EA014226B1

EA014226B1 - Антитела к cd154, их фрагменты и способы применения антител и фрагментов

Info

Publication number: EA014226B1
Application number: EA200700136A
Authority: EA
Inventors: Герман Ван Влеймен; Алексей Александрович Луговской; Карл Дж. М. Ханф
Original assignee: Байоджен Айдек Ма Инк.
Priority date: 2004-07-26
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2010-10-29
Also published as: JP2008511290A; CN101072587A; EP2399936A3; BRPI0513798A; IS8596A; JP2008056676A; JP5102028B2; MX2007001015A; KR20070047327A; EA200700136A1; IL180852A0; US8961976B2; RS20070027A; US20080305116A1; CN101072587B; WO2006033702A2; IL180852A; JP2012100660A; AU2005287406A1; US8647625B2

Abstract

Данное изобретение относится к антителам или их фрагментам, содержащим по меньшей мере одну аминокислотную замену в сравнении с антителом 5с8 дикого типа. Данное изобретение относится также к композициям и применению антител по изобретению или их фрагментов для лечения у субъекта заболеваний или нарушений, ассоциированных с CD154.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится, частично, к анти-СО154-антителам и их фрагментам, которые содержат по меньшей мере одну замененную аминокислоту в вариабельной области либо легкой, либо тяжелой цепи, либо в обоих, и к композициям, содержащим такие антитела и их фрагменты, и к способам применения этих антител или их фрагментов.

Уровень техники

Генерирование гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета управляется взаимодействием активированных хелперных Т-клеток с антигенпредставляющими клетками (АВС) и эффекторными Т-клетками. Активация хелперных Т-клеток не только зависит от взаимодействия антигенспецифического Т-клеточного рецептора (ТСВ) с его родственный пептид-МНС-лигандом, но также требует координированного связывания и активации ряда молекул клеточной адгезии и костимулирующих молекул (8а1а/аг-Боп1апа с1 а1., Сшт. Θρίη. Нста!.. 2001, 8, 5).

Критической костимулирующей молекулой является СО 154 (также известная как 0040-лиганд, СО40Ь, др39, Т-ВАМ, активирующая Т-клетки молекула, ТВАР), трансмембранный белок типа II, который экспрессируется зависимым от активации, ограниченным по времени образом на поверхности СО4⁺Т-клеток. СО154 экспрессируется также после активации на субпопуляции СО8⁺ Т-клеток, базофилах, тучных клетках, эозинофилах, природных клетках-киллерах, В-клетках, макрофагах, дендритных клетках и тромбоцитах. Контррецептор СО154, СО40 является мембранным белком типа I, который конститутивно и широко экспрессируется на поверхности многих типов клеток, в том числе АРС (Гоу с1 а1., Апп. Веу. 1ттипо1., 1996, 14, 591).

Передача сигнала через СО40 молекулой СО 154 инициирует каскад событий, которые приводят к активации СО40-рецепторнесущих клеток и оптимальному праймированию СО4⁺ Т-клеток. Более конкретно, родственное взаимодействие между СО 154 и СО40 стимулирует дифференцировку В-клеток в антителосекретирующие клетки и В-клетки иммунологической памяти (Вигк1у, 1п Абу. Ехр. Меб. Βίο., Уо1. 489, О.М. Мопгое, и. Небпег, М.В. Нойшап, С №дйег, О.Б. 8ау1бде апб О.С.Е. УЫ1е, еб§., К1итеег Аеабет1е/Р1епцт РиЫ15Йег5, 2001, р. 135). Дополнительно взаимодействие СО154-СО40 стимулирует клеточно-опосредованный иммунитет через активацию макрофагов и дендритных клеток и генерирование природных клеток-киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов (Вигк1у, выше).

Было показано, что взаимодействие СО40-СО154 является важным в нескольких экспериментально индуцированных аутоиммунных заболеваниях, таких как индуцированный коллагеном артрит, экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), оофорит, колит, индуцированный лекарственным средством люпус-нефрит (волчаночный нефрит). Конкретно было показано, что индукция заболевания во всех этих моделях может быть блокирована антагонистами СО 154 в момент введения антигена (Вигк1у, выше).

Блокаду заболевания с использованием антагонистов против СО154 наблюдали также в животныхмоделях спонтанного аутоиммунного заболевания, в том числе инсулинзависимого диабета и волчаночного нефрита, а также в заболевании трансплантат против хозяина, в моделях трансплантата, фиброза легких и атеросклероза (Вигк1у, выше).

Хотя было показано, что гликозилированные анти-СО154-антитела применимы для профилактики и лечения нескольких связанных с иммунной реакцией заболеваний, у некоторых субъектов использующие их терапии иногда осложняются тромбоэмболической активностью. Хотя механизм этого побочного эффекта неизвестен, он мог бы включать связывание анти-СО154-антитела или его агрегатов, БсуВНа и СО154, на тромбоцитах, что приводит к неуместной активации тромбоцитов. Связывание с другими БсУрецепторами и комплементом также может потенциировать это действие. Таким образом, формы антиСО154-антител, которые не связываются с эффекторными рецепторами, могут быть более безопасными и/или более эффективными для терапевтического применения.

Механизм, при помощи которого анти-СО154-антитела ингибируют иммунную функцию, может быть более сложным, чем простое связывание с СО 154 для блокирования взаимодействий с СО40, и, фактически, может включать воздействия эффекторными путями. Например, связывание антителоантиген может индуцировать делецию активированных Т-клеток посредством связывания Бс-домена с БсУ-рецепторами или компонентами комплемента. Альтернативно, связывание антитела с СО154 может быть усилено образованием каркаса клеточной поверхности этого антитела на несущих БсУ-рецептор клетках. Кроме того, доступ этого антитела к его месту действия может стимулироваться взаимодействиями связывания БсУ-рецептора.

Центральная роль СО154 в регуляции функции как гуморальной, так клеточно-опосредованной иммунной реакции пробудила большой интерес к применению ингибиторов этого пути для терапевтической иммуномодуляции (патент США № 5474771). Было показано, что анти-СО154-антитела, как таковые, могут быть полезными в большом разнообразии моделей иммунного ответа на терапевтические

- 1 014226 белки или генотерапию, аллергены, аутоиммунитет и трансплантацию (патент США № 5474771; Виг1ку, выше).

Таким образом, существует потребность в антителах, которые не вызывают сильную иммунную реакцию, но все еще сильно связываются с их антигенами, и способах идентификации таких антител, в частности улучшенных анти-СО154-антител.

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную 8ЕО ГО N0: 3, или ее фрагмент, где аминокислота в каждом из положений 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 54, 57, 58, 59, 60, 93, 95, 96, 97, 98, 100 и 101 независимо является любой встречающейся в природе аминокислотой или любой не встречающейся в природе аминокислотой, где пептид не состоит из 8Е0 ГО N0: 1 и где фрагмент содержит по меньшей мере одно из положений 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 54, 57, 58, 59, 60, 93, 95, 96, 97, 98, 100 и 101, и при образовании комплекса с тяжелой цепью 5с8 дикого типа пептид или его фрагмент может связываться с СЦ154.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 24 выбрана из группы, состоящей из Агд, Акп, Сук, С1и, С1у, Н1к, Мс1. РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и и Ьук; аминокислота в положении 26 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1и, С1у, Ηίκ, Ме1 РНе, ТНг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и; аминокислота в положении 27 выбрана из группы, состоящей из С1и, Акп, Сук, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 28 выбрана из группы, состоящей из Агд, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 30 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, ТНг, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, ТНг, Тгр, Туг, Агд, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Агд и Ьук; аминокислота в положении 32 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, ТНг, Тгр, Туг, Агд, А1а, 11е, Ьеи и Ьук; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из ТНг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд, А1а, Уа1 и Ьук; аминокислота в положении 34 выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, 8ет, ТНг, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 35 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, ТНг, Тгр и Туг; аминокислота в положении 36 выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Акр, А1а, Ьеи и С1и; аминокислота в положении 38 выбрана из группы, состоящей из Н1к, Акп, Сук, С1п, С1у, Ме1 РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, 8ет, ТНг, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и; аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, Акр и С1и; аминокислота в положении 58 выбрана из группы, состоящей из Ьеи, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Акр и С1и; аминокислота в положении 59 выбрана из группы, состоящей из С1и, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг и Акр; аминокислота в положении 60 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акр и С1и; аминокислота в положении 93 выбрана из группы, состоящей из С1п, Акп, Сук, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 95 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, ТНг, Тгр, Туг, Акр и С1и; аминокислота в положении 96 выбрана из группы, состоящей из Тгр, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 97 выбрана из группы, состоящей из С1и и Акр; аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из 11е, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, Акр, А1а, Ьеи, Рго, Уа1 и С1и; аминокислота в положении 100 выбрана из группы, состоящей из Рго, Акп, Сук, С1ц С1у, Н1к, МеЕ РНе, 8ет, ТНг, Тгр, Туг, Акр и С1и; и аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из ТНг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1 РНе, 8ет, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 26 выбрана из группы, состоящей из 8ет и Акр; аминокислота в положении 27 выбрана из группы, состоящей из С1п и С1и; аминокислота в положении 28 выбрана из группы, состоящей из Агд и С1и; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет, А1а, Н1к, Акп, ТНг, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 32 выбрана из группы, состоящей из 8ет, А1а, РНе, 11е, Ьеи, Ме1 и Тгр; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из ТНг, А1а, РНе, МеЕ Уа1, Тгр, Акр, Агд, Туг и С1п; аминокислота в положении 34 выбрана из группы, состоящей из Туг, А1а, Акр, С1и, РНе, 11е, Ьук, Ьеи, Ме1 Агд, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 36 выбрана из группы, состоящей из Туг, А1а, РНе, Ьеи и Тгр; аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из Туг и С1и; аминокислота в положении 96 выбрана из группы, состоящей из Тгр, Акр, С1и, Н1к, Агд, 8ет и ТНг; и аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из 11е, А1а, РНе, Н1к, Ьеи, Ме1 Акп, Рго, С1п, 8ет, ТНг, Уа1, Тгр и Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 26 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акр и С1и; аминокислота в положении 27 выбрана из группы, состоящей из С1п, Акр и С1и; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, ТНг и Туг; аминокислота в положении 32 выбрана из группы, состоящей из 8ет, А1а, 11е, Ьеи, МеЕ РНе, Рго, Уа1 и Тгр;

- 2 014226 аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Т1г, Аки, Сук, С1и, С1у, 8ет и Туг; аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из 11е, Аки, Сук, С1и, С1у, 8ет, Т1г и Туг; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является Т1г.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 28 является С1и; аминокислота в положении 31 является Уа1; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Акр и Агд; и аминокислота в положении 54 является С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из Шк и Аки; аминокислота в положении 32 выбрана из группы, состоящей из Тгр и Р1е; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Тгр, Туг и С1и; аминокислота в положении 36 выбрана из группы, состоящей из Ьеи и Тгр; аминокислота в положении 96 является Шк; и аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из Р1е и С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 26 выбрана из группы, состоящей из 8ет и Акр; аминокислота в положении 27 выбрана из группы, состоящей из С1и и С1и; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет и Аки; аминокислота в положении 32 выбрана из группы, состоящей из 8ет и Р1е; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Т1г, С1и и Туг; аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из 11е и С1и; аминокислота в положении 24 и в положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является Т1г.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0:3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является О1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 33 является Т1г; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является О1и; аминокислота в положении 93 является О1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является Т1г.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 27 является О1и; аминокислота в положении 33 является Т1г; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк, аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является О1и; аминокислота в положении 93 является О1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является Т1г.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 27 является О1и; аминокислота в положении 31 является Аки; аминокислота в положении 33 является Т1г; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является О1и; аминокислота в положении 93 является О1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является Т1г.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 и положении 31 является 8ет; аминокислота в положении 27 является О1и; аминокислота в положении 32 является Р1е; аминокислота в положении 33 является Т1г; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении

- 3 014226 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 27 и положении 33 является С1п; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηί§; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0:3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 33 является Туг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηί§; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 27 и положении 98 является С1п; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηίκ; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηίκ; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 является Акп; аминокислота в положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 является 8ет; аминокислота в положении 32 является РНе; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНт.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 33 является С1п; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30,

- 4 014226 положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 33 является Туг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНт.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ет; аминокислота в положении 33 является ТНт; аминокислота в положении 98 является С1п; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηίκ; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНт.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТНт; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 и положении 36 является Тгр и аминокислота в положении 100 является Рго.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 101 является ТНт; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 и положении 33 является Тгр и аминокислота в положении 100 является Рго.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1п; аминокислота в положении 26, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТНт; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 31 является Уа1 и аминокислота в положении 100 является Рго.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 101 является ТНт; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 33 является Акр и аминокислота в положении 100 является Рго.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ет; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТНт; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34 и положении 36 является Туг; аминокислота

- 5 014226 в положении 38 является Ηίκ; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 54, положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр и аминокислота в положении 100 является Рго.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТЕг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηίκ; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр и аминокислота в положении 100 является Рго.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Ηίκ; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр, аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТЕг.

Данное изобретение обеспечивает также пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную 8ЕО Ш N0: 6, или ее фрагмент, где аминокислота в каждом из положений 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и 107 независимо является любой встречающейся в природе аминокислотой или любой не встречающейся в природе аминокислотой, где пептид не состоит из 8ЕО Ш N0: 4 и где фрагмент содержит по меньшей мере одно из положений 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и 107, и при образовании комплекса с легкой цепью 5с8 дикого типа пептид или его фрагмент может связываться с СЭ154.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 28 выбрана из группы, состоящей из 11е, Акр, С1и, Агд, Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Ηίκ, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр и Туг; аминокислота в положении 30 выбрана из группы, состоящей из ТЕг, Акр, С1и, Агд, Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Агд, №к, Ьук, С1п и Тгр; аминокислота в положении 32 выбрана из группы, состоящей из Туг, Акр, С1и, Агд, Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Туг, Акр, С1и, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 35 выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Акр и С1и; аминокислота в положении 50 выбрана из группы, состоящей из С1и и Акр; аминокислота в положении 52 выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, Агд, А1а, Ьеи, Уа1 и Ьук; аминокислота в положении 53 выбрана из группы, состоящей из Рго, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, Акр и С1и; аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, ТЕг, Тгр, Туг, Агд, Ьук и С1и; аминокислота в положении 55 выбрана из группы, состоящей из Акп, С1и, Ьук, С1п, 8ет, ТЕг, Ме1 и Уа1; аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Акр, С1и, РЕе и Ьеи; аминокислота в положении 58 выбрана из группы, состоящей из ТЕг, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 59 выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и; аминокислота в положении 60 выбрана из группы, состоящей из РЕе, Акр, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, С1и, Агд, Ьук, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 61 выбрана из группы, состоящей из Акп, Акр и С1и; аминокислота в положении 62 выбрана из группы, состоящей из С1и и Акр; аминокислота в положении 63 выбрана из группы, состоящей из Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, Агд, С1и, Акр, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 64 выбрана из группы, состоящей из РЕе, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 65 выбрана из группы, состоящей из Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, Агд, Акр, С1и, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 66 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акр и С1и; аминокислота в положении 99 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Акр, С1и и А1а; аминокислота в положении 100 выбрана из группы, состоящей из Акр и С1и; аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из С1у, РЕе и Ьеи; аминокислота в положении 102 выбрана из группы, состоящей из Агд, Акп, Сук, С1п, С1у, И1к, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг и Ьук; аминокислота в положении 103 выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме1, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, 11е, Ьук, Агд и Уа1; аминокислота в положении 104 выбрана из группы, состоящей из Акр и С1и; аминокислота в положении 105 выбрана из группы, состоящей из Ме1, Акр, С1и, Агд, Шк, Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, РЕе, 8ет, ТЕг, Тгр и Туг; аминокислота в положении 106 выбрана из группы, состоящей из Акр и С1и; и аминокислота в положении 107 вы- 6 014226 брана из группы, состоящей из 8ет, Аки, Сук, С1и, С1у, Н1к, Мс1. Р1е, Т1г, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 28 выбрана из группы, состоящей из Не, Н1к, Акп, С1и, 8ет, Т1г и С1и; аминокислота в положении 30 выбрана из группы, состоящей из Т1г, Ηίκ, Акп, С1п, 8ет, Туг и Агд; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет, С1п и Тгр; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Туг, А1а, Рго, 8ет, Т1г, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 52 выбрана из группы, состоящей из Акп, А1а, Р1е, Ηίκ, Ьеи, Ме1, 8ет, Т1г, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из 8ет, С1и, Н1к, Ьук, Акп, С1п, Агд, Т1г, Тгр, Туг и Р1е; аминокислота в положении 55 выбрана из группы, состоящей из Акп, С1и, Ьук, С1п, 8ет, Т1г, Ме! и Уа1; аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Акр, Р1е и Ьеи; аминокислота в положении 59 выбрана из группы, состоящей из Акп, А1а, Р1е, Ьеи, Ме!, Рго, Уа1, Тгр, Акр и Туг; аминокислота в положении 99 выбрана из группы, состоящей из 8ет и А1а; аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из С1у, Р1е и Ьеи; и аминокислота в положении 103 выбрана из группы, состоящей из Акп, А1а, Акр, С1и, Р1е, Н1к, 11е, Ьук, Ме!, Агд, 8ет, Т1г, Уа1 и Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 31 и положении 54 независимо выбрана из группы, состоящей из 8ет, А1а, 11е, Ьеи, Ме!, Р1е, Рго, Уа1, Тгр, Акп, Сук, С1п, С1у, 8ет, Т1г и Туг; аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Акр, А1а, 11е, Ьеи, Ме!, Р1е, Рго, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из С1у, А1а, 11е, Ьеи, Ме!, Р1е, Рго, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 103 выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, 8ет, Т1г и Туг; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является Т1г; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является Р1е; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ет; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Тгр и С1п; аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из 8ет, Р1е и С1п; аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Акр, Ьеи и Р1е; аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из С1у, Ьеи и Р1е; аминокислота в положении 103 выбрана из группы, состоящей из Акп и Туг; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является Т1г; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является Р1е; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ет; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 28 является С1и; аминокислота в положении 33 является Р1е; аминокислота в положении 54 является Т1г; и аминокислота в положении 59 выбрана из группы, состоящей из Акр и Ьеи.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 30 выбрана из группы, состоящей из Н1к и Агд; аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей С1п и Тгр; аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из из Тгр, Уа1 и Рго; аминокислота в положении 52 выбрана из группы, состоящей из Ме! и Тгр; аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из Акп, Р1е и С1п; аминокислота в положении 55 выбрана из группы, состоящей из Ме!, Ьук и Уа1; аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Р1е и Ьеи; аминокислота в положении 59 выбрана из группы, состоящей из Р1е и Туг; аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из Р1е и Ьеи; и аминокислота в положении 103 выбрана из группы, состоящей из Н1к и Туг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 является Тгр; аминокислота в положении 54 является 8ет; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является Т1г; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является Р1е; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ет; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в поло

- 7 014226 жении 31 является С1п; аминокислота в положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 54 является РНе; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 54 является С1п; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является РНе; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Ьеи; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является РНе; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

- 8 014226

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является Ьеи; аминокислота в положении 103 является Азп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Туг; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в полокении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Нтз; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 33, положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в

- 9 014226 положении 57, положении 59, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55 и положении 61 является Аки; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Бук; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ет; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Бук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 59 является Беи; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

Данное изобретение относится также к композициям, содержащим любой из описанных здесь пептидов.

