а не другого основного остатка. Кроме того. будет признано. что боковые цепи. содержащие ароматические группы (Тгр. Туг и Рке). могут участвовать в ионноароматическом или "катион-пи" взаимодействии. В этих случаях замена одной из этих боковых цепей членом кислотной или незаряженной полярной группы может быть консервативной относительно структуры и функции. Остатки. такие как Рго. О1у и Суз (дисульфидная форма). могут оказать прямые эффекты на конформацию главной цепи и часто не могут заменяться без структурных искажений.

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" относительно полипептидных последовательностей лиганда или рецептора. идентифицированных авторами. определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате. которые являются идентичными аминокислотным остаткам в такой последовательности лиганда или рецептора. идентифицированной авторами. после выравнивания последовательностей и введения промежутков. в случае необходимости. для достижения максимального процента идентичности последовательности. и не учитывая любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно достичь разными способами. которые находятся в пределах навыков в данной области. например. используя общедоступное программное обеспечение. такое как программное обеспечение В^ΑδТ. В^ΑδТ-2. АМОК АЬ1ОШ2 или Медакдп (^NΑδ- 5 030313

ТАК). Квалифицированные специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по полной длине сравниваемых последовательностей. Однако с этой целью % значение идентичности аминокислотной последовательности получают, как описано ниже, используя компьютерную программу сравнения последовательности ΑΤΙΟΝ-2, причем полный исходный код для программы ΑΣΙΟΝ-2 предоставлен в таблице ниже. Компьютерная программа сравнения последовательности ΑΣΙΟΝ-2 была авторизована СспсШссН. 1пс., и исходный код, показанный в таблице ниже, был представлен с документацией пользователя в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон Ό.Ο, 20559, где она зарегистрирована под номером регистрации авторских прав США ΤΧϋ510087. Программа ΑΤΙΟΝ-2 является общедоступной через ОепеШесй, 1пс., Южный Сан-Франциско, Калифорния или может быть собрана из исходного кода, предоставленного в таблице ниже. Программа ΑΣΙΟΝ-2 должна быть собрана для использования на операционной системе ϋΝΙΧ, преимущественно цифровой υΝΙΧ ν4,0Ό. Все параметры сравнения последовательности устанавливаются программой ΑΤΙΟΝ-2 и не изменяются.

Полезный метод для идентификации определенных остатков или участков в белке, которые являются предпочтительными местоположениями для мутагенеза, называют "аланин-сканирующим мутагенезом", как описано в Сипшпдйат апб ХМеПк 8с1епсе, 244: 1081-1085 (1989). Остаток или группу остатков мишени идентифицируют (например, заряженные остатки, такие как агд, акр, Ык, 1ук и д1и) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином), чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот со связывающей мишенью. Такие положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, затем очищают путем введения дополнительных или других вариантов в или для участков замещения. Таким образом, в то время как участок для введения изменения аминокислотной последовательности предопределен, природа мутации, по существу, не должна быть предопределена. Например, чтобы проанализировать эффективность мутации на данном участке, проводится аланиновое сканирование или случайный мутагенез в кодоне мишени или участке, и проводят скрининг экспрессированных вариантов на желательную активность. Термин "дигедральный угол" касается вращения вокруг связи. См., например, Сге1дй1оп, Т.Е., (1993) Рго1еш: БТгисЩгек апб Мо1еси1аг Ргорегбек, 2 еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк, ΝΥ. Термин "рЫ" представляет собой дигедральный угол, который обозначает вращение вокруг связи Ν-С аминокислоты. См., например, Сге1дЫоп, Т.Е., (1993) Рго1еш: §1гисЩгек апб Мо1еси1аг Ргорегбек, 2 еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, Νον Υо^к, ΝΥ. β-повороты типа Ι описаны в НЩсЫпкоп, Ε.Ο. & ТйогпЩп, ТМ. (1994). Пересмотренный набор потенциалов для формирования β-поворотов в белках. РгоТеш §шепсе 3, 2207-2216.

"Слитый белок" и "слитый полипептид" касаются полипептида, имеющего две части, ковалентно соединенные вместе, где каждая из частей представляет собой полипептид, имеющий различное свойство. Свойство может представлять собой биологическое свойство, такое как активность ш уйго или ш νί\Ό. Свойство может также представлять собой простое химическое или физическое свойство, такое как связывание с молекулой мишени, катализ реакции и т.д. Эти две части могут быть связаны непосредственно единственной пептидной связью или через пептидный линкер, содержащий один или несколько аминокислотных остатков. Вообще, эти две части и линкер будут в рамке считывания друг с другом.

"Конъюгат" касается любой гибридной молекулы, включая слитые белки, а также молекул, которые содержат и аминокислоту или белковые части и небелковые части.

Конъюгаты могут быть синтезированы множеством методов, известных в данной области, включая, например, методы рекомбинантной ДНК, твердофазный синтез, синтез в фазе раствора, методы органического химического синтеза или комбинации этих методов. Выбор синтеза будет зависеть от специфической молекулы, которая будет произведена. Например, гибридная молекула не полностью "белок" по природе может быть синтезирована комбинацией рекомбинантных методов и методов в фазе раствора.

Используемый авторами термин "Рс-слитый белок" определяет подобные антителу молекулы, которые комбинируют связывающую специфичность несоответствующего белка с эффекторными функциями иммуноглобулиновых константных доменов. Структурно, Рс-слитые белки включают аминокислотную последовательность с желательной связывающей специфичностью, которая является отличной от участка распознавания и связывания антигена антитела (то есть является "гетерологичной"), и последовательность иммуноглобулинового константного домена. Молекула Рс-слитого белка типично включает смежную аминокислотную последовательность, включающую, по крайней мере, связывающий участок рецептора или лиганда. Последовательность иммуноглобулинового константного домена в Рс-слитом белке может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как подтипы ^0-1, ^0-2, ^0-3 или ^0-4, ^Α (включая ^Α-1 и ^Α-2), ^Ε, !дО или !дМ. Например, полезные Рс-слитые полипептиды могут включать ВЬу§ связывающие части рецептора ВЬу§ без трансмембранных или цитоплазматических последовательностей рецептора ВЬу§. Внеклеточный домен ΒΑΡΡ-К также может быть слит с константным доменом иммуноглобулиновой последовательности.

Термин "млекопитающее" касается любого животного, классифицированного как млекопитающее,

- 6 030313

включая людей, фермерских и сельскохозяйственных животных, животных зоопарка, животных для спортивных состязаний или домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы, и т.д. Термин "терапевтически эффективное количество" касается количества препарата антитела или антагониста, эффективного для "облегчения" или "лечения" болезни или расстройства у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество препарата может уменьшить число раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (то есть замедлить до некоторой степени и предпочтительно остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлить до некоторой степени и предпочтительно остановить) опухолевые метастазы; ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или снизить до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с раком. В зависимости от степени, до которой препарат может предотвратить рост и/или убить существующие раковые клетки, он может представлять собой цитостатический и/или цитотоксический.

ВЬу§ или антитела рецептора ВЬу§ изобретения могут быть произведены с помощью переходной или устойчивой трансфекции эукариотических клеток хозяев, таких как клетки СНО.

"Носители" при использовании авторами включают фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые нетоксичны для клетки или млекопитающего, которое получает используемые дозировки и концентрации. Часто физиологически приемлемый носитель - водный рН буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; монозы, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ΕΌΤΆ; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; формирующие соль противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные сурфактанты, такие как ТВИН полиэтиленгликоль (ΡΕΟ), и РЬиКО№С8™.

Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева.

Описание ниже касается методов получения таких определенных полипептидов путем культивирования клеток-хозяев, трансформированных или трансфецированных с помощью вектора, содержащего кодирующую нуклеиновую кислоту, и выделения полипептида из клеточной культуры (см., например, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬогайгу Мапиа1 (Иете Уогк: Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, 1989); Э1еГГепЬас11 е! а1., РСК Рптег: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогайгу Ргекк, 1995)).

Нуклеиновая кислота (например, кДНК или геномная ДНК), кодирующая желательный полипептид, может быть вставлена в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии.

Различные векторы являются общедоступными. Векторные компоненты вообще включают, кроме прочего, один или несколько из следующих: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или более генов-маркеров, элемент-усилитель, промотор и последовательность терминации транскрипции, каждый из которых описан ниже. Произвольные сигнальные последовательности, точки начала репликации, гены-маркеры, элементы-усилители и последовательности терминации транскрипции, которые могут использоваться, известны в данной области и описаны в дальнейших деталях в \УО 97/25428.

Векторы экспрессии и клонирования обычно содержат промотор, который распознается организмом хозяина и является оперативно связанным с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты. Промоторы - нетранслированные последовательности, расположенные вверх (5') по отношению к начальному кодону структурного гена (вообще в пределах приблизительно 100-1000 Ьр), которые контролируют транскрипцию и трансляцию специфической последовательности нуклеиновой кислоты, с которой они оперативно связаны. Такие промоторы типично попадают в два класса, индуцибельные и конститутивные. Индуцибельные промоторы - промоторы, которые инициируют увеличение уровней транскрипции ДНК под своим контролем в ответ на некоторое изменение условий культивирования, например присутствие или отсутствие питательного вещества или изменения температуры. На данный момент известно большое количество промоторов, распознаваемых множеством потенциальных клетокхозяев. Эти промоторы оперативно связаны с кодирующей ДНК путем извлечения промотора из исходной ДНК путем расщепления ферментом рестрикции и инсерции изолированной последовательности промотора в вектор.

Для конструирования подходящих векторов, содержащих один или несколько вышеупомянутых компонентов, используют стандартные методы лигирования. Изолированные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, скраивают, лигируют в форме, желаемой для получения требуемых плазмид. Для анализа, чтобы подтвердить, что сконструированы правильные последовательности в плазмидах, лигированные смеси могут быть использованы для трансформации К12 штамма 294 Е. сой (АТСС 31 446), и успешные трансформанты отбираются с помощью резистентности к ампициллину или тетрациклину в зависимости от требования. Из трансформантов получают плазмиды, анализируют путем расщепления эндонуклеазы рестрикции и/или секвенируют, используя стандартные методы, известные в данной области [см., например, Меккшд е! а1., Иис1ею Ас1Й8 Кек., 9: 309 (1981); Махат е! а1., МеШойк ίη

- 7 030313

Еи7уто1о§у, 65: 499 (1980)].

Могут использоваться векторы экспрессии, которые предусматривают переходную экспрессию кодирующей ДНК в клетках млекопитающих. Вообще, переходная экспрессия предполагает использование вектора экспрессии, который может эффективно реплицировать в клетке-хозяине, таким образом, что клетка-хозяин накапливает много копий вектора экспрессии и, в свою очередь, синтезирует высокие уровни желательного полипептида, закодированного вектором экспрессии [§атЬгоок и соавт., выше]. Системы переходной экспрессии, включающие подходящий вектор экспрессии и клетку-хозяин, учитывают удобную идентификацию полипептидов, закодированных клонированными ДНК, а также быстрый скрининг таких полипептидов на желательные биологические или физиологические свойства. Другие методы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для адаптации к синтезу желательного полипептида в рекомбинантной культуре клеток позвоночных, описаны в ОеГЫпд еГ а1., ЫаГиге, 293: 620-625 (1981); МапГе1 еГ а1., ЫаГиге, 281: 40-46 (1979); ЕР 117060 и ЕР 117058.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах включают клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот. Подходящие прокариоты для этой цели включают, кроме прочих, теубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например ЕпГегоЬасГейасеае, такие как ЕксйейсЫа, например Е. сой, ЕпГегоЬаеГег, ЕгМша, К1еЬк1е11а, РгоГеик, 8а1топе11а, например 8а1топе11а ГурЫтигшт, §еггайа, например 8еггайа тагсексапк, и §Ыде11а, а также Васйй, такие как В. киЬййк и В.йсйешГогш18 (например, В.ПсйешГогпик 41Р, описанная в ΌΌ 266710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Ркеиботопак, такие как Р. аегидтока и §ГгерГотусек. Клетка-хозяин должна секретировать минимальное количество протеолитических ферментов.

В дополнение к прокариотам эукариотические микробы, такие как волокнистые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами клонирования или экспрессии для векторов. Подходящие клеткихозяева для экспрессии гликозилированного полипептида получают из многоклеточных организмов. Примеры всех таких клеток-хозяев описаны дополнительно в АО 97/25428. Клетки-хозяева трансфецируют и предпочтительно трансформируют с помощью вышеописанных векторов экспрессии или клонирования и культивируют в питательных средах, модифицированных соответствующим образом для стимулирования индукции промоторов, выбора трансформаторов или амплификации генов, кодирующих желательные последовательности. Трансфекция - это захват вектора экспрессии клеткой-хозяином, не зависимо от того, экспрессируются ли фактически какие-нибудь кодирующие последовательности. Многочисленные методы трансфекции известны обычному квалифицированному специалисту, например, СаРО4 и электропорация.

Трансформация означает введение ДНК в организм таким образом, чтобы ДНК реплицировалась, или в качестве экстрахромосомного элемента или хромосомного компонента. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансфрмацию осуществляют, используя стандартные методы, соответствующие таким клеткам. Кальциевая терапия, использующая хлорид кальция, как описано в §атЬгоок и соавт., выше, или электропорация вообще используются для прокариот или других клеток, которые содержат существенные барьеры клеточных стенок. Инфекция с помощью АдгоЬасГегшт ГитеГашепк используется для трансформации определенных клеток растений, как описано §йате еГ а1., Оепе, 23: 315 (1983) и АО 89/05859, опубликованном 29 июня 1989 г. Кроме того, растения могут быть трансфецированы с использованием ультразвука, как описано в АО 91/00358, опубликованном 10 января 1991 г.

Для клеток млекопитающих без таких клеточных стенок может использоваться метод осаждения фосфатом кальция Огайат апб уап бег ЕЬ, Уйо1оду, 52: 456-457 (1978). Общие аспекты трансформаций системы клеток-хозяев млекопитающих были описаны в патенте США № 4399216. Трансформации в дрожжах типично выполняются согласно методу Уап §ойпдеп еГ а1., 1. ВасГ., 130: 946 (1977) апб Нк1ао еГ а1., Ргос. Νηΐ1. Асаб. 8сг (И8А), 76: 3829 (1979). Однако могут также использоваться другие методы для введения ДНК в клетки, такие как ядерная микроинъекция, электропорация, слияние бактериального протопласта с неповрежденными клетками или поликатионами, например полибреном, полиорнитином. Для ознакомления с различными методами для трансформации клеток млекопитающих, см. Кео\уп еГ а1., МеГйобк щ Еп/уто1оду, 185: 527-537 (1990) апб МапкоигеГ а1., №Гиге, 336: 348-352 (1988). Прокариотические клетки могут культивироваться в подходящих питательных средах, как описано вообще в §атЬгоок и соавт. выше. Примеры коммерчески доступных питательных сред включают Хема Р10 (Сигма), минимальную существенную среду (МЕМ, Сигма), КРМ1-1640 (Сигма) и среду Игла в модификации Дульбекко (ИМЕМ, Сигма). Любые такие среды могут дополняться по мере необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как НЕРЕ8), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяются как неорганические соединения, обычно присутствующие при конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки могут также быть включены в соответствующих концентрациях, которые были бы известны квалифицированным специалистам в данной области. Условия культуры, такие как температура, рН и т.п., или ранее используемые с клеткой-хозяином, отобранной для экспрессии, будут очевидны для обычного квалифицированного специалиста.

- 8 030313

В общем, принципы, протоколы и практические методы для того, чтобы максимизировать производительность клеточных культур млекопитающих, могут быть найдены в Маттайаи Се11 Вю1есЬпо1о§у: А Ргасйса1 Арртоасй, М. ВиЙет, ей. (ЖЬ Рге88, 1991).

Экспрессированные полипептиды могут быть выделены из питательной среды в виде секретированного полипептида, хотя могут также быть выделены из лизатов клетки-хозяина при непосредственной выработке без секреторного сигнала. Если полипептид является связанным с мембраной, он может быть высвобожден из мембраны с использованием подходящего раствора детергента (например, Тритона-Х 100), или его внеклеточный домен может быть высвобожден ферментативным расщеплением.

Когда полипептид произведен в рекомбинантной клетке, имеющей не человеческое происхождение, он не содержит белков или полипептидов человеческого происхождения. Однако обычно необходимо восстановить или очистить полипептид от рекомбинантных клеточных белков или полипептидов, чтобы получить препараты, которые являются практически гомогенными. В качестве первого шага питательная среда или лизат могут центрифугироваться для удаления макрочастиц клеточных остатков. Следующие процедуры являются примерами подходящих процедур очистки: фракционирование на ионообменной колонке; осаждение этанолом; обратнофазная ВЕЖХ; хроматография на кремнеземе или катионобменной смоле, такой как ΌΕΑΕ; хроматофокусирование; δΌδ-РАОЕ; осаждение сульфатом аммония; гельфильтрация с использованием, например, 8ер1айех 0-75; колонки белок А 8ерйато8е для удаления загрязняющих веществ, таких как 1§0.

Фаговый дисплей.

Использование методов фагового дисплея разрешает получить большие библиотеки вариантов белков, которые могут быстро и эффективно сортироваться для тех последовательностей, которые связываются с молекулой мишени с высокой аффинностью. Нуклеиновые кислоты, кодирующие различные полипептиды, сливаются с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вирусной оболочки, такой как белок гена III или белок гена VIII. Были разработаны одновалентные системы фагового дисплея, в которых последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок или полипептид, слита с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. (Ва88, δ., Рто1ет8, 8: 309 (1990); Бо\утап апй ^е118, МеЙюЙ8: А Сотратои 1о МеЙюЙ8 ίη Еи/ушо^ду, 3: 205 (1991)). В одновалентной системе фагового дисплея слитые гены экспрессируются на низких уровнях, и белки гена III дикого типа также экспрессируются таким образом, чтобы сохранилась инфекционность частиц. Методы получения пептидных библиотек и скрининга таких библиотек были раскрыты во многих патентах (например, патенты США №№ 5723286; 5432018; 5580717; 5427908 и 5498530).

Дополнительное руководство по использованию фагового дисплея в контексте настоящего изобретения предоставлено в примерах.

Полипептиды, слитые или конъюгированные с гетерологичными полипептидами. Обычно при получении Рс-слитых белков нуклеиновая кислота, кодирующая связывающий домен, будет слита Стерминально с нуклеиновой кислотой, кодирующей Ν-конец последовательности константного домена иммуноглобулина, однако также возможны Ν-терминальные слияния. Как правило, в таких слияниях закодированный химерный полипептид сохранит, по крайней мере, функционально активный шарнирный, СН2 и СН3 домен константного участка иммуноглобулиновой тяжелой цепи. Слияния также сделаны в С-конце части Рс константного домена или непосредственно Ν-терминально с СН1 тяжелой цепи или соответствующим участком легкой цепи. Точный участок, на котором осуществляется слияние, не важен; известны и могут быть отобраны специфические участки для оптимизации биологической активности, секреции или связывающих характеристик Рс-слитого белка. Последовательность связывающего домена может быть слита с Ν-концом участка Рс иммуноглобулина 01 (4дО1). Возможно слить весь константный участок тяжелой цепи с последовательностью связывающего домена. Однако более предпочтительно в слиянии используется последовательность, начинающаяся в шарнирном участке вверх по отношению к участку папаинового расщепления, который определяет ЦО Рс химически (то есть остаток 216, берущий первый остаток константного участка тяжелой цепи, чтобы стать 114), или аналогичные участки других иммуноглобулинов. Аминокислотная последовательность связывающего домена может тоже сливаться с (а) шарнирным участком и СН2 и СН3 или (Ь) СН1, шарнирным, СН2 и СН3 доменами, тяжелой цепи ЦО.

Для биспецифичных Рс-слитых белков Рс-слитые белки собираются в виде мультимеров, и особенно в виде гетеродимеров или гетеротетрамеров. Вообще, эти собранные иммуноглобулины будут иметь известные структуры единицы. Основная четырехцепочечная структурная единица - форма, в которой существуют ЦО, ЦЭ и ЦЕ. Четырехцепочечная единица повторяется в более высокомолекулярных иммуноглобулинах; ЦМ вообще существует в виде пентамера четырех основных единиц, скрепляемых с помощью дисульфидных связей. Глобулин (дА и иногда глобулин ЦО могут также существовать в мультимерной форме в сыворотке. В случае мультимера каждая из этих четырех единиц может быть одинаковой или различной.

Альтернативно, последовательности Рс могут быть вставлены между последовательностями тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, таким образом, что получается иммуноглобулин, включающий химерную тяжелую цепь. Последовательности Рс слиты с 3'-концом иммуноглобулиновой тяжелой

- 9 030313

цепи в каждом плече иммуноглобулина, или между шарнирным и СН2 доменом, или между СН2 и СН3 доменами. О подобных конструкциях сообщалось в НоодепЬоот е! а1., Мо1. 1ттипо1, 28: 1027-1037 (1991).

Хотя присутствие легкой цепи иммуноглобулина не требуется в Рс-слитых, легкая цепь иммуноглобулина могла бы присутствовать или ковалентно ассоциированной со связывающим доменом иммуноглобулиновой тяжелой цепи слитого полипептида, или непосредственно слитой со связывающим участком. В первом случае ДНК, кодирующая легкую цепь иммуноглобулина, типично ко-экспрессируется с ДНК, кодирующей связывающий домен иммуноглобулиновой тяжелой цепи слитого белка. При секреции гибридная тяжелая цепь и легкая цепь будут ковалентно связаны, чтобы обеспечить подобную иммуноглобулину структуру, включающую две дисульфидно-связанные пары тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина. Методы, подходящие для получения таких структур, например, раскрыты в патенте США № 4816567, опубликованном 28 марта 1989 г.

Рс-слитые белки наиболее удобно конструируются путем слияния последовательности кДНК, кодирующей часть связывающего домена в рамке, с последовательностью кДНК иммуноглобулина. Однако может также использоваться слияние с геномными фрагментами иммуноглобулина (см., например, АгиГТо е! а1., Се11, 61: 1303-1313 (1990); апб 81атепкоую е! а1., Се11., 66: 1133-1144 (1991)). Последний тип слияния требует присутствия регулирующих последовательностей 1д для экспрессии. кДНК, кодирующие константные участки тяжелой цепи 1д0, может быть изолирована на основании опубликованных последовательностей из библиотек кДНК, полученных из лимфоцитов селезенки или периферической крови с помощью методов гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР). кДНК, кодирующие связывающий домен и иммуноглобулиновые части Рс-слитого белка, вставляются в тандеме в вектор плазмиды, который направляет эффективную экспрессию в выбранных клетках-хозяевах.

"Лейциновый зиппер" представляет собой термин в данной области, используемый для обозначения богатой лейцином последовательности, которая увеличивает, содействует или ведет димеризацию или тримеризацию своего слитого партнера (например, последовательность или молекула, с которой слит или связан лейциновый зиппер). Различные лейциновые зипперные полипептиды были описаны в данной области. См., например, ЬапбксЬик е! а1., 8с1епсе, 240: 1759 (1988); И8 Ра!еп! 5,716,805; АО 94/10308; Норре е! а1., РЕВ8 Ьейегк, 344: 1991 (1994); Машайк е! а1., №йиге. 341: 24 (1989). Полипептиды настоящего изобретения могут также быть модифицированы таким образом, чтобы сформировать химерные молекулы путем слияния полипептида с другой гетерологичной полипептидной или аминокислотной последовательностью.

Такой гетерологичной полипептидной или аминокислотной последовательностью является последовательность, которая действует для олигомеризации химерной молекулы.

Присутствие эпитопных концевых форм полипептида может быть обнаружено с помощью антитела против концевого полипептида. Кроме того, обеспечение эпитопа на свободном конце позволяет полипептиду быть легко очищенным с помощью аффинной очистки, используя концевое антитело или другой тип матрицы аффинности, которая связывает эпитопный конец. Различные концевые полипептиды и их соответствующие антитела известны в данной области. Примеры включают полигистидиновые (полиΗΐδ) или поли-гистидин-глициновые (поли-Шк-Ду) свободные концы; йи НА концевой полипептид и его антитело 12СА5 [Р1е1б е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 8:2159-2165 (1988)]; с-тус !а§ и 8Р9, 3С7, 6Е10, 04, В7 и 9Е10 антитела к нему [Еуап е! а1., Мо1еси1аг апб Се11и1аг Вю1о§у, 5:3610-3616 (1985)]; и !ад гликопротеина Ό вируса герпеса простого (§Ц) и его антитело [РаЬогкку е! а1., Рто!еш Епдшеетшд, 3(6):547-553 (1990)]. Другие концевые полипептиды включают Р1ад-пептид [Норр е! а1., ВюТесйпо1о§у, 6:1204-1210 (1988)]; пептид эпитопа КТ3 [Матйп е! а1., 8с1епсе, 255:192-194 (1992)]; пептид α-тубулинового эпитопа [Зкшпет е! а1., 1. Вю1. Сйет., 266:15163-15166 (1991)]; и !ад пептида белка 10 гена Т7 [ЕиЦ-РтеуегтиШ е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8οΐ. И8А, 87:6393-6397 (1990)].

Конструкция конъюгатов полимер-пептид.

Конъюгат полимера (например, ПЭГилирование) синтетических пептидов состоит из комбинирования через формирование конъюгатной связи в растворе пептида и ПЭГ-остатка, каждый из которых содержит специальные функциональные возможности, которые являются взаимно реактивными друг к другу. Пептиды могут быть легко подготовлены с помощью обычного твердофазного синтеза. Пептиды "предактивируют" с помощью соответствующей функциональной группы в определенном участке. Прекурсоры очищают и полностью характеризуют до реакции с ПЭГ-остатком. Лигация пептида с ПЭГ обычно имеет место в водной фазе и может быть легко мониторирована обратнофазной аналитической ВЭЖХ. ПЭГилированные пептиды могут быть легко очищены препаративной ВЭЖХ и охарактеризованы аналитической ВЭЖХ, аминокислотным анализом и лазерной десорбционной масс-спектрометрией.

Пептид ковалентно связывают через один или несколько аминокислотных остатков пептида с терминальной реактивной группой на полимере в зависимости, главным образом, от условий реакции, молекулярной массы полимера и т. д. Полимер с реактивной группой(ами) определяется авторами как активированный полимер. Реактивная группа выборочно реагирует со свободными амино или другими реактивными группами на пептиде. Потенциальные реактивные участки включают: Ν-терминальную аминогруппу, эпсилон аминогруппы на остатках лизина, а также другие амино, имино, карбоксил, сульфгид- 10 030313

рил, гидроксил и другие гидрофильные группы. Однако будет подразумеваться, что тип и количество выбранной реактивной группы, а также тип используемого полимера для получения оптимальных результатов будут зависеть от используемого специфического пептида, чтобы избежать реакции реактивной группы со слишком многими особенно активными группами на пептиде. Реактивный остаток (например, лизин (К), модифицированная, неприродная аминокислота или другая малая молекула) может быть замещен в положении, подходящем для конъюгации.

В то время как конъюгация может произойти в любой реактивной аминокислоте на полипептиде, реактивная аминокислота лизин, который связан с реактивной группой активированного полимера через его свободную эпсилон-аминогруппу, или глутаминовая кислота или аспартамовая кислота, которая связана с полимером через амидную связь. Иногда реактивные аминокислоты пептида не представляют собой остатки цистеина в положениях Х2 и Χΐζ. Степень конъюгации полимера с каждым пептидом будет изменяться в зависимости от числа реактивных участков на пептиде, молекулярной массы, гидрофильности и других характеристик полимера, и выбранных специфических участков дериватизации пептида. Конъюгат может иметь конечное молярное соотношение 1-10 молекул полимера на молекулу пептида, но также рассматриваются большие количества молекул полимера, присоединенных к пептидам изобретения. Иногда каждый конъюгат содержит одну молекулу полимера. Желательное количество дериватизации легко достигается при использовании экспериментальной матрицы, в которой время, температура и другие условия реакции изменяются, чтобы изменить степень замещения, после которой уровень замещения полимера конъюгатов определяется эксклюзивной хроматографией или другими средствами, известными в данной области.

Полимер также может содержать только единственную группу, которая является реактивной. Это помогает избежать поперечного сшивания молекул белка. Однако в пределах этой области максимизировать условия реакции уменьшить поперечное сшивание или очистить продукты реакции с помощью гельфильтрации или ионообменной хроматографии, чтобы выделить практически гомогенные производные. Полимер также может содержать две или больше реактивных групп с целью соединения многих пептидов с основой полимера.