Данное изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим любой из описанных здесь пептидов.

Данное изобретение относится также к векторам, содержащим любую из описанных здесь молекул нуклеиновых кислот.

Данное изобретение относится также к композициям, содержащим любую из описанных здесь молекул нуклеиновых кислот или любой из описанных здесь векторов.

Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, содержащим любую из описанных здесь молекул нуклеиновых кислот или любой из описанных здесь векторов.

Данное изобретение относится также к антителам или их фрагментам, содержащим любой из описанных здесь пептидов, где эти антитела или их фрагменты могут связываться с СБ154 человека.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из одноцепочечного антитела (кеЕу), Е(аЬ')₂-фрагмента, ЕаЬ-фрагмента и Еб-фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент помечены детектируемым маркером, таким как маркер, выбранный из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, фермента, флуорохрома, коллоидного золота, красителя и биотина.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент конъюгированы с терапевтическим агентом, таким как терапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из радиоизотопа, токсина, токсоида и химиотерапевтического агента, или конъюгированы с гранулой.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит по меньшей мере один высокомолекулярный полимер, такой как полимер, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленимина и полилизина.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержат по меньшей мере одну аминокислоту, которая выбрана из группы, состоящей из ПЭГилированной и гликозилированной аминокислоты.

Данное изобретение относится также к композициям, содержащим любые из описанных здесь антител или их фрагментов.

Данное изобретение относится также к наборам, содержащим любые из описанных здесь антител или их фрагментов.

Данное изобретение относится также к способам лечения или профилактики СО154-связанного заболевания или нарушения человека, предусматривающим введение человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или его фрагмента по любому из пп. формулы 55-77 или композиции по п.53, так что СО154-связанное заболевание или нарушение человека ослабляется или предотвращается.

В некоторых вариантах осуществления заболеванием или нарушением человека является воспаление, такое как заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из воспаления, связанного с артритом, контактным дерматитом, гипер-1дЕ-синдромом, воспалительным заболеванием кишечника, аллергической астмой и идиопатическим воспалительным заболеванием.

В некоторых вариантах осуществления артрит выбран из группы, состоящей из ревматоидного артрита, неревматоидного воспалительного артрита, артрита, связанного с болезнью Лайма, и воспалительного остеоартрита.

В некоторых вариантах осуществления идиопатическое воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из псориаза и системной красной волчанки.

- 10 014226

В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из тяжелой псевдопаралитической миастении, болезни Грейвса, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, гемолитической анемии, сахарного диабета, болезни Крона, рассеянного склероза и индуцированных лекарственными средствами аутоиммунных заболеваний.

В некоторых вариантах осуществления нарушением является отторжение субъектом трансплантированного органа, такого как трансплантированный орган, выбранный из группы, состоящей из трансплантированных сердца, почки, печени, кожи, панкреатических островковых клеток и костного мозга.

В некоторых вариантах осуществления нарушение выбрано из группы, состоящей из реакции трансплантат против хозяина, аллергических реакций, аутоиммунной реакции и фиброза у субъекта, такого как фиброз легких или фибротическое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления легочный фиброз выбран из группы, состоящей из фиброза легких (пневмофиброза), вторичного относительно респираторного дистресс-синдрома взрослых людей, индуцированного лекарственным средством фиброза легких, идиопатического фиброза легких и гиперчувствительного пневмонита; а фибротическое заболевание выбрано из группы, состоящей из гепатита С, гепатита В, цирроза, цирроза печени, вторичного относительно токсическопо повреждения, цирроза печени, вторичного относительно индуцированного лекарственными средствами заболевания, цирроза печени, вторичного относительно вирусной инфекции, и цирроза печени, вторичного относительно аутоиммунного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления аутоиммунная реакция выбрана из группы, состоящей из аутоиммунной реакции, происходящей из синдрома Рейтера, спондилоартрита, болезни Лайма, ВИЧинфекции, сифилиса и туберкулеза.

В некоторых вариантах осуществления заболеванием или нарушением является желудочнокишечное заболевание, такое как заболевание, выбранное из группы, состоящей из нарушения моторики пищевода, воспалительного заболевания кишечника и склеродермии; или сосудистое заболевание, где это сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из атеросклероза и реперфузионного повреждения.

В некоторых вариантах осуществления этим заболеванием или нарушением является Т-клеточный рак, такой как рак, выбранный из группы, состоящей из Т-клеточного лейкоза и Т-клеточной лимфомы.

Данное изобретение относится также к пептидам и их фрагментам для применения в лечении заболевания или нарушения человека, связанного с СЭ154. и в приготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения человека, связанного с С.П154.

Описание вариантов осуществления

Данное изобретение обеспечивает пептиды, в частности вариабельные области легкой и тяжелой цепей и их фрагменты, и антитела и их фрагменты, содержащие их, где эти пептиды содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену в сравнении с антителом 5с8 дикого типа.

Термин антитело в данном контексте включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), химерные антитела, СОВ-привитые антитела, гуманизированные антитела, антитела человека и т.п. и их фрагменты.

Фраза фрагмент антитела или т.п. включает в данном контексте, например, легкую цепь антитела (У_ь), тяжелую цепь антитела (Ун), одноцепочечное антитело (зеРу), Р(аЬ')₂-фрагмент, РаЬ-фрагмент, РаЬ'фрагмент, Рб-фрагмент, Ρν-фрагмент и фрагмент единственного домена антитела (ОЛЬ).

Термин СОВ включает в данном контексте определяющие комплементарность районы, описанные, например, КаЬа!, СЬо1Ыа или МасСа11ит е! а1., (см., например, КаЬа! е! а1., Ιη 8ес.|иепсез οί Рто1ешз οί 1ттипо1одюа1 1п1егез1, И.8. Эераг1теп1 οί НеаИЬ апб Нитап Зетсез, 1983; СЬо1Ыа е! а1., 1. Мо1. Βίο1., 1987, 196, 901-917 и МасСа11ит е! а1., 1. Мо1. Вю1., 1996., 262, 732-745).

Положения аминокислотных остатков, которые обычно включают СОВ, описанные каждой из цитируемых выше ссылок, представлены ниже для сравнения.

	КаЬаЬ	Определения СОВ СЬоТЫа	МасСаИит	5сЗ
УН	СПН1	31-35	26-32	30-35	26-35
УН	С.ТЖ2	50-65	53-55	47-58	50-66
УН	сьвз	95-102	96-101	93-101	99-107
УЬ	СЕ К.1	24-34	26-32	30-36	24-38
УЬ	СПК2	50-56	50-52	46-55	54-60
УЬ	ськз	89-97	91-96	89-96	93-101

Фраза каркасный район включает в данном контексте последовательность антитела, которая находится между этими СОВ и разделяет их. Таким образом, каркас вариабельной области имеет длину приблизительно 100-120 аминокислот, но обычно называют только аминокислоты, находящиеся вне этих

- 11 014226

СЭВ В качестве конкретного примера вариабельной области тяжелой цепи и для СЭВ. определенных КаЬа! с1 а1.. каркасный район 1 соответствует домену вариабельной области. включающему аминокислоты 1-30; район 2 соответствует домену вариабельной области. включающему аминокислоты 36-49; район 3 сответствует домену вариабельной области. включающему аминокислоты 66-94. и район 4 соответствует домену вариабельной области от аминокислоты 103 до конца вариабельной области. Каркасные участки для легкой цепи подобным образом отделены друг от друга посредством СОК вариабельной области легкой цепи. Подобным образом. согласно определению СОВ С’1ю11иа с1 а1. или МасСа11ит с1 а1.. границы каркасной области разделены соответствующими концами СОВ. как описано выше.

Фраза вариабельная область включает в данном контексте аминоконцевую часть антитела. которая ответственна за связывание антигена на этой молекуле и которая не является константной областью. Предполагается. что этот термин включает функциональные фрагменты. например антигенсвязывающий фрагмент. которые поддерживают некоторую часть функции связывания или всю функцию связывания всей вариабельной области.

Фраза антитело 5с8 относится к антителу. которое связывает СЭ154 и которое заявлено и описано в патенте США № 5474771. тАЬ-Гибридома Ьи5с8 является доступной из АТСС (НВ10916). Аминокислотная последовательность для легкой и тяжелой цепи вариабельных областей антитела 5с8 дикого типа представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 4 соответственно.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает производные антитела 5с8. содержащие по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельной области легкой цепи. Вариабельная область легкой цепи 5с8 дикого типа представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 1 (аминокислотная последовательность). Данное изобретение обеспечивает пептиды. содержащие вариабельную область легкой цепи 5с8 дикого типа. в которой сделана по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. эти пептиды не содержат 8Е0 ΙΌ N0: 1). Этот пептид легкой цепи может содержать всю легкую цепь. включающую константную область и вариабельную область. или может содержать только вариабельную область. Этот пептид легкой цепи может также содержать всю вариабельную область и часть константной области. которая может находиться в диапазоне от всей константной области без одной аминокислоты до всего лишь одной аминокислоты константной области. или может быть в любом диапазоне внутри указанного диапазона. Альтернативно. пептид легкой цепи может содержать вариабельную область. слитую с любой неродственной пептидной последовательностью. с образованием. следовательно. слитого белка.

В некоторых вариантах осуществления пептид легкой цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в любом из следующих положений вариабельной области легкой цепи антитела 5с8 дикого типа (см. 8Е0 ΙΌ N0: 1): положениях. выбранных из группы. состоящей из положений 24. 26. 27. 28. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 38. 54. 57. 58. 59. 60. 93. 95. 96. 97. 98. 100 и 101 или любой их подгруппы. Такой пептид. содержащий эти положения. которые могут содержать аминокислотную замену. представлен в 8Е0 ΙΌ N0: 3 (аминокислотная последовательность). Эти пептиды легкой цепи могут также содержать по меньшей мере 2. по меньшей мере 3. по меньшей мере 4. по меньшей мере 5. по меньшей мере 6. по меньшей мере 7. по меньшей мере 8. по меньшей мере 9. по меньшей мере 10. по меньшей мере 11. по меньшей мере 12. по меньшей мере 13. по меньшей мере 14. по меньшей мере 15. по меньшей мере 16. по меньшей мере 17. по меньшей мере 18. по меньшей мере 19. по меньшей мере 20. по меньшей мере 21. по меньшей мере 22 или по меньшей мере 23 аминокислотные замены или замену в каждом из 24 положений.

В некоторых вариантах осуществления пептид легкой цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в любом из положений 26. 27. 31. 32. 33 и 98 или их любую подгруппу. Такой пептид. содержащий эти положения. который может содержать аминокислотную замену. представлен в 8Е0 ΙΌ N0: 3 (аминокислотная последовательность). где положения 24. 28. 30. 34. 35. 36. 38. 54. 57. 58. 59. 60. 93. 95. 96. 97. 100 и 101 являются аминокислотами дикого типа. Эти пептиды могут также содержать по меньшей мере 2. по меньшей мере 3. по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислотных замен или замену в каждом из 6 положений.

Замененная аминокислота в каждом из предыдущих положений (т.е. в положениях 24. 26. 27. 28. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 38. 54. 57. 58. 59. 60. 93. 95. 96. 97. 98. 100 и 101) может быть независимо любой встречающейся в природе аминокислотой или любой не встречающейся в природе аминокислотой. Таким образом. конкретный пептид легкой цепи может содержать одну или несколько аминокислотных замен. которые являются встречающимися в природе аминокислотами. и/или одну или несколько амино кислотных замен. которые являются не встречающимися в природе аминокислотами.

Отдельные аминокислотные замены выбраны из любой из следующих серий: 1) серии аминокислот с неполярными боковыми цепями. например А1а. Сук. Не. Ьеи. МсЕ РЬе. Рго. Уа1; 2) серии аминокислот с отрицательно заряженными боковыми цепями. например Акр. 01ц; 3) серии аминокислот с положительно заряженными боковыми цепями. например Агд. Ηικ. Ьук; и 4) серии аминокислот с незаряженными полярными боковыми цепями. например Акп. Сук. О1п. О1у. Ηικ. МсЕ РЬе. 8ет. ТЬг. Тгр. Туг. к которым добавлены Сук. О1у. Ме! и РЬе.

Встречающиеся в природе аминокислоты включают. например. аланин (А1а). аргинин (Агд). аспара

- 12 014226 гин (Άδη), аспарагиновую кислоту (Акр), цистеин (Сук), глутамин (С1и), глутаминовую кислоту (С1и), глицин (С1у), гистидин (Ηίκ), изолейцин (Не), лейцин (Ьеи), лизин (Ьук), метионин (Мс1). фенилаланин (Р11С). пролин (Рго), серии (8сг), треонин (Тйт), триптофан (Тгр), тирозин (Туг) и валин (Уа1).

Не встречающиеся в природе аминокислоты включают, например, норлейцин, омитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как аналоги, описанные в Е11таи е1 а1., Ме111. Еихут., 1991, 202, 301-336. Для генерирования таких не встречающихся в природе аминокислотных остатков могут быть использованы процедуры Ыогеп е1 а1., 8с1еисе, 1989, 244, 182 и Е11таи е1 а1., выше. Вкратце, эти процедуры включают химическую активацию супрессорной тРНК не встречающимся в природе аминокислотным остатком с последующей транскрипцией и трансляцией этой РНК ίη νίίτο.

В некоторых вариантах осуществления пептид легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична соответствующему району 8ЕЦ ΙΌ N0: 3. Так, например, пептид легкой цепи, который содержит две аминокислотные замены в положениях 26 и 27, может все еще иметь дополнительные замены где-нибудь в другом месте в этом пептиде (т.е. в положениях, других, чем положения, обозначенные Хаа в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3), до тех пор, пока этот пептид имеет, по меньшей мере, указанный процент идентичности. Таким образом, здесь обсуждаются пептиды, имеющие дополнительные аминокислотные замены или аминокислотные инсерции или делеции. Должно быть понятно, что при определении процентной идентичности пептида, который содержит часть константной области легкой цепи, только вариабельная область рассматривается для целей определения процентной идентичности (т.е. часть константной области не включена в процентную идентичность).

Фрагмент может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 105 аминокислот, максимально 110 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления этот фрагмент содержит по меньшей мере одно из положений 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 54, 57, 58, 59, 60, 93, 95, 96, 97, 98, 100 и 101 или любую подгруппу из них в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления фрагмент содержит одну или несколько из любых из предыдущих аминокислотных замен легкой цепи.

Пептиды легкой цепи и их фрагменты, обсуждаемые здесь, сохраняют их способность связываться с ΟΌ154. То есть замена соответствующих аминокислот дикого типа антитела 5с8 описанными здесь пептидами или фрагментами все еще будет позволять полученному антителу связывать ΟΌ154 человека. Например, замена всех аминокислот вариабельной области легкой цепи 5с8 дикого типа соответствующими аминокислотами описанного здесь пептида или фрагмента будет приводить к антителу, которое сохраняет способность связывать ΟΌ154 человека.

В некоторых вариантах осуществления легкая цепь может иметь замены следующими типами аминокислот в указанных положениях: Р24 (отрицательная, положительная, полярная, неполярная); 826 (отрицательная, полярная, неполярная); Ц27 (положительная, отрицательная, полярная); Р28 (отрицательная, полярная, неполярная); 830 (положительная, отрицательная, полярная); 831 (положительная, полярная, неполярная); 832 (положительная, полярная, неполярная); Т33 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); Υ34 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); 835 (полярная); Υ36 (полярная, неполярная, отрицательная); Н38 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); Υ54 (отрицательная, полярная, неполярная); N57 (отрицательная, полярная); Ь58 (отрицательная, полярная); Е59 (отрицательная, полярная); 860 (отрицательная); Ц93 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); 895 (отрицательная, полярная); \У96 (отрицательная, положительная, полярная); Е97 (отрицательная); 198 (отрицательная, полярная, неполярная); Р100 (отрицательная, полярная) и Т101 (отрицательная, полярная, неполярная).

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 24 (в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Агд, Аки, Сук, С1и, С1у, Ηίκ, Мек Рйе, 8ег, Тйт, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и и Ьук или их любой подгруппы.

Аминокислота в положении 24 может быть также предпочтительно Агд.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 26 (в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Аки, Сук, С1и, С1у, Н1к, Мек Рйе, 8ег, Тйт, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр или С1и или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислотой в положении 26 является предпочтительно 8ег или Агд. Аминокислота в положении 26 может быть также предпочтительно 8ег, Акр или С1и; или предпочтительно 8ег или Акр.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 27 (в соответствии с 8ЕЦ ΙΌ N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из С1и, Аки, Сук, С1у, Н1к, Мек Рйе, 8ег, Тйт, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 27 является предпочтительно С1и или С1и. Аминокислота в положении 27 может быть также предпочтительно С1и, Акр или С1и; или предпочтительно С1и или С1и.

- 13 014226

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 28 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Агд, Акп, Сук, С1п, С1у, Н15, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, 11е, Ьеи, Рго или Уа1 или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 28 может быть предпочтительно Агд или С1п. Аминокислота в положении 28 может быть также предпочтительно Агд.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 30 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Ηίκ, Ме1, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 30 может быть также предпочтительно 8ег.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 31 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ег, А1а, Н1к, Акп, ТЬг, Уа1 и Тгр. Аминокислота в положении 31 может быть также выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, ТЬг и Туг; или предпочтительно является 8ег или Акп.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 32 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Агд, А1а, 11е, Ьеи и Ьук или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 32 выбрана также из группы, состоящей из 8ег, А1а, РЬе, 11е, Ьеи, Ме1 и Тгр. Аминокислота в положении 32 может быть также выбрана из группы, состоящей из 8ег, А1а, 11е, Ьеи, Ме1, РЬе, Рго, Уа1 и Тгр; или предпочтительно является 8ег или РЬе.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 33 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из ТЬг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд, А1а, Уа1 и Ьук или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из ТЬг, А1а, РЬе, Ме1, Уа1, Тгр, Акр, Агд, Туг и С1п. Аминокислота в положении 33 выбрана также из группы, состоящей из ТЬг, Акп, Сук, С1п, С1у, 8ег и Туг; или предпочтительно является ТЬг, С1п или Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 34 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 34 выбрана из группы, состоящей из Туг, А1а, Акр, С1и, РЬе, 11е, Ьук, Ьеи, Ме1, Агд, Уа1 и Тгр. Аминокислота в положении 34 может быть также предпочтительно Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 35 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, ТЬг, Тгр и Туг или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 35 может быть также предпочтительно 8ег.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 36 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Акр, А1а, Ьеи и С1и или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 36 выбрана из группы, состоящей из Туг, А1а, РЬе, Ьеи и Тгр. Аминокислота в положении 36 может быть также предпочтительно Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 38 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Н1к, Акп, Сук, С1п, С1у, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 38 может быть также предпочтительно Н1к.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 54 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 54 является предпочтительно Туг или С1и. Аминокислота в положении 54 может быть также предпочтительно Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 57 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 57 может быть также предпочтительно Акп.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 58 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Ьеи, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Акр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 58 может быть также предпочтительно Ьеи.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 59 (в соответствии с 8ЕЦ Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из С1и, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг и Акр или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 59 может быть также предпочтительно С1и.

- 14 014226

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 60 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акр и С1и или любой их подгруппы. Аминокислота в положении 60 может быть также предпочтительно 8ег.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 93 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из С1и, Акп, Сук, С1у, Ηίκ, МеЕ РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 93 может быть также предпочтительно С1п.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 95 (в соответствии с 8ЕС Ш N0:3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Акр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 95 может быть также предпочтительно 8ег.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 96 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Тгр, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 96 выбрана из группы, состоящей из Тгр, Акр, С1и, Н1к, Агд, 8ег и ТЬг. Аминокислота в положении 96 может быть также предпочтительно Тгр.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 97 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента является С1и или Акр или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 97 может быть также предпочтительно С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 98 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 11е, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, МеЕ РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр, А1а, Ьеи, Рго, Уа1 и С1и или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из 11е, А1а, РЬе, Н1к, Ьеи, МеЕ Акп, Рго, С1п, 8ег, ТЬг, Уа1, Тгр и Туг. Аминокислота в положении 98 выбрана из группы, состоящей из 11е, Акп, Сук, С1п, С1у, 8ег, ТЬг и Туг; или предпочтительно является 11е или С1п.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 100 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Рго, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, Тгр, Туг, Акр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 100 может быть также предпочтительно Рго.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 101 (в соответствии с 8ЕС Ш N0: 3) пептида легкой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из ТЬг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме1, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 101 может быть также предпочтительно ТЬг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 28 является С1и; аминокислота в положении 31 является Уа1; аминокислота в положении 33 является Акр или Агд; и аминокислота в положении 54 является С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 31 является Н1к или Акп; аминокислота в положении 32 является Тгр или РЬе; аминокислота в положении 33 является Тгр, Туг или С1п; аминокислота в положении 36 является Ьеи или Тгр; аминокислота в положении 96 является Н1к; и аминокислота в положении 98 является РЬе или С1п.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕС Ш N0:3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Нхк; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг. Этот мутант называют здесь мутантом № 6.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕС Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг. Этот мутант называют здесь мутантом № 7.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕС Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 31 и по

- 15 014226 ложении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг. Этот мутант называют здесь мутантом № 14.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 и положении 36 является Тгр; и аминокислота в положении 100 является Рго. Этот мутант называют здесь мутантом № 3.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 и положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 100 является Рго. Этот мутант называют здесь мутантом № 5.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 31 является Уа1 и аминокислота в положении 100 является Рго. Этот мутант называют здесь мутантом № 8.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 33 является Акр и аминокислота в положении 100 является Рго. Этот мутант называют здесь мутантом № 9.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34 и положении 36 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 54, положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр и аминокислота в положении 100 является Рго. Этот мутант называют здесь мутантом № 10.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТЬг. Этот мутант называют здесь мутантом

- 16 014226 № 15.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п. аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 31 является Акп; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26 и положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 32 является РНе; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 и положении 33 является С1п; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 33 является Туг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 5ЕО Ш N0: 3, где в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 и положении 98 является С1п; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в

- 17 014226 положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 является Акп; аминокислота в положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг. Этот пептил называют здесь также пептидом 826Э/Э27Е/831№'.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 32 является РНе; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг. Этот пептид называют здесь также пептидом 826Э/Э27Е/832Р.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является С1п; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго и аминокислота в положении 101 является ТНг. Этот пептид называют здесь также пептидом 826Э/О27Е/Т33О.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является Туг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг. Этот пептид называют здесь также пептидом 826Э/О27Е/Т33У.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 3, где аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является С1п; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг. Этот пептид называют здесь также пептидом 826Ο/027Ε/Ι980.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает производные антитела 5с8, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную замену в вариабельной области тяжелой цепи. Вариабельная область тяжелой цепи 5с8 дикого типа представлена в 8ЕЭ ΙΌ N0: 4 (аминокислотная последовательность). Данное изобретение обеспечивает пептиды, содержащие вариабельную область тяжелой цепи 5с8 дикого типа, в которой сделана по меньшей мере одна аминокислотная замена (т.е. эти пептиды не содержат 8ЕЭ ΙΌ N0: 4). Этот пептид тяжелой цепи может содержать всю тяжелую цепь, включающую константную область (СН1 и/или СН2 и/или СН3) и вариабельную область, или может содержать только вариабельную область. Этот пептид тяжелой цепи может также содержать всю вариабельную область и часть константной области, которая может находиться в диапазоне от всей константной области без одной аминокислоты до всего лишь одной аминокислоты константной области, или может быть в любом диа

- 18 014226 пазоне внутри указанного диапазона. Альтернативно, пептид тяжелой цепи может содержать вариабельную область, слитую с любой неродственной пептидной последовательностью, с образованием, следовательно, слитого белка.

В некоторых вариантах осуществления пептид тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в любом из следующих положений вариабельной области тяжелой цепи антитела 5с8 дикого типа (см. 8Е0 ΙΌ N0: 4): положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и 107 или любой их подгруппы. Такой пептид, содержащий эти положения, который может содержать аминокислотную замену, представлен в 8ЕО ΙΌ N0: 6 (аминокислотная последовательность). Эти пептиды тяжелой цепи могут содержать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28 или по меньшей мере 29 аминокислотных замен или по меньшей мере одну аминокислотную замену в каждом из этих 30 положений.

В некоторых вариантах осуществления пептид тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в любом из положений 31, 54, 57, 101 и 103 или любой их подгруппы. Такой пептид, содержащий положения, которые могут содержать аминокислотную замену, представлен в 8ЕО ΙΌ N0: 6 (аминокислотная последовательность), где положения 28, 30, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 102, 104, 105, 106 и 107 являются аминокислотами дикого типа. Эти пептиды могут также содержать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23 или по меньшей мере 24 аминокислотные замены или одну аминокислотную замену в каждом из этих 25 положений.

Замененная аминокислота в каждом из предыдущих положений (т.е. положений 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и 107) может быть независимо любой встречающейся в природе аминокислотой или любой не встречающейся в природе аминокислотой. Таким образом, конкретный пептид тяжелой цепи может содержать одну или несколько аминокислотных замен, которые являются встречающимися в природе аминокислотами, и/или одну или несколько аминокислотных замен, которые являются не встречающимися в природе аминокислотами.

В некоторых вариантах осуществления пептид тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере на 95% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 6. Так, например, пептид тяжелой цепи, который содержит аминокислотную замену в положении 31, может все еще иметь дополнительные замены где-нибудь в другом месте в этом пептиде (т.е. в положениях, других, чем положения, обозначенные Хаа в 8ЕО ΙΌ N0: 6), пока этот пептид имеет, по меньшей мере, указанный процент идентичности. Таким образом, здесь обсуждаются пептиды, имеющие дополнительные аминокислотные замены или аминокислотные инсерции или делеции. Должно быть понятно, что при определении процентной идентичности пептида, который содержит часть константной области тяжелой цепи, только вариабельная область рассматривается для целей определения процентной идентичности (т.е. часть константной области не включена в процентную идентичность).

В некоторых вариантах осуществления обеспечен фрагмент пептида тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере на 95% идентична соответствующему району 8ЕО ΙΌ N0: 6.

Этот фрагмент может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 105 по меньшей мере 110 или по меньшей мере 115 аминокислот, максимально 117 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления этот фрагмент содержит по меньшей мере одно из положений 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и 107 или любую их подгруппу в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: 6. В некоторых вариантах осуществления этот фрагмент содержит одну или несколько любых из предыдущих аминокислотных замен тяжелой цепи.

Пептиды тяжелой цепи и их фрагменты, описанные здесь, сохраняют их способность связываться с СЭ154. То есть замена соответствующих аминокислот дикого типа антитела 5с8 описанными здесь пеп

- 19 014226 тидами или фрагментами все еще будет позволять полученному антителу связывать СЭ154 человека. Например, замена всех аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 5с8 дикого типа соответствующими аминокислотами описанного здесь пептида или фрагмента будет приводить к антителу, которое сохраняет способность связывать СО 154 человека. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела могут контактировать с количеством остатков СЭ154. меньшим на один или несколько остатков, чем антитело 5с8 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь может иметь замены следующими типами аминокислот в указанных положениях: 128 (положительная, отрицательная, полярная); Т30 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); 831 (положительная, полярная); Υ32 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); Υ33 (положительная, отрицательная, полярная, неполярная); Υ35 (полярная), Е50 (отрицательная); N52 (полярная, неполярная); Р53 (отрицательная, полярная); 854 (положительная, отрицательная, полярная); N55 (отрицательная, полярная, неполярная); Ό57 (отрицательная, неполярная); Т58 (полярная, неполярная); N59 (отрицательная, полярная, неполярная); Р60 (отрицательная, положительная, полярная, неполярная); N61 (отрицательная); Е62 (отрицательная); К63 (отрицательная, положительная, полярная, неполярная); Р64 (отрицательная, полярная, неполярная); К65 (отрицательная, положительная, полярная, неполярная); 866 (отрицательная); 899 (отрицательная, неполярная); Ό100 (отрицательная); С101 (неполярная); К102 (положительная, полярная); N103 (отрицательная, положительная, полярная, неполярная); Ό104 (отрицательная); М105 (отрицательная, полярная, положительная); Ό106 (отрицательная) и 8107 (отрицательная, полярная, неполярная).

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 28 (в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Не, Азр, С1и, Агд, Ьуз, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, 8ег, ТНг и Тгр или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 28 выбрана из группы, состоящей из Не, Н1з, Азп, С1п, 8ег, ТНг и С1и. Аминокислота в положении 28 может быть также предпочтительно Не.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 30 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из ТНг, Азр, С1и, Агд, Ьуз, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, 8ег, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 30 выбрана из группы, состоящей из ТНг, Н1з, Азп, С1п, 8ег, Туг и Агд. Аминокислота в положении 30 может быть также предпочтительно ТНг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 31 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Агд, Н1з, Ьуз, С1п и Тгр или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 31 является предпочтительно 8ег, С1п или Тгр. Аминокислота в положении 31 выбрана из группы, состоящей из 8ег, А1а, Не, Ьеи, МеЕ РЬе, Рго, Уа1, Тгр, Азп, Суз, С1п, С1у, 8ег, ТНг и Туг; или предпочтительно является 8ег, Тгр или С1п.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 32 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Туг, Азр, С1и, Агд, Ьуз, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, 8ег, Тгр, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 32 может быть также предпочтительно Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 33 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Туг, Азр, С1и, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, 8ег, ТНг, Тгр, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 33 выбрана из группы, состоящей из Туг, А1а, Рго, 8ег, ТНг, Уа1 и Тгр. Аминокислота в положении 33 может быть также предпочтительно Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 35 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Туг, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Азр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 35 может быть также предпочтительно Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 50 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является С1и или Азр или любой их подсерией. Аминокислота в положении 50 может быть также предпочтительно С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 52 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Агд, А1а, Ьеи, Уа1 и Ьуз или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 52 выбрана из группы, состоящей из Азп, А1а, РЬе, Н1з, Ьеи, Ме1, 8ег, ТНг, Уа1 и Тгр. Аминокислота в положении 52 может также быть предпочтительно Азп.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 53 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Рго, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Азр и С1и или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 53 может также быть предпочтительно Рго.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 54 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме1, РЬе, ТНг, Тгр, Туг, Агд, Ьуз и С1и или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в

- 20 014226 положении 54 выбрана из группы, состоящей из 8ег, С1и, Η 1к. Ьук, Акп, 61п, Агд, ТНг, Тгр, Туг и РНе. Аминокислота в положении 54 выбрана из группы, состоящей из 8ег, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РНе, Рго, Уа1, Тгр, Акп, Сук, С1п, С1у, 8ег, ТНг и Туг; или предпочтительно 8ет, РНе или С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 55 (в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Акп, С1и, Ьук, С1п, 8ет, Т11Г Ме! и Уа1 или любой их подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 55 выбрана из группы, состоящей из Акп, С1и, Ьук, С1п, 8ет, ТНт, Ме! и Уа1. Аминокислота в положении 55 может быть также предпочтительно Акп.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 57 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Акр, С1и, РНе и Ьеи или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 57 является предпочтительно Акр, РНе или Ьеи. Аминокислота в положении 57 выбрана из группы, состоящей из Акр, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РНе, Рго, Уа1 и Тгр; или является предпочтительно Акр, Ьеи или РНе.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 58 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из ТНт, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, РНе, 8ет, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или любой их подгруппы. Аминокислота в положении 58 может быть также предпочтительно ТНт.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 59 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, РНе, 8ет, ТНт, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 59 выбрана из группы, состоящей из Акп, А1а, РНе, Ьеи, Ме!, Рго, Уа1, Тгр, Акр и Туг. Аминокислота в положении 59 может быть также предпочтительно Акп.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 60 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из РНе, Акр, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, 8ет, ТНт, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд, Ьук, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 60 может быть также предпочтительно РНе.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 61 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является Акп, Акр или С1и или их любой подгруппой. Аминокислота в положении 61 может также быть предпочтительно Акп.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 62 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является С1и или Акр или их любой подгруппой. Аминокислота в положении 62 может также быть предпочтительно С1и.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 63 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, РНе, 8ет, ТНт, Тгр, Туг, Агд, С1и, Акр, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 63 может быть также предпочтительно Ьук.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 64 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из РНе, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, 8ет, ТНт, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 64 может быть также предпочтительно РНе.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 65 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, РНе, 8ет, ТНт, Тгр, Туг, Агд, Акр, С1и, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 65 может быть также предпочтительно Ьук.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 66 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является 8ет, Акр или С1и или их любой подгруппой. Аминокислота в положении 66 является также предпочтительно 8ет.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 99 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является 8ет, Акр, С1и или А1а или их любой подгруппой. Альтернативно, аминокислота в положении 99 является предпочтительно 8ет или А1а. Аминокислота в положении 99 может быть также предпочтительно 8ет.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 100 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является Акр или С1и или их любой подгруппой. Аминокислота в положении 100 может быть также предпочтительно Акр.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 101 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является С1у, РНе или Ьеи или их любой подгруппой. Альтернативно, аминокислота в положении 101 является предпочтительно С1у, РНе или Ьеи. Аминокислота в положении 101 выбрана из группы, состоящей из С1у, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РНе, Рго, Уа1 и Тгр; или является предпочтительно С1у, Ьеи или РНе.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 102 (в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Агд, Акп, Сук, С1п, С1у, Шк, Ме!, РНе, 8ес, ТНт, Тгр, Туг и Ьук или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 102 мо

- 21 014226 жет быть также предпочтительно Агд.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 103 (в соответствии с 8ЕЭ ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, Не, Ьук, Агд и Уа1 или их любой подгруппы. Альтернативно, аминокислота в положении 103 выбрана из группы, состоящей из Акп, А1а, Акр, С1и, РЬе, Н1к, Не, Ьук, Ме!, Агд, 8ег, ТЬг, Уа1 и Туг. Аминокислота в положении 103 выбрана также из группы, состоящей из Акп, Сук, С1п, С1у, 8ег, ТЬг и Туг; или является предпочтительно Акп или Туг.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 104 (в соответствии с 8ЕЭ ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является Акр или С1и, или их любой подгруппой. Аминокислота в положении 104 может быть также предпочтительно Акр.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 105 (в соответствии с 8ЕЭ ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из Ме!, Акр, С1и, Агд, Н1к, Ьук, Акп, Сук, С1п, С1у, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр и Туг или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 105 может также быть предпочтительно Ме!.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 106 (в соответствии с 8ЕЭ ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента является Акр или С1и или их любой подгруппой. Аминокислота в положении 106 может также быть предпочтительно Акр.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 107 (в соответствии с 8ЕЭ ΙΌ N0: 6) пептида тяжелой цепи или его фрагмента выбрана из группы, состоящей из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Акр, С1и, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1 или их любой подгруппы. Аминокислота в положении 107 может также быть предпочтительно 8ег.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 28 является С1и; аминокислота в положении 33 является РЬе; аминокислота в положении 54 является ТЬг; и аминокислота в положении 59 является Акр или Ьеи.