Снова могут использоваться гель-фильтрация или ионообменная хроматография, чтобы выделить желательное производное в практически гомогенной форме. Часто полимер ковалентно связан непосредственно с пептидом без использования многофункционального (обычно бифункционального агента) агента для поперечного сшивания. В некоторых вариантах осуществления существует 1:1 молярное соотношение ПЭГ цепи к пептиду.

Реакция ковалентной модификации может происходить с помощью любого соответствующего метода, вообще используемого для реакции биологически активных материалов с инертными полимерами, предпочтительно приблизительно при рН 5-9, более предпочтительно 7-9, если реактивные группы на пептиде - лизиновые группы. Вообще, процесс вовлекает подготовку активированного полимера (полимер, типично имеющий по крайней мере одну терминальную гидроксильную группу, которая активируется) путем получения активного субстрата из этого полимера и после этого путем реакции пептида с активным субстратом, чтобы произвести пептид, подходящий для формулировки. Вышеупомянутая реакция модификации может быть выполнена несколькими методами, которые могут включать одну или более стадий. Примеры модифицирующих веществ, которые могут использоваться, чтобы произвести активированный полимер в реакции с одной стадией, включают хлорид циануроновой кислоты (2,4,6трихлор-8-триазин) и фторид циануроновой кислоты.

Иногда реакция модификации происходит в двух стадиях, причем полимер реагирует сначала с кислотным ангидридом, таким как янтарный или глутаровый ангидрид, чтобы сформировать карбоновую кислоту, а карбоксильная кислота затем реагирует с соединением, способным к реакции с карбоновой кислотой, чтобы сформировать активированный полимер с реактивной эфирной группой, которая способна к реакции с пептидом. Примеры таких соединений включают Ν-гидроксисукцинимид, 4-гидрокси3- нитробензолсульфоновую кислоту и т.п. и предпочтительно используются Ν-гидроксисукцинимид или

4- гидрокси-3-нитробензолсульфоновая кислота. Например, монометилзамещенный ПЭГ может реагировать при повышенных температурах, предпочтительно приблизительно 100-110°С в течение четырех часов, с глутаровым ангидридом. Таким образом, произведенная монометил ПЭГ-глутаровая кислота затем реагирует с Ν-гидроксисукцинимидом в присутствии карбодиимидного реактива, такого как дициклогексил или изопропилкарбодиимид, чтобы получить активированный полимер, метоксиполиэтиленгликолил-^сукцинимидилглутарат, который может затем реагировать с ОН. Этот метод описан подробно в ЛЬис1ю\У5к1 с1 а1., Сапсег ВюсНет. Вюрку8., 7: 175-186 (1984). В другом примере монометилзамещенный ПЭГ может реагировать с глутаровым ангидридом, что сопровождается реакцией с 4гидрокси-3-нитробензолсульфоновой кислотой (ΗΝ8Ά) в присутствии дициклогексилкарбодиимида, чтобы получить активированный полимер. ΗΝ8Ά описывается ВЬаЛадат е1 а1., Рерййек: 8упЛе81881тис1иге-Рипс-йоп. Ргосеейшдз οί Не ЗеуепЛ Лтепсап Рерййе 8утро8шт, КтсЬ е1 а1. (еЙ8.) (Р1егсе СНеписа1 Со., Росккотй11Т, 1981), р. 97-100, апй ίη ШесО е1 а1., НфН-ТесНпокду РоШе ΐο У1ги8 Уассше8 (Лтепсап 8оае1у кот МютоЪю1оду: 1986) под названием "№уе1 ЛдеШ кот Соирйпд ЗутНеОс Рерййе8 Ю Сатег8 апй Ιΐ8 ЛррПсаОощ".

- 11 030313

Ковалентное связывание с аминогруппами достигается известными химическими реакциями, основанными на хлориде циануроновой кислоты, карбонилдиимидазоле, альдегидных реактивных группах (ПЭГ алкоксид плюс диэтилацеталь бромацетальдегида; ПЭГ плюс диметилсульфоксид и уксусный ангидрид или хлорид ПЭГ плюс феноксид 4-гидроксибензальдегида, активированные сукцинимидиловые эфиры, активированный дитиокарбонат ПЭГ, 2,4,5-трихлорфенилклороформат или Р-нитрофенилклороформат активизированный ПЭГ. Карбоксильные группы дериватизируются путем спаривания ПЭГ-амина, используя карбодиимид. Сульфгидрильные группы дериватизируются путем спаривания с малеимидзамещенным ПЭГ (например, алкокси-ПЭГ-амин плюс сульфосукцинимидил 4-(Νмалеимидметил)циклогексан-1-карбоксилат), как описано в АО 97/10847, опубликованном 27 марта 1997 г., или ПЭГ-малеимид, коммерчески доступный у №к!аг ТссНпо1од1С5. §аи Саг1о8, СА (Гогтсг1у 5>Нсаг\уа1сг Ро1утег8, 1пс. (прежде 5>Нсаг\уа1сг Ро1утег8, 1пс). Альтернативно, свободные аминогруппы на пептиде (например, эпсилон-аминогруппы на остатках лизина), могут быть соединены с Νгидроксисукцинимидил замещенным ПЭГ (ПЭГ-ΝΗδ, доступный у №к!аг ТесНпо1од1С5) или могут быть тиолированы с помощью 2-имино-тиолана (реактив Траута) и затем соединены с малеимидсодержащими производными ПЭГ, как описано в Реб1еу е1 а1., Вг. 1. Сапсег, 70: 1126-1130 (1994). Много инертных полимеров, включая, кроме прочих, ПЭГ, являются подходящими для использования в фармацевтических препаратах. См., например, Эауш е1 а1., ВютеФса1 Ро1утег§: Ро1утепс МаЮпаЕ апб РНагтасеиОсаЕ Гог Вютебюа1 Ике, рр. 441-451 (1980). Возможно применение небелкового полимера. Небелковый полимер типично гидрофильный синтетический полимер, то есть полимер, который иначе не встречается в природе. Однако полимеры, которые существуют в природе и произведены рекомбинантным методом или ш νΐΐΐΌ, также полезны, как полимеры, которые изолированы из природных источников. Гидрофильные поливиниловые полимеры находятся в пределах области этого изобретения, например поливиниловый спирт и поливинилпирролидон. Особенно полезны полиалкиленовые эфиры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); полиоксиалкилены, такие как полиоксиэтилен, полиоксипропилен и блок-сополимеры полиоксиэтилен и полиоксипропилен (Р1игошс8); полиметакрилаты; карбомеры; разветвленные или не разветвленные полисахариды, которые включают сахаридные мономеры Ό-маннозы, Ό- и Ь-галактозы, фукозы, фруктозы, Ό-ксилозы, Ь-арабинозы, Ό-глюкуроновой кислоты, сиаловая кислота, Όгалактуроновая кислота, Ό-маннуроновая кислота (например, полиманнуроновая кислота или альгиновая кислота), Ό-глюкозамин, Ό-галактозамин, Ό-глюкоза и нейраминовая кислота, включая гомополисахариды и гетерополисахариды, такие как лактоза, амилопектин, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, амилоза, декстрансульфат, декстран, декстрины, гликоген, или полисахаридная подединица кислотных мукополисахаридов, например гиалуроновая кислота; полимеры сахарных спиртов, таких как полисорбитол и полиманнит; гепарин или гепарон. Полимер до конъюгации не должен быть, но предпочтительно является, растворимым в воде, но конечный конъюгат предпочтительно растворим в воде. Предпочтительно конъюгат демонстрирует растворимость в воде, составляющую по крайней мере приблизительно 0,01 мг/мл и более предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,1 мг/мл, все еще более предпочтительно по крайней мере приблизительно 1 мг/мл. Кроме того, полимер не должен быть высокоиммуногенным в конъюгированной форме, и при этом он не должно обладать вязкостью, которая несовместима с внутривенной инфузией, инъекцией или ингаляцией, если конъюгат предназначен для введения такими путями.

Молекулярная масса полимера может составлять приблизительно до 100000 Ό, предпочтительно составляет по крайней мере приблизительно 500 Ό, или по крайней мере приблизительно 1000 Ό, или по крайней мере приблизительно 5000 Ό. В некоторых вариантах осуществления, ПЭГ или другой полимер имеет молекулярную массу в диапазоне 5000-20000 Ό. Выбранная молекулярная масса может зависеть от эффективного размера конъюгата, который будет достигнут, природы (например, структуры, такой как линейная или разветвленная) полимера, и степени дериватизации, то есть числа молекул полимера на пептид, и участка присоединения полимера или участков на пептиде. Также ПЭГ может использоваться, чтобы вызвать большое увеличение эффективного размера пептидов. ПЭГ или другой полимерный конъюгат может быть использован, чтобы увеличить период полувыведения, увеличить растворимость, чтобы стабилизировать против протеолитического нападения и снизить иммуногенность.

Функционализированные ПЭГ-полимеры, чтобы модифицировать пептиды доступны у №к!аг ТесЬпо1од1е8 оГ §ап Саг1о8, СА (прежде 5>Неаг\уа1ег Ро1утег8, 1пс.). Такие коммерчески доступные производные ПЭГ включают, кроме прочих, амино-ПЭГ, ПЭГ-аминокислотные эфиры. Химия ПЭГ-Νгидроксисукцинамида (ΝΗδ), ПЭГ-гидразид, ПЭГ -тиол, ПЭГ-сукцинат, карбоксиметилированный ПЭГ, ПЭГ-пропионовая кислота, ПЭГ-аминокислоты, ПЭГ-сукцинимидилсукцинат, ПЭГ-сукцинимидилпропионат, сукцинимидиловый эфир карбоксиметилированного ПЭГ, сукцинимидилкарбонат ПЭГ, сукцинимидиловые эфиры аминокислотных ПЭГ, ПЭГ-оксикарбонилимидазол, ПЭГ-нитрофенилкарбонат, ПЭГ-тресилат, ПЭГ-глицидиловый эфир, ПЭГ-альдегид, ПЭГ-винилсульфон, ПЭГ-малеимид, ПЭГортопиридил-дисульфид, гетерофункциональные ПЭГ, ПЭГ-винилпроизводные, ПЭГ-силаны и ПЭГфосфолиды. Условия реакции для спаривания эти ПЭГ-производных изменяются в зависимости от белка, желательной степени ПЭГилирования и используемого производного ПЭГ. Некоторые факторы, вовлеченные в выбор ПЭГ-производных, включают желательную точку присоединения (такую как лизиновые или цистеиновые К-группы), гидролитическую стабильность и реактивность производных, стабильность,

- 12 030313

токсичность и антигенность связывания, пригодности для анализа и т.д. Определенные инструкции для использования любого специфического производного доступны от производителя.

Конъюгаты могут быть охарактеризованы δΌδ-ΡΑΟΕ, гель-фильтрацией, ЯМР, трипсиновым меппингом, жидкостной хроматографией-массовой спектрофотометрией и биологическими испытаниями ίη νίίτο. Например, степень конъюгации ПЭГ может быть показана δΌδ-ΡΛΟΕ и гель-фильтрацией и затем проанализирована ЯМР, у которого есть определенный пик резонанса для метиленводородов ПЭГ. Число групп ПЭГ на каждой молекуле может быть вычислено из спектра ЯМР или масс-спектрометрии. Полиакриламидный гель-электрофорез в 10% δΌδ соответственно проводят в 10 мМ Трис-НС1 рН 8,0, 100 мМ ЫаС1 как буфер элюирования. Чтобы продемонстрировать, какой остаток ПЭГилированный, может быть выполнен трипсиновый меппинг. Таким образом, ПЭГилированные пептиды расщепляются с помощью трипсина в соотношении белок/фермент от 100 до 1 в мг при 37°С в течение 4 ч в 100 мМ ацетате натрия, 10 мМ Тт18-НС1, 1 мМ хлориде кальция, рН 8,3 и подкисляются до рН <4, чтобы остановить расщепление перед разделением на ВЭЖХ №с1ео8Й С-18 (4,6 мм, 150 мм, 5 μ, 100 А). Хроматограмма сравнивается с таковой для не-ПЭГилированного исходного материала. Каждый пик может затем быть проанализирован масс-спектрометрией, чтобы проверить размер фрагмента в пике. Фрагмент(ы), который нес группы ПЭГ, обычно не сохраняется на колонке ВЭЖХ после инъекции и исчезает из хроматографа. Такое исчезновение из хроматографа - признак ПЭГилирования на этом специфическом фрагменте, который должен содержать по крайней мере один остаток лизина. ПЭГилированные пептиды могут затем быть оценены на способность связываться с ВЬу8 обычными методами. Конъюгаты очищаются ионообменной хроматографией (например, ионообменной ВЭЖХ). Химия многих электрофильно активированных ПЭГ приводит к снижению заряда аминогруппы ПЭГилированного продукта. Таким образом, ионообменная хроматография с высокой разрешающей способностью может использоваться, чтобы отделить свободные и конъюгированные белки, и к выделению веществ с различными уровнями ПЭГилирования.

Фактически, разделение различных веществ (например, содержащие один или два остатка ПЭГ), также возможно из-за различия ионных свойств нереагировавших аминокислот. Вещества с различными уровнями ПЭГилирования разделяются согласно методам, описанным в XVО 96/34015 (международная заявка № РСТ/υδ 96/05550, опубликованная 31 октября 1996 г.). Гетерологичные виды конъюгатов очищаются друг от друга таким же самым способом.

ΡΕΟ-Ν-гидроксисукцинамид (ЫН8) реагирует с первичным амином (например, лизины и Ν-конец). ПЭГ-ΝΉδ реагирует с С-терминальным лизином (К) полипептида. Остаток лизина добавляется к Сконцу 17-тег полипептида, Χί замещается лизином. Полимер может реагировать с Ν-концом. Конъюгат получают, используя методы очистки и дериватизации, описанные в примерах ниже.

ВЬу8 или рецептор ВЬу8, который будет использоваться для производства или скрининга антител, могут, например, представлять собой растворимую форму антигена или его часть, содержащие желательный эпитоп. Как описано выше, известны последовательность ВЬу8 и последовательность рецепторов ВЬу8, а также связи различных доменов этих полипептидов. Пептидные фрагменты внеклеточного домена (Εί','Ό) могут использоваться в качестве иммуногенов. На основании этих известных проектов последовательностей и доменов специалист с навыками в данной области может экспрессировать полипептиды и их фрагменты ВЬу8 или рецепторов ВЬу8 для использования, чтобы получить антитела.

Чтобы получить антитела к ВЬу8 или его рецепторам, полноразмерные полипептиды или пептидные фрагменты из 6 или больше остатков длиной могут использоваться в качестве иммуногенов, чтобы вызвать образование антител в грызунов, включая мышей, хомяков и крыс, у кроликов, козы или другого подходящего животного. Полипептид или их иммуногенные фрагменты растворимого ВЬу8 или рецептора ВЬу8 могут экспрессироваться в подходящих клетках-хозяевах, таких как бактерии или эукариотические клетки. Человеческий и мышиный полноразмерный ВЬу8 продуцируются в Е. сой и используются для иммунизации и скрининга на гибридомы, продуцирующие антитела ВЬу8.

Альтернативно или дополнительно, В-клетки или клеточные линии, экспрессирующие ВЬу8 или рецепторы ВЬу8 на их клеточной поверхности, могут использоваться для того, чтобы получать и/или отбирать антитела. Другие формы ВЬу8, полезные для производства антител, очевидны для квалифицированных специалистов в данной области, такие как методология фагового дисплея, могут также использоваться для производства ВЬу8 связывающего антитела. Антитела, которые связывают ВЬу8 или рецепторы ВЬу8, могут быть химерными, гуманизированными или человеческими. Такие антитела и методы их производства описаны более подробно ниже. Поликлональные антитела предпочтительно образуются у животных с помощью нескольких подкожных (вс) или интраперитонеальних (ίρ) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может быть полезным конъюгировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным в видах, которые будут иммунизированы, например гемоцианин фиссуреля, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор соевого трипсина, используя бифункциональный или дериватизирующий агент, например малеимидобензоилсульфосукцинимидный эфир (конъюгация через цистеиновые остатки), Ν-гидроксисукцинимид (через лизиновые остатки), глутаральдегид, янтарный ангидрид, 8ОС.'Е. или Κ.1Ν^=ΝΚ, где К. и К.1 - разные алкильные группы.

Животные иммунизируются против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем

- 13 030313

комбинации, например, 100 теи или 5 г белка или конъюгата (для кроликов или мышей соответственно) с 3 об. полного адъюванта Фрейнда и введения раствора интрадермально во многие участки. Через один месяц животным опять вводят от 1/5 до 1/10 начального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда подкожной инъекцией во многие участки. Через 7-14 дней у животных отбирают кровь и оценивают титр антител в сыворотке. Животных продолжают иммунизировать до достижения плато титра. Предпочтительно животному вводят конъюгат того же антигена, но конъюгированый с разным белком и/или через разный сшивающий реактив. Конъюгаты также могут быть получены в рекомбинантной клеточной культуре в виде слитых белков. Кроме того, агрегирующие агенты, такие как квасцы, используются соответственно, чтобы увеличить иммунный ответ. Моноклональные антитела получают из популяции практически гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Таким образом, модификатор "моноклональный" указывает на природу антитела, как не являющееся смесью дискретных антител.

Например, моноклональные антитела могут быть сделаны, используя метод гибридомы, впервые описанный КоЫег с1 а1., Ыа1иге, 256:495 (1975), или могут быть получены рекомбинантными методами ДНК (патент США № 4816567). В методе гибридомы мышь или другое соответствующее животноехозяин, такое как хомяк, иммунизируют, как выше описано, для выявления лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфически связываются с белком, который используется для иммунизации.

Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы ίη νίΐτο. После этого лимфоциты сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, для формирования клеток гибридомы (Оойшд, Мопос1опа1 АпйЬой1е8: Рйпар1е8 апй Ргасйсе, рр. 59-103 (Асайетю Рге88, 1986)).

Клетки гибридомы, полученные таким способом, высевают и выращивают в подходящей питательной среде, которая типично содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не имеют фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (НОРКТ или НРКТ), питательная среда для гибридом будет типично включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), эти вещества предотвращают рост НОРКТ-дефицитных клеток.

Предпочтительные клетки миеломы - те, которые сливаются эффективно, поддерживают стойкое производство высокого уровня антитела отобранными продуцирующими антитело клетками, и чувствительны к среде, такой как НАТ среда.

Среди них, оптимальные клеточные линии миеломы представляют собой мышиные линии миеломы, такие как полученные из МОРС-21 и МРС-11 мышиных опухолей, доступных от Центра 8а1к 1п8111и1е Се11 Л18йтЬийоп Се Шег. Сан-Диего, Калифорния, США, и 8Р-2 или Х63-Ад8-653-клеток, доступных из Американской коллекции типичных культур, КосЫНе, Мериленд, США. Человеческие миеломные и мышиные-человеческие гетеромиеломные клеточные линии также были описаны для производства человеческих моноклональных антител (КогЬог, 1. 1ттипо1., 133:3001 (1984); Вгойеиг е1 а1., Мопос1опа1 АпйЬойу Ргойисйоп ТесНп!цие8 апй Аррйсайоп8, ст. 51-63 (Магсе1 Леккег, 1пс., №\ν Уогк, 1987)).

Питательную среду, в которой растут клетки гибридомы, оценивают на производство моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно связывающая специфичность моноклональных антител, которые продуцируются клетками гибридомы, может быть определена иммунопреципитацией или испытанием на связывание ш νίΐΐΌ, таким как радиоиммунологичное испытание (К1А) или испытание твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А). Связывающая аффинность моноклонального антитела может, например, быть определена анализом Скетчард из Мип8оп апй Ро11агй, Апа1. Вюсйет., 107:220 (1980). После идентификации клеток гибридомы, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы с помощью процедур ограничивающего разведения и выращены стандартными методами (Оойшд, Мопос1опа1 АпйЬой1е8: Ргшс1р1е8 апй Ргасйсе, рр. 59-103 (Асайетю Рге88, 1986)). Подходящие питательные среды для этой цели включают, например, среду Л-МЕМ или КРМ1-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут выращиваться ш νί\Ό как асциты опухолей у животного.

Моноклональные антитела, которые секретируются субклонами, соответственно отделяются от питательной среды, жидкости асцита или сыворотки в соответствии с обычными процедурами очистки иммуноглобулина, такими как, например, белок А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, гельэлектрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК, которая кодирует моноклональные антитела, может быть легко изолирована и секвенована с помощью обычных процедур (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые имеют способность к специфическому связыванию с генами, которые кодируют тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы служат в качестве оптимального источника такой ДНК. После изоляции ДНК может быть заключена в векторы экспрессии, которые потом трансфецируются в клетки-хозяин, такие как клетки Е. сой, клетки СО8, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные

- 14 030313

статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают §кетга е! а1., Сигг. Θρίηίοη ίη 1ттипо1., 5: 256-262 (1993) апй ИиекШии, 1ттипо1 Кеу8., 130: 151-188(1992).

Антитела или фрагменты антител могут также быть выделены из библиотек фаговых антител с помощью методов, описанных в МсСайейу е! а1., №Чиге. 348:552-554(1990).

С1аск8ои е! а1., №1иге. 352:624-628 (1991) и Магкк е! а1., 1. Мо1. Βίο1., 222:581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител соответственно, используя библиотеки фагов. Следующие публикации описывают получение высокоаффинных (нМ диапазон) человеческих антител перетасовкам цепи (Магкк е! а1., Вю/ТесЬио1оду, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторного инфицирования и рекомбинации ίη У1уо как стратегию для конструирования очень больших библиотек фагов (Аа!егЬои8е е! а1., Ыис. Аайк. Кек., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы являются альтернативами традиционным гибридомным методам моноклональных антител для изоляции моноклональных антител.

ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности на человеческие тяжело- и легкоцепочечные константные домены вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США № 4816567; Мошкой, е! а1., Ргос. Ыа!1 Асай. δα. υδΑ, 81:6851 (1984)), или путем ковалентного соединения с иммуноглобулиновой кодирующей последовательностью всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида.

Типично, такие неиммуноглобулиновые полипептиды замещают на константные домены антитела, или они замещаются на вариабельные домены одного антиген-комбинирующего участка антитела для создания химерного бивалентного антитела, которое включает один антиген-комбинирующий участок, имеющий специфичность к антигену, и другой антиген-комбинирующий участок, имеющий специфичность к другому антигену.

Методы для гуманизации нечеловеческих антител были описаны в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который является нечеловеческим. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто отмечаются как "импортированные" остатки, которые типично берутся из "импортированного" вариабельного домена. Гуманизация может быть в сущности выполнена по методу АиНег и соавторов Оонек е! а1., №Чиге. 321:522-525 (1986); К^есЬтаии е! а1., №1иге. 332:323-327 (1988); УегНоеуен е! а1., δ^ι^. 239:1534-1536 (1988)), путем замены последовательностей гипервариабельного участка на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), в которых существенно меньший чем интактный человеческий вариабельный домен замещен соответствующей последовательностью от нечеловеческого вида.

Практически, гуманизированные антитела типично являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка и возможно некоторые РК остатки замещены остатками от аналогичных участков в антителах грызунов.

Выбор человеческих вариабельных доменов, легких и тяжелых, для использования в создании гуманизированных антител является очень важным для уменьшения антигенности. Согласно так называемому методу "Ъе8!-й!", последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют против всей библиотеки известных человеческих последовательностей вариабельного домена. Человеческая последовательность, которая является ближайшей к последовательности грызуна, принимается в качестве человеческого каркасного участка (РК) для гуманизированного антитела (δίιηδ е! а1., 1. ([тти^^ 151:2296 (1993); Сйо!Ыа е! а1., 1. Мо1. Вю1., 196:901 (1987)). Другой метод использует определенный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же каркас может использоваться для нескольких разных гуманизированных антител (Сайег е! а1., Ргос. №ιΐ1. Асай. δα. υδΑ, 89:4285(1992); Ргек!ае!а1., 1. 1ттиο1., 151:2623(1993)). Далее важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Чтобы достичь этой цели, в соответствии с оптимальным методом гуманизированные антитела получают процессом анализа родительских последовательностей и разных концептуальных гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина обычно доступны и знакомы квалифицированным специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Обзор этих дисплеев позволяет делать анализ вероятной роли остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательности-кандидата, то есть анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связывать его антиген. Таким образом, РК-остатки могут быть отобраны и объединены от реципиентной и импортной последовательностей таким образом, чтобы была достигнута желаемая характеристика антитела, такая как увеличенная аффинность к антигену(ам) мишени. Вообще, остатки гипервариабельного участка прямо и наиболее существенно вовлечены во влияние на связывание антигена. Альтернативно гуманизации, человеческие антитела могут быть произведены. Например, теперь возможно получить трансгенных животных (например, мышей), которые являются способными, после иммунизации, продуцировать полный спектр человеческих антител при отсутствии выработки эндогенного

- 15 030313

иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена тяжелоцепочечного присоединяющего участка антитела (Ш) в химерных и мутантных из зародышевой линии мышах приводит к полному ингибированию выработки эндогенных антител.

Перенесение набора генов человеческого зародышевого иммуноглобулина в такие мутантные линии мыши приведет к выработке человеческих антител после нагрузки антигеном. См., например, 1ако6ονΐΐδ е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. δει. υδΑ, 90:2551 (1993); 1акоЬоуЙ8 е! а1., Ыа!иге, 362:255-258 (1993); Вгиддегтапп е! а1., Уеат ίη 1ттипе, 7:33 (1993); и патенты США №№ 5591669, 5589369 и 5545807.

Альтернативно, технология фагового дисплея (МсСайсПу е! а1., Ыа!иге 348: 552-553 (1990)), может использоваться, чтобы произвести человеческие антитела и фрагменты антител ίη νίΙΐΌ. из генных репертуаров иммуноглобулинового вариабельного (V) домена от неиммунизированных доноров. Согласно этой технике гены V домена антитела клонируются в рамку или в большой или в малый ген белка оболочки бактериофага, такого как М13 или ίά, и показываются как функциональные фрагменты антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку эта частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, выборы, основанные на функциональных свойствах антитела, также приводят к выбору гена, который кодирует антитело, показывающего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговый дисплей может быть выполнен в ряде форматов, рассмотренных, например, в 1ойпкоп, Κχνίη δ. апй СЫк^ей, Ρπνίά Т, Ситгеп! Оршюп ίη 8!гис!ига1 Вю1оду 3: 564-571 (1993). Несколько источников ν-генных сегментов могут использоваться для фагового дисплея. С1асккоп е! а1., На!иге, 352:624-628 (1991) изолировали разный набор антиоксазолоновых антител из малой рандомизованной комбинаторной библиотеки V генов, полученных из селезенок иммунизированных мышей. Может быть сконструирован набор V генов от неиммунизированных человеческих доноров, и антитела к разному набору антигенов (включая самоантигены) могут быть изолированы в сущности согласно методам, описанным Магкк е! а1., I. Мо1. Вю1. 222:581-597 (1991), или ΟτίίίίΛ е! а1., ЕМВО I. 12:725-734 (1993). См. также патенты США №№ 5565332 и 5573905. Человеческие антитела могут также быть получены ίη νίίΐΌ с помощью активированных В-клеток (см. патенты США №№ 5567610 и 5229275).

Для производства фрагментов антител были разработаны разные методы. Традиционно эти фрагменты были получены через протеолитическое расщепление интактных антител (см., например, Мопто!о е! а1., 1оигпа1 о! Вюсйетюа1 апй Вюрйукюа1 Ме1йойк 24:107-117 (1992) и Вгеппап е! а1., 8шепсе, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут теперь продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антитела могут быть изолированы из фаговых библиотек антител, обсужденных выше. Альтернативно, РаЬ'-δΗ могут быть непосредственно изъяты из Е. сой и химически соединены для образования Р(аЬ')₂ фрагментов (Сайет е! а1., Вю/Тесйпо1оду 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом Р(аЬ')₂ фрагменты могут быть изолированы непосредственно из рекомбинантной культуры клеток-хозяев. Другие методы для производства фрагментов антитела очевидны квалифицированному практику. См. XVО 93/16185; патент США № 5571894 и патент США № 5587458. Фрагмент антитела может также быть "линейным антителом", например, как описано в патенте США № 5641870, например. Такие линейные фрагменты антитела могут быть моноспецифичными или биспецифичными.