В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 30 является Н1к или Агд; аминокислота в положении 31 является С1п или Тгр; аминокислота в положении 33 является Тгр, Уа1 или Рго; аминокислота в положении 52 является Ме! или Тгр; аминокислота в положении 54 является Акп, РЬе или С1п; аминокислота в положении 55 является Ме!, Ьук или Уа1; аминокислота в положении 57 является РЬе или Ьеи; аминокислота в положении 59 является РЬе или Туг; аминокислота в положении 101 является РЬе или Ьеи; и аминокислота в положении 103 является Н1к или Туг.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является Туг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; и аминокислота в положении 105 является Ме!. Этот мутант называют здесь мутантом № 1.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!. Этот мутант называют здесь мутантом № 2.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!. Этот мутант называют здесь мутантом № 4.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕЭ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в

- 22 014226 положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 33, положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!. Этот мутант называют здесь мутантом № 11.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит ЗЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 57, положении 59, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в полжении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!. Этот мутант называют здесь мутантом № 12.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит ЗЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является Туг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является ТЬг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 59 является Ьеи и аминокислота в положении 105 является Ме!. Этот мутант называют здесь мутантом № 13.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит ЗЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 является Тгр; аминокислота в положении 54 является Зег; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит ЗЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 является С1п; аминокислота в положении 54 является Зег; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит ЗЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31 является Зег; аминокислота в положении 54 является РЬе; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит ЗЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в поло

- 23 014226 жении 31 является 8ег; аминокислота в положении 54 является С1п; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32. положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6. где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является РЬе; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32. положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег. аминокислота в положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6. где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Ьеи; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32. положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6. где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является РЬе; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32. положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6. где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является Ьеи; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32. положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

В некоторых вариантах осуществления пептид содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6. где аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103 является Туг; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32. положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд и аминокислота в положении 105 является Ме!.

Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется здесь как процент аминокислотных остатков в модифицированной последовательности. которые являются идентичными

- 24 014226 (т.е. теми же самыми остатками) с остатками антитела 5с8 дикого типа после сопоставления этих последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для получения максимальной процентной идентичности последовательности. Обычно ^концевые, С-концевые или внутренние удлинения, делеции или инсерции в последовательности антитела вне вариабельной области не считаются влияющими на идентичность или сходство последовательности. Это антитело может содержать одно или несколько аминокислотных изменений в его одном или нескольких гипервариабельных районах или вблизи них. Процентная идентичность может быть определена, например, с использованием программы Сар (\У1ксопкт 8едиепсе Апа1ук1к Раскаде, Уегкюга 8 £ог Ишх, Сепейск Сотрипег Сгоир, Ишуегкйу КекеагсЕ Рагк, Майкоп VI), с использованием установок по умолчанию, которая использует алгоритм 8тЕЕ апЕ Vаΐе^тап (АЕу, Арр1. Май, 1981, 2, 482-489).

Данное изобретение обеспечивает также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любой из описанных здесь пептидов или их фрагментов. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид 8Е0 ГО N0: 3, представлена в 8Е0 ГО N0: 2. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид 8Е0 ГО N0: 6, представлена в 8Е0 ГО N0: 5. Специалист с квалификацией в данной области, имеющий аминокислотные последовательности описанных здесь пептидов, может сконструировать и получить молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эти пептиды.

Данное изобретение обеспечивает также векторы, содержащие любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой из описанных здесь пептидов или их фрагментов. Специалисту с квалификацией в данной области будут известны многочисленные векторы, многие из которых являются коммерчески доступными.

Данное изобретение обеспечивает также клетки-хозяева, содержащие любые из описанных здесь молекул нуклеиновых кислот или векторов. Эти клетки-хозяева могут быть использованы, например, для экспрессии пептидов и антител или их фрагментов. Пептиды и антитела или их фрагменты могут быть также экспрессированы в клетках ш у|уо. Клетка-хозяин, которая трансформирована (например, трансфицирована) для продуцирования этих пептидов или антител или их фрагментов, может быть иммортализованной клеточной линией млекопитающего, такой как клеточные линии лимфоидного происхождения (например, линии клеток миеломы, гибридомы, триомы или квадромы). Клетка-хозяин может также включать лимфоидные клетки, такие как В-клетки, которые были иммортализованы трансформацией вирусом (например, вирусом Эпштейна-Барра).

Некоторые иммортализованные лимфоидные клеточные линии, такие как миеломные клеточные линии, в их нормальном состоянии секретируют легкую или тяжелую цепи антител. Если такую клеточную линию трансформируют вектором, который содержит мутантное антитело или его фрагмент, полученные во время способа данного изобретения, может быть необязательным проведение остальных стадий этого способа, при условии, что нормально секретируемая цепь является комплементарной вариабельному домену цепи 1д, кодируемому полученным ранее вектором. Однако если эта иммортализованная клеточная линия не секретирует эту цепь или не секретирует комплементарную цепь, будет необходимо введение в эти клетки вектора, который кодирует соответствующую комплементарную цепь или ее фрагмент.

В случае, когда иммортализованная клеточная линия секретирует комплементарную легкую или тяжелую цепь, эта трансформированная клеточная линия может быть получена, например, трансформацией подходящей бактериальной клетки этим вектором и затем слиянием этой бактериальной клетки с иммортализованной клеточной линией (например, слиянием сферобластов). Альтернативно, эта ДНК может быть непосредственно введена в иммортализованную клеточную линию электропорацией.

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как Е. сой, Саи1оЬас!ег сгексейик, 81гер1отусек креаек и 8а1топе11а 1ур1итигтт; дрожжевые клетки, такие как 8ассЕаготусек сегеутоае, 8сй/окасскаготусек ротЬе, Р1сЕ1а ра&Еопк, РюЫа тейапойса; линии клеток насекомых, такие как клетки из 8роЕор!ега £гид1регЕа (например, клеточные линии 8£9 и 8£21 и клетки ехргек8Е™ (Рго!ет 8аепсек Согр., МепЕеп, СТ, И8А)), клетки ЭгокорЕЕа 82 и клетки ТпсЕорЫыа в Ηί§1ι Рйе® Се11к (1пуйгодеп, Саг1кЬаЕ, СА, И8А); и клетки млекопитающих, такие как клетки С081 и С087, клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки миеломы N80, клетки N14 ЗТЗ, клетки 293, клетки ИЕРС2, клетки ^Ьа, Ь-клетки, Иека, МЭСК, ΗΕΚ293, νΐ38, мышиная клеточная линия эмбриональных стволовых клеток (Е8) (например, из штаммов 129/8У, С57/ВЬ6, ЭВА-1, 129/8У1), К562, клетки 1игка! и Βν5147. Другие применимые клеточные линии млекопитающих хорошо известны и легко доступны из Американской Коллекции типовых культур (АТСС) (Мапаккак, УА, И8А) и №1Еопа1 1пкШйе о£ Сепега1 МеЕюа1 8аепсек (МСМ8) Читан Сепейс Се11 Керокйогу а! Соие1 Се11 Керокйопек (СатЕеп, N1, И8А). Эти типы клеток являются только репрезентативными клетками и не предназначены для того, чтобы служить исчерпывающим перечнем.

Пептиды и антитела и их фрагменты могут быть получены в прокариотических и эукариотических клетках. Таким образом, это изобретение обеспечивает также клетки, которые экспрессируют антитела данного изобретения, в том числе гибридомные клетки, В-клетки, плазматические клетки, а также клетки-хозяева, рекомбинантно модифицированные для экспрессии антител данного изобретения.

- 25 014226

Среди других рассмотрений, некоторые из которых описаны выше, штамм клетки-хозяина может быть отобран на его способность процессировать экспрессируемые пептид или антитело или их фрагмент желаемым образом. Посттрансляционные модификации этого полипептида включают, но не ограничиваются ими, гликозилирование, ацетилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование, и одним аспектом данного изобретения является обеспечение антител или их фрагментов с одной или несколькими посттрансляционными модификациями.

Данное изобретение обеспечивает также антитела или их фрагменты, содержащие любой описанный здесь пептид, причем это антитело или его фрагмент может связываться с СЭ154 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит любой из описанных здесь пептидов легкой цепи или их фрагментов. В других вариантах осуществления это антитело или его фрагмент содержит любой из описанных здесь пептидов тяжелой цепи или их фрагментов. В дополнительных других вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит любой из описанных здесь пептидов тяжелой цепи или их фрагментов и любой из описанных здесь пептидов легкой цепи или их фрагментов.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 14, и второй пептид, который является пептидом мутанта № 1. Такой композиционный (составной) мутант называют здесь мутантом № 16.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который является пептидом мутанта № 2. Такой композиционный (составной) мутант называют здесь мутантом № 17.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который является пептидом мутанта № 1. Такой композиционный (составной) мутант называют здесь мутантом № 18.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 14, и второй пептид, который является пептидом мутанта № 4. Такой композиционный (составной) мутант называют здесь мутантом № 19.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который является пептидом мутанта № 4. Такой композиционный (составной) мутант называют здесь мутантом № 20.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 14, и второй пептид, который является пептидом мутанта № 2. Такой композиционный (составной) мутант называют здесь мутантом № 23.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 14, и второй пептид, который содержит 8Е0 ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; аминокислота в положении 33 является Тгр и аминокислота в положении 105 является МеЕ Такой составной мутант называют здесь мутантом № 21.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который содержит 8Е0 ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; аминокислота в положении 33 является Тгр и аминокислота в положении 105 является МеЕ Такой составной мутант называют здесь мутантом № 22.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 14, и второй пептид, который содержит 8ЕО ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении

- 26 014226 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к, аминокислота в положении 33 является Тгр и аминокислота в положении 105 является Ме1. Такой составной мутант называют здесь мутантом № 24.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который содержит 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении и положении 61 является Аки; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к, аминокислота в положении 33 является Тгр и аминокислота в положении 105 является Ме1. Такой составной мутант называют здесь мутантом № 25.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который содержит 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Аки; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 в положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; и аминокислота в положении 105 является Ме1. Такой составной мутант называют здесь мутантом № 26.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 15, и второй пептид, который содержит 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Аки; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33; является Тгр и аминокислота в положении 105 является Ме1. Такой составной мутант называют здесь мутантом № 27.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент содержит первый пептид, который является пептидом мутанта № 14, и второй пептид, который содержит 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, где аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Аки; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр и аминокислота в положении 105 является Ме1. Такой составной мутант называют здесь мутантом № 28.

Антитело является гликопротеином с приблизительной молекулярной массой (М\У) 150 кДа, которое продуцируется гуморальной ветвью иммунной системы позвоночных в ответ на присутствие чужеродных молекул в теле. Функциональное антитело или производное антитела способно узнавать специфический антиген 1и νίΐΐΌ и 1и νί\Ό и связываться с ним, и может инициировать любые последующие действия, ассоциированные со связыванием антитела, в том числе, например, прямую цитотоксичность, комплементзависимую цитотоксичность (СЭС), антителозависимую цитотоксичность (АЭСС) и продуцирование антител.

После связывания с антигеном антитела активируют одну или несколько из многих эффекторных систем иммунной системы, которые способствуют нейтрализации, деструкции и элиминации инфицирующего микроорганизма или другой антигенсодержащей частицы, например раковой клетки.

Антитела и их фрагменты, описанные здесь, имеют увеличенную или уменьшенную аффинность,

- 27 014226 авидность и/или специфичность в сравнении с антителом 5с8 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эти антитела и их фрагменты, описанные здесь, имеют увеличенную аффинность, авидность и/или специфичность в сравнении с антителом 5с8 дикого типа. Аффинность, авидность и/или специфичность могут быть измерены различными путями. Обычно, независимо от конкретного способа, в котором определяют или измеряют аффинность, способы данного изобретения улучшают аффинность антитела, когда они генерируют антитело, которое является превосходящим в любом аспекте его клинического применения относительно антитела (или антител), из которого (которых) оно произведено (например, способы этого изобретения считаются эффективными или успешными, когда модифицированное антитело может вводиться в более низкой дозе или менее часто или более удобным способом введения, чем антитело или антитела, из которых оно получено).

Специалистам с квалификацией в данной области будет ясно, что определение аффинности не всегда является таким простым, как рассмотрение в единственной, конечной конфигурации. Поскольку антитела имеют два плеча, их кажущаяся аффинность является обычно гораздо более высокой, чем внутренняя аффинность между вариабельной областью и антигеном. Внутренняя аффинность может быть измерена с использованием ксЕу- или ЕаЬ-фрагментов.

В некоторых вариантах осуществления этот фрагмент антитела является одноцепочечным антителом (ксЕу), Е(аЬ')₂-фрагментом, ЕаЬ-фрагментом, ЕаЬ'-фрагментом или Еб-фрагментом или их антигенсвязывающими фрагментами. Одноцепочечное антитело получают из вариабельных областей, связанных белковыми спейсерами в единой белковой цепи. В других вариантах осуществления фрагменты антител включают гетеромерные комплексы антител и слияния антител, такие как биспецифические антитела, полудимерные антитела и поливалентные антитела (например, тетравалентные антитела). Полудимерное антитело получают из Ес-части и одной ЕаЬ-части.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты могут также включать белки, содержащие одну или несколько легких цепей и/или тяжелых цепей иммуноглобулина, такие как мономеры или гомо- или гетеромультимеры (например, димеры или тримеры) этих цепей, где эти цепи являются необязательно связанными дисульфидными связями или сшиты иным образом. Эти антитела или их фрагменты могут связываться с одним или несколькими антигенами.

Описанные здесь фрагменты антитела сохраняют их способность связывать ί.Ό154. Например, для фрагмента 5с8, который способен связываться с СЭ154. соответствующий фрагмент, который содержит любую описанную здесь мутацию, также способен связывать СО 154. Аминокислоты, присутствующие на СО154, с которыми контактирует 5с8, включают У126, Ι127, 8128, Е129, А130, 8131, 8132, К133, Т134, р139, №140, А141, Е142, К143, 0144, Υ145, Υ146, Т147, М148, 8149, N150, N151, У153, Т154, Ь155, Е156, N157, 0158, К159, Т176, Е177, С178, 8179, N180, Е182, А183, 8184, В200, Е201, Е202, В203, Ι204, Ь205, А209, А215, К216, Р217, С218, 0219, 9220, 9221, Ό243, Р244, 8245, 9246, У247, 8248, Н249, 0250, Т251, 0252, Е253 и Т254. В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих остатков на ί.Ό154 взаимодействуют с описанными здесь мутантами.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь мутанты могут контактировать с количеством остатков СЭ154, на один или несколько остатков меньшим, чем антитело дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления это антитело или его фрагмент помечены детектируемым маркером. Детектируемые маркеры включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные изотопы (такие как Р³² и 8³⁵), ферменты (такие как пероксидаза хрена, хлорамфениколацетилтрансфераза (САТ), βгалактозидаза (в-да1) и т.п.), флуорохромы, хромофоры, коллоидное золото, красители и биотин. Эти меченые антитела или их фрагменты могут быть использованы для проведения диагностических процедур (многие диагностические анализы основаны на детектировании белкового антигена (такого как Р8А))) в различных типах клеток и тканей. Для процедур визуализации, ίπ νίΙΐΌ или ίπ у1уо, измененные антитела, полученные описанными здесь способами, могут быть помечены дополнительными агентами, такими как ЯМР-контрастные агенты, рентгеноконтрастные агенты или квантовые точки. Способы присоединения детектируемого агента к полипептидам, в том числе антителам или их фрагментам, известны в данной области. Антитела могут быть также присоединены к нерастворимой подложке (такой как гранула, стеклянное или пластиковое предметное стекло или т.п.).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент конъюгируют с терапевтическим агентом, который включает, но не ограничивается ими, радиоизотопы (такие как ' ''Ιπ или ⁹⁰Υ), токсины (такие как столбнячный токсоид или рицин), токсоиды и химиотерапевтические агенты (см. патент США № 6307026).

В некоторых вариантах осуществления эти антитела или их фрагменты модифицируют конъюгированием с визуализирующим агентом. Визуализирующие агенты включают, например, метящую часть (такую как биотин, флуоресцентные части молекул, радиоактивные части молекул, гистидиновая метка или другие пептидные метки) для облегчения выделения и детектирования.

При введении антитела часто выводятся быстро из кровотока и, следовательно, могут индуцировать относительно краткосрочную фармакологическую активность. Таким образом, могут требоваться частые инъекции относительно больших доз антител для поддержания терапевтической эффективности лечения

- 28 014226 антителами.

В некоторых вариантах осуществления эти антитела и их фрагменты могут быть модифицированы (например, присоединением к другим молекулам) для увеличения целостности и продолжительности существования антитела ш νί\Ό. Например, эти антитела или их фрагменты могут быть модифицированы для включения части молекулы, которая может увеличивать стабилизацию, пролонгируя посредством этого полупериод существования в сыворотке этого антитела.

В некоторых вариантах осуществления это антитело или его фрагмент содержит по меньшей мере один высокомолекулярный полимер, который включает, но не ограничивается ими, полиэтиленимин и полилизин. В других вариантах осуществления эти антитела и их фрагменты модифицированы ковалентным присоединением водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин, все из которых, как известно, проявляют существенно более длительные полупериоды существования в крови после внутривенной инъекции, чем соответствующие немодифицированные белки (ЛЬисЬоеткк! е! а1., Ш: Епхутек ак Итидк, 1981; Но1сеиЬегд е! а1., Ей., 1981, ^йеуйШеткаеисе, №ет Уотк, ИУ, 367-383; Аийегкои, Нитаи Сеие ТЬегару. 8аеисе, 1992, 256, 808-813; №еттагк е! а1., 1. Арр1. ВюсЬет., 1982, 4, 185-189; и Кайе е! а1., Ргос. №И. Асай. 8ск И8А, 84, 1487-1491).

В некоторых вариантах осуществления это антитело или его фрагмент является ПЭГилированным или гликозилированным по меньшей мере в одном положении аминокислоты или модифицированным другими подходящими водорастворимыми полимерами, в том числе, но не только, ПЭГ, сополимерами этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозой, декстраном, поливиниловым спиртом, поливинилпирролидоном, поли-1,3-диоксоланом, поли-1,3,6-триоксаном, сополимером этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислотами (либо гомополимерами, либо статистическими сополимерами) и декстраном или поли(н-винилпирролидоном), ПЭГ, гомополимерами полипропиленгликоля, сополимерами полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированными полиолами (например, глицерином), поливиниловым спиртом и их смесями.

Этот полимер может иметь любую подходящую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным.