Биспецифичные антитела имеют связывающую специфичность по крайней мере к двум различным эпитопам. Типичные биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами маркера поверхности В-клетки. Другие такие антитела могут связывать первый маркер В-клетки и далее связывать второй маркер поверхности В-клетки. Альтернативно, связывающее плечо анти-В-клеточного маркера может быть объединено с плечом, которое связывается с молекулой на лейкоците, такой как молекула рецептора Т-клетки (например, СР2 или СР3), или рецепторы Рс для 1дО (РсуК), такие как РсуК1 (СР64), РсуКП (СР32) и РсуКШ (СР16), чтобы сосредоточить клеточные защитные механизмы к В-клетке. Биспецифичные антитела могут также использоваться для локализации цитотоксических агентов в В-клетке. Эти антитела имеют плечо, связывающее В-клеточный маркер, и плечо, которое связывает цитотоксический агент (например, сапорин, антиинтерферон, алкалоид барвинка, рициновую А цепь, метотрексат или радиоактивный изотоп гаптена).

Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, Р(аЬ')₂ биспецифичные антитела). В данной области известны методы для создания биспецифичных антител. Традиционное производство полноразмерных биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар иммуноглобулиновых тяжелых цепей/легких цепей, где две цепи имеют разную специфичность (Мй1к!ет е! а1., ИаШте, 305:537-539 (1983)).

Через рандомизованный ассортимент иммуноглобулиновых тяжелых и легких цепей эти гибридомы (квадромы) создают потенциальную смесь 10 разных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы, которая обычно достигается стадиями аффинной хроматографии, является достаточно тяжелой, и выходы продукта низкие. Подобные процедуры раскрыты в νθ 93/08829 и в Тгаипескег е! а1, ЕМВО I., 10:3655-3659 (1991).

В соответствии с другим подходом вариабельные домены антитела с желаемыми связывающими специфичностями (антиген-антитело объединяющие участки) сливаются с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние преимущественно происходит с иммуноглобулиновым

- 16 030313

тяжелоцепочечным константным доменом, включающим, по крайней мере, шарнирный, СН2 и СН3 участки. Желательно иметь первый константный тяжелоцепочечный участок (СН1), который содержит сайт, необходимый для легкоцепочечного связывания по крайней мере в одном из слияний. ДНК, которые кодируют слияние тяжелой иммуноглобулиновой цепи и, если желательно, легкой иммуноглобулиновой цепи, встраивают в отдельные векторы экспрессии и котрансфецируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в приспособлении взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, которые используются в конструировании, обеспечивают оптимальные выходы. Однако возможно вставить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, когда экспрессия по крайней мере двух полипептидных цепей в ровных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют никакого определенного значения. Биспецифичные антитела состоят из гибридной иммуноглобулиновой тяжелой цепи с первой связывающей специфичностью в одном плече, и пары гибридная иммуноглобулиновая тяжелая цепь-легкая цепь (это обеспечивает вторую связывающую специфичность) в другом плече. Обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифичного соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновой цепи, поскольку присутствие иммуноглобулиновой легкой цепи только в одной половине биспецифичной молекулы предусматривает легкий путь отделения. Этот подход раскрыт в XVО 94/04690. Последующие детали получения биспецифичных антител см., например, в §игекй с1 а1., Ме1йобк ίη Еп/ушо1оду, 121:210 (1986). В соответствии с другим подходом, описанным в патенте США № 5731168, может быть создан интерфейс между парой молекул антитела, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые получают из рекомбинантной клеточной культуры. Оптимальный интерфейс включает по крайней мере часть СН3 домена константного домена антитела. В этом методе одна или несколько маленьких аминокислотных боковых цепей из интерфейса первой молекулы антитела замещается большими боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). На интерфейсе второй молекулы антитела создаются компенсаторные "впадины" идентичного или подобного размера к большой(ым) боковой(ым) цепи(ям) путем замены больших аминокислотных боковых цепей на меньшие (например, аланин или треонин). Это предлагает механизм для увеличения выхода гетеродимера по отношению к другим нежелательным конечным продуктам, таким как гомодимеры. Биспецифичные антитела включают поперечные связанные или "гетероконъюгатные" антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое с биотином. Такие антитела были, например, предложены для таргетирования клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980), и для лечения ВИЧ-инфекции (νθ 91/00360, νθ 92/200373, и ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть сделаны с использованием любых удобных методов для поперечного соединения. Подходящие вещества для поперечного соединения известны в данной области и раскрыты в патенте США № 4676980, наряду со многими методами поперечного связывания.

Методы для получения биспецифичных антител из фрагментов антитела были также описаны в литературе. Например, биспецифичные антитела могут быть приготовлены с использованием химической связи. Вгеппап с1 а1., 8с1епсе, 229: 81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела протеолитически расщепляются для образования Р(аЬ')₂ фрагментов. Эти фрагменты восстанавливаются в присутствии дитиолового комплексообразующего средства натрия арсенита, чтобы стабилизировать местные дитиолы и предотвратить образование межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные РаЬ' фрагменты после этого превращаются в производные тионитробензоата (ΤΝΒ). Одно из РаЬ'-ΤΝΒ производных после этого повторно превращается в РаЬ'-тиол путем восстановления с помощью меркаптоэтиламина и смешивается с эквимолярным количеством другого РаЬ'-ΤΝΒ производного, чтобы сформировать биспецифическое антитело. Полученные биспецифичные антитела могут использоваться в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Недавний прогресс облегчил прямое выделение РаЬ'-8Н фрагментов из Е. сой, которые могут быть химически соединены для образования биспецифических антител. 8йа1аЬу е1 а1., 1. Ехр. Меб., 175: 217225 (1992) описывают производство Р(аЬ')₂ молекулы полностью гуманизованного биспецифичного антитела. Каждый РаЬ' фрагмент был отдельно выделен из Е. сой и подлежал направленному химическому сцеплению ш уйго для образования биспецифичного антитела. Таким способом сформированное биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, которые сверхэкспрессируют рецептор ЕгЬ'₂, и нормальными человеческими Т-клетками, а также вызывать литическую активность человеческих цитотоксичных лимфоцитов против мишеней человеческой опухоли молочной железы.

Были также описаны разные методы для получения и изоляции биспецифичных фрагментов антитела непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Например, биспецифичные антитела были получены, используя лейциновые зипперы. 1<оЧе1пу е1 а1., 1. 1ттипо1., 148(5): 1547-1553 (1992). Лейциновые зипперные пептиды из Рок и 1ип белков были связаны с РаЬ' частями двух разных антител путем генного слияния.

Гомодимеры антител были восстановлены в каркасном участке, чтобы сформировать мономеры, и потом повторно окислены, чтобы сформировать гетеродимеры антител. Этот метод может также использоваться для производства гомодимеров антител.

- 17 030313

Технология "диател", описанная НоШпдет е! а1., Ргос. ЫаИ. Асаб. δοί. И8А, 90:6444-6448 (1993) предложила альтернативный механизм для создания биспецифичных фрагментов антител. Фрагменты включают тяжелоцепочечный вариабельный домен (УН), связанный с легкоцепочечным вариабельным доменом (УЪ) линкером, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами на той же цепи. Соответственно, УН и УЪ домены одного фрагмента вынуждают спариваться с комплементарными УЪ и УН доменами другого фрагмента, таким способом формируя два антигенсвязывающих участка. Также сообщалось о другой стратегии для создания биспецифичных фрагментов антител с помощью одноцепочечных Ρν (δΡν) димеров. См. ОтиЪет е! а1., 1. 1ттипо1., 152:5368(1994).

Рассматриваются антитела с больше чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Ти!! е! а1., 1. 1ттипо1. 147: 60 (1991).

Рассматривается модификация(и) аминокислотной последовательности белка или пептидных антагонистов и антител, описанных авторами. Например, желательно улучшить связывающую аффиность и/или другие биологические свойства ВЬУ§ связывающего антитела или антагониста. Варианты аминокислотной последовательности антагониста получают путем введения соответствующих изменений нуклеотида в нуклеиновую кислоту антагониста или синтезом пептида. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в пределах аминокислотных последовательностей антагониста. Любая комбинация делеции, инсерции и замены осуществляется для достижения конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает желательными характеристиками. Аминокислотные изменения также могут изменить посттрансляционные процессы антагониста, такие как изменение числа или положения участков гликозилирования.

Полезный метод для идентификации определенных остатков или участков в белке, которые являются предпочтительными местоположениями для мутагенеза, называют "аланин-сканирующим мутагенезом", как описано в Сипшпдйат апб \Уе11к Заепсе. 244: 1081-1085 (1989). Остаток или группу остатков мишени идентифицируют (например, заряженные остатки, такие как агд, акр, Ык, 1ук и д1и) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином), чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот со связывающей мишенью. Такие положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, затем очищают путем введения дополнительных или других вариантов для участков замещения. Таким образом, в то время как участок для введения изменения аминокислотной последовательности предопределен, природа мутации, по существу, не должна быть предопределена. Например, чтобы проанализировать эффективность мутации на данном участке, проводится аланиновое сканирование или случайный мутагенез в кодоне мишени или участке и проводят скрининг экспрессированных вариантов на желательную активность. Инсерции аминокислотной последовательности включают амино и/или карбокситерминальные слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или больше остатков, а также инсерции внутри последовательности одного или многих аминокислотных остатков. Примеры терминальных инсерций включают антагониста с Ν-терминальным метиониновым остатком или антагонист, слитый с цитотоксическим полипептидом. Другие инсерциональные варианты молекулы антагониста включают слияние с Ν- или С-концом антагониста фермента, или полипептид, который увеличивает период полувыведения антагониста из сыворотки. Другой тип варианта - вариант аминокислотной замены. У этих вариантов есть по крайней мере один аминокислотный остаток в молекуле антагониста, замененный другим остатком. Участки самого большого интереса для заменяющего мутагенеза антагонистов антитела включают гипервариабельные участки, но изменения ΡΚ также рассматриваются. Консервативные замены показаны в табл. 1 под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, более существенные изменения, называемые "образцовые замены" в табл. 1, или как далее описано ниже в ссылке "классы аминокислот", могут быть введены, а продукты при этом подвергаются скринингу.

Существенные модификации в биологических свойствах антагониста достигаются путем выбора замен, которые значительно отличаются по их эффекту на поддержку (а) структуры каркаса полипептида в области замены, например, в виде листовой или винтовой конформации, (Ъ) заряда или гидрофобности молекулы в участке мишени, или (с) массы боковой цепи. Природные остатки разделены на группы на основании общих свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: норлейцин, те!, а1а, νа1, 1еи, йе; (2) нейтральные гидрофильные: сук, сер, !йт; (3) кислотные: акр, д1и; (4) основные: акп, дт, Ык, 1ук, агд; (5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: д1у, рго; и (6) ароматические: 1гр. 1уг. рйе. Неконсервативные замены повлекут за собой обмен члена одного из этих классов на другой класс.

Любой цистеиновый остаток, не вовлеченный в поддержание надлежащей конформации антагониста, также можно заменить, вообще серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвратить аберрантное поперечное сшивание. Наоборот, цистеиновая связь(и) мо(жет)гут быть добавлены к антагонисту, чтобы улучшить его стабильность (особенно, если антагонист - фрагмент антитела, такой как фрагмент Ρν). Особенно предпочтительный тип заменяющего варианта вовлекает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела. Вообще, получающийся вариант(ы), выбранный(е) для дальнейшего развития, улучши(а)т биологические свойства

- 18 030313

относительно родительского антитела, из которого они получены. Удобный путь для получения таких заменяющих вариантов является аффинным созреванием с использованием фагового дисплея. Кратко, несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) мутируют для получения всех возможных аминозамен на каждом сайте. Таким образом, произведенные варианты антитела показывают одновалентным способом из волокнистых фаговых частиц как слияния с генным III продуктом М13, упакованные в пределах каждой частицы. Показанные фагом варианты затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, связывающую аффинность), как раскрыто авторами.

Чтобы идентифицировать сайты-кандидаты гипервариабельного участка для модификации, может быть выполнен аланин-сканирующий мутагенез, чтобы идентифицировать остатки гипервариабельного участка, значительно способствующие связыванию антигена. Альтернативно или дополнительно, может быть выгодно проанализировать кристаллическую структуру комплекса антитело-антиген, чтобы идентифицировать точки контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки - кандидаты для замены - согласно методам, разработанным авторами. Как только такие варианты произведены, группа вариантов подвергается скринингу, и антитела с превосходящими свойствами в одном или нескольких соответствующих испытаниях могут быть отобраны для дальнейшего развития. Другой тип аминокислотного варианта антагониста изменяет оригинальный характер гликозилирования антагониста. Под изменением подразумевается удаление одного или нескольких остатков углевода, найденных в антагонисте, и/или добавление одного или нескольких участков гликозилирования, которые не присутствуют в антагонисте.

Гликозилирование полипептидов типично или Ν-связанное или О-связанное. Ν-связанный касается присоединения остатка углевода к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х - любая аминокислота, кроме пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения остатка углевода к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование касается присоединения одного из Сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, обычно к серину или треонину, хотя может также использоваться 5-гидроксипролин или 5гидроксилизин. Дополнение участков гликозилирования к антагонисту удобно достигается путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что он содержит одну или больше вышеописанных трипептидных последовательностей (для Ν-связанных участков гликозилирования). Изменение может также быть сделано путем дополнения или замены одного или больше сериновых или треониновых остатков последовательности оригинального антагониста (для О-связанных участков гликозилирования).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотной последовательности антагониста, получают множеством методов, известных в данной области. Эти методы включают, кроме прочих, выделение из природного источника (в случае вариантов природных аминокислотных последовательностей) или подготовку олигонуклеотидопосредованным (или направленным на участок) мутагенезом, мутагенезом, ПЦР мутагенезом и кассетным мутагенезом более раннего подготовленного варианта или невариантной версии антагониста.

Может быть желательно модифицировать антагонист изобретения относительно эффекторной функции, чтобы увеличить, например, антигензависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС) и/или комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) антагониста. Это может быть достигнуто путем введения одной или нескольких аминокислотных замен в участке Рс антагониста антитела. Альтернативно или дополнительно, остаток(ки) цистеина может(гут) быть введен(ы) в Рс участок, таким способом позволяя образование межцепочечной дисульфидной связи в этом участке. Гомодимерное антитело, полученное таким способом, может улучшить способность к интернализации и/или увеличить комплементопосредованное разрушение клеток и антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС). См., Сагоп βί а1., I. Εχρ Меб. 176:1191-1195 (1992) и §Ьоре5, В. I. 1ттипо1. 148:2918-2922 (1992). Могут также быть приготовлены гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью с использованием гетеробифункциональных поперечных линкеров, как описано в ^Уо1ГГ еί а1. Сапсег КекеагсЬ 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, может быть создано антитело, которое имеет двойные Рс участки и может, таким образом, иметь повышенный лизис комплемента и ЛЭСС способности. См., 81еνеη8οη еί а1. Апб-Сапсег Эгид Эемдп 3:219-230 (1989).

Чтобы увеличить период полувыведения антитела из сыворотки, можно включить в антитело связывающий эпитоп рецептора спасения (особенно фрагмент антитела), как описано в патенте США № 5739277, например. Используемый авторами термин "связывающий эпитоп рецептора спасения" касается эпитопа Рс участка молекулы 1дО (например, 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4), который отвечает за увеличение периода полувыведения молекулы 1дО из сыворотки ш νίνο.

Количественные определения.

Концентрации В-клеток в периферической крови определяются методом РАС8, который подсчитывает СО3-/СЭ40+ клетки.

Процент СЭ3-СЭ40+ В-клеток полных лимфоцитов в образцах может быть получен в соответствии

- 19 030313

со следующей стратегией. Популяция лимфоцитов отмечается на диаграмме рассеяния переднего рассеивания/бокового рассеивания, чтобы определить область I (Κι). Используя события ίηΚΕ точечные графики интенсивности флюоресценции показаны для маркеров ί'.Ό40 и СЭ3. Флуоресцентно меченые контроли изотипа используются, чтобы определить соответствующие пределы для ί'.Ό40 и СЭ3 позитивности.

Анализ РАСδ.

Полмиллиона клеток промывают и повторно суспендируют в 1001 из буфера РАСδ, который является буферизованным фосфатом солевым раствором с 1% ВδА, содержащим 5 мкл антитела для окрашивания или контроля. Все красящие антитела, включая контрольные изотипы, получены из РкагМшдеп, Сан-Диего, Калифорнии. Экспрессию человеческого ΒΕΥδ оценивают, окрашивая с помощью ΚίЮхап&соттаЕ наряду с РПС-конъюгированным античеловек ЦО1 вторичным антителом.

Анализ РАСδ проводится с использованием РАСδсаη и Се11 Оие81 (ВесЮп Эюкиъоп Тттипосу1оте1гу δу8ΐет8, Сан-Хосе, Калифорния). Все лимфоциты определяются в переднем и боковом рассеиваниях, в то время как все В-лимфоциты определяются по экспрессии В220 на поверхности клетки. Истощение и восстановление В-клеток оценивают, анализируя количество В-клеток периферической крови и анализ ΗΒΕΥδ + клетки с помощью РАСδ в селезенке, лимфоузле и костном мозге ежедневно в течение первой недели после инъекции и после этого еженедельно. Мониторируют сывороточные уровни введенного 2Н7 вариантного антитела.

Фармацевтические составы.

Терапевтические составы антагонистов ВБуЮ таких как ВБуЮсвязывающие антитела, готовятся к хранению путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с произвольными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (РепипдЮи'8 Ркагтасеийса1 δ^ι^8 1611 ейШои, О8о1, А. Ей. (1980)), в виде лиофилизованных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при дозировках и концентрациях, которые используются, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпиролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ΕΌΊΆ; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζη-протеин); и/или неионные сурфактанты, такие как ΤΑΕΕΝ'™, РЬ-БРОШСЮ™ або полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Такой состав может также содержать больше чем одно активное соединение по мере необходимости, предпочтительно таковые с комплементарными активностями, которые не оказывают неблагоприятного влияния друг на друга. Например, может быть желательно далее предложить цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, цитокин или иммуносупрессивный агент (например, тот, который действует на Т-клетки, такие как циклоспорин или антитело, которое связывает Т-клетки, например тот, который связывает ЬРА-1). Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в составе, или типа болезни, или расстройства, или лечения, и других факторов. Они вообще используются в тех же самых дозировках и путем введения от 1 до 99% прежде используемых дозировок. Активные компоненты могут также быть включены в готовые микрокапсулы, например, методами коацервации или предельной полимеризацией, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из поли-(метилметацилата), соответственно, в коллоидные системы доставки действующего вещества (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в РеттдЮп'8 Ркагтасеийса1 δ^η^8 1611 еййои, О8о1, А. Ей. (1980).

Могут быть приготовлены препараты с длительным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, которые содержат антагонист, причем матрицы находятся в виде сформированных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают полиэстеры, гидрогели (например, поли-(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и этил-Ь-глутамата, этиленвинилацетат, который не разлагается, сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, которые разлагаются, такие как ББРРОН ЭЕРОТ™ (инъекционные микросферы, которые состоят из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли-Э-(-)-3-гидроксибутировую кислоту.

Составы, которые используются для введения ίη У1уо должны быть стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через мембраны стерильной фильтрации.

- 20 030313

Лечение болезней.

Болезни.

Иммуносупрессивные препараты и антагонисты ВЬу8 полезны для лечения регулируемых Вклетками аутоиммунных расстройств. Регулируемые В-клетками аутоиммунные болезни включают артрит (ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит), псориаз, дерматит, включая атопический дерматит; хроническую аутоиммунную крапивницу, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, системную склеродерму и склероз, ответы, связанные с воспалительной болезнью кишечника (ΙВО) (болезнь Крона, язвенный колит), острый синдром расстройства дыхания, острый синдром расстройства дыхания у взрослых (АРДС), менингит, аллергический ринит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответы, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, дефицит адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (СЧВ), волчанку (включая нефрит, не почечную, дискообразную, алопецию), раннее начало диабета, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, иммунные ответы, связанные с острой и отсроченной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, включая гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (включая ΑNСΑ), апластическую анемию, положительную анемию Кумбса, анемию Блекфана-Даймонда, иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (АША), пернициозную анемию, чисто тромбоцитарную аплазию (РКСА), дефицит Фактора УШ, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, болезни, включающие диапедезиз лейкоцитов, воспалительные расстройства со стороны ЦНС, синдром поражения множественных органов, миастению гравис, опосредованные комплексом антителоантиген болезни, болезнь базальных мембран почечных клубочков, синдром антифосфолипидных антител, аллергический неврит, болезнь Беше, синдром Кастлемана, синдром Гудпасчера, миастенический синдрома Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжения трансплантата солидного органа (включая пред лечением реактивных титров антитела высокой группы, осаждение ΙβΛ в тканях и т.д.), реакция "трансплантат против хозяина" (ОУНО), булезный пемфигоид, пемфигус (все, включая ретрЫдик уЫдапк, ретрЫдик ГоНасеик), аутоиммунные полиэндокринопатии, синдром Рейтера, синдром мышечной скованности, гигантоклеточный артериит, иммунокомплексный нефрит, нефропатия ^А, полиневропатии ^М или ^М опосредованные невропатии, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ΙΤΡ), тромбическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР), аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунную болезнь яичка и яичника, включая автоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз; аутоиммунные эндокринные болезни, включая аутоиммунный тироидит, хронический тироидит (тироидит Хашимото), подострый тироидит, идиопатический гипотиреоз, болезнь Аддисона, болезнь Грейва, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), диабет типа Ι, также называемый инсулинозависимым сахарным диабетом (ГООМ) и синдром Шихана; аутоиммунный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмония (ШУ), ((нетрансплантатный) против Ν8ΙΡ, синдром Гийена-Баре, васкулит средних сосудов (включая ревматическую полимиальгию и гигантоклеточный артериит (Такауаки)), васкулит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), анкилозирующий спондилит, болезнь Бергера (нефропатия ^А), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный желчный цирроз, целиакийное спру (глютеновая энтеропатия), криоглобулинемию, АЬ8, болезнь коронарной артерии.

Желательный уровень истощения В-клеток будет зависеть от болезни. Предпочтительно истощение В-клеток достаточное, чтобы предотвратить прогрессию болезни в течение по крайней мере 2 месяцев, более предпочтительно 3 месяцев, еще более предпочтительно 4 месяцев, более предпочтительно 5 месяцев, еще более предпочтительно 6 или больше месяцев. В даже более предпочтительных вариантах осуществлениях истощение В-клеток является достаточным, чтобы увеличить время ремиссии по крайней мере на 6 месяцев, более предпочтительно 9 месяцев, более предпочтительно один год, более предпочтительно 2 года, более предпочтительно 3 года, еще более предпочтительно 5 или больше лет. Иногда истощения В-клеток достаточно, чтобы излечить болезнь. В предпочтительных вариантах осуществлениях истощение В-клеток у аутоиммунного пациента является, по крайней мере, преходящим приблизительно 75% и более, предпочтительно 80, 85, 90, 95, 99% и даже 100% от исходного уровня перед лечением.

Для лечения аутоиммунной болезни может быть желательно смоделировать степень истощения Вклеток в зависимости от болезни и/или тяжести состояния у индивидуального пациента путем коррекции дозировки иммуносупрессивного препарата или антагониста ВЬу8. Таким образом, истощение В-клеток может, но не должно быть полным. Или полное истощение В-клеток может быть желательно при начальном лечении, но в последующих лечениях дозировка может быть откорректирована таким образом, чтобы достигнуть только частичного истощения. Истощение В-клеток может составлять по крайней мере 20%, то есть 80% или меньше В-клеток остается по сравнению с исходным уровнем перед лечением. Истощение В-клеток может также составлять 25, 30, 40, 50, 60, 70% или больше.

Предпочтительно истощение В-клеток достаточно, чтобы остановить прогрессию болезни, более предпочтительно облегчить признаки и симптомы специфической болезни при лечении, еще более предпочтительно излечить болезнь.

- 21 030313

Для терапевтических применений иммуносупрессивный препарат и композиции антагониста ВЬуЗ могут использоваться в комбинированной терапии с дополнительными препаратами, такими как противовоспалительные препараты, включая ЭМАКЭ и другие биологические средства. Предыдущие методы лечения можно вводить в соединении с другими формами обычной терапии для аутоиммунной болезни или последовательно перед или после обычной терапии.

У пациента отмечается облегчение или успешное лечение регулируемых В-клетками аутоиммунных болезней настоящими методами, если существует измеримое улучшение симптомов или других применимых критериев после введения таких композиций по сравнению с состоянием перед лечением. Эффект лечения может быть очевидным в течение 3-10 недель после введения композиций. Применимые критерии для каждой болезни будут известны врачу с навыками в соответствующей области. Например, врач может мониторировать подвергающегося лечению пациента на клинические или серологические доказательства болезни, такие как серологические маркеры болезни, общий анализ крови, включая подсчет В-клеток, и уровни иммуноглобулина в сыворотке. Сывороточные уровни 1дС и 1дМ уменьшаются у леченных антагонистом ВЬуЗ. Пациенты, отвечающие на лечение актацицептом аналогично, показывают снижение сывороточных уровней 1дС и 1дМ. Параметры для оценки эффективности или успеха лечения аутоиммунной или аутоиммунной связанной болезни известны врачу с навыками в лечении соответствующей болезни. Вообще, врач с навыками будет наблюдать уменьшение признаков и симптомов определенной болезни. Следующее объясняется посредством примеров.

Ревматоидный артрит (РА) является аутоиммунным расстройством неизвестной этиологии. Большинство пациентов с РА переносит хроническое течение болезни, которая даже при терапии может привести к прогрессирующему разрушению суставов, деформированию, инвалидизации и даже преждевременной смерти. Цели терапии РА состоят в том, чтобы предотвратить или контролировать поражение суставов, предотвратить потерю функции и уменьшить боль. Начальная терапия РА обычно вовлекает введение одного или нескольких из следующих препаратов: нестероидные противовоспалительные препараты (ΝδΛΙΌ). глюкокортикоид (через инъекцию в суставы) и преднизон в низкой дозе. См. "Ошйе1шек Гог (Не тападетеп! оГ гНеитаЮИ айНпЙ5"Аг1Нп115 & КНеттайкт 46 (2): 328-346 (РеЬгиагу, 2002). Большинство пациентов с недавно диагностированным РА начинают с терапии изменяющим течение болезни противоревматическим препаратом (ОМАКЭ) в течение 3 месяцев после диагноза.

ОМАКО, обычно используемые при РА, представляют собой гидроксиклорохин, сульфасалазин, метотрексат, лефлуномид, этанерцепт, инфликсимад (плюс пероральный и подкожный метотрексат), азатиоприн, Ό-пеницилламин, Золото (перорально), Золото (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин, иммуноадсорбция стафилококкового белка А.

Поскольку организм производит фактор некроза опухоли альфа (ΤΝΡα) во время РА, ингибиторы ΤΝΡα использовались для терапии этой болезни. Этанерцепт (ΈΝΕ^Ε^ является инъекционным препаратом, одобренным в США для терапии активного РА. Этанерцепт связывается с ΤΝΡα и служит для удаления большей части ΤΝΡα из суставов и крови, таким образом предотвращая ΤΝΡα, который способствует воспалению и другим симптомам ревматоидного артрита.

Этанерцепт - слитый белок "Рс-слитого белка", состоящий из связывающей части внеклеточного лиганда рецептора к человеческому фактору некроза опухоли альфа 75 ΕΌ (р75) ДЖ), связанному с частью Рс человеческого 1дС1. Инфликсимад, продаваемый под торговой маркой КЕМ1САОЕ, является иммуносупрессирующим препаратом, предназначенным для лечения болезни Крона и РА. Инфликсимад химерное моноклональное антитело, которое связывается с ΤΝΡ и уменьшает воспаление в организме, нацеливаясь и связываясь с ΤΝΡα, который вызывает воспаление.

Адалимумаб (НυМIКАΤМ, АЬЬо!! ЬаЬогаЮпек), ранее известный как Ό2Ε7, является человеческим моноклональным антителом, которое связывается с ΤΝΡα, и одобрен для уменьшения признаков и симптомов и ингибирования прогрессии структурного поражения у взрослых со среднетяжелым или тяжелым активным РА, у которых отмечался недостаточный ответ на один или несколько традиционных модифицирующих течение болезни ОМАКО. Лечение ревматического артрита путем введения иммуносупрессивных препаратов и антагониста ВЬуЗ может осуществляться в комбинации с терапией одним или несколькими вышеупомянутыми препаратами для РА. Для ревматоидного артрита, например, измерение прогресса лечения может включать число опухших и чувствительных суставов и длительность утренней онемелости. Пациенты могут быть исследованы на то, сколько разрушено сустав в руках и ногах при использовании рентгеновского исследования и системы баллов, известной как балы ЗНагр. Другая система балов основана на критериях Американского колледжа по ревматологии для оценки ответа на методы лечения.

Один метод оценки эффективности лечения РА основан на критериях Американского колледжа ревматологии (АСК), который определяет процент улучшения в чувствительных и опухших суставах, среди прочего. Пациент с РА может быть оценен, например, АСК 20 (20-процентное улучшение) при сравнении лечения без антитела (например, исходный уровень перед лечением) или лечения плацебо. Другие способы оценить эффективность лечения антителом включают систему баллов рентгеновского исследования, такую как систему баллов рентгеновского исследования ЗНагр, используемую для оценки

- 22 030313

структурного поражения, такого как эрозия кости и сужение пространства сосудов. Пациенты могут также быть оценены на профилактику или улучшение инвалидизации на основании балла Анкетного опроса оценки состояния здоровья |НАО|. балла ΑΙΜδ, балла 8Р-36 в разные периоды времени в течение или после лечения. Критерии АСК 20 могут включать 20% улучшение числа чувствительных (болезненных) суставов и числа опухших суставов плюс 20% улучшение по крайней мере в 3 из 5 дополнительных параметров:

1) оценка боли пациентом по визуальной аналоговой шкале (УА§).

2) глобальная оценка пациентом активности болезни (УА§).

3) глобальная оценка врачом активности болезни (УА§).

4) самооценка пациентом инвалидизации. определяемая анкетным опросом оценки состояния здоровья. и

5) реагенты острой фазы. СКР или Е8К.

АСК 50 и 70 определяются аналогично. Пациенту вводят количество ВЬУ§ связывающего антитела. эффективное для достижения по крайней мере бала АСК 20. предпочтительно по крайней мере АСК 30. более предпочтительно по крайней мере АСК50. еще более предпочтительно по крайней мере АСК70. наиболее предпочтительно по крайней мере АСК 75 и выше. Псориатический артрит имеет уникальные и отличительные радиографические характеристики. Для псориатического артрита эрозия суставов и сужение пространства суставов могут также быть оценены балом §йатр. Гуманизированные ВЬУ§ связывающие антитела могут использоваться для профилактики поражения суставов. а также уменьшения признаков болезни и симптомов расстройства.

Возможно также лечение волчанки или §ЬЕ путем введения пациенту. страдающему от §ЬЕ. терапевтически эффективного количества антагониста ВЬуЗЬ в комбинации с иммуносупрессивным препаратом изобретения. Баллы §ЬЕПА1 обеспечивают количественное определение активности болезни. §ЬЕПА1 - взвешенный индекс 24 клинических и лабораторных параметров. известных своей корреляцией с активностью болезни. с числовым диапазоном 0-103. См. Вгуап Сексик & ίοΐιη Όανίδ. "Νονοί 1йетареиОс адеп! ίοτ куйепис 1ири8 етуШетаФкик" ίη Сиггеп! Ορίηίοη ίη Кйеита1о1оду 2002. 14: 515-521. Антитела к двойной переплетенной ДНК. как полагают. вызывают почечные вспышки и другие проявления волчанки. Пациенты. подвергающиеся лечению антителом. могут мониторироваться в течение времени на почечную вспышку. которая определяется как существенное. восстанавливаемое увеличение сывороточного креатинина. белка в моче или крови в моче. Альтернативно или кроме того. пациенты могут мониторироваться на уровни противоядерных антител и антител к двойной переплетенной ДНК. Лечение §ЬЕ включает кортикостероиды в высокой дозе и/или циклофосфамид (НЭСС). Для системной красной волчанки. пациенты могут мониторироваться на уровни противоядерных антител и антител к двойной переплетенной ДНК. Специфический аспект - лечение волчаночного нефрита комбинацией иммуносупрессивных препаратов и антагониста ВЬу§. такого как атацицепт. Спондилоартропатии - группа расстройств суставов. включая анкилозирующий спондилит. псориатическую болезнь Крона и артрит. Успех лечения может быть определен с помощью утвержденных пациентом и врачом глобальных инструментов оценки.

Теперь используются различные лекарства для лечения псориаза; лечение отличается непосредственно в зависимости от тяжести болезни. Пациенты с более легкой формой псориаза типично используют местное лечение. такое как местные стероиды. антралин. кальципотриен. клобетазол и тазаротен. в то время как пациенты со среднетяжелым и тяжелым псориазом. более вероятно. будут использовать системные (метотрексат. ретиноиды. циклоспорин. РЬТУА и ИУВ) метод лечения. Смолы также используются. Эти методы лечения характеризуются комбинацией проблем безопасности. трудоёмких режимов или неудобства. Кроме того. некоторые из них требуют дорогого оборудования и отведенного места в офисе. Системные лекарства могут вызывать серьезные побочные эффекты. включая гипертензию. гиперлипидемию. супрессию костного мозга. болезнь печени. почечную болезнь и желудочно-кишечное расстройство. Кроме того. использование фототерапии может увеличить уровень раковых образований кожи. В дополнение к неудобству и дискомфорту. связанному с использованием местных методов лечения. фототерапия и системные лечения требуют изменения цикла пациентов на и вне терапии и мониторинга пожизненной экспозиции из-за их побочных эффектов. Эффективность лечения для псориаза оценивается путем мониторинга изменений клинических признаков и симптомов болезни. включая изменения Глобальной оценки врача (РСА) и баллы индекса площади и тяжести псориаза (РА§1). оценки симптомов псориаза (Р8А) по сравнению с исходным состоянием. Состояние пациента может периодически измеряться в течение лечения по визуальной аналоговой шкале. используемой. чтобы указать степень зуда. отмечаемую в определенные периоды времени. Аутоиммунный гепатит вовлекает воспаление печени из-за самопоражения собственной иммунной системой пациента. Подобным образом. самопоражение и получающееся воспаление щитовидной железы - биологическая причина аутоиммунного тироидита. Как ожидается. болезни подобного типа будут облегчаться при использовании комбинации антагониста ВЬу§ с иммуносупрессивным препаратом. таким как ΜΜΡ.

Дозировка.

В зависимости от показания. которое лечится. и факторов. которые касаются дозирования. с кото- 23 030313

рыми ознакомлен врач, квалифицированный в данной области, антагонисты ВЬуЬ и иммуносупрессивные препараты будут вводиться в дозировке, которая является эффективной для лечения такого показания, минимизируя токсичность и побочные эффекты. Вообще, антагонист ВЬуб будут вводиться человеку в диапазоне дозировки, составляющей приблизительно от 0,25 до приблизительно 25 мг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно от 1 приблизительно до 10 мг/кг. Альтернативно, экспрессированный предпочтительный диапазон дозировок для антагониста ВЬуб приблизительно от 75 приблизительно до 190 мг на дозу. Итак, методы лечения включают комбинацию одновременного и последовательного введения иммуносупрессивных препаратов и антагониста ВЬуб. При последовательном введении их можно вводить в любом порядке, то есть сперва иммуносупрессивные препараты, которые сопровождаются антагонистом ВЬ-уЬ. Пациент может лечиться одним препаратом и мониторироваться на эффективность перед лечением. Например, если иммуносупрессивный препарат генерирует частичный ответ, лечение может сопровождаться антагонистом ВЬ-уА чтобы достигнуть полного ответа, и наоборот. Альтернативно, пациентом можно первоначально вводить, оба препарата и последующее дозирование могут быть только с одним или другим препаратом.

Чтобы натренировать пациента переносить препараты и/или уменьшить возникновение отрицательных воздействий, таких как связанные с инфузией симптомы, которые являются результатом начальных и последующих введений терапевтического соединения, млекопитающему, которое в этом нуждается, можно вводить первую или начальную кондиционирующую дозу одного или обоих препаратов и затем вводить, по крайней мере, вторую терапевтически эффективную дозу одного или обоих препаратов, причем вторая и любые последующие дозы выше чем первая доза. Первая доза служит для того, чтобы натренировать млекопитающее переносить более высокую вторую терапевтическую дозу. Таким образом, млекопитающее в состоянии переносить более высокие дозы терапевтического соединения, чем могли бы вводиться первоначально. "Кондиционирующая доза" является дозой, которая снижает или уменьшает частоту или тяжесть неблагоприятных побочных эффектов первой дозы, связанных с введением терапевтического соединения. Кондиционирующая доза может быть терапевтической дозой, субтерапевтической дозой, симптоматической дозой или субсимптоматической дозой. Терапевтическая доза доза, которая оказывает терапевтический эффект на пациента, и субтерапевтическая доза - доза, которая не оказывает терапевтический эффект на получающего лечение пациента. Симптоматическая доза - доза, которая вызывает по крайней мере одно отрицательное воздействие на введение, и субсимптоматическая доза - доза, которая не вызывает отрицательного воздействия. Некоторые отрицательные воздействия включают лихорадку, головную боль, тошноту, рвоту, трудности при дыхании, миальгию и озноб.

Вне режима кондиционирующей дозы есть многие другие режимы, которые могут соблюдаться, чтобы достигнуть облегчения болезни настоящего изобретения. Один такой подход - короткий курс лечения одним иммуносупрессивным препаратом, который сопровождается сужением, что сопровождается лечением комбинацией другого иммуносупрессивного препарата и антагониста ВЬуб. Например, кортикостероиды можно вводить 1000-1500 мг перорально, два раза в день в течение четырех недель, что сопровождается снижением до 5 мг/неделю - 10 мг/сутки в течение 10 недель. Как только пришло время начинать применение антагониста ВЬ-уА режим ударной дозы может быть соответствующим. В частности, атацицепт может вводиться дважды в неделю в течение четырех недель, что сопровождается еженедельным введением в течение увеличенного промежутка времени, такого как 48 недель. Напротив, иммуносупрессивный препарат будет, вероятно, вводиться в режиме эскалирующей дозы. Например, ММР можно вводить в дозе 500 мг два раза в день и увеличить до 750 мг дважды в день после двух недель. Еженедельно авансы в дозировке могут быть сделаны до максимальной дозы 1000 мг 3 разы на день, если число лейкоцитов пациента остается на приемлемых уровнях (то есть выше 3,0х10⁹/л или 3000/мм²). В частности, ожидалось бы, что максимальный диапазон введения ММР будет от 2000 до 3000 мг на пациента в сутки.

Путь введения.

Антагонисты Β^уδ и иммуносупрессивные препараты вводятся человеку в соответствии с известными методами, такими как внутривенное введение, например болюс или непрерывная инфузия в течение времени, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интрацереброспинальное, внутрисуставное, внутрисиновиальное, интратекальное введение или ингаляция. Иммуносупрессивные препараты с соответствующей формулировкой можно также вводить перорально или местно. Антагонист ВЬуЬ и некоторые иммуносупрессивные препараты следует вообще вводить внутривенным или подкожным введением. В различных частях лечения можно вводить одинаковыми или различными путями.

Изделия и наборы.

Изделие включает по крайней мере один контейнер и этикетку или листок-вкладыш в нем или связанный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть сформированы из разных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом для внутривенного раствора или флаконом, который имеет крышку, которая прокалывается иглой для подкожных инъекций). Этикетка или листок-вкладыш указывает, что композиция используется для лечения конкретного состояния, например волчаночного

- 24 030313

нефрита или ревматоидного артрита. Этикетка или листок-вкладыш будут дополнительно включать инструкции для введения композиции пациенту. Дополнительно изделие может далее включать второй контейнер, который включает фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (В^И), солевой раствор, буферизуемый фосфатом, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, желаемые из коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, растворы, фильтры, иглы и шприцы.

Как в случае изделия, набор включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш в нем или связанный с контейнером. Контейнер содержит композицию, которая включает по крайней мере один иммуносупрессивный препарат и один антагониста ВЕуВ. Могут быть включены дополнительные контейнеры, которые содержат, например, растворители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или листоквкладыш могут предоставлять описание композиции, а также инструкции для намеченного использования т νίΐΐΌ или диагностического использования.

Экспериментальные примеры

Пример 1. Производство антагониста ВЬуВ и/или ΑΓΚΙΕ.

Четыре аминотерминальные усеченные версии ΤΑСI-Рс были произведены. У всех четырех была модифицированная человеческая сигнальная последовательность тканевого активатора профибринолизина, как раскрыто в ^О 02/094852 (3ΕΩ ΙΌ ΝΟ: 41), слитая с аминокислотным остатком номер 30 из ВЕС) ΙΌ ΝΟ: 2. Однако эти четыре белка отличались по местоположению, в котором Рс5 был слит с аминокислотной последовательностью ΤΑΕΊ ВЕС) ΙΌ ΝΟ: 2. Табл. 1 обрисовывает в общих чертах структуры четырех слитых белков.

Таблица 1

ΤΑΕΊ Рс. Слитые белки

Обозначение ТАСРРс	Аминокислотные остатки ТАС1
ТАС1 (с1Р29)-Рс5	30- 154 ЗЕО Ю N0:2
ТАС1 (сП-29, 0ΙΟ7-154)-Рс5	30-106 ЗЕО Ю N0:2
ТАС1 (сП-29, сПП-154)-Рс5	30 -110 ЗЕО Ю N0:2
ΤΑΟΙ (сП-29, сП20-154)-Рс5	30 -119 ЗЕО Ю N0:2

Белок, кодирующий кассеты экспрессии, был произведен перекрещивающейся ПЦР с использованием стандартных методов (см., например, Нойон е! а1., Оепе 77:61 (1989)). Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ΤΑΕΊ, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Рс5, использовалась как шаблоны ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры идентифицированы в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для производства слитых белков ΤΑΡΊ

Обозначение ТАСРРс	Олигонуклеотидные обозначения
5' ТАС1	3' ΤΑΟΙ	5'Ρο5	3'Ρο5
ТАС1 (0Р29)-Рс5	Ζ024,903	ΖΟ24,955	ΖΟ24,952	ΖΟ24,946
ΤΑΟΙ (сП-29, сПО7-154)-Рс5	Ζ024,903	ΖΟ24,951	ΖΟ24,949	ΖΟ24,946
ΤΑΟΙ (сП-29, с111Р154)-Рс5	Ζ024,903	ΖΟ28,978	ΖΟ28,979	ΖΟ24,946
ΤΑΟΙ (сП-29, СП20-154)-Рс5	Ζ024,903	ΖΟ28,981	Ζ028,980	ΖΟ24,946

Таблица 3

Олигонуклеотидные последовательности

Праймер	Нуклеотидная последовательность	3ΕΩ ГО ΝΟ.
ΖΟ24,903	5' ТАТТАССССССССАССАТССАТССААТеА 3'	27
ΖΟ24,955	5' ТСААСАТТТССССТССТТСАСАССТСССА 3'	28
ΖΟ24,952	5' ТСССАССТСТСААССАССССАААТСТТСА 3'	29
ΖΟ24,946	5' ТААТТССССССССТСТАСАТТАТТТАСССССАСАСА 3'	30
ΖΟ24,951	5' ТСААСАТТТССССТССТТСТСАСАСААСТА 3'	31
ΖΟ24,949	5' АТАСТТСТСТСАСААССАССССАААТСТТСА 3'	32
ΖΟ28,978	5' ТТТССССТСССТССТСАССТТСТТСТСАСА 3'	33
ΖΟ28,979	5' СТСАССАСССАССССАААТСТТСАСАСА 3'	34
ΖΟ28,981	5' ТТТССССТСССТСАССТСТССТССАА 3'	35
ΖΟ28,980	5' САССТСАСССАССССАААТСТТСАСАСА 3'	36

Первый раунд амплификации ПЦР состоял из двух реакций для каждой из четырех аминотерминальных усеченных версий. Эти две реакции были выполнены, отдельно используя 5' и 3' ΤΑίΊ олигонуклеотиды в одной реакции, и 5' и 3' Рс5 олигонуклеотиды в другой реакции для каждой версии. Условия первого раунда амплификации ПЦР были следующими. К 25 мкл конечного объема было добавлено приблизительно 200 нг ДНК шаблона, 2,5 мкл 10х РЕи буфера для реакции (ВЬЩадепе), 2 мкл 2,5 мМ ίΙΝΤΡκ, по 0,5 мкл 20 мМ 5'-олигонуклеотида и 3'-олигонуклеотида и 0,5 мкл РЕи полимеразы (2,5 единицы, ВкнЕщенеЕ Термальный профиль амплификации состоял из 94°С в течение 3 мин, 35 циклов при 94°С в течение 15 с, 50°С в течение 15 с, 72°С в течение 2 мин, что сопровождается 2-минутным расширением при 72°С. Продукты реакции фракционировались агарозным гель-электрофорезом, и полосы, соответствующие предсказанным размерам, были вырезаны из геля и восстановлены с использованием

- 25 030313

набора ΟΙΑΟΗΝ ()Ι.Ά()υΚ'Κ Ое1 ЕхЧасйоп Κΐί (СРацелц), согласно инструкциям производителя. Второй раунд амплификации ПЦР или реакция амплификации перекрещивающейся ПЦР был выполнен с использованием гелевых очищенных фрагментов из первого раунда ПЦР как шаблон ДНК. Условия второго раунда амплификации ПЦР были следующими. К 25 мкл конечного объема было добавлено приблизительно по 10 нг ДНК шаблона фрагмента ТАС1 и фрагмента Рс5, 2,5 мкл 10х Р1и буфера для реакции (8(га(адепе), 2 мкл 2,5 мМ άΝΤΡδ, по 0,5 мкл 20 мкМ 2С24,903 (ЗЕр II) ΝΟ: 27) и 2С24,946 (ЗЕр II) ΝΟ: 30) и 0,5 мкл Р1и полимеразы (2,5 единицы, 3(га(а§епе). Термальный профиль амплификации состоял из 94°С в течение 1 мин, 35 циклов в 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 15 с, 72°С в течение 2 мин, что сопровождается 2-минутным расширением при 72°С. Продукты реакции фракционировались агарозным гель-электрофорезом, и полосы, соответствующие предсказанным размерам, были вырезаны из геля и восстановлены с использованием набора ΟΙΑΟΕΝ ()Ι.Ά()υΚ'Κ Ое1 ЕхЧасйоп Κΐί (Сйадедц), согласно инструкциям производителя.

Каждая из четырех версий аминотерминальных усеченных ТАС1-Рс ПЦР продуктов была отдельно клонирована с использованием набора НпчИ'оце'п'в /НКОВ1,и\Т ТОРО РСК С1ошп§ Κΐί после рекомендуемого протокола производителя. Табл. 4 идентифицирует нуклеотидные и аминокислотные последовательности этих конструкций ТАС1-Рс.

Таблица 4

Последовательности вариантов ТАС1-Рс

Обозначение ТАСРРс	ЗЕО Ю ΝΟ
Нуклеотид	Аминокислота
ТАС1 (б1-29)-Рс5	18	19
ТАС1 (61-29, 6ΙΟ7-154)-Рс5	20	21
ТАС1 (6Ι-29, бШ-154)-Рс5	22	23
ТАС! (6Ι-29, 6120-154)-Рс5	24	25

После того как последовательности нуклеотида были проверены, плазмиды, включающие каждую из четырех версий аминотерминальных усеченных слияний ТАС1-Рс, были расщеплены с помощью Р§е1 и Авс1, чтобы высвободить кодирующие аминокислоты сегменты. Р§е1 - Авс1 фрагменты были лигированы в вектор экспрессии млекопитающих, содержащий промотор СМУ и ЗУ40 поли А сегмент. Векторы экспрессии были введены в клетки яичника китайского хомяка, как описано ниже.

Пример 2. Производство белков ТАС1-Рс клетками яичника китайского хомяка.

Конструкции экспрессии ТАС1-Рс использовались для трансфекции путем электропорации, приспособленные к суспензии клетки 1)044 яичника китайского хомяка (СНО), выращенные в животной среде без белков (Шайб еί а1., Зот. Се11. Мо1ес. ОепеР 12:555 (1986)). Клетки СНО 0044 не имеют функционального гена дигидрофолатредуктазы из-за делеций в обоих хромосомных положения дигидрофолатредуктазы. Рост клеток в присутствии увеличенных концентраций метотрексата приводит к амплификации гена дигидрофолатредуктазы, и связанного кодирующего рекомбинантный белок гена на конструкции экспрессии.

Клетки СНО 0044 были пропущены в среде РРСНО (1КН Вю§с1епсе§, Еепеха, КЗ), 4-мМ Еглутамин (РКН Вю§с1епсе§), и Ιχ добавка гипоксантин-тимидин (ЕПе Тесйпо1о§1е§), клетки инкубировались при 37°С и 5% СО₂ в шейкерных колбах Согпшд при 120 об/мин на вращающейся платформе шейкера. Клетки были трансфецированы отдельно с помощью линеаризованных плазмидам экспрессии. Чтобы гарантировать стерильность, единственная стадия осаждения этанолом была выполнена на льду в течение 25 мин путем комбинации 200 мкг ДНК плазмиды в пробирке Эппендорфа с 20 мкг пДНК носителя спермы лосося (5'^3' 1пс. ВоиШег, СО, 10 мг/мл), 22 мкл 3М ХаОЛс (рН 5,2) и 484 мкл 100%о этанола (0оЕ1 ЗЫе16 Сйетща1 Со., Нау^агб, СА). После инкубации пробирку центрифугировали при 14000 об/мин в микрофуге, помещенной при 4°С в холодную комнату, супернатант удалили и пеллету промыли дважды 0,5 мл 70% этанола и позволила высохнуть на воздухе. Клетки СНО 0044 были подготовлены, в то время как пеллета ДНК высушивалась, путем центрифугирования 10⁶ общих клеток (16,5 мл) в конической центрифужной пробирке на 25 мл при 900 об/мин в течение 5 мин. Клетки СНО 1)044 повторно суспендировали в полный объем 300 мкл среды роста РРСНО и поместили в Оепе-Ри1§ег Сиνеίίе с 0,4-см промежутком электрода (Вю-Каб). ДНК приблизительно после 50 мин высушивания повторно суспендируют в 500 мкл среды роста РРСНО и добавляют к клеткам в кювете таким образом, чтобы общий объем не превышал 800 мкл, и позволяют осесть при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы уменьшить формирование пузырьков. Кювету поместили в прибор ВюКаб Оепе Ри1§ег II при 0,296 кВ (киловольт) и 0,950 НС (высокая емкость) и немедленно электропорировали.

Клетки инкубировали 5 мин при комнатной температуре перед размещением в 20 мл общего объема среды РРСНО в колбе СοЗίа^ Т-75. Колбу поместили при 37°С и 5% СО₂ в течение 48 ч, когда клетки посчитали гемоцитометром, используя исключение трипановым синим, и поместили в селективную среду РРСНО без добавки гипоксантина-тимидина и содержащую 200 мМ метотрексата (Са1 ВюсЬет).

После восстановления процесса выбора метотрексатом кондиционированные среды, содержащие секретированные белки ТАС1-Рс, были исследованы анализом Вестерн-блот.

- 26 030313

Пример 3. Комбинация атацицепта и ММР у мышей.

Совместное введение атацицепта и ММР (СеИСер!) тестировались в 28-дневном исследовании у мышей СЛ-Ι. Сто пятьдесят животных были распределены на четыре группы лечения. Группа 1 получала контроль носителем, который используется и для атацицепта и для ММР, используя тот же путь и режим, используемый для каждого из испытуемых средств. Группа 2 получала ММР (351 мг/кг) каждый день через желудочный зонд. Группа 3 получала атацицепт (20 мг/кг) три раза еженедельно через подкожную инъекцию. Группа 4 получала атацицепт (20 мг/кг, 3х/неделю, 8С) и ММР (351 мг/кг, каждый день, перорально), что типично вводится в течение 30 мин друг после друга. Доза ММР, которую вводят, была выбрана как максимальная выполнимая доза у мышей, и имитировала человеческую эквивалентную дозу для 70-килограммового человека 29 мг/кг, используемую для пациентов с пересадкой печени (приблизительно 2 г/сутки), используя площадь поверхности тела, чтобы измерить человеческую дозу для мышей.

Животных умерщвляли на исходном уровне (день-1) и дни 14, 28 (в последний день лечения), 42, 56 и 112. Мышей проверяли ежедневно на смертность, отклонения и признаки боли или обострения. Массы тела были измерены и зарегистрированы в день-1 исследования и еженедельно после этого и до умерщвления. Кровь была собрана у умерщвленных животных для полного анализа крови и биохимии сыворотки, анализа проточной цитометрией подтипов лимфоцитов и общих концентраций сывороточного 1дО, 1дМ и 1дА. Общие сывороточные уровни 1дО, 1дМ и 1дА были измерены, проводилась некроскопии на умерщвленных животных для оценки изменений веса органа, большой патологии и гистопатологии.

Общие уровни 1дО оценивались, используя комплект для количественного определения мышиного 1дО ЕЫ8А (каталожный № Е90-131, Ве1Ну1 ЬаЬога1опе8, Монтгомери, Техас), объединенный с пакетом ЕЫ8А 81аг1ег Ассе88огу Раскаде (каталожный № Е101, Ве1Ну1 ЬаЬога1опе8, Монтгомери, Техас). Все манипуляции с жидкостями была выполнены, используя интегрированную систему Ргеейот Еνο 150 Псций НапйПпд 8У81ет и Со1итЬи8 Аа8Йег (ТЕСАЫ, Дания). Микротитровальные лунки были покрыты аффинным очищенным коза анти-мышь 1дО и инкубировались при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки были аспирированы, промыты раствором для промывки и затем заблокированы блокирующим раствором в течение 30 мин. Раствор для блокирования был удален, планшеты вымыты и образцы/стандарты добавлены в двойном повторении. Через 1 ч образцы/стандарты были аспирированы и лунки промыты раствором для промывки. Конъюгированный с пероксидазой хрена коза анти-мышь 1дО был добавлен, и лунки инкубировались при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязанное конъюгированное антитело было удалено путем промывки, и количество конъюгата, остающееся в лунке, было измерено путем инкубации с субстратом ТМВ (ВеЛу1 ЬаЬога1опе8, Монтгомери, Техас) в течение 10 мин. Цветная реакция была остановлена добавлением 2 Н₂8О₄, и полученная спектральная поглощательная способность (ОЛ-450) была измерена на ридере микропланшета 8рес1гата\ 190.

Вычисления данных для общего 1дО были выполнены следующим образом: средний нулевой стандарт (планшетный бланк) значения ОЛ-450 были вычтены из каждого образца и стандарта, и параметры в двойном повторении были усреднены. Стандартная кривая была создана с помощью графика средней ОЛ для каждого стандарта в сравнение с концентрацией, используя логистическое приспособление кривой с четырьмя параметрами. Концентрации образцов были получены путем интерполяции со стандартной кривой. Средняя концентрация образца была умножена на коэффициент разведения. Данные проанализировали, используя программное обеспечение 8ойМа\®Рго, включая значения ОЛ, стандартную кривую(ые), стандартное отклонение и % СУ между репликатами и интерполированное значение неизвестного(ых).

Общие уровни 1дМ оценивались, используя комплект для количественного определения мышиного 1дМ ЕЫ8А (каталожный № Е90-101, Ве1Ну1 ЬаЬога1опе8, Монтгомери, Техас), объединенный с пакетом ЕЫ8А 81аг1ег Ассе88огу Раскаде (каталожный № Е101, Ве1Ну1 ЬаЬога1опе8, Монтгомери, Техас). Все манипуляции с жидкостями была выполнены, используя интегрированную систему Ргеейот Еνο 150 Псций НапйПпд 8У81ет и Со1итЬи8 Аа8Йег (ТЕСАЫ, Дания). Микротитровальные лунки были покрыты аффинным очищенным коза анти-мышь 1дМ и инкубировались при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки были аспирированы, промыты раствором для промывки, и затем заблокированы блокирующим раствором в течение 30 мин. Раствор для блокирования был удален, планшеты вымыты и образцы/стандарты добавлены в двойном повторении. Через 1 ч образцы/стандарты были аспирированы и лунки промыты раствором для промывки. Конъюгированный с пероксидазой хрена коза анти-мышь 1дМ был добавлен, и лунки инкубировались при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязанное конъюгированное антитело было удалено путем промывки, и количество конъюгата, остающееся в лунке, было измерено путем инкубации с субстратом ТМВ (ВеЛу1 ЬаЬога1опе8, Монтгомери, Техас) в течение 10 мин. Цветная реакция была остановлена добавлением 2М Н₂8О₄ и полученная спектральная поглощательная способность (ОЛ-450) была измерена на ридере микропланшета 8рес1гата\ 190.