Для ПЭГ подходящая средняя молекулярная масса находится в диапазоне приблизительно 2-100 кДа. Это обеспечивает легкость манипулирования и получения. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что в препаратах ПЭГ некоторые молекулы имеют большую массу, некоторые меньшую массу, чем указанная молекулярная масса. Таким образом, молекулярная масса обычно указывается как средняя молекулярная масса. Могут быть использованы другие молекулярные массы (размеры) в зависимости от желаемого терапевтического профиля (например, желаемой продолжительности поддерживаемого высвобождения; действий, если они имеются, на биологическую активность; легкости в манипулировании; степени или отсутствия антигенности и других известных действий ПЭГ на терапевтический белок). В различных вариантах осуществления молекулярная масса равна приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 40 или приблизительно 100 кДа. В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса каждой цепи ПЭГ равна приблизительно 20 кДа. В других вариантах осуществления средняя молекулярная масса равна приблизительно 10 кДа.

Количество присоединенных таким образом молекул может варьироваться, и специалист с квалификацией в данной области будет способен определить действие на функцию. Можно монодериватизировать или можно получить ди-, три-, тетра- или некоторую комбинацию дериватизации с одними и теми же или различными химическими частями молекул (например, полимерами, такими как ПЭГ с различными молекулярными массами). Отношение молекул полимера к молекулам белка (или полипептида) будет варьироваться, как и их концентрация в реакционной смеси. Обычно оптимальное отношение (в смысле эффективности реакции, заключающейся в том, что нет избытка непрореагировавшего белка или полимера) будет определяться такими факторами, как желаемая степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т. д.), молекулярная масса выбранного полимера, является ли этот полимер разветвленным или неразветвленным, и условия реакции.

Молекулы ПЭГ (или другие химические части молекул) должны быть присоединены к этому белку с учетом действий на функциональные или антигенные домены этого белка. Имеется ряд способов присоединения, доступных специалистам с квалификацией в данной области. См., например, ЕР 0401384 (связывание ПЭГ с С-С8Е); Ма11к е! а1., Ехр. Нета!о1., 1992, 20, 1028-1035 (где сообщается ПЭГилирование СМ-С8Е с использованием трезилхлорида).

Например, ПЭГ может быть ковалентно связанным (ПЭГилирование) посредством аминокислотных остатков через реакционноспособную группу, такую как свободная аминогруппа или карбоксильная группа. Аминокислотные остатки, имеющие свободную аминогруппу, включают остатки лизина и аминоконцевой аминокислотный остаток. Остатки, имеющие свободную карбоксильную группу, включают остатки аспарагиновой кислоты, остатки глутаминовой кислоты и С-концевой аминокислотный остаток. Для присоединения ПЭГ-молекулы (ПЭГ-молекул) в качестве реакционноспособной группы могут быть также использованы сульфгидрильные группы. Для терапевтическиих целей присоединение может про

- 29 014226 исходить при аминогруппе, например, в Ν-конце или группе лизина. Может быть специфически желательным химически модифицированный на аминоконце белок.

С использованием ПЭГ в качестве иллюстрации этих композиций могут быть выбраны ПЭГмолекулы из различных ПЭГ-молекул (по молекулярной массе, ветвлению и т.д.), соотношение молекул ПЭГ к молекулам белка (или пептида) в реакционной смеси, тип выполняемой реакции ПЭГилирования и способ получения выбранного ПЭГилированного на аминоконце белка. Способ получения ПЭГилированного на аминоконце препарата (т.е. отделения этой части молекулы от других моноПЭГилированных частей молекул, если необходимо) может предусматривать очистку ПЭГилированного на аминоконце материала из популяции ПЭГилированных белковых молекул. Селективная аминоконцевая модификация может быть выполнена восстановительным алкилированием, которое использует дифференциальную реактивность различных типов первичных аминогрупп (лизина против аминоконцевой аминогруппы), доступных для дериватизации в конкретном белке. При подходящих условиях реакции достигается, по существу, селективная дериватизация этого белка на аминоконце содержащим карбонильную группу полимером. Например, можно селективно ПЭГилировать аминоконец белка выполнением этой реакции при рН, который позволяет использовать преимущество различий рКа между эпсилон (е)-аминогруппой остатка лизина и альфа (а)-аминогруппой аминоконцевого остатка этого белка. Посредством такой селективной дериватизации контролируют присоединение водорастворимого полимера к белку: конъюгация с этим полимером имеет место преимущественно на аминоконце этого белка без значимой модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина.

С использованием восстановительного алкилирования водорастворимый полимер может быть такого типа, как описанный выше тип, и следует иметь единственный реакционноспособный альдегид для связывания с этим белком. Может быть использован ПЭГ-пропиональдегид, содержащий единственный реакционноспособный альдегид.

Модификации антител могут также увеличивать растворимость этого белка в водном растворе, исключать агрегацию, повышать физическую и химическую стабильность этого белка и в значительной степени уменьшать иммуногенность и антигенность этого белка. В результате желаемая ίη νΐνο биологическая активность может быть достигнута введением таких аддуктов полимер-белок менее часто или при более низких дозах, чем с немодифицированным белком.

Термин химерное антитело используется для описания белка, содержащего по меньшей мере антигенсвязывающую часть молекулы иммуноглобулина, которая присоединена, например, пептидной связью или пептидным линкером к гетерологичному белку или его пептиду. Гетерологичный белок может быть неиммуноглобулином или частью иммуноглобулина другого вида, класса или подкласса.

Имеются многочисленные способы, при помощи которых могут быть получены такие антитела. Например, можно получить экспрессирующий вектор, включающий промотор, который функционально связан с ДНК-последовательностью, которая кодирует по меньшей мере Ун или У_ь, и последовательность, которая кодирует этот гетерологичный белок (или его пептид (причем этот пептид имеет достаточную длину, которая может узнаваться как молекула неиммуноглобулина (например, пептид, не имеющий существенной идентичности последовательности с иммуноглобулином))). Если это необходимо или желательно, можно получить второй экспрессирующий вектор, включающий промотор, который функционально связан с ДНК-псследовательностью, которая кодирует комплементарный вариабельный домен (например, когда этот исходный экспрессирующий вектор кодирует У_н, второй экспрессирующий вектор кодирует У_ъ и νίοο \'СГ5а). Затем клеточная линия (например, иммортализованная клеточная линия млекопитающего) может быть трансформирована одним или обоими этими экспрессирующими векторами и культивирована при условиях, которые делают возможной экспрессию этого химерного вариабельного домена или химерного антитела (см., например, международную заявку на патент № РСТ/СВ 85/00292). Этот способ может быть использован для экспрессии модифицированных антител данного изобретения, антител, содержащих полноразмерные тяжелую и легкую цепи или их фрагменты (например, описанные здесь ЕаЬ-, Е(аЬ')₂- или 5сЕ\'-фрагменты). Эти способы не ограничиваются экспрессией химерных антител.

Хотя встречающиеся в природе антитела получают из единственного вида, сконструированные антитела и фрагменты антител могут быть получены из более чем одного вида животного, например химерные антитела. До настоящего времени были генерированы химерные антитела мышь/человек и антитела мышь/примат (не человек), хотя возможны и комбинации других видов.

В некоторых вариантах осуществления эти антитела или их фрагменты являются химерными антителами. Обычно химерные антитела включают вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, включающие как определяющий комплементарность район (СИЕ), так и каркасные остатки из одного вида (обычно мыши), слитые с константными областями другого вида (обычно человека). Эти химерные антитела мышь/человек содержат приблизительно 75% аминокислотных последовательностей человека и 25% аминокислотных последовательностей мыши. Последовательности человека представляют константные области этого антитела, тогда как мышиные последовательности представляют вариабельные области (и, следовательно, антигенсвязывающий сайт) этого антитела.

- 30 014226

Основанием для использования таких химер является сохранение антигенспецифичности мышиного антитела, но уменьшение иммуногенности мышиного антитела (мышиное антитело вызывало бы иммунную реакцию против него в видах, других, чем мышь) и, следовательно, возможность использования этой химеры в терапиях для человека.

В другом варианте осуществления эти антитела или их фрагменты включают химерные антитела, содержащие каркасные районы из одного антитела и районы СЭК из другого антитела. В других вариантах осуществления эти антитела или их фрагменты включают химерные антитела, содержащие районы СЭК из различных антител человека. В других вариантах осуществления эти антитела или их фрагменты включают химерные антитела, содержащие районы СОК из по меньшей мере двух различных антител человека.

Способы получения всех этих химерных антител, описанных выше, хорошо известны специалисту с квалификацией в данной области (патент США № 5807715; Моткоп е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А, 1984, 81, 6851-5; 8йагоп е! а1., ХаИие. 1984, 309, 364-7; и Такейа е! а1., \а1иге. 1985, 314, 452-4).

В другом варианте осуществления эти антитела и их фрагменты включают также приматизированные, гуманизированные и полностью человеческие антитела. Приматизированные и гуманизированные антитела обычно включают СОК тяжелой и/или легкой цепи из мышиного антитела, привитые (трансплантированные) в каркас ν-области антитела человека или антитела примата (не человека), и обычно содержат дополнительно константную область человека (ШесНтапи е! а1., №1Шге. 1988, 332, 323-7; Со е! а1., №!иге, 1991, 351, 501-2; и патенты США №№ 6054297, 5821337, 5770196, 5766886, 5821123, 5869619, 6180377, 6013256, 5693761 и 6180370).

Гуманизированное антитело является антителом, продуцируемым технологией рекомбинантных ДНК, в которой некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не требуются для связывания антигена (например, константные области и каркасные районы вариабельных доменов), используют для замены соответствующих аминокислот из легкой или тяжелой цепи родственного антитела не человека. Например, гуманизированная версия мышиного антитела к конкретному антигену имеет на его обеих тяжелой и легкой цепях 1) константные области антитела человека; 2) каркасные районы из вариабельных доменов антитела человека и 3) СОК из мышиного антитела. В случае необходимости, один или несколько остатков в каркасных районах человека могут быть изменены на остатки в соответствующих положениях в мышином антителе таким образом, чтобы сохранить аффинность связывания этого гуманизированного антитела с антигеном. Это изменение называют иногда обратной мутацией. Гуманизированные антитела обычно с меньшей вероятностью индуцируют иммунную реакцию в людях в сравнении с химерными антителами человека, так как первые содержат значительно меньше компонентов не человека. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам с квалификацией в области антител (европейский патент № 239400; 1опек е! а1., №!иге, 1986, 321, 522-525; ШесНтапп е! а1., №!иге, 1988, 332, 323-327; Vе^йоеуеп е! а1., 8аепсе, 1988, 239, 1534-1536; Онееп е! а1., Ргос. №И. Асай. 8ск И8А, 1989, 86, 10029; 0г1апй1 е! а1., Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А, 1989, 86, 3833 и патент США № 6180370).

В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела генерируют трансплантацией мышиных (или других, не являющихся человеческими) СОК на антитело человека. Более конкретно, это может быть достигнуто следующим образом: 1) кДНК, кодирующую вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, выделяют из гибридомы; 2) ДНК-последовательности этих вариабельных доменов, в том числе СОК, определяют секвенированием; 3) ДНК, кодирующие СОК, переносят в соответствующщие районы кодирующей последовательности вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела человека сайт-направленным мутагенезом; и 4) добавляют сегменты гена константной области человека желаемого изотипа (например, 1 для СН, и к для СЬ). Наконец, эти гуманизированные гены тяжелой и легкой цепи коэкспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего (например, клетках СНО и N80) с получением растворимого гуманизированного антитела.

Иногда, прямой перенос СИК в каркас человека приводит к потере антигенсвязывающей аффинности полученного антитела. Это происходит вследствие того, что в некоторых родственных антителах определенные аминокислоты в каркасных районах взаимодействуют с этими СИК и, следовательно, влияют на общую антигенсвязывающую аффинность этого антитела. В таких случаях, было бы решающим введение обратных мутаций в каркасные районы акцепторного антитела для сохранения антигенсвязывающей активности родственного антитела. Общие подходы получения обратных мутаций хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области (Онееп е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А, 1989, 86, 10029; и Со е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А, 1991, 88, 2869-2873; заявка на патент РСТ А0 90/07861; и Тетрек!, ВюйсНпо^ду, 1991, 9, 266-271).

В некоторых вариантах осуществления эти антитела или фрагменты являются полностью антиСО154-антителами человека. Эти полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием праймированных ш уйго спленоцитов человека (Воегпег е! а1., I. Iттипо1., 1991, 147, 86-95) или библиотек антител в виде фагового дисплея (птент США № 6300064). Альтернативно, полностью человеческие антитела могут быть получены репертуарным клонированием (Регккоп е! а1., Ргос. №!1. Асай.

- 31 014226

8οί. И8А, 1991, 88, 2432-2436 и Ниапд е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!Ьобк, 1991, 141, 227-236). Кроме того, в патенте США № 5798230 описано получение моноклональных антител человека из В-клеток человека, где антитело, продуцирующее В-клетки человека, иммортализуют инфицированием вирусом Эпштейна-Барр или его производным, которые экспрессируют ядерный антиген 2 вируса Эпштейна-Барр (ЕΒNА2), белок, необходимый для иммортализации. Затем функцию ЕΒNА2 выключают, что приводит к увеличению продуцирования антител.

Другие способы получения полностью человеческих антител включают использование животных (не человека), которые имеют инактивированные локусы эндогенного 1д и являются трансгенными в отношении нереаранжированных генов тяжелой и легкой цепи антитела человека. Такие трансгенные животные могут быть иммунизированы активированными Т-клетками или белком Ό1.1 (патенты США №№ 5474771; 6331433 и 6455044) и из полученных из них В-клеток могут быть генерированы гибридомы. Подробности этих способов описаны в данной области. См., например, различные публикации/патенты СеиРБагт/Мебагех (Ра1о А11о, СА), касающиеся трансгенных мышей, содержащих минилокусы 1д человека, в том числе патент США № 5789650; различные публикации/патенты АЬдешх (Ргетоп!, СА) в отношении мышей XЕN0М0υ8Е®, в том числе патенты США №№ 6075181, 6150584 и 6162963; Сгееп е! а1., №1Шге Сепебск, 1994, 7, 13-21; Мепбех е! а1., №1Шге Сепебск, 1997, 15, 146-56; и различные публикации/патенты Киш (•Таран) в отношении трансомных мышей, в том числе европейский патент 843961 и Тоии/ика е! а1., №1Шге Сепебск, 1997 1ип; 16(2): 133-43.

Как только будет принято решение в отношении последовательности антитела (например, СЭКтрансплантированного или иным образом модифицированного или гуманизированного антитела), это антитело может быть получено способами, хорошо известными в области молекулярной биологии. Более конкретно, способы рекомбинантных ДНК могут быть использованы для получения большого диапазона полипептидов трансформацией клетки-хозяина последовательностью нуклеиновой кислоты (например, ДНК-последовательностью, которая кодирует желаемые белковые продукты (например, модифицированную тяжелую или легкую цепь; их вариабельные домены или их другие антигенсвязывающие фрагменты)).

Более конкретно, эти способы получения могут проводиться, как описано выше, для химерных антител. ДНК-последовательность, кодирующая, например, измененный вариабельный домен, может быть получена олигонуклеотидным синтезом. Вариабельным доменом может быть домен, который включает РК акцепторной молекулы человека и СЭК донора, например мышиные, либо до, либо после того, как один или несколько остатков (например, остаток в СЭК) были модифицированы для облегчения связывания антигена. Это облегчается определением последовательности каркасных районов акцепторного антитела и по меньшей мере СЭК-последовательностей донорного антитела. Альтернативно, ДНКпоследовательность, кодирующая измененный вариабельный домен, может быть получена направляемым праймером олигонуклеотидным сайт-направленным мутагенезом. Этот способ включает гибридизацию олигонуклеотида, кодирующего желаемую мутацию, с единственной цепью ДНК, содержащей точку мутации, и использование этой единственной цепи в качестве матрицы для удлинения этого олигонуклеотида с получением цепи, содержащей эту мутацию. Этот способ в различных формах описан, например, 2о11ег апб 8тбб (Шс. Ас1бк Кек., 1982, 10, 6487-6500), №гпк е! а1. (Лис. Ас1бк Кек., 1983, 11, 5102-5112), 2о11ег апб 8тбб (ОЫА, 1984, 3, 479-488) и Кгатег е! а1. Щис. Аабк Кек., 1982, 10, 6475-6485).

Известны также другие способы введения мутаций в последовательность, и они могут быть использованы для генерирования описанных здесь измененных антител (см., например, Сабег е! а1., Кис. Ас1бк Кек., 1985, 13, 4431-4443). Олигонуклеотиды, используемые для сайт-направленного мутагенеза, могут быть получены олигонуклеотидным синтезом или выделены из ДНК, кодирующей вариабельный домен донорного антитела, с использованием подходящих рестриктаз.

В другом варианте осуществления эти антитела или их фрагменты могут быть получены бесклеточной трансляцией. Альтернативно, эти антитела и их фрагменты могут быть получены в биореакторах, содержащих антителоэкспрессирующие клетки для облегчения крупномасштабного получения.

В некоторых вариантах осуществления эти антитела или их фрагменты могут быть получены в трансгенных млекопитающих, таких как козы, коровы или овцы, которые экспрессируют это антитело в молоке, для облегчения крупномасштабного получения антител (патент США № 5827690 и Ро11оск е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!Ь., 1999, 231, 147-57).

Данное изобретение обеспечивает также фармацевтические композиции, содержащие любые один или несколько пептидов или их фрагментов, любые один или несколько молекул нуклеиновых кислот или векторов, или любые одно или несколько антител или их фрагментов, описанных здесь. Композиции включают, например, фармацевтические композиции.

В профилактических применениях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят субъекту, страдающему от нарушения, в количестве, достаточном для элиминации или уменьшения риска, ослабления тяжести или задержки возникновения этого нарушения, в том числе биохимических, гистологических и/или поведенческих симптомов этого нарушения, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, присутствующих во время развития этого нарушения. В терапевтических

- 32 014226 применениях эти композиции или лекарственные средства вводят субъекту, в котором подозревают наличие такого нарушения, или который страдает от такого нарушения, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, частичной приостановки симптомов этого нарушения (биохимических, гистологических и/или поведенческих) в том числе его осложнений и промежуточных патологических фенотипов в развитии этого нарушения.

Фармацевтические композиции этого изобретения могут включать по меньшей мере одно антитело или его фрагмент, описанные здесь, в фармацевтически приемлемом носителе. Фармацевтически приемлемый носитель обозначает по меньшей мере один компонент фармацевтического препарата, который обычно используют для введения активных ингредиентов. Такой носитель может содержать любой фармацевтический эксципиент, известный в данной области, и любую форму носителя для введения. Носители включают, но не ограничиваются ими, забуференный фосфатом солевой раствор, физиологический раствор, воду, готовые формы цитрат/сахароза/Твин и эмульсии, такие как, например, эмульсии типа масло/вода.

Эти композиции могут включать активный терапевтический агент и различные другие фармацевтически приемлемые компоненты. См. Кеттд1ои'к Рйагтасеибса1 8с1еисе (15^4Ь еб., Маск РиЬккНтд Сотрапу, Еак1оп, Реппкукаша (1980)). Желаемая форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Эти композиции могут также включать в зависимости от желаемой готовой формы фармацевтически приемлемые, нетоксичные носители или разбавители, которые определяются как носители, обычно используемые для приготовления фармацевтических композиций для введения животному или человеку. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примеры таких разбавителей включают, но не ограничиваются ими, дистиллированную воду, физиологический забуференный фосфатом солевой раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хенкса. Кроме того, фармацевтическая композиция или готовая форма может также включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и т. п. Твердые формы композициий для перорального введения могут содержать подходящие носители или эксципиенты, такие как кукурузный крахмал, желатин, лактоза, аравийская камедь, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, каолин, маннит, дикальцийфосфат, карбонат кальция, хлорид натрия или альгиновая кислота. Дезинтеграторы, которые могут быть использованы, включают, без ограничения, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, гликолат натрийкрахмала и альгиновую кислоту. Связывающие вещества таблеток, которые могут быть использованы, включают аравийскую камедь, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон (Роу|бопе™), гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу, крахмал и этилцеллюлозу. Смазывающие вещества, которые могут быть использованы, включают стеараты магния, стеариновую кислоту, силиконовую жидкость, тальк, воски, масла и коллоидальный диоксид кремния. Дополнительные эксципиенты включают, например, красители, маскирующие вкус агенты, солюбилизаторы, суспендирующие агенты, облегчающие прессование агенты, энтеросолюбильные покрытия, приспособления для замедленного высвобождения, и т. п.

Антитела могут вводиться в форме инъекции веществ замедленного всасывания (депо) или препарата имплантата, которые могут быть приготовлены таким образом, что происходит поддерживаемое высвобождение активного ингредиента. Пример композиции содержит антитело или его фрагмент, при 5 мг/мл, приготовленные в водном буфере, состоящем из 50 мМ Ь-гистидина и 150 мМ №С1, доведенного до рН 6,0 с использованием НС1. Другой пример подходящего буфера для приготовления для моноклональных антител содержит 20 мМ цитрат натрия, рН 6,0, 10% сахарозу и 0,1% Твин 80.

В некоторых вариантах осуществления жидкие формы фармацевтической композиции для перорального введения, приготовленные в воде или других водных носителях, могут содержать различные суспендирующие агенты, такие как метилцеллюлоза, альгинаты, трагакант, пектин, келгин, каррагенан, аравийскую камедь, поливинилпирролидон и поливиниловый спирт. Жидкие формы фармацевтических композиций этого изобретения могут также содержать растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие вместе с активным соединением (активными соединениями) увлажняющие агенты, подслащивающие вещества и красители и ароматизирующие агенты. Различные жидкие и порошкообразные формы фармацевтических композиций могут быть приготовлены общепринятыми способами для ингаляции в легкие подлежащего лечению млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления жидкие формы фармацевтической композиции для инъекции могут содержать различные носители, такие как растительные масла, диметилацетамид, диметилфорамид, этиллактат, этилкарбонат, изопропилмиристат, этанол, полиолы, такие как, например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п. В некоторых вариантах осуществления эта композиция включает носитель цитрат/сахароза/Твин. Для внутривенных инъекций водорастворимые версии этой композиции могут вводиться капельным способом, посредством которого инфузируют фармацевтическую готовую форму, содержащую противогрибковое средство и физиологически приемлемый эксципиент. Физиологически приемлемые эксципиенты могут включать, например, 5% декстрозу, 0,9% солевой раствор, раствор Рингера или другие подходящие эксципиенты. Подходящая нерастворимая форма этой композиции может быть приготовлена и введена в виде суспензии в водной основе или в фармацев

- 33 014226 тически приемлемой масляной основе, такой как эфир жирной кислоты с длинной цепью, например этилолеат.

Этими композициями могут быть, например, инъекционные растворы, водные суспензии или растворы, неводные суспензии или растворы, твердые и жидкие пероральные готовые формы, мази, гели, притирания, внутридермальные пластыри, кремы, лосьоны, таблетки, капсулы, формы пролонгированного высвобождения и т.п. В некоторых вариантах осуществления для локальных применений фармацевтические композиции могут быть приготовлены в подходящей мази. В некоторых вариантах осуществления форма полутвердой мази для местного применения обычно содержит концентрацию активного ингредиента приблизительно 1-20% или 5-10% в носителе, таком как фармацевтическая основа в виде крема. Некоторые примеры готовых форм композиции для местного применения включают, но не ограничиваются ими, капли, настои, лосьоны, кремы, растворы и мази, содержащие активный ингредиент и различные основы и носители.

Обычно композиции готовят в виде инъекционных форм, либо в виде растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, подходящие для приготовления раствора или суспензии в жидких носителях перед инъекцией. Этот препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомах или микрочастицах, таких как полилактид, полигликолид или сополимер, для усиленного адъювантного эффекта (см. Ьапдег, 8аепсе, 1990, 249, 1527 и Напек, Абуапсеб Эгид ЭеЬуегу Веу1етек, 1997, 28, 97). Может быть также приготовлен стерильный инъекционный препарат, такой как, например, стерильная инъекционная водная или масляная суспензия. Эта суспензия может быть приготовлена в соответствии со способами, известными в данной области, с использованием подходящих диспергирующих, увлажняющих и суспендирующих агентов. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может доставляться в микроинкапсулирующем устройстве, чтобы уменьшать или предотвращать иммунную реакцию хозяина против этого белка.

Эффективные дозы композиций данного изобретения для лечения того или иного состояния варьируются в зависимости от многих различных факторов, в том числе способа введения, участка-мишени, физиологического состояния субъекта, от того, является ли этот субъект человеком или животным, других вводимых лекарственных средств, и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно этим субъектом является человек, но могут лечиться также млекопитающие, не являющиеся человеком, в том числе трансгенные млекопитающие.

Для пассивной иммунизации антителом используют диапазон доз приблизительно 0,0001-100 мг/кг, приблизительно 0,01-200 мг/кг или приблизительно 0,01-20 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела, или 10 мг/кг массы тела, или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг, или быть по меньшей мере 1 мг/кг. Такие дозы могут вводиться субъекту один раз в день, один раз в неделю или в соответствии с любой другой схемой введения, определенной при помощи эмпирического анализа.

Примерная схема лечения включает введение в виде множественных доз на протяжении продолжительного периода времени, например по меньшей мере шести месяцев. Дополнительные схемы лечения включают введение один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или каждые 3-6 месяцев. Примеры схем введения доз включают 1-10 мг/кг или 15 мг/кг в последовательные дни, 30 мг/кг каждый второй день или 60 мг/кг один раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления два или более антител или их фрагментов с различными специфичностями связывания вводят одновременно, и в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в указанных диапазонах.

Антитело обычно вводят в виде множественных введений. Интервалы между отдельными дозами могут быть один раз в неделю, один раз в месяц или один раз в год. В некоторых вариантах осуществления дозу приспосабливают для получения концентрации антитела в плазме 1-1000 мг/мл и в некоторых способах 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело может вводиться в виде формы пролонгированного высвобождения, и в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения варьируются в зависимости от полупериода существования антитела у субъекта. Обычно антитела человека обнаруживают наиболее длительный полупериод существования, после них следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела не человека в нисходящем порядке.

Доза и частота введения могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях композиции, содержащие эти антитела или их смесь, вводят субъекту, не находящемуся уже в состоянии заболевания для повышения сопротивляемости субъекта. Такое количество определяется как профилактическая эффективная доза. В этом применении точные количества опять зависят от состояния здоровья и общего иммунитета субъекта, но обычно находятся в диапазоне 0,1-25 мг на дозу, в частности 0,5-2,5 мг на дозу. Относительно низкую дозу вводят при относительно нечастых интервалах на протяжении длительного периода времени. Некоторые субъекты продолжают получать лечение в течение всей остальной жизни.

В терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая доза (например, 1-200 мг антитела на дозу, причем более часто используют дозы 5-25 мг) при относительно коротких интервалах, пока это заболевание не ослабляется или не терминируется, и, возможно, до тех пор, пока субъект не обнаружит частичное или полное уменьшение симптомов этого заболевания. После этого может продолжаться профилактическая схема введения.

- 34 014226

В некоторых вариантах осуществления эти антитела или их фрагмент, или содержащие их композиции могут вводиться субъекту инъекцией внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, интрамедуллярно, интравентрикулярно, интраэпидурально, интраартериально, интраваскулярно, интраартикулярно, интрасиновиально, внутригрудинно, внутриоболочечно, внутрипеченочно, интраспинально, внутрь опухоли, интракраниально, энтерально, внутрилегочно, трансмукозно, внутриматочно, подъязычно или местно в участках воспаления или роста опухоли с использованием стандартных способов. Альтернативно, эти антитела, или их фрагменты, или содержащие их композиции могут вводиться субъекту способами, включающими пероральный, назальный, глазной, ректальный или местный способы. Наиболее типичным способом введения белкового лекарственного средства является интраваскулярный, подкожный или внутримышечный способы, хотя и другие способы могут быть эффективными. В некоторых вариантах осуществления антитела вводят в виде композиции или устройства пролонгированного высвобождения, такого как устройство Меб1раб™. Белковое лекарственное средство может также вводиться через дыхательные пути, например, с использованием ингаляционного устройства для сухого порошка, распылителя или ингалятора с отмеренными дозами.

В некоторых вариантах осуществления эти антитела или их фрагменты могут вводиться субъекту введением с пролонгированным высвобождением, посредством таких способов, как инъекция веществ замедленного всасывания (депо) разрушаемых имплантатов, непосредственно применяемых во время хирургии, или имплантация инфузионного насоса или биосовместимого имплантата пролонгированного высвобождения в субъекта. Альтернативно, эти антитела и их фрагменты могут вводиться субъекту инъекционными способами введения веществ замедленного всасывания (депо), например, с использованием 1-, 3- или 6-месячного поддерживаемого депо инъекционных или биодеградируемых веществ и соответствующих способов или нанесением на кожу субъекта трансдермального пластыря в контакте с кожей субъекта обычно в течение 1-5 ч на один пластырь.

Эти композиции могут необязательно вводиться в комбинации с другими агентами, которые являются, по меньшей мере, частично эффективными в лечении иммунных нарушений. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммуносупрессивное или иммуномодулирующее соединение. Например, таким иммуносупрессивным или иммуномодулирующим соединением может быть один из следующих агентов: агент, который прерывает Т-клеточную костимулирующую передачу сигнала через СЭ28; агент, который прерывает передачу сигнала кальцинейрина, кортикостероид, антипролиферативный агент и антитело, которое специфически связывается с белком, экспрессируемым на поверхности иммунных клеток, в том числе, но не только, СЭ45, СЭ2, ГБ2В, СЭ4, ί.Ό8 и ВАЯК РсВ, В7, СТБА4, ТХР, ЬТЗ и УЪА-4. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивным или иммуномодулирующим соединением является такролимус, сиролимус, микофенолят-мофетил, мизорубин, дезоксиспергуалин, бреквинар-натрий, лефлуномид, рапамицин или азаспиран.

Данное изобретение относится также к наборам, содержащим любое из описанных здесь антител, или любой из их фрагментов. Этот набор может включать, например, контейнер, упаковку или дозатор вместе с ярлыками и инструкциями для введения или использования.

Данное изобретение относится также к способам лечения или предупреждения СО 154ассоциированного заболевания или нарушения человека. В некоторых вариантах осуществления этот способ предусматривает введение человеку терапевтически или профилактически эффективного количества любого из описанных здесь антител, или их фрагментов, или содержащей их композиции, так что СО154-связанное заболевание или нарушение человека уменьшается или предупреждается. Для целей данного изобретения введение обозначает любой из стандартных способов введения антитела, фрагмента антитела или композиции, известных специалистам с квалификацией в данной области, и не должно ограничиваться примерами, обеспеченными здесь.

В некоторых вариантах осуществления субъект, подвергаемый лечению, будет субъектом, которые ранее был диагностирован как имеющий заболевание или состояние, подходящее для описанных здесь способов лечения. Таким образом, такие субъекты будут субъектами, которые были диагностированы как нуждающиеся в лечении. Альтернативно, это лечение может быть предназначено для лечения конкретного заболевания или состояния, но одновременно быть лечением другого, недиагностированного состояния.

Лечение субъекта, страдающего от заболевания или нарушения, может быть подвергнуто мониторингу с использованием стандартных способов. Некоторые способы предусматривают определение величины фона, например уровня или профиля антитела у субъекта, перед введением дозы агента и сравнение этой величины с величиной профиля, или уровня после лечения. Значимое увеличение, такое как, например, увеличение, большее, чем обычный предел экспериментальной ошибки в повторных измерениях одной и той же пробы, выраженный в виде одного стандартного отклонения от средней величины таких измерений, в величине уровня или профиля свидетельствует о положительном результате лечения (т.е. введение этого агента давало желаемую реакцию). Если величина иммунной реакции не изменяется значимо или уменьшается, это свидетельствует об отрицательном результате лечения.

В других вариантах осуществления контрольную величину, например, в виде средней величины и

- 35 014226 стандартного отклонения, уровня или профиля определяют для контрольной популяции. Обычно индивидуумы в этой контрольной популяции не получали ничего перед лечением. Затем измеренные величины уровня или профиля у субъекта после введения терапевтического агента сравнивают с этой контрольной величиной. Значимое увеличение относительно этой контрольной величины, например, большее, чем одно стандартное отклонение от среднего, свидетельствует о положительном или достаточном результате лечения. Отсутствие значимого увеличения или уменьшение свидетельствует об отрицательном или недостаточном результате лечения. Введение терапевтического вещества обычно продолжают, пока этот уровень увеличивается относительно контрольной величины. Как и прежде, получение плато относительно контрольных величин является показателем того, что лечение может быть прекращено или уменьшено в дозе и/или частоте введения.

В других вариантах осуществления контрольную величину уровня или профиля, например в виде средней величины и стандартного отклонения, определяют из контрольной популяции индивидуумов, которые подвергались лечению терапевтическим агентом и уровни или профили которых вышли на плато в ответ на лечение. Измеренные величины уровней или профилей у субъекта сравнивают с этой контрольной величиной. Если измеренный уровень у субъекта не является значимо отличающимся, например, на более, чем одно стандартное отклонение, от этой контрольной величины, лечение может быть прекращено. Если этот уровень у субъекта находится значимо ниже контрольной величины, это дает основание для продолжения введения агента. Если этот уровень у субъекта продолжает оставаться ниже контрольной величины, то может быть показано изменение в лечении.

В других вариантах осуществления субъекта, который в настоящее время не получает лечения, но подвергался предыдущему курсу лечения, подвергают мониторингу на уровни или профили антитела для определения, требуется ли возобновление лечения. Измеренный уровень или профиль у субъекта может быть сравнен с величиной, достигнутой у этого субъекта ранее после предыдущего курса лечения. Значимое увеличение относительно предыдущего измерения, такое как увеличение, большее, чем обычный предел ошибки в повторных измерениях одной и той же пробы, является указанием на то, что лечение может быть возобновлено. Альтернативно, величину, измеренную у субъекта, можно сравнить с контрольной величиной (средняя величина плюс стандартное отклонение), определенной в популяции субъектов после прохождения курса лечения. Альтернативно, эту измеренную величину у субъекта можно сравнить с контрольной величиной в популяциях профилактически лечившихся субъектов, которые остаются свободными от симптомов заболевания, или в популяциях терапевтически лечившихся субъектов, которые обнаруживают уменьшение признаков заболевания. Во всех этих случаях, значимое уменьшение относительно контрольного уровня, такое как уменьшение, большее, чем стандартное отклонение, является показателем того, что это лечение должно быть возобновлено у субъекта.

Профиль антитела после введения обычно показывает немедленный пик в концентрации антитела с последующим экспоненциальным снижением. Без дополнительной дозы это снижение приближается к уровням перед лечением в пределах периода дней-месяцев в зависимости от полупериода существования в организме введенного антитела. Например, полупериод существования некоторых антител человека имеет порядок 20 дней.

В некоторых способах измерение фона антитела к конкретному антигену у субъекта выполняют перед введением, второе измерение выполняют вскоре после этого для определения максимального уровня (пика) антитела и одно или несколько дополнительных измерений выполняют с интервалами для мониторинга снижения уровней антитела. Когда уровень антитела снижается до фона или предварительно определенного процента пика (минус фон), такого как 50%, 25% или 10%, вводят дополнительную дозу антитела. В некоторых вариантах осуществления, пик или последующие измеренные уровни (за вычетом фона) сравнивают с определенными ранее ссылочными уровнями для создания выгодной схемы профилактического или терапевтического лечения у других субъектов. Если уровень измеренного антитела является значимо меньшим, чем ссылочный уровень, например меньшим, чем среднее минус одно стандартное отклонение ссылочной величины в популяции субъектов, получающих пользу от лечения, следует выполнять дополнительное введение антитела.

Дополнительные варианты осуществления включают мониторинг на протяжении хода лечения любого признанного в данной области физиологического симптома, такого как физический или психический симптом, рутинно используемый исследователями или врачами для диагностики или мониторинга нарушений.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела или их фрагменты или содержащая их фармацевтическая композиция способны ингибировать иммунную реакцию у субъекта. Антитело, производное антитела или фармацевтическую композицию вводят субъекту в эффективно ингибирующем количестве. Эффективно ингибирующим количеством антитела, производного антитела, такого как ί.Ό154-связывающий фрагмент, или фармацевтической композиции является любое количество, которое является эффективным для ингибирования взаимодействия ί.Ό154-ί.Ό40 у субъекта, которому его вводят. Способы определения ингибирующего количества хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области и зависят от факторов, включающих, но не ограничивающихся ими, тип субъекта, размер субъекта и конкретный доставляемый терапевтический агент.

- 36 014226

В конкретном варианте осуществления анти-СО154-антитело, производное антитела или содержащая это антитело или производное антитела фармацевтическая композиция способна связываться с молекулой СЭ154. В другом варианте осуществления анти-СП154-антитело, производное антитела или содержащая это антитело или производное антитела фармацевтическая композиция способна ингибировать иммунную реакцию ингибированием взаимодействия СЭ154-СЭ40.