Вычисления данных для общего 1дМ были выполнены следующим образом: средний нулевой стандарт (планшетный бланк) значения ОЛ-450 были вычтены из каждого образца и стандарта и параметры в двойном повторении были усреднены. Стандартная кривая была создана с помощью графика средней ОЛ для каждого стандарта в сравнение с концентрацией, используя логистическое приспособление кривой с

- 27 030313

четырьмя параметрами. Концентрации образцов были получены путем интерполяции со стандартной кривой. Средняя концентрация образца была умножена на коэффициент разведения. Данные проанализировали, используя программное обеспечение 8ойМах®Рго, включая значения ОО, стандартную кривую(ые), стандартное отклонение и % СУ между репликатами и интерполированное значение неизвестного(ых). Общие уровни 1дА оценивались, используя комплект для количественного определения мышиного 1дА ЕЫ8А (каталожный № Е90-101, Ве1йу1 РаЬопПопез, Монтгомери, Техас), объединенный с пакетом ЕЫ8А Майег Асс姧огу Раскаде (каталожный № Е101, Ве1йу1 РаЬопПопез, Монтгомери, Техас). Все манипуляции с жидкостями была выполнены, используя интегрированную систему Ргеебот Еуо 150 Ицшй НапсНтд §у§1ет и Со1итЬи§ Аазйег (ТЕСАЛ', Дания). Микротитровальные лунки были покрыты аффинным очищенным коза анти-мышь 1дА и инкубировались при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки были аспирированы, промыты раствором для промывки и затем заблокированы блокирующим раствором в течение 30 мин. Раствор для блокирования был удален, планшеты вымыты и образцы/стандарты добавлены в двойном повторении. Через 1 ч образцы/стандарты были аспирированы и лунки промыты раствором для промывки. Конъюгированный с пероксидазой хрена коза анти-мышь 1дА был добавлен, и лунки инкубировались при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязанное конъюгированное антитело было удалено путем промывки и количество конъюгата, остающееся в лунке, было измерено путем инкубации с субстратом ТМВ (Ве1йу1 РаЬонПопез, Монтгомери, Техас) в течение 10 мин. Цветная реакция была остановлена добавлением 2М Н₂ЗО₄ и полученная спектральная поглощательная способность (ОО-450) была измерена на ридере микропланшета 8рес1гатах 190.

Вычисления данных для общего 1дА были выполнены следующим образом: средний нулевой стандарт (планшетный бланк) значения ОО-450 были вычтены из каждого образца и стандарта и параметры в двойном повторении были усреднены. Стандартная кривая была создана с помощью графика средней ОО для каждого стандарта в сравнении с концентрацией, используя логистическое приспособление кривой с четырьмя параметрами. Концентрации образцов были получены путем интерполяции со стандартной кривой. Средняя концентрация образца была умножена на коэффициент разведения. Данные проанализировали, используя программное обеспечение 8ойМах®Рго, включая значения ОО, стандартную кривую(ые), стандартное отклонение и % СУ между репликатами и интерполированное значение неизвестного(ых).

Средние результаты изменения в измерениях иммуноглобулинов зарегистрированы в табл. 5 ниже и графически на фиг. 1, 2 и 3.

Таблица 5

Числовые средние 1дО, 1дМ и 1дА результаты для дня-28 и отличие от носителя (мкг/мл)

	Носитель (V)	ММР	Актацицепт (А)	Атацицепт + ММР (А + М)
1дС	179	185	75	31
1дм	238	317	76	19
1дА	498	506	105	33
	Δ1 (V - ММР)	Δ2 (У-А)	Δ1 +Δ2	Δ3 (V - (А + М))	Δ3 По сравнению с Δ1 + Δ2
1дС	-6	104	98	148	148 > 98
1дм	-79	162	83	219	219 > 83
1дА	-8	393	385	464	464 > 385

Как может быть отмечено по этим вычислениям, комбинация имеет синергетический эффект на снижение иммуноглобулина для всех трех типов (то есть среднее изменение от носителя с комбинацией (Δ3) является большим, чем дополнение среднего изменения от носителя к только ММР (Δ1) со средним изменением от носителя к только атацицепту (Δ2) (или математически Δ3 > Δ1 + Δ2)).

Заключение.

Эксперименты, описанные авторами, продемонстрировали удивительные результаты, состоящие в том, что комбинация иммуносупрессивных препаратов и антагонистов ВЬу8 и/или .АРКИ,, таких как ММР и атацицепт, привела к синергетическому истощению уровней 1д по сравнению с уровнем снижения с помощью иммуносупрессивных препаратов и только антагонистов ВРуЗ и/или АРК1Ь.

Пример 4. Повторение и расширение эксперимента комбинации атацицепта и ММР.

Используя подобные процедуры к описанным в примере 3 и дозирование до дня 91, результаты примера 3 реплицировались и увеличились в течение времени в дни 35, 91, 126 и 182. Результаты этого эксперимента подтвердили синергетический эффект атацицепта и ММР на средние уровни иммуноглобулина по крайней мере для одного из трех типов иммуноглобулинов в каждый период времени. Синергетические результаты подсуммированы в табл. 6 ниже.

- 28 030313

Таблица 6

Синергетические результаты числового среднего значения для результатов 1дО. 1дМ и 1дА для расширенного эксперимента и отличия от носителя (мкг/мл)

День взятия образца	Тип иммуноглобулина	Носитель (V)	ММР	Атацицепт (А)	Атацицепт + ММР(+ М)
35	|дС	519,7	940,13	261,35	148,59
35	1дМ	105,7	141,34	5,54	5,11
91	1дС	697,01	1192,87	191,84	128,22
91	1дА	924,36	1764,55	37,53	0
126	1дА	1113,48	1467,05	817,22	778,05
182	|дм	73,95	53,77	73,75	47,63
День ВЗЯТИЯ образца	Тип иммуноглобулина	Δ1 (V - ММР)	Δ2 (ν-Α)	Δ1 +Δ2	Δ3 (V - (А + М))	Δ3 По сравнению ΟΔ1 + Δ2
35		1дС	-420,43	258,35	-162,08	371,11		371,11>162,08
35		1дм	-35,64	100,16	64,52	100,59	100,59> 64,52
91	|дС	-495,86	505,17	9,31	568,79	568,79> 9,31
91	1дА	-840,19	886,83	46,64	924,36	924,36> 46,64
126	1дА	-353,57	296,26	57,31	335,43	335,43> 57,31
182	1дм	20,18	,20	20,38	26,32	26,32> 20,38

Нужно отметить. что поскольку выбранные подтипы иммуноглобулина достигли максимального угнетения. способность наблюдать синергетический эффект маскируется из-за низких абсолютных чисел. Этот "эффект маскировки" объясняет. почему синергизм менее последовательно отмечался у всех трех подтипов иммуноглобулина в более поздние периоды времени. В сумме эти результаты подтверждают синергетические эффекты комбинации атацицепт и ММР на числовое среднее значение уровней обозначенных типов иммуноглобулинов. отмеченные в примере 3. и расширяют это заключение в течение периода времени от 35. 91. 126 и 182 дня.

Ради законченности следующее описывает экспериментальные группы. дозы. вводимые объемы и используемые концентрации в этом эксперименте повторения и расширения:

Таблица 7

Группа	№ животных	Доза (мг/кг/день)	Путь введения	Схема дозирования
1 Носитель 1 + Носитель 2	20М + 20Р	0 0	з.с. перорально	3/неделю ежедневно
2 Атацицепт	20М + 20Р	20	з.с.	3/неделю
ЗММР	20М + 20Р	350	перорально	ежедневно
4 Атацицепт + ММР	20М + 20Р	20 350	з.с. перорально	3/неделю ежедневно

Режим введения.

Атацицепт: через день. в течение 3 дней/неделю. подкожным путем.

ММР: ежедневно. пероральным путем.

Группа 1 получала и носитель для атацицепта. и носитель для Се11Сер1 при той же частоте лечения как и леченые группы.

Группа 2 получала только атацицепт.

Группа 3 получала только Се11Сер1.

Группа 4 получала Се11Сер1 через желудочный зонд. что сопровождалось п/к инъекцией атацицепта в пределах периода. составляющего приблизительно 30 мин. День первой лечения считался днем 1 исследования. В течение периода исследования были выполнены клинические наблюдения. гематологические анализы и анализы биохимии крови. токсикокинетики и дополнительные исследования.

Общие определения 1дО. 1дМ и 1дА/сателлитные группы 9. 10. 11 и 12.

Дополнительные сателлитные группы животных использовались для определений общего иммуноглобулина и определения антитела. Их лечили и взвешивали согласно тем же самым процедурам. как главное исследование.

- 29 030313

Таблица 8

Г руппа/пол (№ животных)	АТАЦИЦЕПТ Дозы (мг/кг/день) Подкожно	ММР Дозы (мг/кг/день) перорально
9М (15)	0	0
9Р (15)
ЮМ (12)	20	н/п
ЮР (12)
11 М. (12)	н/п	350
11 Р (12)
12М (12)	20	350
12Р (12)

Животные были размещены по 3 мыши/пол/клетку.

Образцы крови были собраны у 3 животных/пол/группу (в прогрессирующем числовом порядке) для определения сывороточных уровней 1§О, 1дМ и 1дА следующим образом:

от животных группы контроля (дг,9): Преддоза от животных групп 9, 10, 11 и 12 в день 34 5-недельного периода лечения, в день 90 13-недельного периода лечения, в день 34 5-недельного периода восстановления, в день 90 13-недельного периода восстановления.

Кровь (по крайней мере 0,8-1 мл) была собрана из брюшной аорты мышей после того, как они были полностью обезболены с помощью диэтилового эфира.

Образцы были собраны в пробирку без антикоагулянта, и им дали свернуться в течение приблизительно 1 ч при комнатной температуре. Сгусток оборачивали путем центрифугирования при 3000 об/мин при +4°С в течение 15 мин. Клетки крови отбросили и сыворотку собрали в 100 мкл аликвоты (четыре аликвоты для каждого отдельного анализа) и хранили при -80°С до анализа. Общие уровни 1§О, 1дМ и 1дА были определены провалидированными методами ΕΟδΑ.

Умерщвление выполнялось в конце 5-недельного периода лечения для 4 животных/пол/группу (первые в числовом порядке); в конце 13-недельного периода лечения для 8 животных/пол/группу (вторые в числовом порядке); в конце 5-недельного периода восстановления для 4 животных/пол/группу (первые восстановленные животные в числовом порядке); и в конце 13-недельного периода восстановления для 4 животных/пол/группу (остающиеся животные).

Заключение.

Эксперимент по расширению, сообщенный авторами, поддерживают результаты примера 3, где было удивительно показано, что комбинация иммуносупрессивных препаратов и антагонистов Β^уδ и/или АРМЕ, таких как ММР и атацицепт, привела к синергетическому истощению уровней 1д по сравнению с уровнем снижения с иммуносупрессивными препаратами и только антагонистами Β^уδ и/или АРМЕ.

Ссылки.

Ссылки, процитированные в пределах этой заявки, включая патенты, опубликованные заявки и другие публикации, включены авторами путем ссылки.

- 30 030313

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ка£ае1 А. Ропсе, Лг.

Уаупе Л. ИаШз

Ма55Ием 5. Но1Дгеп

ЬЧпДа Бискегтап

АНза М. ЬЧЬЬаи

КЧгк Р. Чап Ыезз

С1аиЛа Репа КоззЧ

Напз О55о ЬеппагЬ Сга££пег

<120> КОМБИНАЦИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ БЬу5 И/ИЛИ АРБ1Б И ИММУНОСУПРЕССАНТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННОЙ БОЛЕЗНИ

<130> 07-04РС

<150> 60/908,365

<151> 2007-03-27

<160> 41

<170> Еаз55Е12 для ’.'ягДож Версия 4.0

<210> 1

<211> 1377

<212> ДНК

<213> Иото зарЧепз

<220>

<221> СБ5

<222> (14)...(892)

<400> 1

адса5сс5да д5а а5д ад5 ддс с5д ддс сдд адс адд сда дд5 ддс сдд 49

Ме5 5ег О1у Беи О1у Агд 5ег Агд Агд О1у О1у Агд

1 5 10

адс 5ег

сд5 Агд

д5д Ча1 15

дас Азр

сад О1п

дад О1и

дад О1и

сдс Агд 20

555 РИе

сса Рго

сад О1п

ддс О1у

с5д Ьеи 25

5дд Тгр

асд ТИг

ддд О1у

97

д5д

дс5

а5д

ада

5сс

5дс

ссс

даа

дад

сад

5ас

5дд

да5

сс5

с5д

с5д

145

Ча1

А1а

Ме5

Агд

5ег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

Туг

Тгр

Азр

Рго

Ьеи

Ьеи

30

35

40

дд5

асс

5дс

а5д

5сс

5дс

ааа

асс

а55

5дс

аас

са5

сад

адс

сад

сдс

193

О1у

ТИг

Суз

Ме5

5ег

Суз

Ьуз

ТИг

11е

Суз

Азп

Няз

О1п

5ег

О1п

Агд

45

50

55

60

асс

5д5

дса

дсс

55с

5дс

адд

5са

с5с

адс

5дс

сдс

аад

дад

саа

ддс

241

ТИг

Суз

А1а

А1а

РИе

Суз

Агд

5ег

Ьеи

5ег

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

65

70

75

аад

55с

5а5

дас

са5

с5с

с5д

адд

дас

5дс

а5с

адс

5д5

дсс

5сс

а5с

289

Ьуз

РИе

Туг

Азр

Няз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

11е

5ег

Суз

А1а

5ег

11е

80

85

90

5д5

дда

сад

сас

сс5

аад

саа

5д5

дса

5ас

55с

5д5

дад

аас

аад

с5с

337

Суз

О1у

О1п

Няз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

РИе

Суз

О1и

Азп

Ьуз

Ьеи

95

100

105

- 31 030313

385

адд Агд

адс Зег 110

сса Рго

дЕд Уа1

аас Азп

сЕЕ Ьеи

сса Рго 115

сса Рго

дад О1и

сЕс Ьеи

адд Агд

ада Агд 120

сад О1п

сдд Агд

адЕ Зег

дда О1у

даа

дЕЕ

даа

аас

ааЕ

Еса

дас

аас

Есд

дда

адд

Еас

саа

дда

ЕЕд

дад

О1и

Уа1

О1и

Азп

Азп

Зег

Азр

Азп

Зег

О1у

Агд

Туг

О1п

О1у

Ьеи

О1и

125

130

135

140

сас

ада

ддс

Еса

даа

дса

адЕ

сса

дсЕ

сЕс

ссд

ддд

сЕд

аад

сЕд

адЕ

Ηΐ3

Агд

О1у

Зег

О1и

А1а

Зег

Рго

А1а

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

145

150

155

дса

даЕ

сад

дЕд

дсс

сЕд

дЕс

Еас

адс

асд

сЕд

ддд

сЕс

Едс

сЕд

ЕдЕ

А1а

Азр

О1п

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

Туг

Зег

ТЪг

Ьеи

О1у

Ьеи

Су3

Ьеи

Суз

160

165

170

дсс

дЕс

сЕс

Едс

Едс

ЕЕс

сЕд

дЕд

дсд

дЕд

дсс

Едс

ЕЕс

сЕс

аад

аад

А1а

Уа1

Ьеи

Суз

Суз

РЪе

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Су3

РЪе

Ьеи

Ьуз

Ьуз

175

180

185

адд

ддд

даЕ

ссс

Едс

Есс

Едс

сад

ссс

сдс

Еса

адд

ссс

сдЕ

саа

адЕ

Агд

О1у

Азр

Рго

Суз

Зег

Суз

О1п

Рго

Агд

Зег

Агд

Рго

Агд

О1п

Зег

190

195

200

ссд

дсс

аад

ЕсЕ

Есс

сад

даЕ

сас

дсд

аЕд

даа

дсс

ддс

адс

ссЕ

дЕд

Рго

А1а

Ьуз

Зег

Зег

О1п

Азр

Ηίδ

А1а

МеЕ

О1и

А1а

О1у

Зег

Рго

Уа1

205

210

215

220

адс

аса

Есс

ссс

дад

сса

дЕд

дад

асс

Едс

адс

ЕЕс

Едс

ЕЕс

ссЕ

дад

Зег

ТЪг

Зег

Рго

О1и

Рго

Уа1

О1и

ТЪг

Суз

Зег

РЪе

Су3

РЪе

Рго

О1и

225

230

235

Едс

адд

дсд

ссс

асд

сад

дад

адс

дса

дЕс

асд

ссЕ

ддд

асс

ссс

дас

Суз

Агд

А1а

Рго

ТЪг

О1п

О1и

Зег

А1а

Уа1

ТЪг

Рго

О1у

ТЪг

Рго

Азр

240

245

250

ссс

асЕ

ЕдЕ

дсЕ

дда

адд

Едд

ддд

Едс

сас

асс

адд

асс

аса

дЕс

сЕд

Рго

ТЪг

Суз

А1а

О1у

Агд

Тгр

О1у

Суз

Ηΐ3

ТЪг

Агд

ТЪг

ТЪг

Уа1

Ьеи

255

260

265

сад

ссЕ

Едс

сса

сас

аЕс

сса

дас

адЕ

ддс

сЕЕ

ддс

аЕЕ

дЕд

ЕдЕ

дЕд

О1п

Рго

Суз

Рго

Ηίδ

11е

Рго

Азр

Зег

О1у

Ьеи

О1у

11е

Уа1

Суз

Уа1

270

275

280

ссЕ

дсс

сад

дад

ддд

ддс

сса

ддЕ

дса

ЕаааЕддддд Есадддаддд

Рго

А1а

О1п

О1и

О1у

О1у

Рго

О1у

А1а

285

290

433

481

529

577

625

673

721

769

817

865

912

аааддаддад

дададаЕаЕд

дадддадада

ддсададаад

дддадададд

ддддсасЕсЕ

дсааЕааадЕ

ааассЕЕЕдд

ддадададаЕ

аддададада

дадасададд

дааададаса

садададаса

дадЕсссадЕ

ссЕсдЕдссЕ

садсЕдсссЕ

ддададдадд

дасададдад

дадададада

ддсададаад

дададддада

ЕсссадЕдса

дсЕдсЕсаса

ЕссЕсааааа

ддадададаа

дсадаааддд

сададдддаа

дадададдса

дадддасада

дсЕдЕаддЕс

дсссссдада

аааааааааа

адададдЕдд

ададааасад

дададдсада

дададддада

дададаЕада

дЕсаЕсассЕ

дссссЕссЕс

ааааа

ддададддда

аддадасада

дадддааада

даддсадада

дсаддаддЕс

аассасасдЕ

сЕддадааЕа

972

1032

1092

1152

1212

1272

1332

1377

<210> 2

<211> 293

<212> РКТ

<213> Ъото зартепз

<400> 2

- 32 030313

Мек

Зег

О1у

Ьеи

О1у

Агд

Зег

Агд

Агд

О1у

О1у

Агд

Зег

Агд

Уа1

Азр

1

5

10

15

О1п

О1и

О1и

Агд

РЬе

Рго

О1п

О1у

Ьеи

Тгр

ТЬг

О1у

Уа1

А1а

Мек

Агд

20

25

30

Зег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

Туг

Тгр

Азр

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

ТЬг

Суз

Мек

35

40

45

Зег

Суз

Ьуз

ТЬг

11е

Суз

Азп

Нбз

О1п

Зег

О1п

Агд

ТЬг

Суз

А1а

А1а

50

55

60

РЬе

Суз

Агд

Зег

Ьеи

Зег

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

Ьуз

РЬе

Туг

Азр

65

70

75

80

Нчз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

11е

Зег

Суз

А1а

Зег

11е

Суз

О1у

О1п

Нбз

85

90

95

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

РЬе

Суз

О1и

Азп

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

Рго

Уа1

100

105

110

Азп

Ьеи

Рго

Рго

О1и

Ьеи

Агд

Агд

О1п

Агд

Зег

О1у

О1и

Уа1

О1и

Азп

115

120

125

Азп

Зег

Азр

Азп

Зег

О1у

Агд

Туг

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Нбз

Агд

О1у

Зег

130

135

140

О1и

А1а

Зег

Рго

А1а

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

А1а

Азр

О1п

Уа1

145

150

155

160

А1а

Ьеи

Уа1

Туг

Зег

ТЬг

Ьеи

О1у

Ьеи

Суз

Ьеи

Суз

А1а

Уа1

Ьеи

Суз

165

170

175

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Суз

РЬе

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Агд

О1у

Азр

Рго

180

185

190

Суз

Зег

Суз

О1п

Рго

Агд

Зег

Агд

Рго

Агд

О1п

Зег

Рго

А1а

Ьуз

Зег

195

200

205

Зег

О1п

Азр

Нбз

А1а

Мек

О1и

А1а

О1у

Зег

Рго

Уа1

Зег

ТЬг

Зег

Рго

210

215

220

О1и

Рго

Уа1

О1и

ТЬг

Суз

Зег

РЬе

Суз

РЬе

Рго

О1и

Суз

Агд

А1а

Рго

225

230

235

240

ТЬг

О1п

О1и

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Рго

О1у

ТЬг

Рго

Азр

Рго

ТЬг

Суз

А1а

245

250

255

О1у

Агд

Тгр

О1у

Суз

Нбз

ТЬг

Агд

ТЬг

ТЬг

Уа1

Ьеи

О1п

Рго

Суз

Рго

260

265

270

Нбз

11е

Рго

Азр

Зег

О1у

Ьеи

О1у

11е

Уа1

Суз

Уа1

Рго

А1а

О1п

О1и

275

280

285

О1у

О1у

Рго

О1у

А1а

290

<210> 3

<211> 586

<212> ДНК

<213> Ното зарбепз

<220>

<221> СЬЗ

<222> (27)...(578)

<400> 3

дсадсккдкд сддсддсдкс ддсасс акд адд еда ддд ссс едд аде скд едд 53 Мек Агд Агд О1у Рго Агд Зег Ьеи Агд

1 5

ддс О1у 10

адд Агд

дас Азр

дсд А1а

сса Рго

дсс А1а 15

ссс Рго

асд ТЬг

ссс Рго

кдс Суз

дкс Уа1 20

ссд Рго

дсс А1а

дад О1и

кдс Суз

ккс РЬе 25

101

дас

скд

скд

дкс

сдс

сас

кдс

дкд

дсс

кдс

ддд

скс

скд

сдс

асд

ссд

149

Азр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Агд 30

Нбз

Суз

Уа1

А1а

Суз 35

О1у

Ьеи

Ьеи

Агд

ТЬг 40

Рго

сдд

ссд

ааа

ссд

дсс

ддд

дсс

адс

адс

сск

дсд

ссс

адд

асд

дсд

скд

197

- 33 030313

Агд

Рго

Ьуз

Рго 45

А1а

О1у

А1а

Зег

Зег 50

Рго

А1а

Рго

Агд

ТЪг 55

А1а

Ьеи

сад

ссд

сад

дад

5сд

д5д

ддс

дсд

ддд

дсс

ддс

дад

дсд

дсд

с5д

ссс

245

О1п

Рго

О1п

О1и

Зег

Уа1

О1у

А1а

О1у

А1а

О1у

О1и

А1а

А1а

Ьеи

Рго

60

65

70

с5д

ссс

ддд

с5д

с5с

555

ддс

дсс

ссс

дсд

с5д

с5д

ддс

с5д

дса

с5д

293

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Ьеи

РЪе

О1у

А1а

Рго

А1а

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

А1а

Ьеи

75

80

85

д5с

с5д

дсд

с5д

д5с

с5д

д5д

дд5

с5д

д5д

адс

5дд

адд

сдд

сда

сад

341

ναι

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

О1у

Ьеи

Уа1

Зег

Тгр

Агд

Агд

Агд

О1п

90

95

100

105

сдд

сдд

с55

сдс

ддс

дсд

5сс

5сс

дса

дад

дсс

ссс

дас

дда

дас

аад

389

Агд

Агд

Ьеи

Агд

О1у

А1а

Зег

Зег

А1а

О1и

А1а

Рго

Азр

О1у

Азр

Ьуз

110

115

120

дас

дсс

сса

дад

ссс

с5д

дас

аад

д5с

а5с

а55

с5д

5с5

ссд

дда

а5с

437

Азр

А1а

Рго

О1и

Рго

Ьеи

Азр

Ьуз

Уа1

11е

11е

Ьеи

Зег

Рго

О1у

11е

125

130

135

5с5

да5

дсс

аса

дс5

сс5

дсс

5дд

сс5

сс5

сс5

ддд

даа

дас

сса

дда

485

Зег

Азр

А1а

ТЪг

А1а

Рго

А1а

Тгр

Рго

Рго

Рго

О1у

О1и

Азр

Рго

О1у

140

145

150

асс

асс

сса

сс5

ддс

сас

ад5

д5с

сс5

д5д

сса

дсс

аса

дад

с5д

ддс

533

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

О1у

Ηΐ3

Зег

Уа1

Рго

Уа1

Рго

А1а

ТЪг

О1и

Ьеи

О1у

155

160

165

5сс

ас5

даа

с5д

д5д

асс

асс

аад

асд

дсс

ддс

сс5

дад

саа

саа

578

Зег

ТЪг

О1и

Ьеи

Уа1

ТЪг

ТЪг

Ьуз

ТЪг

А1а

О1у

Рго

О1и

О1п

О1п

170 175 180

5адсаддд 586

<210> 4

<211> 184

<212> РКТ

<213> Ъото зартепз

<400> 4

Ме5

Агд

Агд

О1у

Рго

Агд

Зег

Ьеи

Агд

О1у

Агд

Азр

А1а

Рго

А1а

Рго

1

5

10

15

ТЪг

Рго

Суз

Уа1

Рго

А1а

О1и

Суз

РЪе

Азр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Агд

Н1з

Суз

20

25

30

Уа1

А1а

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

Агд

ТЪг

Рго

Агд

Рго

Ьуз

Рго

А1а

О1у

А1а

35

40

45

Зег

Зег

Рго

А1а

Рго

Агд

ТЪг

А1а

Ьеи

О1п

Рго

О1п

О1и

Зег

Уа1

О1у

50

55

60

А1а

О1у

А1а

О1у

О1и

А1а

А1а

Ьеи

Рго

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Ьеи

РЪе

О1у

65

70

75

80

А1а

Рго

А1а

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

85

90

95

О1у

Ьеи

Уа1

Зег

Тгр

Агд

Агд

Агд

О1п

Агд

Агд

Ьеи

Агд

О1у

А1а

Зег

100

105

110

Зег

А1а

О1и

А1а

Рго

Азр

О1у

Азр

Ьуз

Азр

А1а

Рго

О1и

Рго

Ьеи

Азр

115

120

125

Ьуз

Уа1

11е

11е

Ьеи

Зег

Рго

О1у

11е

Зег

Азр

А1а

ТЪг

А1а

Рго

А1а

130

135

140

Тгр

Рго

Рго

Рго

О1у

О1и

Азр

Рго

О1у

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

О1у

Нтз

Зег

145

150

155

160

- 34 030313

Уа1 Рго Уа1 Рго А1а ТЪг О1и Ьеи О1у Зег ТЪг О1и Ьеи Уа1 ТЪг ТЪг

165	170	175
Ьуз ТЪг А1а	О1у Рго О1и О1п О1п 180
<210>	5
<211>	995
<212>	ДНК
<213>	Ното	заргепз

<220>

<221> СЬЗ

<222> (219)...(770)