В некоторых вариантах осуществления анти-СП154-антитело, производное антитела или содержащая это антитело или производное антитела фармацевтическая композиция способна ингибировать воспаление. Для целей этого изобретения воспалительные реакции характеризуются покраснением, опуханием, повышенной температурой и болью, как следствиями расширения капилляров с отеком и миграцией фагоцитарных лейкоцитов. Некоторые примеры воспалительных реакций включают, но не ограничиваются ими, артрит, контактный дерматит, гиперЧдЕ-синдром, воспалительное заболевание кишечника, аллергическую астму и идиопатическое воспалительное заболевание. Некоторые примеры артрита включают, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит, неревматоидный воспалительный артрит, артрит, ассоциированный с болезнью Лайма, и воспалительный остеоартрит. Некоторые примеры идиопатического воспалительного заболевания включают, но не ограничиваются ими, псориаз и системную красную волчанку. Дополнительные заболевания, нарушения и состояния, которые могут лечиться с использованием описанных здесь соединений и/или композиций, включают, но не ограничиваются ими, атеросклероз, тяжелую псевдопаралитическую миастению, болезнь Грейвса, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, гемолитическую анемию, сахарный диабет, болезнь Крона, рассеянный склероз и индуцированные лекарственными средствами аутоиммунные заболевания, такие как индуцированная лекарственными средствами волчанка.

В некоторых вариантах осуществления эти соединения и композиции могут быть использованы для ингибирования отторжения субъектом трансплантированного органа, такого как, например, трансплантированные сердце, почка, печень, кожа, панкреатические островковые клетки и костный мозг. В других вариантах осуществления эти соединения и композиции могут быть использованы для ингибирования реакции трансплантат против хозяина, аллергических реакций, таких как сенная лихорадка (поллиноз) или аллергия на пенициллин или другие лекарственные средства, аутоиммунная реакция у субъекта, страдающего от аутоиммунной реакции, которая происходит из инфекционного заболевания, или ингибирования фиброза у субъекта. Примеры фиброза включают, но не ограничиваются ими, фиброз легких или фибротическое заболевание. Примеры фиброза легких включают, но не ограничиваются ими, фиброз легких (пневмофиброз), вторичный относительно респираторного дистресс-синдрома, индуцированный лекарственным средством фиброз легких, идиопатический фиброз легких и гиперчувствительный пневмонит. Примеры фибротических заболеваний включают, но не ограничиваются ими, гепатит С, гепатит В, цирроз, цирроз печени, вторичный относительно токсического повреждения, цирроз печени, вторичный относительно индуцированного лекарственными средствами заболевания, цирроз печени, вторичный относительно вирусной инфекции, и цирроз печени, вторичный относительно аутоиммунного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления эти соединения и композиции могут ингибировать аутоиммунную реакцию у субъекта, страдающего от аутоиммунной реакции, которая происходит, например, из синдрома Рейтера, спондилоартрита, болезни Лайма, ВИЧ-инфекции, сифилиса и туберкулеза.

В некоторых вариантах осуществления эти соединения и композиции могут ингибировать желудочно-кишечное заболевание, такое как, например, нарушение моторики пищевода, воспалительное заболевание кишечника и склеродермия. Альтернативно, эти соединения и композиции могут ингибировать сосудистое заболевание, такое как, например, атеросклероз и реперфузионное повреждение.

В некоторых вариантах осуществления эти соединения и композиции могут ингибировать пролиферацию Т-клеточных опухолевых клеток у субъекта, страдающего от Т-клеточного рака, такого как, например, Т-клеточный лейкоз или Т-клеточная лимфома. Альтернативно, эти соединения и композиции могут ингибировать вирусное инфицирование Т-клеток субъекта вирусом НТЬУ Ι.

В некоторых вариантах осуществления эти соединения и композиции могут быть использованы для визуализации (томографии) опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта, которые экспрессируют белок, специфически узнаваемый 1ш5е8. Один способ визуализации опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта предусматривает введение субъекту эффективного количества рассматриваемого антитела или его фрагмента или содержащей их композиции в условиях, делающих возможным образование комплекса между этим антителом или фрагментом антитела и белком на поверхности опухолевых клеток или неопластических клеток, и визуализацию любого образованного комплекса антитело/белок или комплекса фрагмент антитела/белок, с визуализацией посредством этого любых опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления эти соединения и композиции могут быть использованы для детектирования присутствия опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта, которые экспрессируют белок, специфически узнаваемый Ьи5с8. Один способ для детектирования присутствия опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта предусматривает введение субъекту эффективного количества этого антитела или его фрагмента или содержащей их композиции в условиях, делаю

- 37 014226 щих возможным образование комплекса между этим антителом или фрагментом антитела и белком, выведение любого несвязанного агента визуализации из субъекта и детектирование присутствия любого образованного комплекса антитело/белок или комплекса фрагмент антитела/белок, причем присутствие такого комплекса указывает на присутствие опухолевых клеток или неопластических клеток у субъекта.

Эти антитела или их фрагменты и содержащие их композиции могут вводиться в виде единственной дозы для некоторых показаний, таких как предупреждение иммунной реакции на антиген, действию которого субъект подвергается в течение короткого времени, например, такой как экзогенный антиген, вводимый в единственный день лечения. Примеры такой терапии могут включать совместное введение антитела или производного антитела данного изобретения вместе с терапевтическим агентом, например антигенным фармацевтическим агентом, аллергеном или продуктом крови или вектором генотерапии. В показаниях, в которых антиген присутствует продолжительно, таких как контролирование иммунной реакции на трансплантированную ткань или на продолжительно вводимые антигенные фармацевтические вещества, антитела, производные антител или фармацевтические композиции данного изобретения вводят с интервалами такой длины, которая показана с точки зрения медицины, в диапазоне от дней до недель относительно жизни этого субъекта.

В некоторых вариантах осуществления субъектом (субъектами), который может лечиться вышеописанными способами, является животное, такое как млекопитающее, в том числе, но не только, люди, приматы (не являющиеся человеком), грызуны (в том числе крысы, мыши, хомячки и морские свинки), корова, лошадь, овца, коза, свинья, собака и кошка. В большинстве случаев этим млекопитающим является человек.

Данное изобретение относится также к применению любого из этих пептидов или их фрагментов или антител или их фрагментов, описанных здесь, для лечения заболевания или нарушения человека, ассоциированного с СЭ154.

Данное изобретение относится также к применению любого из этих пептидов или их фрагментов или антител или их фрагментов, описанных здесь, для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения человека, ассоциированного с СЭ154.

Описанные здесь варианты осуществления могут быть лучше понятыми на основе нижеследующих примеров. Однако специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что обсуждаемые конкретные способы и результаты являются только иллюстрациями данного изобретения, описанными более полно в вариантах осуществления, следующих далее.

Во всей этой заявке в скобках приводятся различные публикации и ссылки. Описания этих публикаций и ссылок, в их полном объеме, включены тем самым в качестве ссылки в эту заявку для более полного описания состояния области, к которой относится это изобретение. Эти материалы, способы и примеры являются только иллюстрацией и не предназначены для ограничения.

Стандартные справочники, описывающие общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, известные специалистам с квалификацией в данной области, включают АикиЬе1 е! а1., Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оНт АПеу апб 8опк, Уогк (1998 и 8ирр1етеп!к до 2001 г.); 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Еббюп, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Уогк (1989); КаиГтап е! а1., Ебк., НапбЬоок 0Г Мо1еси1аг Апб Се11и1аг Ме!Нобк 1п Вю1оду Апб Мебкте, СКС Ргекк, Воса Ка1оп (1995); МсРЬегкоп, Еб., Э|гес1еб Ми1адепек1к: А Ргасбса1 АрргоасЬ, ЖЬ Ргекк, 0хГогб (1991).

Стандартные справочники, описывающие общие принципы иммунологии, известные специалистам с квалификацией в данной области, включают Наг1от апб Ьапе, АпбЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2б Еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, КУ. (1999); и Коб! е! а1., 1ттипо1оду, 3б Еб., МокЬу-Уеаг Воок Еигоре Ытбеб, Ьопбоп (1993). Стандартные справочники, описывающие общие принципы медицинской физиологии и фармакологии, известные специалистам с квалификацией в данной области, включают Раис1 е! а1., Ебк., Наткоп'к Рппс1р1ек 0Г 1п!ета1 Мебюше, 14'^Н Еб., МсОгат-НШ Сотрашек, 1пс. (1998).

Примеры

Во всех этих примерах использовали следующие материалы и способы, если нет других указаний. Следующие примеры иллюстрируют способы и продукты данного изобретения. Подходящие модификации и адаптации описанных условий и параметров, обычно встречающиеся в области молекулярной биологии, которые являются очевидными специалистам с квалификацией в данной области, находятся в пределах сущности и объема данного изобретения.

Обычно практика данного изобретения использует, если нет других указаний, общепринятые способы химии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (особенно, например, технологии антител) и стандартные способы в электрофорезе. См., например, 8атЬгоок, Ргбксй апб Машабк, Мо1еси1аг С1ошпд: Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог (1989); АпбЬобу Епдшеегшд Рго!осо1к (Мебюбк т Мо1еси1аг Вю1оду), 510, Раи1, 8., Нитапа Рг (1996); АпбЬобу Епдтеегшд: А Ргасбса1 АрргоасЬ (Ргасбса1 АрргоасЬ 8епек, 169), МсСаГГейу, Еб., 1г1 Рг (1996); Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1от е! а1., С.8.Н.Ь. Ргекк, РиЬ. (1999); и Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, ебк. АикиЬе1 е! а1., 1о1ш Абеу & 8опк (1992).

- 38 014226

Пример 1. Конструирование антител.

Описанные здесь способы использовали для получения оптимизированного антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), хотя могут быть также использованы, без ограничения, и другие способы, известные специалистам с квалификацией в данной области. На основе вычислительного анализа могут быть идентифицированы положения в любом конкретном антителе, где имеется различие (чем больше это различие, тем более значимым оно может быть) между распределением зарядов в оптимизированном комплексе антитело-антиген и распределением зарядов в исходном комплексе антитело-антиген. Такие различия в распределении зарядов связаны также с изменениями в свободной энергии связывания антитела при связывании с антигеном в растворителе. Затем аминокислотный остаток в таком положении может быть изменен таким образом, что электростатические силы в исходном антителе более близко приближены (или в альтернативных вариантах осуществления, являются более отклоняющимися от них) к электростатическим силам в оптимизированном антителе, посредством чего они модулируют свободную энергию связывания этого антитела при связывании с антигеном в растворителе. Изменения в отношении этого антитела вводят в соответствии с рядом дискретных критериев и правил, как описано здесь и как описано в международной публикации с регистрационным номером РСТ/И8 04/24200, которая включена здесь в качестве ссылки в ее полном объеме.

1. Правила для модификации антител для улучшенной функции.

Правила для модификации антител использовали следующим образом. Для модуляции антигенсвязывающей аффинности антитела, например для улучшения или восстановления такого связывания, сначала получают базовую последовательность и/или структурные данные. Затем используют способы оптимизации электростатических зарядов для предложения мутантов с улучшенной аффинностью.

Обычно оптимизацию электростатических зарядов сначала используют для определения положения (положений) остатка (остатков) СИЯ, которые являются субоптимальными в отношении связывания (Ьее е! а1., Σ. СНет. РНук., 1997, 106, 8681-8690; Капдак е! а1., Σ. СНет. РНук., 1998, 109, 7522-7545). Затем одну или несколько СИЯ-мутаций (т.е. модификаций) подвергают дополнительному вычислительному анализу. Затем на основе этих расчетов определяют аффинность связывания для субпопуляции модифицированных антител, имеющих одну или несколько модификаций, в соответствии с правилами этого изобретения.

С использованием модели СопЦтшт е1ес!гок!аНск (способа для моделирования электростатических взаимодействий в водном растворе и других средах без точного моделирования молекул растворителя) оптимизацию электростатических зарядов выполняли на каждой боковой цепи аминокислот в СИЯ этого антитела. Оптимизация зарядов дает заряды в центрах атомов, но не всегда дает фактическую мутацию (фактические мутации). Таким образом, выполняли раунд оптимизации зарядов с различными налагаемыми ограничениями степеней свободы для представления свойств природной боковой цепи в представляющих интерес положениях. Например, оптимизацию выполняли для общего заряда боковой цепи -1, 0 и +1 с дополнительным ограничением, заключающимся в том, что ни один заряд атома не превышал конкретной величины, например 0,85 единиц заряда электрона. Затем кандидатные положения боковой цепи аминокислоты и модификации остатков в этих положениях определяли на основе потенциального увеличения электростатической свободной энергии связывания, наблюдаемой в этих оптимизациях.

Рассчитывали приращение свободной энергии связывания (в ккал/моль) при переходе от нативного остатка к полностью незаряженному изостеру боковой цепи, такому как остаток той же самой формы, но без зарядов или с частичными зарядами на этих атомах. Отрицательные числа указывают предсказанное увеличение аффинности связывания. Оптимальное распределение зарядов, при котором общий заряд боковой цепи равен +1, 0 или -1, использовали для расчета приращения свободной энергии связывания.

В тех случаях, в которых приращение свободной энергии связывания является предпочтительным (АО < -0,25 ккал/моль) и ассоциировано с переходом от нативного остатка к изостеру с полностью незаряженной боковой цепью, такому как остаток с той же самой формой, но без зарядов или с частичными зарядами на этих атомах, выбирали модификации из популяции аминокислот с неполярными боковыми цепями, например А1а, Сук, Не, Ьеи, Ме!, РНе, Рго, Уа1.

Когда предпочтительным является приращение свободной энергии связывания, которое может быть получено с оптимальным распределением зарядов в боковой цепи и общим зарядом боковой цепи -1 (АО < -0,25 ккал/моль), выбирали модификации из популяции аминокислот с отрицательно заряженными боковыми цепями, например Акр, О1и.

Подобным образом, когда предпочтительным является приращение свободной энергии связывания, которое может быть получено с оптимальным распределением зарядов в боковой цепи и общим зарядом боковой цепи +1 (АО < -0,25 ккал/моль), выбирали модификации из популяции аминокислот с положительно заряженными боковыми цепями, например Агд, Шк, Ьук.

Наконец, в случаях, в которых предпочтительным является различие свободной энергии связывания, которое может быть получено с оптимальным распределением зарядов в боковой цепи и общим зарядом боковой цепи 0 (АО < -0,25 ккал/моль), выбирали модификации из популяции аминокислот с незаряженными полярными боковыми цепями, например Акп, Сук, О1п, О1у, Шк, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, к

- 39 014226 которым добавляют Сук. 01у. Ме! и РЬе.

Как описано здесь. сконструированные модифицированные антитела строили 1п кШсо и повторно рассчитывали энергию связывания. Модифицированные боковые цепи строили выполнением двугранного сканирования ротамера в известной программе СНАВММ с использованием приращений двугранного угла 60° для определения наиболее желаемого положения для каждой боковой цепи. Затем рассчитывали энергии связывания для комплексов дикого типа (исходного) и мутантных (модифицированных) комплексов с использованием электростатической энергии Пуассона-Больцманна и дополнительных компонентов для вандерваальсовой энергии и скрытой площади поверхности.

Затем результаты из расчетов этих вычислительных модификаций повторно оценивали по мере необходимости. например. после последовательных повторений способа либо ш кШсо. либо посредством получения информации в виде дополнительных экспериментальных структурных/функциональных данных.

Правила. позволяющие сделать несколько предсказаний. которые могут быть представлены в виде следующих категорий:

1) модификации на границе взаимодействия. включающие остатки на антителе. которые становятся частично скрытыми после связывания (ваимодействия улучшаются образованием водородных связей с антигеном);

2) модификации полярных остатков на антителе. которые становятся скрытыми после связывания и. следовательно. платят штраф десольватации. но не образуют никаких электростатических взаимодействий с антигеном (улучшения обычно получают модификацией гидрофобного остатка сходной формы на остаток дикого типа или добавлением остатка. который может создать предпочтительные электростатические взаимодействия); и

3) модификации поверхностных остатков на антителе. которые находятся в районах некомплементарных потенциалов. Считается. что эти модификации улучшают электростатические взаимодействия длительного действия между антителом и антигеном без нарушения пакующих взаимодействий на границе связывания.

Первый тип модификации определяется рассмотрением основных физических/химических аргументов. так как эти остатки. по существу. образуют водородные связи с ненасыщенными водородными партнерами антигена. В отличие от других способов. правила данного изобретения делают возможными удивительные модификации остатков. в которых за счет десольватации создается возможность перевешивания энергии полезного взаимодействия.

Второй тип модификации представляет все еще другой набор модификаций. так как приобретенная энергия является прежде всего результатом элиминации невыгодной десольватации при поддержании неполярных взаимодействий.

Третий тип модификации относится к взаимодействиям длительного действия. которые обнаруживают потенциал в отношении значительного увеличения аффинности. Эти типы модификаций представляют особый интерес. так как они не создают прямых контактов с антигеном и. следовательно. создают меньшее нарушение в деликатных взаимодействиях на границе взаимодействия антитело-антиген.

Таким образом. после того как желательная химия боковых цепей была определена для кандидатного положения (кандидатных положений) аминокислот в соответствии с этими правилами. положение остатка (положения остатков) модифицируют или изменяют. например. заменой. инсерцией или делецией. как описано здесь далее.

Кроме вышеописанных правил для модификации антител. отмечается. что некоторые определения. например эффекты растворителя. могут быть факторизованы в начальные (и последующие) расчеты оптимальных распределений зарядов.

2. Получение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Способы данного изобретения. которые нацелены на генерирование не встречающегося в природе антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента). могут начинаться (но не обязательно) с получения антитела. Это антитело может называться в данном контексте исходным антителом или иногда «первым» антителом. и оно может быть использовано для получения информации. которая позволит модифицировать или изменять один или несколько аминокислотных остатков либо в этом антителе (например. в исходном антителе). либо в модифицированном или измененном антителе. имеющем последовательность. которая является сходной с последовательностью исходного антитела или которая содержит части последовательности исходного антитела. Например. как описано здесь. один или несколько из СЭВ (или их частей) исходного антитела заменяли соответствующим СОВ (соответствующими СОВ) модифицированного антитела с использованием стандартных способов генной инженерии для получения так называемого СЭВ-привитого фрагмента или СОВ-трансплантата. Таким образом. этот способ начинается с моноклонального или поликлонального антитела млекопитающего (например. мышиного антитела или антитела примата). химерного. СОВ-трансплантированного. гуманизированного антитела или антитела человека.