<400> 5

аадасЬсааа сЬЬадааасЬ ЬдааЬЬадаЬ дЬддЬаЬЬса ааЬссЬЬасд Ьдссдсдаад 60

асасадасад сссссдЬаад аасссасдаа дсаддсдаад ЬЬсаЬЬдЬЬс ЬсаасаЬЬсЬ 120

адсЬдсЬсЬЬ дсЬдсаЬЬЬд сЬсЬддааЬЬ сЬЬдЬадада ЬаЬЬасЬЬдЬ ссЬЬссаддс 180

ЬдЬЬсЬЬЬсЬ дЬадсЬсссЬ ЬдЬЬЬЬсЬЬЬ ЬЬдЬдаЬс аЬд ЬЬд сад аЬд дсЬ ддд 236

МеЬ Ьеи О1п МеЬ А1а О1у 1 5

сад О1п

Ьдс Суз

Ьсс Зег

саа О1п 10

ааЬ Азп

даа О1и

ЬаЬ Туг

ЬЬЬ РЬе

дас Азр 15

адЬ Зег

ЬЬд Ьеи

ЬЬд Ьеи

саЬ Н1з

дсЬ А1а 20

Ьдс Суз

аЬа 11е

284

ссЬ

ЬдЬ

саа

сЬЬ

сда

ЬдЬ

ЬсЬ

ЬсЬ

ааЬ

асЬ

ссЬ

ссЬ

сЬа

аса

ЬдЬ

сад

332

Рго

Суз

О1п

Ьеи

Агд

Суз

Зег

Зег

Азп

ТЬг

Рго

Рго

Ьеи

ТЬг

Суз

О1п

25

30

35

сдЬ

ЬаЬ

ЬдЬ

ааЬ

дса

адЬ

дЬд

асс

ааЬ

Ьса

дЬд

ааа

дда

асд

ааЬ

дсд

380

Агд

Туг

Суз

Азп

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

Зег

Уа1

Ьуз

О1у

ТЬг

Азп

А1а

40

45

50

аЬЬ

сЬс

Ьдд

асс

ЬдЬ

ЬЬд

дда

сЬд

адс

ЬЬа

аЬа

аЬЬ

ЬсЬ

ЬЬд

дса

дЬЬ

428

11е

Ьеи

Тгр

ТЬг

Суз

Ьеи

О1у

Ьеи

Зег

Ьеи

11е

11е

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

55

60

65

70

ЬЬс

дЬд

сЬа

аЬд

ЬЬЬ

ЬЬд

сЬа

адд

аад

аЬа

адс

ЬсЬ

даа

сса

ЬЬа

аад

476

РЬе

Уа1

Ьеи

МеЬ

РЬе

Ьеи

Ьеи

Агд

Ьуз

11е

Зег

Зег

О1и

Рго

Ьеи

Ьуз

75

80

85

дас

дад

ЬЬЬ

ааа

аас

аса

дда

Ьса

ддь

сЬс

сЬд

ддс

аЬд

дсЬ

аас

аЬЬ

524

Азр

О1и

РЬе

Ьуз

Азп

ТЬг

О1у

Зег

О1у

Ьеи

Ьеи

О1у

МеЬ

А1а

Азп

11е

90

95

100

дас

сЬд

даа

аад

адс

адд

асЬ

ддь

даЬ

даа

аЬЬ

аЬЬ

сЬЬ

ссд

ада

ддс

572

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

Зег

Агд

ТЬг

О1у

Азр

О1и

11е

11е

Ьеи

Рго

Агд

О1у

105

110

115

сЬс

дад

Ьас

асд

дЬд

даа

даа

Ьдс

асс

ЬдЬ

даа

дас

Ьдс

аЬс

аад

адс

620

Ьеи

О1и

Туг

ТЬг

Уа1

О1и

О1и

Суз

ТЬг

Суз

О1и

Азр

Суз

11е

Ьуз

Зег

120

125

130

ааа

ссд

аад

дЬс

дас

ЬсЬ

дас

саЬ

Ьдс

ЬЬЬ

сса

сЬс

сса

дсЬ

аЬд

дад

668

Ьуз

Рго

Ьуз

Уа1

Азр

Зег

Азр

Н1з

Суз

РЬе

Рго

Ьеи

Рго

А1а

МеЬ

О1и

135

140

145

150

даа

ддс

дса

асс

аЬЬ

сЬЬ

дЬс

асс

асд

ааа

асд

ааЬ

дас

ЬаЬ

Ьдс

аад

716

О1и

О1у

А1а

ТЬг

11е

Ьеи

Уа1

ТЬг

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Азп

Азр

Туг

Суз

Ьуз

155

160

165

- 35 030313

аде сЬд сса дсЬ дсЬ ЬЬд адЬ дсЬ асд дад аЬа дад ааа Ьса аЬЬ ЬсЬ 764

Зег Ьеи Рго А1а А1а Ьеи Зег А1а ТЬг О1и 11е О1и Ьуз Зег 11е Зег

170 175 180

дсЬ адд ЬааЬЬаасса ЬЬЬсдасЬсд адсадЬдсса сЬЬЬаааааЬ сЬЬЬЬдЬсад 820 А1а Агд

ааЬадаЬдаЬ дЬдЬсадаЬс ЬсЬЬЬаддаЬ дасЬдЬаЬЬЬ ЬЬсадЬЬдсс даЬасадсЬЬ 880

ЬЬЬдЬссЬсЬ аасЬдЬддаа асЬсЬЬЬаЬд ЬЬадаЬаЬаЬ ЬЬсЬсЬаддЬ ЬасЬдЬЬддд 940

адсЬЬааЬдд ЬадааасЬЬс сЬЬддЬЬЬса ЬдаЬЬааадЬ сЬЬЬЬЬЬЬЬЬ ссЬда 995

<210> 6

<211> 184

<212> РКТ

<213> Ьото заргепз

<400> 6

МеЬ 1

Ьеи

О1п МеЬ

А1а 5

О1у О1п

Суз

Зег

О1п Азп 10

О1и

Туг

РЬе

Азр 15

Зег

Ьеи

Ьеи

Н1з

А1а

Суз

11е

Рго

Суз

О1п

Ьеи

Агд

Суз

Зег

Зег

Азп

ТЬг

20

25

30

Рго

Рго

Ьеи

ТЬг

Суз

О1п

Агд

Туг

Суз

Азп

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

Зег

35

40

45

Уа1

Ьуз

О1у

ТЬг

Азп

А1а

11е

Ьеи

Тгр

ТЬг

Суз

Ьеи

О1у

Ьеи

Зег

Ьеи

50

55

60

11е

11е

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

РЬе

Уа1

Ьеи

МеЬ

РЬе

Ьеи

Ьеи

Агд

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Зег

О1и

Рго

Ьеи

Ьуз

Азр

О1и

РЬе

Ьуз

Азп

ТЬг

О1у

Зег

О1у

Ьеи

85

90

95

Ьеи

О1у

МеЬ

А1а

Азп

11е

Азр

Ьеи

О1и

Ьуз

Зег

Агд

ТЬг

О1у

Азр

О1и

100

105

110

11е

11е

Ьеи

Рго

Агд

О1у

Ьеи

О1и

Туг

ТЬг

Уа1

О1и

О1и

Суз

ТЬг

Суз

115

120

125

О1и

Азр

Суз

11е

Ьуз

Зег

Ьуз

Рго

Ьуз

Уа1

Азр

Зег

Азр

Н1з

Суз

РЬе

130

135

140

Рго

Ьеи

Рго

А1а

МеЬ

О1и

О1и

О1у

А1а

ТЬг

11е

Ьеи

Уа1

ТЬг

ТЬг

Ьуз

145

150

155

160

ТЬг

Азп

Азр

Туг

Суз

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Ьеи

Зег

А1а

ТЬг

О1и

165

170

175

11е

О1и

Ьуз

Зег

11е

Зег

А1а

Агд

180

<210> 7

<211> 1149

<212> ДНК

<213> Ьото зар1епз

<220>

<221> СЬЗ

<222> (173)...(1023)

<400> 7

дааЬЬсддса сдаддсадаа аддадааааЬ ЬсаддаЬаас ЬсЬссЬдадд ддЬдадссаа 60

дсссЬдссаЬ дЬадЬдсасд саддасаЬса асааасасад аЬаасаддаа аЬдаЬссаЬЬ 120

сссЬдЬддЬс асЬЬаЬЬсЬа ааддссссаа ссЬЬсааадЬ ЬсаадЬадЬд аЬ аЬд даЬ 178

МеЬ Азр 1

дас

Ьсс

аса

даа

адд

дад

сад

Ьса

сдс

сЬЬ

асЬ

ЬсЬ

Ьдс

сЬЬ

аад

ааа

226

Азр

Зег

ТЬг

О1и

Агд

О1и

О1п

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Зег

Суз

Ьеи

Ьуз

Ьуз

5

10

15

- 36 030313

ада Агд

даа О1и 20

даа О1и

абд Меб

ааа Ьуз

сбд Ьеи

аад Ьуз 25

дад О1и

бдб Суз

дбб Уа1

бсс Зег

абс 11е 30

сбс Ьеи

сса Рго

сдд Агд

аад Ьуз

274

даа

адс

ссс

бсб

дбс

сда

бсс

бсс

ааа

дас

дда

аад

сбд

сбд

дсб

дса

322

О1и

Зег

Рго

Зег

Уа1

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Азр

О1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

А1а

А1а

35

40

45

50

асе

ббд

сбд

сбд

дса

сбд

сбд

бсб

бдс

бдс

сбс

асд

дбд

дбд

бсб

ббс

370

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

Суз

Суз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Уа1

Зег

РЬе

55

60

65

бас

сад

дбд

дсс

дсс

сбд

саа

ддд

дас

сбд

дсс

адс

сбс

сдд

дса

дад

418

Туг

О1п

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1п

О1у

Азр

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

70

75

80

сбд

сад

ддс

сас

сас

дсд

дад

аад

сбд

сса

дса

дда

дса

дда

дсс

ссс

466

Ьеи

О1п

О1у

Нчз

Нчз

А1а

О1и

Ьуз

Ьеи

Рго

А1а

О1у

А1а

О1у

А1а

Рго

85

90

95

аад

дсс

ддс

сбд

дад

даа

дсб

сса

дсб

дбс

асс

дсд

дда

сбд

ааа

абс

514

Ьуз

А1а

О1у

Ьеи

О1и

О1и

А1а

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

О1у

Ьеи

Ьуз

11е

100

105

110

ббб

даа

сса

сса

дсб

сса

дда

даа

ддс

аас

бсс

адб

сад

аас

адс

ада

562

РЬе

О1и

Рго

Рго

А1а

Рго

О1у

О1и

О1у

Азп

Зег

Зег

О1п

Азп

Зег

Агд

115

120

125

130

ааб

аад

сдб

дсс

дбб

сад

ддб

сса

даа

даа

аса

дбс

асб

саа

дас

бдс

610

Азп

Ьуз

Агд

А1а

Уа1

О1п

О1у

Рго

О1и

О1и

ТЬг

Уа1

ТЬг

О1п

Азр

Суз

135

140

145

ббд

саа

сбд

абб

дса

дас

адб

даа

аса

сса

асб

аба

саа

ааа

дда

бсб

658

Ьеи

О1п

Ьеи

11е

А1а

Азр

Зег

О1и

ТЬг

Рго

ТЬг

11е

О1п

Ьуз

О1у

Зег

150

155

160

бас

аса

ббб

дбб

сса

бдд

сбб

сбс

адс

ббб

ааа

адд

дда

адб

дсс

сба

706

Туг

ТЬг

РЬе

Уа1

Рго

Тгр

Ьеи

Ьеи

Зег

РЬе

Ьуз

Агд

О1у

Зег

А1а

Ьеи

165

170

175

даа

даа

ааа

дад

ааб

ааа

аба

ббд

дбс

ааа

даа

асб

ддб

бас

ббб

ббб

754

О1и

О1и

Ьуз

О1и

Азп

Ьуз

11е

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

ТЬг

О1у

Туг

РЬе

РЬе

180

185

190

аба

баб

ддб

сад

дбб

бба

баб

асб

даб

аад

асс

бас

дсс

абд

дда

саб

802

11е

Туг

О1у

О1п

Уа1

Ьеи

Туг

ТЬг

Азр

Ьуз

ТЬг

Туг

А1а

Меб

О1у

Нчз

195

200

205

210

сба

абб

сад

адд

аад

аад

дбс

саб

дбс

ббб

ддд

даб

даа

ббд

адб

сбд

850

Ьеи

11е

О1п

Агд

Ьуз

Ьуз

Уа1

Нчз

Уа1

РЬе

О1у

Азр

О1и

Ьеи

Зег

Ьеи

215

220

225

дбд

асб

ббд

ббб

сда

бдб

абб

саа

ааб

абд

ссб

даа

аса

сба

ссс

ааб

898

Уа1

ТЬг

Ьеи

РЬе

Агд

Суз

11е

О1п

Азп

Меб

Рго

О1и

ТЬг

Ьеи

Рго

Азп

230

235

240

ааб

бсс

бдс

баб

бса

дсб

ддс

абб

дса

ааа

сбд

даа

даа

дда

даб

даа

946

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

О1у

11е

А1а

Ьуз

Ьеи

О1и

О1и

О1у

Азр

О1и

245

250

255

сбс

саа

сбб

дса

аба

сса

ада

даа

ааб

дса

саа

аба

бса

сбд

даб

дда

994

Ьеи

О1п

Ьеи

А1а

11е

Рго

Агд

О1и

Азп

А1а

О1п

11е

Зег

Ьеи

Азр

О1у

- 37 030313

	260					265			270
дак	дкс	аса	ккк	ккк	ддк	дса	ккд	ааа	ск дскдкдасск асккасасса	1043
Азр	Уа1	Ткг	РНе	РНе	О1у	А1а	Ьеи	Ьуз
275					280

кдкскдкадс какккксскс сскккскскд касскскаад аадааадаак скааскдааа 1103 акассааааа аааааааааа аааааааааа сссксдадсд дссдсс 1149

<210> 8

<211> 283

<212> РКТ

<213> Ното зарчепз

<400> 8

Мек

Азр

Азр

Зег

ТНг

О1и

Агд

О1и

О1п

Зег

Агд

Ьеи

ТНг

Зег

Суз

Ьеи

1

5

10

15

Ьуз

Ьуз

Агд

О1и

О1и

Мек

Ьуз

Ьеи

Ьуз

О1и

Суз

Уа1

Зег

11е

Ьеи

Рго

20

25

30

Агд

Ьуз

О1и

Зег

Рго

Зег

Уа1

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Азр

О1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

35

40

45

А1а

А1а

ТНг

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

Суз

Суз

Ьеи

ТНг

Уа1

Уа1

50

55

60

Зег

РНе

Туг

О1п

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

О1п

О1у

Азр

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Агд

65

70

75

80

А1а

О1и

Ьеи

О1п

О1у

Нчз

Нчз

А1а

О1и

Ьуз

Ьеи

Рго

А1а

О1у

А1а

О1у

85

90

95

А1а

Рго

Ьуз

А1а

О1у

Ьеи

О1и

О1и

А1а

Рго

А1а

Уа1

ТНг

А1а

О1у

Ьеи

100

105

110

Ьуз

11е

РНе

О1и

Рго

Рго

А1а

Рго

О1у

О1и

О1у

Азп

Зег

Зег

О1п

Азп

115

120

125

Зег

Агд

Азп

Ьуз

Агд

А1а

Уа1

О1п

О1у

Рго

О1и

О1и

ТНг

Уа1

ТНг

О1п

130

135

140

Азр

Суз

Ьеи

О1п

Ьеи

11е

А1а

Азр

Зег

О1и

ТНг

Рго

ТНг

11е

О1п

Ьуз

145

150

155

160

О1у

Зег

Туг

ТНг

РНе

Уа1

Рго

Тгр

Ьеи

Ьеи

Зег

РНе

Ьуз

Агд

О1у

Зег

165

170

175

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз

О1и

Азп

Ьуз

11е

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1и

ТНг

О1у

Туг

180

185

190

РНе

РНе

11е

Туг

О1у

О1п

Уа1

Ьеи

Туг

ТНг

Азр

Ьуз

ТНг

Туг

А1а

Мек

195

200

205

О1у

Нчз

Ьеи

11е

О1п

Агд

Ьуз

Ьуз

Уа1

Нчз

Уа1

РНе

О1у

Азр

О1и

Ьеи

210

215

220

Зег

Ьеи

Уа1

ТНг

Ьеи

РНе

Агд

Суз

11е

О1п

Азп

Мек

Рго

О1и

ТНг

Ьеи

225

230

235

240

Рго

Азп

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

О1у

11е

А1а

Ьуз

Ьеи

О1и

О1и

О1у

245

250

255

Азр

О1и

Ьеи

О1п

Ьеи

А1а

11е

Рго

Агд

О1и

Азп

А1а

О1п

11е

Зег

Ьеи

260

265

270

Азр

О1у

Азр

Уа1

ТНг

РНе

РНе

О1у

А1а

Ьеи

Ьуз

275

280

<210> 9

<211> 1680

<212> ДНК

<213> тиз тизси1из

<220>

<221> СЕ>5

<222> (164)...(1093)

<400> 9

- 38 030313

ЬасЬсасЬаЬ адддсЬсдад сддссдсссд ддсаддЬдсЬ ссЬдддддаа сссадсссЬд 60 ссаЬдсЬсЬд адддсадЬсЬ сссаддасас адаЬдасадд аааЬдассса ссссЬдЬддЬ 120 сасЬЬасЬсс аааддссЬад ассЬЬсааад ЬдсЬссЬсдЬ дда аЬд даЬ дад ЬсЬ 175

МеЬ Азр О1и Зег 1

дса А1а 5

аад Ьуз

асс ТЬг

сЬд Ьеи

сса Рго

сса Рго 10

ссд Рго

Ьдс Суз

сЬс Ьеи

ЬдЬ Суз

ЬЬЬ РЬе 15

Ьдс Суз

Ьсс Зег

дад О1и

ааа Ьуз

дда О1у 20

223

даа

даЬ

аЬд

ааа

дЬд

дда

ЬаЬ

даЬ

ссс

аЬс

асЬ

ссд

сад

аад

дад

дад

271

О1и

Азр

МеЬ

Ьуз

Уа1 25

О1у

Туг

Азр

Рго

11е 30

ТЬг

Рго

О1п

Ьуз

О1и 35

О1и

ддЬ

дсс

Ьдд

ЬЬЬ

ддд

аЬс

Ьдс

адд

даЬ

дда

адд

сЬд

сЬд

дсЬ

дсЬ

асс

319

О1у

А1а

Тгр

РЬе 40

О1у

11е

Суз

Агд

Азр 45

О1у

Агд

Ьеи

Ьеи

А1а 50

А1а

ТЬг

сЬс

сЬд

сЬд

дсс

сЬд

ЬЬд

Ьсс

адс

адЬ

ЬЬс

аса

дсд

аЬд

Ьсс

ЬЬд

Ьас

367

Ьеи

Ьеи

Ьеи 55

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег 60

Зег

РЬе

ТЬг

А1а

МеЬ 65

Зег

Ьеи

Туг

сад

ЬЬд

дсЬ

дсс

ЬЬд

саа

дса

дас

сЬд

аЬд

аас

сЬд

сдс

аЬд

дад

сЬд

415

О1п

Ьеи 70

А1а

А1а

Ьеи

О1п

А1а 75

Азр

Ьеи

МеЬ

Азп

Ьеи 80

Агд

МеЬ

О1и

Ьеи

сад

адс

Ьас

сда

ддЬ

Ьса

дса

аса

сса

дсс

дсс

дсд

ддЬ

дсЬ

сса

дад

463

О1п 85

Зег

Туг

Агд

О1у

Зег 90

А1а

ТЬг

Рго

А1а

А1а 95

А1а

О1у

А1а

Рго

О1и 100

ЬЬд

асс

дсЬ

дда

дЬс

ааа

сЬс

сЬд

аса

ссд

дса

дсЬ

ссЬ

сда

ссс

сас

511

Ьеи

ТЬг

А1а

О1у

Уа1 105

Ьуз

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Рго 110

А1а

А1а

Рго

Агд

Рго 115

Н1з

аас

Ьсс

адс

сдс

ддс

сас

адд

аас

ада

сдс

дсЬ

ЬЬс

сад

дда

сса

дад

559

Азп

Зег

Зег

Агд 120

О1у

Н1з

Агд

Азп

Агд 125

Агд

А1а

РЬе

О1п

О1у 130

Рго

О1и

даа

аса

даа

саа

даЬ

дЬа

дас

сЬс

Ьса

дсЬ

ссЬ

ссЬ

дса

сса

Ьдс

сЬд

607

О1и

ТЬг

О1и 135

О1п

Азр

Уа1

Азр

Ьеи 140

Зег

А1а

Рго

Рго

А1а 145

Рго

Суз

Ьеи

ссЬ

дда

Ьдс

сдс

саЬ

ЬсЬ

саа

саЬ

даЬ

даЬ

ааЬ

дда

аЬд

аас

сЬс

ада

655

Рго

О1у 150

Суз

Агд

Н1з

Зег

О1п 155

Н1з

Азр

Азр

Азп

О1у 160

МеЬ

Азп

Ьеи

Агд

аас

аЬс

аЬЬ

саа

дас

ЬдЬ

сЬд

сад

сЬд

аЬЬ

дса

дас

адс

дас

асд

ссд

703

Азп 165

11е

11е

О1п

Азр

Суз 170

Ьеи

О1п

Ьеи

11е

А1а 175

Азр

Зег

Азр

ТЬг

Рго 180

асЬ

аЬа

сда

ааа

дда

асЬ

Ьас

аса

ЬЬЬ

дЬЬ

сса

Ьдд

сЬЬ

сЬс

адс

ЬЬЬ

751

ТЬг

11е

Агд

Ьуз

О1у 185

ТЬг

Туг

ТЬг

РЬе

Уа1 190

Рго

Тгр

Ьеи

Ьеи

Зег 195

РЬе

ааа

ада

дда

ааЬ

дсс

ЬЬд

дад

дад

ааа

дад

аас

ааа

аЬа

дЬд

дЬд

адд

799

Ьуз

Агд

О1у

Азп 200

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз 205

О1и

Азп

Ьуз

11е

Уа1 210

Уа1

Агд

саа

аса

ддс

ЬаЬ

ЬЬс

ЬЬс

аЬс

Ьас

адс

сад

дЬЬ

сЬа

Ьас

асд

дас

ссс

847

О1п

ТЬг

О1у 215

Туг

РЬе

РЬе

11е

Туг 220

Зег

О1п

Уа1

Ьеи

Туг 225

ТЬг

Азр

Рго

аЬс

ЬЬЬ

дсЬ

аЬд

ддЬ

саЬ

дЬс

аЬс

сад

адд

аад

ааа

дЬа

сас

дЬс

ЬЬЬ

895

- 39 030313

11е

РЬе 230

А1а

МеЕ

О1у

Ηΐ3

Уа1 235

11е

О1п

Агд

Ьуз

Ьуз 240

Уа1

Н1з

Уа1

РЬе

ддд

дас

дад

сЕд

адс

сЕд

дЕд

асс

сЕд

ЕЕс

сда

ЕдЕ

аЕЕ

сад

ааЕ

аЕд

943

О1у

Азр

О1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

РЬе

Агд

Суз

11е

О1п

Азп

МеЕ

245

250

255

260

ссс

ааа

аса

сЕд

ссс

аас

ааЕ

Есс

Едс

Еас

Есд

дсЕ

ддс

аЕс

дсд

адд

991

Рго

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Рго

Азп

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

О1у

11е

А1а

Агд

265

270

275

сЕд

даа

даа

дда

даЕ

дад

аЕЕ

сад

сЕЕ

дса

аЕЕ

ссЕ

сдд

дад

ааЕ

дса

1039

Ьеи

О1и

О1и

О1у

Азр

О1и

11е

О1п

Ьеи

А1а

11е

Рго

Агд

О1и

Азп

А1а

280

285

290

сад

аЕЕ

Еса

сдс

аас

дда

дас

дас

асс

ЕЕс

ЕЕЕ

ддЕ

дсс

сЕа

ааа

сЕд

1087

О1п

11е

Зег

Агд

Азп

О1у

Азр

Азр

ТЬг

РЬе

РЬе

О1у

А1а

Ьеи

Ьуз

Ьеи

295

300

305

сЕд Еаа сЕсасЕЕдсЕ ддадЕдсдЕд аЕссссЕЕсс сЕсдЕсЕЕсЕ сЕдЕассЕсс 1143 Ьеи *

дадддадааа садасдасЕд дааааасЕаа аадаЕдддда аадссдЕсад сдааадЕЕЕЕ 1203

сЕсдЕдассс дЕЕдааЕсЕд аЕссааасса ддаааЕаЕаа садасадсса саассдаадЕ 1263

дЕдссаЕдЕд адЕЕаЕдада аасддадссс дсдсЕсадаа адассддаЕд аддаадассд 1323

ЕЕЕЕсЕссад ЕссЕЕЕдсса асасдсассд саассЕЕдсЕ ЕЕЕЕдссЕЕд ддЕдасасаЕ 1383

дЕЕсадааЕд садддадаЕЕ ЕссЕЕдЕЕЕЕ дсдаЕЕЕдсс аЕдадаадад ддсссасаас 1443

ЕдсаддЕсас ЕдаадсаЕЕс асдсЕаадЕс ЕсаддаЕЕЕа сЕсЕсссЕЕс ЕсаЕдсЕаад 1503

Еасасасасд сЕсЕЕЕЕсса ддЕааЕасЕа ЕдддаЕасЕа ЕддаааддЕЕ дЕЕЕдЕЕЕЕЕ 1563

аааЕсЕадаа дЕсЕЕдаасЕ ддсааЕадас аааааЕссЕЕ аЕаааЕЕсаа дЕдЕааааЕа 1623

аасЕЕааЕЕа ааааддЕааа аааааааааа аааааааааа аааааааааа ааааааа 1680

<210> 10

<211> 309

<212> РКТ

<213> тиз тизси1из

<400> 10

МеЕ

Азр

О1и

Зег

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Рго

Суз

Ьеи

Суз

РЬе

Суз

1

5

10

15

Зег

О1и

Ьуз

О1у

О1и

Азр

МеЕ

Ьуз

Уа1

О1у

Туг

Азр

Рго

11е

ТЬг

Рго

20

25

30

О1п

Ьуз

О1и

О1и

О1у

А1а

Тгр

РЬе

О1у

11е

Суз

Агд

Азр

О1у

Агд

Ьеи

35

40

45

Ьеи

А1а

А1а

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег

Зег

РЬе

ТЬг

А1а

50

55

60

МеЕ

Зег

Ьеи

Туг

О1п

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

О1п

А1а

Азр

Ьеи

МеЕ

Азп

Ьеи

65

70

75

80

Агд

МеЕ

О1и

Ьеи

О1п

Зег

Туг

Агд

О1у

Зег

А1а

ТЬг

Рго

А1а

А1а

А1а

85

90

95

О1у

А1а

Рго

О1и

Ьеи

ТЬг

А1а

О1у

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Рго

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Агд

Рго

Н1з

Азп

Зег

Зег

Агд

О1у

Н1з

Агд

Азп

Агд

Агд

А1а

РЬе

115

120

125

О1п

О1у

Рго

О1и

О1и

ТЬг

О1и

О1п

Азр

Уа1

Азр

Ьеи

Зег

А1а

Рго

Рго

130

135

140

А1а

Рго

Суз

Ьеи

Рго

О1у

Суз

Агд

Н1з

Зег

О1п

Н1з

Азр

Азр

Азп

О1у

145

150

155

160

МеЕ

Азп

Ьеи

Агд

Азп

11е

11е

О1п

Азр

Суз

Ьеи

О1п

Ьеи

11е

А1а

Азр

165

170

175

Зег

Азр

ТЬг

Рго

ТЬг

11е

Агд

Ьуз

О1у

ТЬг

Туг

ТЬг

РЬе

Уа1

Рго

Тгр

180

185

190

- 40 030313

Ьеи

Ьеи

Зег 195

РЬе

Ьуз

Агд

О1у

Азп 200

А1а

Ьеи

О1и

О1и

Ьуз 205

О1и

Азп

Ьуз

11е

Уа1

Уа1

Агд

С1п

ТЬг

О1у

Туг

РЬе

РЬе

11е

Туг

Зег

О1п

Уа1

Ьеи

210

215

220

Туг

ТЬг

Азр

Рго

11е

РЬе

А1а

МеЬ

О1у

Нчз

Уа1

11е

О1п

Агд

Ьуз

Ьуз

225

230

235

240

Уа1

Нчз

Уа1

РЬе

О1у

Азр

О1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

ТЬг

Ьеи

РЬе

Агд

Суз

245

250

255

11е

О1п

Азп

МеЬ

Рго

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Рго

Азп

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

260

265

270

О1у

11е

А1а

Агд

Ьеи

О1и

О1и

О1у

Азр

О1и

11е

О1п

Ьеи

А1а

11е

Рго

275

280

285

Агд

О1и

Азп

А1а

О1п

11е

Зег

Агд

Азп

О1у

Азр

Азр

ТЬг

РЬе

РЬе

О1у

290

295

300

А1а

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Ьеи

305

<210> 11

<211> 185

<212> РКТ

<213> Ьото зарчепз

<400> 11

МеЬ

Агд

Агд

О1у

Рго

Агд

Зег

Ьеи

Агд

О1у

Агд

Азр

А1а

Рго

А1а

Рго

1

5

10

15

ТЬг

Рго

Суз

Уа1

Рго

А1а

О1и

Суз

РЬе

Азр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Агд

Нчз

Суз

20

25

30

Уа1

А1а

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

Агд

ТЬг

Рго

Агд

Рго

Ьуз

Рго

А1а

О1у

А1а

35

40

45

А1а

Зег

Зег

Рго

А1а

Рго

Агд

ТЬг

А1а

Ьеи

О1п

Рго

О1п

О1и

Зег

Уа1

50

55

60

О1у

А1а

О1у

А1а

О1у

О1и

А1а

А1а

Ьеи

Рго

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Ьеи

РЬе

65

70

75

80

О1у

А1а

Рго

А1а

Ьеи

Ьеи

О1у

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

85

90

95

Уа1

О1у

Ьеи

Уа1

Зег

Тгр

Агд

Агд

Агд

О1п

Агд

Агд

Ьеи

Агд

О1у

А1а

100

105

110

Зег

Зег

А1а

О1и

А1а

Рго

Азр

О1у

Азр

Ьуз

Азр

А1а

Рго

О1и

Рго

Ьеи

115

120

125

Азр

Ьуз

Уа1

11е

11е

Ьеи

Зег

Рго

О1у

11е

Зег

Азр

А1а

ТЬг

А1а

Рго

130

135

140

А1а

Тгр

Рго

Рго

Рго

О1у

О1и

Азр

Рго

О1у

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

О1у

Нчз

145

150

155

160

Зег

Уа1

Рго

Уа1

Рго

А1а

ТЬг

О1и

Ьеи

О1у

Зег

ТЬг

О1и

Ьеи

Уа1

ТЬг

165

170

175

ТЬг

Ьуз

ТЬг

А1а

О1у

Рго

О1и

О1п

О1п

180 185

<210> 12

<211> 247

<212> РКТ

<213> Ьото зарчепз

<400> 12

МеЬ

Зег

О1у

Ьеи

О1у

Агд

Зег

Агд

Агд

О1у

О1у

Агд

Зег

Агд

Уа1

Азр

1

5

10

15

С1п

О1и

О1и

Агд

Тгр

Зег

Ьеи

Зег

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

Ьуз

РЬе

20

25

30

Туг

Азр

Нчз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

11е

Зег

Суз

А1а

Зег

11е

Суз

О1у

35

40

45

О1п

Нчз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

РЬе

Суз

О1и

Азп

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

- 41 030313

50

55

60

Рго

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Рго

О1и

Ьеи

Агд

Агд

О1п

Агд

Зег

О1у

О1и

Уа1

65

70

75

80

О1и

Азп

Азп

Зег

Азр

Азп

Зег

О1у

Агд

Туг

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Н1з

Агд

85

90

95

О1у

Зег

О1и

А1а

Зег

Рго

А1а

Ьеи

Рго

О1у

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

А1а

Азр

100

105

110

О1п

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

Туг

Зег

ТЬг

Ьеи

О1у

Ьеи

Суз

Ьеи

Суз

А1а

Уа1

115

120

125

Ьеи

Суз

Суз

РЬе

Ьеи

Уа1

А1а

Уа1

А1а

Суз

РЬе

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Агд

О1у

130

135

140

Азр

Рго

Суз

Зег

Суз

О1п

Рго

Агд

Зег

Агд

Рго

Агд

О1п

Зег

Рго

А1а

145

150

155

160

Ьуз

Зег

Зег

О1п

Азр

Н1з

А1а

МеД

О1и

А1а

О1у

Зег

Рго

Уа1

Зег

ТЬг

165

170

175

Зег

Рго

О1и

Рго

Уа1

О1и

ТЬг

Суз

Зег

РЬе

Суз

РЬе

Рго

О1и

Суз

Агд

180

185

190

А1а

Рго

ТЬг

О1п

О1и

Зег

А1а

Уа1

ТЬг

Рго

О1у

ТЬг

Рго

Азр

Рго

ТЬг

195

200

205

Суз

А1а

С1у

Агд

Тгр

С1у

Суз

Н1з

ТЬг

Агд

ТЬг

ТЬг

Уа1

Ьеи

О1п

Рго

210

215

220

Суз

Рго

Н1з

11е

Рго

Азр

Зег

О1у

Ьеи

О1у

11е

Уа1

Суз

Уа1

Рго

А1а

225

230

235

240

О1п

О1и

С1у

С1у

Рго

О1у

А1а

245

<210> 13

<211> 17

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> БЬуЗ связывающий полипептид

<400> 13

О1и Суз РНе Азр Ьеи Ьеи Уа1 Агд А1а Тгр Уа1 Рго Суз Зег Уа1 Ьеи 1 5 10 15

Ьуз

<210> 14

<211> 17

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> БЬуЗ связывающий полипептид

<400> 14

О1и Суз РНе Азр Ьеи Ьеи Уа1 Агд Н1з Тгр Уа1 Рго Суз О1у Ьеи Ьеи 1 5 10 15

Агд

<210> 15

<211> 17

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 42 030313

<223> ВЬуЗ связывающий полипептид

<400> 15

О1и Суз РНе Азр Ьей	Ьей Уа1 Агд Агд Тгр Уа1 Рго Суз О1и Меб Ьей
1	5	10	15
С1у

<210>	16
<211>	17
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ВЬуЗ связывающий полипептид
<400>	16
О1и Суз РНе Азр Ьей Ьей Уа1 Агд Зег	Тгр	Уа1	Рго	Суз	Нбз	Меб	Ьей
1	5	10					15
Агд
<210>	17
<211>	17
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ВЬуЗ связывающий полипептид
<400>	17
О1и Суз РНе Азр Ьей Ьей Уа1 Агд Нбз	Тгр	Уа1	А1а	Суз	С1у	Ьей	Ьей
1	5	10					15

Агд

<210> 18

<211> 1214

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Ьс слитый белок

<221> СЬЗ

<222> (17)...(1192)

<400> 18

баббаддссд дссасс абд даб дса абд аад ада ддд обо бдс бдб дбд сбд 52 Меб Азр А1а Меб Ьуз Агд О1у Ьей Суз Суз Уа1 Ьей

1 5 10

сбд Ьей

сбд Ьей

бдб Суз 15

ддс О1у

дсс А1а

дбс Уа1

ббс РНе

дбб Уа1 20

бсд Зег

сбс Ьей

адс Зег

сад О1п

даа О1и 25

абс 11е

саб Нбз

дсс А1а

100

дад

ббд

ада

сдс

ббс

сдб

ада

дсб

абд

ада

бсс

бдс

ссс

даа

дад

сад

148

О1и

Ьей

Агд

Агд

РНе

Агд

Агд

А1а

Меб

Агд

Зег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

30

35

40

- 43 030313

5ас Туг 45

5дд Тгр

да5 Азр

сс5 Рго

с5д Ьеи

с5д Ьеи 50

дд5 О1у

асс ТЬг

5дс Суз

а5д Ме5

5сс Зег 55

5дс Суз

ааа Ьуз

асс ТЬг

а55 11е

5дс Суз 60

196

аас

са5

сад

адс

сад

сдс

асс

5д5

дса

дсс

55с

5дс

адд

5са

с5с

адс

244

Азп

Ηΐ3

О1п

Зег

О1п

Агд

ТЬг

Суз

А1а

А1а

РЬе

Суз

Агд

Зег

Ьеи

Зег

65

70

75

5дс

сдс

аад

дад

саа

ддс

аад

55с

5а5

дас

са5

с5с

с5д

адд

дас

5дс

292

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

Ьуз

РЬе

Туг

Азр

Н1з

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

80

85

90

а5с

адс

5д5

дсс

5сс

а5с

5д5

дда

сад

сас

сс5

аад

саа

5д5

дса

5ас

340

11е

Зег

Суз

А1а

Зег

11е

Суз

О1у

О1п

Н1з

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

95

100

105

55с

5д5

дад

аас

аад

с5с

адд

адс

сса

д5д

аас

с55

сса

сса

дад

с5с

388

РЬе

Суз

О1и

Азп

Ьуз

Ьеи

Агд

Зег

Рго

Уа1

Азп

Ьеи

Рго

Рго

О1и

Ьеи

110

115

120

адд

ада

сад

сдд

ад5

дда

даа

д55

даа

аас

аа5

5са

дас

аас

5сд

дда

436

Агд

Агд

О1п

Агд

Зег

О1у

О1и

Уа1

О1и

Азп

Азп

Зег

Азр

Азп

Зег

О1у

125

130

135

140

адд

5ас

саа

дда

55д

дад

сас

ада

ддс

5са

даа

дса

ад5

сса

дс5

с5с

484

Агд

Туг

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Н1з

Агд

О1у

Зег

О1и

А1а

Зег

Рго

А1а

Ьеи

145

150

155

сса

дд5

с5с

аад

дад

ссс

ааа

5с5

5са

дас

ааа

ас5

сас

аса

5дс

сса

532

Рго

О1у

Ьеи

Ьуз

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Зег

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

160

165

170

ссд

5дс

сса

дса

сс5

даа

дсс

дад

ддд

дса

ссд

5са

д5с

55с

с5с

55с

580

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

175

180

185

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асс

с5с

а5д

а5с

5сс

сдд

асс

сс5

дад

д5с

628

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Ме5

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

О1и

Уа1

190

195

200

аса

5дс

д5д

д5д

д5д

дас

д5д

адс

сас

даа

дас

сс5

дад

д5с

аад

55с

676

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЬе

205

210

215

220

аас

5дд

5ас

д5д

дас

ддс

д5д

дад

д5д

са5

аа5

дсс

аад

аса

аад

ссд

724

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

225

230

235

сдд

дад

дад

сад

5ас

аас

адс

асд

5ас

сд5

д5д

д5с

адс

д5с

с5с

асс

772

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

240

245

250

д5с

с5д

сас

сад

дас

5дд

с5д

аа5

ддс

аад

дад

5ас

аад

5дс

аад

д5с

820

ναι

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

255

260

265

5сс

аас

ааа

дсс

с5с

сса

5сс

5сс

а5с

дад

ааа

асс

а5с

5сс

ааа

дсс

868

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

270

275

280

ааа

ддд

сад

ссс

сда

даа

сса

сад

д5д

5ас

асс

с5д

ссс

сса

5сс

сдд

916

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

285

290

295

300

- 44 030313

даЕ Азр

дад О1и

сЕд Ьеи

асс ТЬг

аад Ьуз 305

аас Азп

сад О1п

дЕс Уа1

адс Зег

сЕд Ьеи 310

асс ТЬг

Едс Суз

сЕд Ьеи

дЕс Уа1

ааа Ьуз 315

ддс О1у

964

ЕЕс

ЕаЕ

ссс

адс

дас

аЕс

дсс

дЕд

дад

Едд

дад

адс

ааЕ

ддд

сад

ссд

1012

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

320

325

330

дад

аас

аас

Еас

аад

асс

асд

ссЕ

ссс

дЕд

сЕд

дас

Есс

дас

ддс

Есс

1060

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

335

340

345

ЕЕс

ЕЕс

сЕс

Еас

адс

аад

сЕс

асс

дЕд

дас

аад

адс

адд

Едд

сад

сад

1108

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

350

355

360

ддд

аас

дЕс

ЕЕс

Еса

Едс

Есс

дЕд

аЕд

саЕ

дад

дсЕ

сЕд

сас

аас

сас

1156

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

365

370

375

380

Еас

асд

сад

аад

адс

сЕс

Есс

сЕд

ЕсЕ

ссд

ддЕ

ааа

ЕааЕсЕадад

1202

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

385 390

дсдсдссааЕ Еа 1214

<210> 19

<211> 392

<212> РКТ

<213> Искусственная	последовательность
<220>
<223> ТАС1-Рс слитый белок
<400> 19
МеЕ Азр А1а МеЕ Ьуз	Агд О1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Суз О1у
1 5	10 15
А1а Уа1 РЬе Уа1 Зег	Ьеи Зег О1п О1и 11е Н1з А1а О1и Ьеи Агд Агд
20	25 30
РЬе Агд Агд А1а МеЕ	Агд Зег Суз Рго О1и О1и О1п Туг Тгр Азр Рго
35	40 45
Ьеи Ьеи О1у ТЬг Суз	МеЕ Зег Суз Ьуз ТЬг 11е Суз Азп Н1з О1п Зег
50	55 60
О1п Агд ТЬг Суз А1а	А1а РЬе Суз Агд Зег Ьеи Зег Суз Агд Ьуз О1и
65	70 75 80
О1п О1у Ьуз РЬе Туг	Азр Н1з Ьеи Ьеи Агд Азр Суз 11е Зег Суз А1а
85	90 95
Зег 11е Суз О1у О1п	Н1з Рго Ьуз О1п Суз А1а Туг РЬе Суз О1и Азп
100	105 110
Ьуз Ьеи Агд Зег Рго	Уа1 Азп Ьеи Рго Рго О1и Ьеи Агд Агд О1п Агд
115	120 125
Зег О1у О1и Уа1 О1и	Азп Азп Зег Азр Азп Зег О1у Агд Туг О1п О1у
130	135 140
Ьеи О1и Н1з Агд О1у	Зег О1и А1а Зег Рго А1а Ьеи Рго О1у Ьеи Ьуз
145	150 155 160
О1и Рго Ьуз Зег Зег	Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а
165	170 175
Рго О1и А1а О1и О1у	А1а Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго
180	185 190
Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЕ	11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1
195	200 205
Уа1 Азр Уа1 Зег Нтз	О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1

- 45 030313

210

215

220

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Няз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

225

230

235

240

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Няз

О1п

245

250

255

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

260

265

270

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

275

280

285

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЬг

290

295

300

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

305

310

315

320

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

325

330

335

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

340

345

350

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЬе

355

360

365

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Няз

О1и

А1а

Ьеи

Нтз

Азп

Няз

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

370

375

380

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

385

390

<210> 20

<211> 1070

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Рс слитый белок

<221> СЕ>5

<222> (17)...(1048)

<400> 20

баббаддссд дссасс абд даб дса абд аад ада ддд сбс бдс бдб дбд сбд 52 Меб Азр А1а Меб Ьуз Агд О1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи

1 5 10

сбд Ьеи

сбд Ьеи

бдб Суз 15

ддс О1у

дсс А1а

дбс Уа1

ббс РЬе

дбб Уа1 20

бсд Зег

сбс Ьеи

адс Зег

сад О1п

даа О1и 25

абс 11е

саб Няз

дсс А1а

100

дад

ббд

ада

сдс

ббс

сдб

ада

дсб

абд

ада

бсс

бдс

ссс

даа

дад

сад

148

О1и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

Агд

Агд

А1а

Меб

Агд

Зег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

30

35

40

бас

бдд

даб

ссб

сбд

сбд

ддб

асс

бдс

абд

бсс

бдс

ааа

асс

абб

бдс

196

Туг

Тгр

Азр

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

ТЬг

Суз

Меб

Зег

Суз

Ьуз

ТЬг

11е

Суз

45

50

55

60

аас

саб

сад

адс

сад

сдс

асс

бдб

дса

дсс

ббс

бдс

адд

бса

сбс

адс

244

Азп

Няз

О1п

Зег

О1п

Агд

ТЬг

Суз

А1а

А1а

РЬе

Суз

Агд

Зег

Ьеи

Зег

65

70

75

бдс

сдс

аад

дад

саа

ддс

аад

ббс

баб

дас

саб

сбс

сбд

адд

дас

бдс

292

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

Ьуз

РЬе

Туг

Азр

Няз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

80

85

90

абс

адс

бдб

дсс

бсс

абс

бдб

дда

сад

сас

ссб

аад

саа

бдб

дса

бас

340

11е

Зег

Суз

А1а

Зег

11е

Суз

О1у

О1п

Нтз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

- 46 030313

95

100

105

ЕЕс

ЕдЕ

дад

аас

дад

ссс

ааа

ЕсЕ

Еса

дас

ааа

асЕ

сас

аса

Едс

сса

388

РЬе

Суз

О1и

Азп

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Зег

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

110

115

120

ссд

Едс

сса

дса

ссЕ

даа

дсс

дад

ддд

дса

ссд

Еса

дЕс

ЕЕс

сЕс

ЕЕс

436

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

125

130

135

140

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асс

сЕс

аЕд

аЕс

Есс

сдд

асс

ссЕ

дад

дЕс

484

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

О1и

Уа1

145

150

155

аса

Едс

дЕд

дЕд

дЕд

дас

дЕд

адс

сас

даа

дас

ссЕ

дад

дЕс

аад

ЕЕс

532

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЬе

160

165

170

аас

Едд

Еас

дЕд

дас

ддс

дЕд

дад

дЕд

саЕ

ааЕ

дсс

аад

аса

аад

ссд

580

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

175

180

185

сдд

дад

дад

сад

Еас

аас

адс

асд

Еас

сдЕ

дЕд

дЕс

адс

дЕс

сЕс

асс

628

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

190

195

200

дЕс

сЕд

сас

сад

дас

Едд

сЕд

ааЕ

ддс

аад

дад

Еас

аад

Едс

аад

дЕс

676

Уа1

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

205

210

215

220

Есс

аас

ааа

дсс

сЕс

сса

Есс

Есс

аЕс

дад

ааа

асс

аЕс

Есс

ааа

дсс

724

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

225

230

235

ааа

ддд

сад

ссс

сда

даа

сса

сад

дЕд

Еас

асс

сЕд

ссс

сса

Есс

сдд

772

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

240

245

250

даЕ

дад

сЕд

асс

аад

аас

сад

дЕс

адс

сЕд

асс

Едс

сЕд

дЕс

ааа

ддс

820

Азр

О1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

255

260

265

ЕЕс

ЕаЕ

ссс

адс

дас

аЕс

дсс

дЕд

дад

Едд

дад

адс

ааЕ

ддд

сад

ссд

868

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

270

275

280

дад

аас

аас

Еас

аад

асс

асд

ссЕ

ссс

дЕд

сЕд

дас

Есс

дас

ддс

Есс

916

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

285

290

295

300

ЕЕс

ЕЕс

сЕс

Еас

адс

аад

сЕс

асс

дЕд

дас

аад

адс

адд

Едд

сад

сад

964

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

305

310

315

ддд

аас

дЕс

ЕЕс

Еса

Едс

Есс

дЕд

аЕд

саЕ

дад

дсЕ

сЕд

сас

аас

сас

101

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

320

325

330

Еас

асд

сад

аад

адс

сЕс

Есс

сЕд

ЕсЕ

ссд

ддЕ

ааа

ЕааЕсЕадад

105

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

335

340

дсдсдссааЕ Еа 1070

- 47 030313

<210> 21

<211> 344

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Рс слитый белок

<400> 21

Меб

Азр

А1а

Меб

Ьуз

Агд

О1у

Ьеи

Суз

Суз

Уа1

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Суз

О1у

1

5

10

15

А1а

Уа1

Рйе

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

О1п

О1и

11е

Няз

А1а

О1и

Ьеи

Агд

Агд

20

25

30

Рйе

Агд

Агд

А1а

Меб

Агд

Зег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

Туг

Тгр

Азр

Рго

35

40

45

Ьеи

Ьеи

О1у

Тйг

Суз

Меб

Зег

Суз

Ьуз

Тйг

11е

Суз

Азп

Няз

О1п

Зег

50

55

60

О1п

Агд

ТЬг

Суз

А1а

А1а

Рйе

Суз

Агд

Зег

Ьеи

Зег

Суз

Агд

Ьуз

О1и

65

70

75

80

О1п

О1у

Ьуз

Рйе

Туг

Азр

Няз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

11е

Зег

Суз

А1а

85

90

95

Зег

11е

Суз

О1у

О1п

Няз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

Рйе

Суз

О1и

Азп

100

105

110

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Зег

Азр

Ьуз

Тйг

Няз

Тйг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

115

120

125

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

А1а

Рго

Зег

Уа1

Рйе

Ьеи

Рйе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

130

135

140

Ьуз

Азр

Тйг

Ьеи

Меб

11е

Зег

Агд

Тйг

Рго

О1и

Уа1

Тйг

Суз

Уа1

Уа1

145

150

155

160

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Няз

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

Рйе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

165

170

175

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Няз

Азп

А1а

Ьуз

Тйг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

180

185

190

Туг

Азп

Зег

Тйг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

Тйг

Уа1

Ьеи

Няз

О1п

195

200

205

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

210

215

220

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

Тйг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

225

230

235

240

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

Тйг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

Тйг

245

250

255

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

Тйг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

Рйе

Туг

Рго

Зег

260

265

270

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

275

280

285

Ьуз

Тйг

Тйг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

Рйе

Рйе

Ьеи

Туг

290

295

300

Зег

Ьуз

Ьеи

Тйг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

Рйе

305

310

315

320

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Няз

О1и

А1а

Ьеи

Няз

Азп

Нтз

Туг

Тйг

О1п

Ьуз

325

330

335

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

340

<210> 22

<211> 1082

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Рс слитый белок

- 48 030313

<221> СОЗ

<222> (17)...(1060)

<400> 22

баббаддссд дссасс абд даб дса абд аад ада ддд сбс бдс бдб дбд сбд 52 Меб Азр А1а Меб Ьуз Агд О1у Ьей Суз Суз Уа1 Ьей

1 5 10

сбд Ьей

сбд Ьей

бдб Суз 15

ддс О1у

дсс А1а

дбс Уа1

ббс РНе

дбб Уа1 20

бсд Зег

сбс Ьей

адс Зег

сад О1п

даа О1и 25

абс 11е

саб Нбз

дсс А1а

100

дад

ббд

ада

сдс

ббс

сдб

ада

дсб

абд

ада

бсс

бдс

ссс

даа

дад

сад

148

О1и

Ьей

Агд

Агд

РНе

Агд

Агд

А1а

Меб

Агд

Зег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

30

35

40

бас

бдд

даб

ссб

сбд

сбд

ддб

асс

бдс

абд

бсс

бдс

ааа

асс

абб

бдс

196

Туг

Тгр

Азр

Рго

Ьей

Ьей

О1у

ТНг

Суз

Меб

Зег

Суз

Ьуз

ТНг

11е

Суз

45

50

55

60

аас

саб

сад

адс

сад

сдс

асс

бдб

дса

дсс

ббс

бдс

адд

бса

сбс

адс

244

Азп

Нбз

О1п

Зег

О1п

Агд

ТНг

Суз

А1а

А1а

РНе

Суз

Агд

Зег

Ьей

Зег

65

70

75

бдс

сдс

аад

дад

саа

ддс

аад

ббс

баб

дас

саб

сбс

сбд

адд

дас

бдс

292

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

Ьуз

РНе

Туг

Азр

Нбз

Ьей

Ьей

Агд

Азр

Суз

80

85

90

абс

адс

бдб

дсс

бсс

абс

бдб

дда

сад

сас

ссб

аад

саа

бдб

дса

бас

340

11е

Зег

Суз

А1а

Зег

11е

Суз

О1у

О1п

Нбз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

95

100

105

ббс

бдб

дад

аас

аад

сбс

адд

адс

дад

ссс

ааа

бсб

бса

дас

ааа

асб

388

РНе

Суз

О1и

Азп

Ьуз

Ьей

Агд

Зег

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Зег

Азр

Ьуз

ТНг

110

115

120

сас

аса

бдс

сса

ссд

бдс

сса

дса

ссб

даа

дсс

дад

ддд

дса

ссд

бса

436

Нбз

ТНг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

А1а

Рго

Зег

125

130

135

140

дбс

ббс

сбс

ббс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асс

сбс

абд

абс

бсс

сдд

484

Уа1

РНе

Ьей

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьей

Меб

11е

Зег

Агд

145

150

155

асс

ссб

дад

дбс

аса

бдс

дбд

дбд

дбд

дас

дбд

адс

сас

даа

дас

ссб

532

ТНг

Рго

О1и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нбз

О1и

Азр

Рго

160

165

170

дад

дбс

аад

ббс

аас

бдд

бас

дбд

дас

ддс

дбд

дад

дбд

саб

ааб

дсс

580

О1и

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Нбз

Азп

А1а

175

180

185

аад

аса

аад

ссд

сдд

дад

дад

сад

бас

аас

адс

асд

бас

сдб

дбд

дбс

628

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Зег

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

190

195

200

адс

дбс

сбс

асс

дбс

сбд

сас

сад

дас

бдд

сбд

ааб

ддс

аад

дад

бас

676

Зег

Уа1

Ьей

ТНг

Уа1

Ьей

Нбз

О1п

Азр

Тгр

Ьей

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

205

210

215

220

аад

бдс

аад

дбс

бсс

аас

ааа

дсс

сбс

сса

бсс

бсс

абс

дад

ааа

асс

724

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьей

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

ТНг

- 49 030313

225

230

235

а5с

5сс

ааа

дсс

ааа

ддд

сад

ссс

сда

даа

сса

сад

д5д

5ас

асс

с5д

772

11е

5ег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Ча1

Туг

ТИг

Ьеи

240

245

250

ссс

сса

5сс

сдд

да5

дад

с5д

асс

аад

аас

сад

д5с

адс

с5д

асс

5дс

820

Рго

Рго

5ег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТИг

Ьуз

Азп

О1п

Ча1

5ег

Ьеи

ТИг

Суз

255

260

265

с5д

д5с

ааа

ддс

55с

5а5

ссс

адс

дас

а5с

дсс

д5д

дад

5дд

дад

адс

868

Ьеи

Ча1

Ьуз

О1у

РИе

Туг

Рго

5ег

Азр

11е

А1а

Ча1

О1и

Тгр

О1и

5ег

270

275

280

аа5

ддд

сад

ссд

дад

аас

аас

5ас

аад

асс

асд

сс5

ссс

д5д

с5д

дас

916

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТИг

ТИг

Рго

Рго

Ча1

Ьеи

Азр

285

290

295

300

5сс

дас

ддс

5сс

55с

55с

с5с

5ас

адс

аад

с5с

асс

д5д

дас

аад

адс

964

5ег

Азр

О1у

5ег

РИе

РИе

Ьеи

Туг

5ег

Ьуз

Ьеи

ТИг

Ча1

Азр

Ьуз

5ег

305

310

315

адд

5дд

сад

сад

ддд

аас

д5с

55с

5са

5дс

5сс

д5д

а5д

са5

дад

дс5

101

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Ча1

РИе

5ег

Суз

5ег

Ча1

Ме5

Нтз

О1и

А1а

320

325

330

с5д

сас

аас

сас

5ас

асд

сад

аад

адс

с5с

5сс

с5д

5с5

ссд

дд5

ааа

106

Ьеи

Нтз

Азп

Нтз

Туг

ТИг

О1п

Ьуз

5ег

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

Рго

О1у

Ьуз

335 340 345

5аа5с5адад дсдсдссаа5 5а 1082

<210> 23

<211> 348

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Ес слитый белок

<400> 23

Ме5

Азр

А1а

Ме5

Ьуз

Агд

О1у

Ьеи

Суз

Суз

Ча1

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Суз

О1у

1

5

10

15

А1а

Ча1

РИе

Ча1

5ег

Ьеи

5ег

О1п

О1и

11е

Нтз

А1а

О1и

Ьеи

Агд

Агд

20

25

30

РИе

Агд

Агд

А1а

Ме5

Агд

5ег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

Туг

Тгр

Азр

Рго

35

40

45

Ьеи

Ьеи

О1у

ТИг

Суз

Ме5

5ег

Суз

Ьуз

ТИг

11е

Суз

Азп

Нтз

О1п

5ег

50

55

60

О1п

Агд

ТИг

Суз

А1а

А1а

РИе

Суз

Агд

5ег

Ьеи

5ег

Суз

Агд

Ьуз

О1и

65

70

75

80

О1п

О1у

Ьуз

РИе

Туг

Азр

Нтз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

11е

5ег

Суз

А1а

85

90

95

5ег

11е

Суз

О1у

О1п

Нтз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

РИе

Суз

О1и

Азп

100

105

110

Ьуз

Ьеи

Агд

5ег

О1и

Рго

Ьуз

5ег

5ег

Азр

Ьуз

ТИг

Нтз

ТИг

Суз

Рго

115

120

125

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

А1а

Рго

5ег

Ча1

РИе

Ьеи

РИе

130

135

140

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТИг

Ьеи

Ме5

11е

5ег

Агд

ТИг

Рго

О1и

Ча1

145

150

155

160

ТИг

Суз

Ча1

Ча1

Ча1

Азр

Ча1

5ег

Нтз

О1и

Азр

Рго

О1и

Ча1

Ьуз

РИе

165

170

175

- 50 030313

Азп

Тгр

Туг Уа1 180

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1 185

Нбз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг 190

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

195

200

205

Уа1

Ьеи

Нбз

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

210

215

220

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

225

230

235

240

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

245

250

255

Азр

О1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

260

265

270

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

275

280

285

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

290

295

300

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

305

310

315

320

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Нбз

О1и

А1а

Ьеи

Нтз

Азп

Нтз

325

330

335

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

340

345

<210> 24

<211> 1109

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Рс слитый белок

<221> СЕ>5

<222> (17)...(1090)

<400> 24

баббаддссд дссасс абд даб дса абд аад ада ддд сбс бдс бдб дбд сбд 52 Меб Азр А1а Меб Ьуз Агд О1у Ьеи Суз Суз Уа1 Ьеи

1 5 10

сбд Ьеи

сбд Ьеи

бдб Суз 15

ддс О1у

дсс А1а

дбс Уа1

ббс РЬе

дбб Уа1 20

бсд Зег

сбс Ьеи

адс Зег

сад О1п

даа О1и 25

абс 11е

саб Нбз

дсс А1а

100

дад

ббд

ада

сдс

ббс

сдб

ада

дсб

абд

ада

бсс

бдс

ссс

даа

дад

сад

148

О1и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

Агд

Агд

А1а

Меб

Агд

Зег

Суз

Рго

О1и

О1и

О1п

30

35

40

бас

бдд

даб

ссб

сбд

сбд

ддб

асс

бдс

абд

бсс

бдс

ааа

асс

абб

бдс

196

Туг

Тгр

Азр

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

ТЬг

Суз

Меб

Зег

Суз

Ьуз

ТЬг

11е

Суз

45

50

55

60

аас

саб

сад

адс

сад

сдс

асс

бдб

дса

дсс

ббс

бдс

адд

бса

сбс

адс

244

Азп

Нбз

О1п

Зег

О1п

Агд

ТЬг

Суз

А1а

А1а

РЬе

Суз

Агд

Зег

Ьеи

Зег

65

70

75

бдс

сдс

аад

дад

саа

ддс

аад

ббс

баб

дас

саб

сбс

сбд

адд

дас

бдс

292

Суз

Агд

Ьуз

О1и

О1п

О1у

Ьуз

РЬе

Туг

Азр

Нбз

Ьеи

Ьеи

Агд

Азр

Суз

80

85

90

абс

адс

бдб

дсс

бсс

абс

бдб

дда

сад

сас

ссб

аад

саа

бдб

дса

бас

340

11е

Зег

Суз

А1а

Зег

11е

Суз

О1у

О1п

Нтз

Рго

Ьуз

О1п

Суз

А1а

Туг

95

100

105

- 51 030313

ДДс РЬе

ДдД Суз 110

дад О1и

аас Азп

аад Ьуз

сДс Ьеи

адд Агд 115

адс Зег

сса Рго

дДд Уа1

аас Азп

сДД Ьеи 120

сса Рго

сса Рго

дад О1и

сДс Ьеи

388

адд

дад

ссс

ааа

ДсД

Дса

дас

ааа

асД

сас

аса

Ддс

сса

ссд

Ддс

сса

436

Агд

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Зег

Азр

Ьуз

ТЬг

Н1з

ТЬг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

125

130

135

140

дса

ссД

даа

дсс

дад

ддд

дса

ссд

Дса

дДс

ДДс

сДс

ДДс

ссс

сса

ааа

484

А1а

Рго

О1и

А1а

О1и

О1у

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

145

150

155

ссс

аад

дас

асс

сДс

аДд

аДс

Дсс

сдд

асс

ссД

дад

дДс

аса

Ддс

дДд

532

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеД

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

О1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

160

165

170

дДд

дДд

дас

дДд

адс

сас

даа

дас

ссД

дад

дДс

аад

ДДс

аас

Ддд

Дас

580

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

175

180

185

дДд

дас

ддс

дДд

дад

дДд

саД

ааД

дсс

аад

аса

аад

ссд

сдд

дад

дад

628

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

190

195

200

сад

Дас

аас

адс

асд

Дас

сдД

дДд

дДс

адс

дДс

сДс

асс

дДс

сДд

сас

676

О1п

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1з

205

210

215

220

сад

дас

Ддд

сДд

ааД

ддс

аад

дад

Дас

аад

Ддс

аад

дДс

Дсс

аас

ааа

724

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

225

230

235

дсс

сДс

сса

Дсс

Дсс

аДс

дад

ааа

асс

аДс

Дсс

ааа

дсс

ааа

ддд

сад

772

А1а

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

240

245

250

ссс

сда

даа

сса

сад

дДд

Дас

асс

сДд

ссс

сса

Дсс

сдд

даД

дад

сДд

820

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

255

260

265

асс

аад

аас

сад

дДс

адс

сДд

асс

Ддс

сДд

дДс

ааа

ддс

ДДс

ДаД

ссс

868

ТЬг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЬе

Туг

Рго

270

275

280

адс

дас

аДс

дсс

дДд

дад

Ддд

дад

адс

ааД

ддд

сад

ссд

дад

аас

аас

916

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

285

290

295

300

Дас

аад

асс

асд

ссД

ссс

дДд

сДд

дас

Дсс

дас

ддс

Дсс

ДДс

ДДс

сДс

964

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

305

310

315

Дас

адс

аад

сДс

асс

дДд

дас

аад

адс

адд

Ддд

сад

сад

ддд

аас

дДс

1012

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

320

325

330

ДДс

Дса

Ддс

Дсс

дДд

аДд

саД

дад

дсД

сДд

сас

аас

сас

Дас

асд

сад

1060

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеД

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Нтз

Азп

Н1з

Туг

ТЬг

О1п

335

340

345

аад

адс

сДс

Дсс

сДд

ДсД

ссд

ддД

ааа

Даа

ДсДададдсд сдссааДДа

1109

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

*

- 52 030313

350 355

<210> 25

<211> 357

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ТАС1-Рс слитый белок

<400> 25

МеЕ	Азр	А1а	МеЕ	Ьуз	Агд	О1у	Ьеи
1 А1а	Уа1	РЬе	Уа1	5 Зег	Ьеи	Зег	О1п
РЬе	Агд	Агд	20 А1а	МеЕ	Агд	Зег	Суз
Ьеи	Ьеи	35 О1у	ТЬг	Суз	МеЕ	Зег	40 Суз
О1п	50 Агд	ТЬг	Суз	А1а	А1а	55 РЬе	Суз
65 О1п	О1у	Ьуз	РЬе	Туг	70 Азр	Н1з	Ьеи
Зег	11е	Суз	О1у	85 О1п	Н1з	Рго	Ьуз
Ьуз	Ьеи	Агд	100 Зег	Рго	Уа1	Азп	Ьеи
Зег	Зег	115 Азр	Ьуз	ТЬг	Н1з	ТЬг	120 Суз
О1и	130 О1у	А1а	Рго	Зег	Уа1	135 РЬе	Ьеи
145 Ьеи	МеЕ	11е	Зег	Агд	150 ТЬг	Рго	О1и
Зег	Н1з	О1и	Азр	165 Рго	О1и	Уа1	Ьуз
О1и	Уа1	Н1з	180 Азп	А1а	Ьуз	ТЬг	Ьуз
ТЬг	Туг	195 Агд	Уа1	Уа1	Зег	Уа1	200 Ьеи
Азп	210 О1у	Ьуз	О1и	Туг	Ьуз	215 Суз	Ьуз
225 Зег	11е	О1и	Ьуз	ТЬг	230 11е	Зег	Ьуз
О1п	Уа1	Туг	ТЬг	245 Ьеи	Рго	Рго	Зег
Уа1	Зег	Ьеи	260 ТЬг	Суз	Ьеи	Уа1	Ьуз
Уа1	О1и	275 Тгр	О1и	Зег	Азп	О1у	280 О1п
Рго	290 Рго	Уа1	Ьеи	Азр	Зег	295 Азр	О1у
305 ТЬг	Уа1	Азр	Ьуз	Зег	310 Агд	Тгр	О1п
Уа1	МеЕ	Н1з	О1и	325 А1а	Ьеи	Нтз	Азп
Ьеи	Зег	Рго 355	340 О1у	Ьуз

Суз	Суз 10	Уа1	Ьеи	Ьеи	Ьеи	Суз 15	О1у
О1и 25	11е	Н1з	А1а	О1и	Ьеи 30	Агд	Агд
Рго	О1и	О1и	О1п	Туг 45	Тгр	Азр	Рго
Ьуз	ТЬг	11е	Суз 60	Азп	Н1з	О1п	Зег
Агд	Зег	Ьеи 75	Зег	Суз	Агд	Ьуз	О1и 80
Ьеи	Агд 90	Азр	Суз	11е	Зег	Суз 95	А1а
О1п 105	Суз	А1а	Туг	РЬе	Суз 110	О1и	Азп
Рго	Рго	О1и	Ьеи	Агд 125	О1и	Рго	Ьуз
Рго	Рго	Суз	Рго 140	А1а	Рго	О1и	А1а
РЬе	Рго	Рго 155	Ьуз	Рго	Ьуз	Азр	ТЬг 160
Уа1	ТЬг 170	Суз	Уа1	Уа1	Уа1	Азр 175	Уа1
РЬе 185	Азп	Тгр	Туг	Уа1	Азр 190	О1у	Уа1
Рго	Агд	О1и	О1и	О1п 205	Туг	Азп	Зег
ТЬг	Уа1	Ьеи	Н1з 220	О1п	Азр	Тгр	Ьеи
Уа1	Зег	Азп 235	Ьуз	А1а	Ьеи	Рго	Зег 240
А1а	Ьуз 250	О1у	О1п	Рго	Агд	О1и 255	Рго
Агд 265	Азр	О1и	Ьеи	ТЬг	Ьуз 270	Азп	О1п
О1у	РЬе	Туг	Рго	Зег 285	Азр	11е	А1а
Рго	О1и	Азп	Азп 300	Туг	Ьуз	ТЬг	ТЬг
Зег	РЬе	РЬе 315	Ьеи	Туг	Зег	Ьуз	Ьеи 320
О1п	О1у 330	Азп	Уа1	РЬе	Зег	Суз 335	Зег
Н1з 345	Туг	ТЬг	О1п	Ьуз	Зег 350	Ьеи	Зег

<210> 26 <211> 311 <212> РКТ

- 53 030313

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ВАРР-К-Рс слитый белок

<400> 26

МеЬ 1

Зег

А1а

Ьеи

Ьеи 5

11е

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1 10

О1у

А1а

А1а

Уа1

А1а 15

Зег

ТЬг

Агд

Агд

О1у

Рго

Агд

Зег

Ьеи

Агд

О1у

Агд

Азр

А1а

Рго

А1а

Рго

20

25

30

ТЬг

Рго

Суз

Уа1

Рго

А1а

О1и

Суз

РЬе

Азр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Агд

Н1з

Суз

35

40

45

Уа1

А1а

Суз

О1у

Ьеи

Ьеи

Агд

ТЬг

Рго

Агд

Рго

Ьуз

Рго

А1а

О1у

А1а

50

55

60

Зег

Зег

Рго

А1а

Рго

Агд

ТЬг

А1а

Ьеи

О1п

Рго

О1п

О1и

Зег

О1п

Уа1

65

70

75

80

ТЬг

Азр

Ьуз

А1а

А1а

Н1з

Туг

ТЬг

Ьеи

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

85

90

95

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

100

105

110

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

О1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

115

120

125

А1а

Уа1

Зег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

130

135

140

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

145

150

155

160

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

165

170

175

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

180

185

190

Рго

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

195

200

205

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

О1и

О1и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

210

215

220

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

225

230

235

240

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

245

250

255

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

260

265

270

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

275

280

285

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Нгз

Азп

Нгз

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

290

295

300

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

305

310

<210> 27

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 27

ЬаЬЬаддссд дссассаЬдд аЬдсааЬда

<210> 28

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

29

- 54 030313

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 28

ЕдаадаЕЕЕд ддсЕссЕЕда дассЕддда 29

<210> 29

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 29

ЕсссаддЕсЕ сааддадссс аааЕсЕЕса 29

<210> 30

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 30

ЕааЕЕддсдс дссЕсЕадаЕ ЕаЕЕЕасссд дадаса 36

<210> 31

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 31

ЕдаадаЕЕЕд ддсЕсдЕЕсЕ сасадаадЕа 30

<210> 32

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 32

аЕасЕЕсЕдЕ дадаасдадс ссаааЕсЕЕс а 31

<210> 33

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 33

ЕЕЕдддсЕсд сЕссЕдадсЕ ЕдЕЕсЕсаса 30

<210> 34

- 55 030313

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 34

сЕсаддадсд адсссаааЕс ЕЕсадаса 28

<210> 35

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 35

ЕЕЕдддсЕсс сЕдадсЕсЕд дЕддаа 26

<210> 36

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность праймера

<400> 36

дадсЕсаддд адсссаааЕс ЕЕсадаса 28

<210> 37

<211> 1216

<212> ДНК

<213> Ъото заряепз

<220>

<221> СПЗ

<222> (141)...(890)

<400> 37

дааЕЕсддсЕ сдадссЕЕЕЕ ЕаЕЕЕсЕссЕ ЕдсдЕаасаа ссЕЕсЕЕссс ЕЕсЕдсасса 60 сЕдсссдЕас ссЕЕасссдс сссдссассЕ ссЕЕдсЕасс ссасЕсЕЕда аассасадсЕ 120 дЕЕддсаддд ЕссссадсЕс аЕд сса дсс Еса ЕсЕ ссЕ ЕЕс ЕЕд сЕа дсс ссс 173

МеЕ Рго А1а Зег Зег Рго РЪе Ьеи Ьеи А1а Рго

1 5 10

ааа Ьуз

ддд О1у

ссЕ Рго

сса Рго 15

ддс О1у

аас Азп

аЕд МеЕ

ддд О1у

ддс О1у 20

сса Рго

дЕс Уа1

ада Агд

дад О1и

ссд Рго 25

дса А1а

сЕс Ьеи

221

Еса

дЕЕ

дсс

сЕс

Едд

ЕЕд

адЕ

Едд

ддд

дса

дсЕ

сЕд

ддд

дсс

дЕд

дсЕ

269

Зег

Уа1

А1а

Ьеи

Тгр

Ьеи

Зег

Тгр

О1у

А1а

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Уа1

А1а

30

35

40

ЕдЕ

дсс

аЕд

дсЕ

сЕд

сЕд

асс

саа

саа

аса

дад

сЕд

сад

адс

сЕс

адд

317

Суз

А1а

МеЕ

А1а

Ьеи

Ьеи

ТЪг

О1п

О1п

ТЪг

О1и

Ьеи

О1п

Зег

Ьеи

Агд

45

50

55

ада

дад

дЕд

адс

сдд

сЕд

сад

ддд

аса

дда

ддс

ссс

Есс

сад

ааЕ

ддд

365

Агд

О1и

Уа1

Зег

Агд

Ьеи

О1п

О1у

ТЪг

О1у

О1у

Рго

Зег

О1п

Азп

О1у

60

65

70

75

- 56 030313

даа О1и

ддд О1у

как Туг

ссс Рго

кдд Тгр 80

сад О1п

адк Зег

скс Ьеи

ссд Рго

дад О1и 85

сад О1п

адк Зег

ксс Зег

дак Азр

дсс А1а 90

скд Ьеи

413

даа

дсс

кдд

дад

аак

ддд

дад

ада

ксс

сдд

ааа

адд

ада

дса

дкд

скс

461

О1и

А1а

Тгр

О1и

Азп

О1у

О1и

Агд

Зег

Агд

Ьуз

Агд

Агд

А1а

Уа1

Ьеи

95

100

105

асс

саа

ааа

сад

аад

аад

сад

сас

кск

дкс

скд

сас

скд

дкк

ссс

акк

509

ТЬг

О1п

Ьуз

О1п

Ьуз

Ьуз

О1п

Нбз

Зег

Уа1

Ьеи

Нбз

Ьеи

Уа1

Рго

11е

110

115

120

аас

дсс

асс

ксс

аад

дак

дас

ксс

дак

дкд

аса

дад

дкд

акд

кдд

саа

557

Азп

А1а

ТЬг

Зег

Ьуз

Азр

Азр

Зег

Азр

Уа1

ТЬг

О1и

Уа1

Мек

Тгр

О1п

125

130

135

сса

дск

скк

адд

сдк

ддд

ада

ддс

ска

сад

дсс

саа

дда

как

ддк

дкс

605

Рго

А1а

Ьеи

Агд

Агд

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1п

А1а

О1п

О1у

Туг

О1у

Уа1

140

145

150

155

сда

акс

сад

дак

дск

дда

дкк

как

скд

скд

как

адс

сад

дкс

скд

ккк

653

Агд

11е

О1п

Азр

А1а

О1у

Уа1

Туг

Ьеи

Ьеи

Туг

Зег

О1п

Уа1

Ьеи

РЬе

160

165

170

саа

дас

дкд

аск

ккс

асс

акд

ддк

сад

дкд

дкд

кск

сда

даа

ддс

саа

701

О1п

Азр

Уа1

ТЬг

РЬе

ТЬг

Мек

О1у

О1п

Уа1

Уа1

Зег

Агд

О1и

О1у

О1п

175

180

185

дда

адд

сад

дад

аск

ска

ккс

сда

кдк

ака

ада

адк

акд

ссс

ксс

сас

749

О1у

Агд

О1п

О1и

ТЬг

Ьеи

РЬе

Агд

Суз

11е

Агд

Зег

Мек

Рго

Зег

Нбз

190

195

200

ссд

дас

сдд

дсс

кас

аас

адс

кдс

как

адс

дса

ддк

дкс

ккс

сак

кка

797

Рго

Азр

Агд

А1а

Туг

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

О1у

Уа1

РЬе

Нбз

Ьеи

205

210

215

сас

саа

ддд

дак

акк

скд

адк

дкс

ака

акк

ссс

сдд

дса

адд

дсд

ааа

845

Нбз

О1п

О1у

Азр

11е

Ьеи

Зег

Уа1

11е

11е

Рго

Агд

А1а

Агд

А1а

Ьуз

220

225

230

235

скк

аас

скс

кск

сса

сак

дда

асс

ккс

скд

ддд

ккк

дкд

ааа

скд

890

Ьеи

Азп

Ьеи

Зег

Рго

Нбз

О1у

ТЬг

РЬе

Ьеи

О1у

РЬе

Уа1

Ьуз

Ьеи

240

245

250

кдаккдкдкк акааааадкд дсксссадск кддаадасса дддкдддкас акаскддада 950

садссаадад скдадкакак аааддададд даакдкдсад даасададдс дкскксскдд 1010

дкккддсксс ссдкксскса сккккссскк кксаккссса ссссскадас кккдакккка 1070

сддакакскк дсккскдккс сссакддадс кссдааккск кдсдкдкдкд кадакдаддд 1130

дсдддддасд ддсдссаддс аккдкксада сскддксддд дсссаскдда адсакссада 1190

асадсассас сакскадсдд ссдссд 1216

<210> 38

<211> 250

<212> РКТ

<213> Ното зарбепз

<400> 38

Мек Рго А1а Зег Зег Рго РЬе Ьеи Ьеи А1а Рго Ьуз О1у Рго Рго О1у 1 5 10 15

Азп Мек О1у О1у Рго Уа1 Агд О1и Рго А1а Ьеи Зег Уа1 А1а Ьеи Тгр 20 25 30

Ьеи Зег Тгр О1у А1а А1а Ьеи О1у А1а Уа1 А1а Суз А1а Мек А1а Ьеи

- 57 030313

35

40

45

Ьеи

ТНг

О1п

О1п

ТНг

О1и

Ьеи

О1п

Зег

Ьеи

Агд

Агд

О1и

Уа1

Зег

Агд

50

55

60

Ьеи

О1п

О1у

ТНг

О1у

О1у

Рго

Зег

О1п

Азп

О1у

О1и

О1у

Туг

Рго

Тгр

65

70

75

80

О1п

Зег

Ьеи

Рго

О1и

О1п

Зег

Зег

Азр

А1а

Ьеи

О1и

А1а

Тгр

О1и

Азп

85

90

95

О1у

О1и

Агд

Зег

Агд

Ьуз

Агд

Агд

А1а

Уа1

Ьеи

ТНг

О1п

Ьуз

О1п

Ьуз

100

105

110

Ьуз

О1п

Нчз

Зег

Уа1

Ьеи

Нчз

Ьеи

Уа1

Рго

11е

Азп

А1а

ТНг

Зег

Ьуз

115

120

125

Азр

Азр

Зег

Азр

Уа1

ТНг

О1и

Уа1

Мек

Тгр

О1п

Рго

А1а

Ьеи

Агд

Агд

130

135

140

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1п

А1а

О1п

О1у

Туг

О1у

Уа1

Агд

11е

О1п

Азр

А1а

145

150

155

160

О1у

Уа1

Туг

Ьеи

Ьеи

Туг

Зег

О1п

Уа1

Ьеи

РНе

О1п

Азр

Уа1

ТНг

РНе

165

170

175

ТНг

Мек

О1у

О1п

Уа1

Уа1

Зег

Агд

О1и

О1у

О1п

О1у

Агд

О1п

О1и

ТНг

180

185

190

Ьеи

РНе

Агд

Суз

11е

Агд

Зег

Мек

Рго

Зег

Нчз

Рго

Азр

Агд

А1а

Туг

195

200

205

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

О1у

Уа1

РНе

Нчз

Ьеи

Нчз

О1п

О1у

Азр

11е

210

215

220

Ьеи

Зег

Уа1

11е

11е

Рго

Агд

А1а

Агд

А1а

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

Зег

Рго

225

230

235

240

Нчз

О1у

ТНг

РНе

Ьеи

О1у

РНе

Уа1

Ьуз

Ьеи

245 250

<210> 39

<211> 762

<212> ДНК

<213> Ното зарчепз

<220>

<221> СчЗ

<222> (7)...(759)

<400> 39

ддаксс акд аад сас скд кдд ккс ккс скс скд скд дкд дсд дск ссс 48

Мек Ьуз Нчз Ьеи Тгр РНе РНе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго

1 5 10

ада Агд 15

кдд Тгр

дкс Уа1

скд Ьеи

ксс Зег

дад О1и 20

ссс Рго

ааа Ьуз

кск Зег

кдк Суз

дас Азр 25

ааа Ьуз

аск ТНг

сас Нчз

аса ТНг

кдс Суз 30

96

сса

ссд

кдс

сса

дса

сск

даа

скс

скд

ддд

дда

ссд

кса

дкс

ккс

скс

144

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а 35

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у 40

О1у

Рго

Зег

Уа1

РНе 45

Ьеи

ккс

ссс

сса

ааа

ссс

аад

дас

асс

скс

акд

акс

ксс

сдд

асс

сск

дад

192

РНе

Рго

Рго

Ьуз 50

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи 55

Мек

11е

Зег

Агд

ТНг 60

Рго

О1и

дкс

аса

кдс

дкд

дкд

дкд

дас

дкд

адс

сас

даа

дас

сск

дад

дкс

аад

240

Уа1

ТНг

Суз 65

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1 70

Зег

Нчз

О1и

Азр

Рго 75

О1и

Уа1

Ьуз

ккс

аас

кдд

кас

дкд

дас

ддс

дкд

дад

дкд

сак

аак

дсс

аад

аса

аад

288

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Нчз

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

80 85 90

- 58 030313

ссд Рго 95

сдд Агд

дад О1и

дад О1и

сад О1п

Еас Туг 100

аас Азп

адс Зег

асд ТНг

Еас Туг

сдЕ Агд 105

дЕд Уа1

дЕс Уа1

адс Зег

дЕс Уа1

сЕс Ьеи 110

336

асс

дЕс

сЕд

сас

сад

дас

Едд

сЕд

ааЕ

ддс

аад

дад

Еас

аад

Едс

аад

384

ТНг

Уа1

Ьеи

Нчз

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

115

120

125

дЕс

Есс

аас

ааа

дсс

сЕс

сса

дсс

ссс

аЕс

дад

ааа

асс

аЕс

Есс

ааа

432

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТНг

11е

Зег

Ьуз

130

135

140

дсс

ааа

ддд

сад

ссс

сда

даа

сса

сад

дЕд

Еас

асс

сЕд

ссс

сса

Есс

480

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

145

150

155

сдд

даЕ

дад

сЕд

асс

аад

аас

сад

дЕс

адс

сЕд

асс

Едс

сЕд

дЕс

ааа

528

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТНг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

160

165

170

ддс

ЕЕс

ЕаЕ

ссс

адс

дас

аЕс

дсс

дЕд

дад

Едд

дад

адс

ааЕ

ддд

сад

576

О1у

РНе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

175

180

185

190

ссд

дад

аас

аас

Еас

аад

асс

асд

ссЕ

ссс

дЕд

сЕд

дас

Есс

дас

ддс

624

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

ТНг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

195

200

205

Есс

ЕЕс

ЕЕс

сЕс

Еас

адс

аад

сЕс

асс

дЕд

дас

аад

адс

адд

Едд

сад

672

Зег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

210

215

220

сад

ддд

аас

дЕс

ЕЕс

Еса

Едс

Есс

дЕд

аЕд

саЕ

дад

дсЕ

сЕд

сас

аас

720

О1п

О1у

Азп

Уа1

РНе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

Нчз

О1и

А1а

Ьеи

Нчз

Азп

225

230

235

сас

Еас

асд

сад

аад

адс

сЕс

Есс

сЕд

ЕсЕ

ссд

ддЕ

ааа

Еда

762

Нчз

Туг

ТНг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

240 245 250

<210> 40

<211> 251

<212> РКТ

<213> Ното зарчепз

<400> 40

МеЕ

Ьуз

Нчз

Ьеи

Тгр

РНе

РНе

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Уа1

А1а

А1а

Рго

Агд

Тгр

1

5

10

15

Уа1

Ьеи

Зег

О1и

Рго

Ьуз

Зег

Суз

Азр

Ьуз

ТНг

Нчз

ТНг

Суз

Рго

Рго

20

25

30

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Зег

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

Рго

35

40

45

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

ТНг

Рго

О1и

Уа1

ТНг

50

55

60

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нчз

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

65

70

75

80

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Нчз

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

85

90

95

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Зег

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

100

105

110

Ьеи

Нчз

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

115 120 125

- 59 030313

Азп

Ьуз 130

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго 135

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е 140

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

Агд

Азр

145

150

155

160

О1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЬе

165

170

175

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

180

185

190

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

195

200

205

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

210

215

220

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

Нчз

О1и

А1а

Ьеи

Нчз

Азп

Нчз

Туг

225

230

235

240

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

245 250

<210> 41

<211> 35

<212> РКТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> оптимизированная ЕРА лидерная

<400> 41

МеЕ

Азр

А1а

МеЕ

Ьуз

Агд

О1у

Ьеи

Суз

Суз

Уа1

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Суз

О1у

1

5

10

15

А1а

Уа1

РЬе

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

О1п

О1и

11е

Нчз

А1а

О1и

Ьеи

Агд

Агд

20

25

30

РЬе Агд Агд 35

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ снижения уровней 1дМ, 1дО или 1дА у млекопитающих, включающий введение антагониста ВБуЯ и микофенолятмофетила (ММР), причем указанный антагонист ВБуЯ является слитым протеином ТАС1-Рс, включающим последовательность полипептида, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 23, где из указанной последовательности полипептида удалена модифицированная сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (δΕΟ ΙΌ N0: 41), причем антагонист ВБуЯ и указанный ММР вводят в количестве, которое действует синергетически в отношении снижения уровней иммуноглобулина, а именно антагонист ВБуЯ вводят в дозе 0,25-25 мг/кг, а ММР вводят в дозе 500-1000 мг.
2. 2. Способ по п.1, где указанное млекопитающее имеет регулируемое В-клетками аутоиммунное расстройство, обусловленное антителами, которые направлены против собственных антигенов или тканей млекопитающего.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где антагонист ВБуЯ вводят в дозе 75-150 мг и микофенолятмофетил (ММР) вводят в дозе 500-1000 мг дважды в день или трижды в день.
4. 4. Способ по п.2 или 3, в котором аутоиммунная болезнь выбирается из группы, состоящей из ювенильного ревматоидного артрита, болезни Вегенера, воспалительной болезни кишечника, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ЬТР), тромбической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), аутоиммунной тромбоцитопении, рассеянного склероза, псориаза, нефропатии 1§А, полиневропатии 1дМ, миастении гравис, васкулита, диабета сахарного, синдрома Рейно, гломерулонефрита, аутоиммунного гепатита и аутоиммунного тироидита.
5. 5. Способ по п.2 или 3, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой волчаночный нефрит.
6. 6. Способ по п.2 или 3, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой системный волчаночный эритематоз (δΕΕ).
7. 7. Способ по п.2 или 3, в котором аутоиммунное заболевание представляет собой синдром Шегрена.
8. 8. Способ по п.2 или 3, причем антагонист ВБуЯ и ММР вводят в комбинации со вторым иммуно- 60 030313

   супрессивным препаратом, выбранным из группы нестероидные противовоспалительные препараты (Ν3ΑΙΌ) и глюкокортикоид.
9. 9. Композиция, включающая антагонист ВЬуЗ и микофенолятмофетил (ММР) в эффективном количестве, для осуществления способа по пп.1-8, причем указанный антагонист ВЬуЗ содержит слитый протеин ТАС1-Ес, включающий последовательность полипептида, представленную в 3Ερ ΙΌ ΝΟ: 23, где из указанной последовательности полипептида была удалена модифицированная сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (3ΕΡ ГО ΝΟ: 41).
10. 10. Применение композиции по п.9 для снижения уровня 1дМ, 1§О или 1дА.