Исходные антитела получали из признанных в данной области источников или получали в соответ

- 40 014226 ствии с признанными в данной области способами. Например, исходное антитело было СЭЙ-привитым или гуманизированным антителом, имеющим СЭЯ-районы, происходящие из другого источника или вида, например мышиные.

Исходное антитело или любые модифицированные антитела данного изобретения могут находиться также в формате моноклонального антитела. Способы получения моноклональных антител известны в данной области (см., например, КоЬ1ег аиб Мйк1еш, На1иге, 1975, 256, 495-497), так же как и способы стабильного введения иммуноглобулинкодирующей ДНК в миеломные клетки (см., например, 01 е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А, 1983, 80, 825-829; №иЬегдег, ЕМВ0 1., 1983, 2, 1373-1378; и 0сЫ е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А, 1983, 80, 6351-6355). Эти способы, которые включают мутагенез 1и уйго и трансфекцию ДНК, делают возможным конструирование рекомбинантных иммуноглобулинов; эти способы могут быть использованы для получения исходных и модифицированных антител, используемых в способах этого изобретения, или для получения модифицированных антител, которые происходят из этих способов. Альтернативно, исходные антитела могут быть получены от коммерческого поставщика. Фрагменты антител (ксЕу и ЕаЬ) могут быть также получены в Е. сой (способы получения и клетки-хозяева описаны дополнительно ниже).

Исходное антитело или любое из модифицированных антител этого изобретения может быть антителом класса ΙβΛ, [дЭ, ЦЕ, ΙβΟ или ЦМ.

Как отмечалось выше, способы этого изобретения могут быть применимы к более чем только тетрамерным антителам (например, антителам, имеющим структуру иммуноглобулина класса С (ΙβΟ)). Например, способы модификации антитела могут проводиться также с антигенсвязывающими фрагментами любого антитела. Эти фрагменты могут быть получены рекомбинантно и сконструированы, синтезированы или получены расщеплением антитела протеолитическим ферментом. Например, этот фрагмент может быть ЕаЬ-фрагментом; расщепление папаином разрывает это антитело в районе, находящемся перед межцепочечной (например, УН-УН) дисульфидной связью, которая соединяет эти две тяжелые цепи. Это приводит к образованию двух идентичных фрагментов, которые содержат легкую цепь и У_Н- и С_Н1домены тяжелой цепи. Альтернативно, этот фрагмент может быть Е(аЬ')₂-фрагментом. Эти фрагменты могут быть созданы расщеплением антитела пепсином, который расщепляет тяжелую цепь после межцепочечной дисульфидной связи и приводит к фрагменту, который содержит оба антигенсвязывающих сайта. Еще одной альтернативой является использование одноцепочечного антитела. Одноцепочечные Εν-фрагменты (ксЕу) могут быть сконструированы различными способами. Например, С-конец У_Н может быть связан с ^концом У_ь. Обычно, между У_Н и У_ъ помещен линкер (например, (СССС8)₄). Однако порядок, в котором эти цепи могут быть связаны, может быть обращен, и могут быть включены метки для облегчения детектирования или очистки (например, Мус-, Н1к- или Е1ад-метки) (такие метки, которые могут быть присоединены к любому антителу или фрагменту антитела этого изобретения; их применение не ограничивается ксЕу). Таким образом, как отмечается ниже, меченые антитела находятся в объеме данного изобретения. В альтернативных вариантах осуществления антитела, используемые в описанных здесь способах или генерируемые этими способами, могут быть димерами тяжелой цепи или димерами легкой цепи. Кроме того, могут быть использованы легкая или тяжелая цепь или их части, например антитело из единственного домена (ЭЛЬ).

Поскольку способы этого изобретения могут быть итеративными (циклическими), исходное антитело может быть не встречающимся в природе антителом. Поскольку способ модификации антитела может повторяться столько раз, сколько это необходимо, исходное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) может быть полностью нечеловеческим антителом или антителом, содержащим ЕЯ человека и СЭЯ не человека (например, мыши). То есть исходное антитело может быть СЭЯтрансплантированным антителом, которое подвергают способам этого изобретения для улучшения аффинности этого антитела, например созревания аффинности этого антитела. Как отмечалось выше, аффинность может быть улучшена только до такой степени, когда она является приблизительно такой же, что и аффинность встречающегося в природе антитела человека (ЕЯ-донора) в отношении его антигена (или незначимо худшей, чем эта аффинность). Таким образом, исходное антитело может быть, вместо этого, антителом, созданным одним или несколькими более ранними раундами модификации, в том числе антителом, которое содержит последовательности более чем одного вида (например, ЕЯ человека и СЭЯ не из человека). Способы данного изобретения предусматривают применение исходного антитела, которое включает один или несколько СЭЯ не из антитела человека (например, СЭЯ антитела мыши) и ЕЯ антитела человека. Альтернативно, исходное антитело может быть полностью человеческим.

Конечно, когда доступна структура, можно начинать вычислительный анализ этой структуры (а не с создания опять этой структуры).

3. Способ данного изобретения, использующий информацию о структурных данных комплекса антитело-антиген.

Известно, что белки укладываются в трехмерные структуры, которые диктуются последовательностями их аминокислот и растворителем, в котором обеспечен конкретный белок (или белоксодержащий комплекс). Трехмерная структура белка влияет на его биологическую активность и стабильность, и эта

- 41 014226 структура может быть определена или предсказана рядом способов. Обычно эмпирические способы используют физико-биохимический анализ. Альтернативно, третичная структура может быть предсказана с использованием построения модели трехмерных структур одного или нескольких гомологичных белков (или белковых комплексов), которые имеют известную трехмерную структуру. Рентгенография является, возможно, наиболее известным способом определения структуры белков (таким образом, термин кристаллическая структура может быть использован вместо термина структура), но приближенные оценки могут быть также сделаны с использованием кругового дихроизма, рассеяния света или измерения поглощения и испускания лучистой энергии. Другие применимые способы включают диффракцию нейтронов и ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Все эти способы известны специалистам с обычной квалификацией в данной области, и они были хорошо описаны в стандартных руководствах (см., например, РНук1са1 СНеш1к1гу, 4'¹' Еб., №.1. Мооге, Ргеп!1кк-На11, N.1., 1972 или РНук1са1 ВюсйеткРу, К.Е. Уап Но1бе, Ргеп!1кк-На11, N.1., 1971)) и многочисленных публикациях. Любые из этих способов могут проводиться для определения структуры антитела или антитело-антигенсодержащего комплекса, которая может быть затем анализирована в соответствии со способами данного изобретения и, например, быть использована для информации для одной или нескольких стадий способа данного изобретения.

Подобным образом, эти и подобные способы могут быть использованы для получения структуры антигена, связанного с фрагментом антитела, в том числе фрагментом, состоящим, например, из одноцепочечного антитела, ЕаЬ-фрагмента и т.п. Способы образования кристаллов антитела, фрагмента антитела или ксЕу-антиген-комплекса сообщались, например, в работе уап Эеп Е1кеп е! а1. (Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 1999, 96, 13679-13684, которая специально включена здесь в качестве ссылки).

4. Вычислительный анализ.

Основная вычислительная формула, используемая в проведении способов этого изобретения, обеспечена, например, в патенте США № 6230102, содержание которого включено тем самым в качестве ссылки в данной заявке в его полном объеме.

Как отмечалось выше, антитела изменяют (или модифицируют) в соответствии с результатами вычислительного анализа электростатических сил между антителом и антигеном, с которым оно связывается, предпочтительно в соответствии с описанными здесь дискретными критериями или правилами данного изобретения. Вычислительный анализ позволяет предсказывать (прогнозировать) оптимальное распределение зарядов в антителе, и одним путем для представления распределения зарядов в компьютерной системе является множество мультиполюсов. Альтернативно, распределение зарядов может быть представлено множеством точечных зарядов, локализованных в положениях атомов антитела. После определения распределения зарядов (предпочтительно оптимального распределения зарядов) можно модифицировать это антитело для соответствия или для лучшего соответствия этого распределения зарядов.

Вычислительный анализ может быть опосредован осуществляемым компьютером способом, который проводит вычисления, описанным в патенте США № 6230102. Эта компьютерная программа адаптирована здесь для рассмотрения контекста связывания антиген-антитело реального мира (и в отличие от других способов, этот способ данного изобретения учитывает, например, растворитель, электростатику длительного действия и диэлектрические эффекты в связывании между антителом и его антигеном в растворителе). Этот способ используют для идентификации модификаций в отношении структуры антитела, которые будут достигать распределения зарядов на зрелом антителе, которое минимизирует электростатический вклад в свободную энергию связывания между зрелым антителом и его антигеном (в сравнении с этим вкладом немодифицированного (исходного или родительского) антитела). Обычно компьютерная система (или устройство (устройства)), которая выполняет описанные здесь (и более подробно в патенте США № 6230102) операции, будет включать устройство вывода (выходное устройство), которое изображает информацию пользователю (например, электронно-лучевую трубку (ЭЛТ), жидкокристаллический дисплей (ЖКД), принтер, устройство связи, например модем, аудиовывод (выходной звуковой сигнал) и т.п.). Кроме того, инструкции для проведения этого способа, частично или в целом, могут быть приданы среде, подходящей для применения в электронном устройстве, для выполнения этих инструкций. Таким образом, способы данного изобретения пригодны для высокопроизводительного подхода, включающего программное обеспечение (например, считываемые при помощи компьютера инструкции) и аппаратное оборудование (например, компьютеры, робототехнику и микросхемы). Этот осуществляемый компьютером способ не ограничивается конкретной компьютерной платформой, конкретным процессором или конкретным высокоорганизованным алгоритмическим языком.

Применимый способ представлен, например, в патенте США № 6230102, а более подробное представление обеспечено, например, в Ьее апб Т1бог (1. СНет. РНук., 1997, 106, 8781-8690), которые специально включены здесь в качестве ссылки.

5. Вычислительные способы конструирования на основе структуры.

Примером подхода к улучшению аффинности антитела в отношении его антигена является использование вычислительных способов конструирования на основе структуры. Один подобный способ известен как рефолдинг боковой цепи с использованием алгоритма элиминации тупиков (см., например, Ьак!егк е! а1., Рго!ет Епд., 8, 815-22; Ьоодег е! а1., 1. Мо1. Вю1., 307, 409-45; ОаНгуа! е! а1., Рго!ет 8сЬ., 5, 895

- 42 014226

903). В таком вычислении остатки антител одновременно мутируют на основе вычисления в любую из 20 встречающихся в природе аминокислот, и полученные мутанты оценивают на аффинность вычислительным способом. Перечень генерированных вычислительным способом мутантов может быть подвергнут сортингу посредством рассчитанной стабильности мутанта для получения списка вариантов, которые будут экспрессироваться экспериментально. В этих расчетах допускается очень малая гибкость скелета молекулы белка или вообще не допускается гибкость этого скелета, что гарантирует то, что спроектированные мутанты, как предсказывается, являются стабильными с конкретными конформациями СИЕ. Таким образом, этот вычислительный анализ позволяет предсказывать мутации антитела, которые будут усиливать аффинность в отношении его антигена.

6. Генерирование антител и их антигенсвязывающих фрагментов.

Отбор, клонирование и получение антител, например химерных, гуманизированных, моноклональных и одноцепочечных антител, хорошо описаны в данной области. Кроме того, гуманизация тАЬ 1ш5с8 была описана ранее (см. Ьебегтап 8. е! а1., 1 Ехр Меб. 1992 Арг 1; 175 (4): 1091-101 и Кагрикак М. е! а1., 81гис1иге (СатЬ). 2001 Арг 4; 9(4):321-9 соответственно. Это антитело доступно из АТСС (РТА-4931). Антитело 5с8 стабильно экспрессировали в миеломных клетках N80 и очищали протеин Ахроматографией и гель-фильтрационной хроматографией. Электрофорез в ДСН-ПААГ и аналитическая гель-фильтрационная хроматография показали, что этот белок образовывал ожидаемый связанный дисульфидными связями тетрамер. Одноцепочечные антитела данного изобретения обычно экспрессировали в Е. сой и иммуноочищали с использованием стандартных способов.

7. Получение ЕаЬ 5с8.

ЕаЬ 5с8 экспрессировали с использованием бицистронной плазмиды рВЕЕ064. Первый цистрон содержит 354 нуклеотида тяжелой цепи 5с8, кодирующих содержащую 118 аминокислот вариабельную область тяжелой цепи, за которыми следуют в рамке считывания 306 нуклеотидов, кодирующих первые 102 аминокислоты константной области 1дС1 человека, и 18 нуклеотидов, кодирующих метку из 6 гистидинов. Второй сайт вхождения рибосом локализован на расстоянии 7 нуклеотидов после конца цистрона тяжелой области. Этот второй цистрон содержит 333 нуклеотида, кодирующих 111 аминокислот вариабельной области легкой цепи 5с8, за которыми следуют в рамке считывания 321 нуклеотид, кодирующие содержащий 107 аминокислот константный домен легкой цепи. Экспрессию проводили в Е. сой, и она запускалась промотором ата-ВАИ, и тяжелая и легкая цепи направлялись в периплазматическое пространство сигналами периплазматической локализации ОтрА (тяжелая цепь) и Р1юЛ (легкая цепь). Сигналы периплазматической локализации отщеплялись от этого белка во время периплазматического экспорта.

8. Анализы связывания.

Анализы связывания обычно выполняли с использованием набора К1ЕхА™. Этот анализ проводили пропусканием разбавленного раствора этого антитела (или антигенсвязывающего фрагмента) через колонку, обеспеченную в наборе, и некоторая часть этого антитела (или антигенсвязывающего фрагмента) взаимодействует с антигеном на гранулах. Затем это антитело (или фрагмент) детектировали вторичным антителом против тяжелой и легкой цепей 1§С человека, конъюгированным с флуоресцентным красителем Су5 (басккоп 1ттипоВекеагск ЬаЬогаЮпек, 1пс., \Уек1 Сгсл'е. РА). Концентрацию этого антитела (или фрагмента) устанавливали таким образом, чтобы сигнал от флуоресцентного красителя был пропорционален концентрации белка. Для получения аффинности взаимодействия в фазе раствора это антитело (или этот фрагмент) смешивали с серией разведений растворимого антигена. Этим белкам (антителу и антигену) давали достичь равновесия во время трехчасовой инкубации при комнатной температуре или инкубации в течение ночи при 4°С. Эту смесь пропускали через антигенсодержащую колонку, и сигнал был пропорционален количеству несвязанного антитела (или фрагмента антитела), которое остается в растворе. Полученные данные строили в виде графика в линейно-логарифмическом масштабе и подгоняли к квадратичной кривой с использованием нелинейной регрессии, которая дает величину для К_с.

9. Анализ связывания 5с8-С’Э154.

Проводили конкурентный анализ связывания на основе ЕЫ8А. Анти-с-тус-тАЬ наносили в виде покрытия на планшеты Мах1когЬ ΝϋΝΕ при 10 мкг/мл в РВ8 в течение 2 ч при комнатной температуре. Готовили серийные разведения немеченого ЕаЬ 5с8 (мутантов или дикого типа) и смешивали с равными объемами фиксированной концентрации (30 нг/мл) меченого биотином ЕаЬ 5с8-конкурента и добавляли в планшет. После 2 ч инкубирования при комнатной температуре этот планшет промывали, и связанный меченый биотином ЕаЬ 5с8-конкурент детектировали с использованием комплекса стрептавидин-НЕР. Аффинности связывания получали из четырехпараметрических подгонок кривых.

Пример 2. Антитела.

1. Генерирование антител.

Отбор, клонирование и гуманизация тАЬ 1и.15с8 были описаны ранее (см. Ьебеттап 8. е! а1., 1 Ехр Меб. 1992 Арг 1; 175(4):1091-101 и Кагрикак М. е! а1., 8!гис!иге (СатЬ). 2001 Арг 4; 9(4):321-9 соответственно. Гибридома тАЬ 1и.15с8 доступна из АТСС (НВ 10916).

2. Анализ связывания СЭ154.

Конкурентный анализ связывания на основе ЕАС8 проводили на клетках 1шСЭ154+ Ό1.1, доступ

- 43 014226 ных из АТСС (СКЬ-10915). Связывание 0,1 мг/мл биотинилированного тАЬ Ьи5с8 подвергали конкуренции с титрованиями тАЬ Ьи5с8 или другого антитела. Клеточно-связанное биотинилированное тАЬ Ьи5с8 детектировали при помощи комплекса стрептавидин-фикоэритрин (РЕ) (ΒΌ-РЬагМтдеи 8аи ^^едо, СА, И8А). Относительные аффинности связывания получали из величин Ιί’₅₀ четырехпараметрических подгонок кривых.

3. Анализ образования мостиковой связи СЬ154-ЕсуК.

Аффинности связывания ЕсуК. измеряли с использованием анализов, основанных на аффинности этого антитела в отношении образования мостиковой связи между антигеном и ЕсуК-несущей клеткой (см. ниже). Анализ образования мостиковой связи ЕсуК! (СЭ64) выполняли покрытием 96-луночных планшетов ЕЫ8А Мах1когЬ (Nа1де-Nиис КосЬек!ег, НУ, И8А) в течение ночи при 4°С 1 мг/мл рекомбинантного растворимого СЬ154 человека (Вюдеи, Кагрикак М. е! а1., 81гис1иге. 1995 Ьес 15; 3(12): 1426) в РВ8 и затем блокированием 1% В8А в РВ8. Затем титрования антитела связывали с СЭ154 в течение 30 мин при 37°С, планшеты промывали и измеряли связывание флуоресцентно меченых клеток И937 (ί.Ό64+). Клетки И937 выращивали в среде КРМI с 10% ЕВ8, 10 мМ НЕРЕ8, Ь-глутамином и пенициллином/стрептомицином, разведенной 1:2, и активировали в течение одного дня перед анализом 1000 единицами на мл ШЫу для увеличения экспрессии ЕсуКЪ

Анализы образования мостиковой связи ЕсуКШ (СО 16) выполняли с использованием монослоя экспрессирующих СО 154 клеток яичника китайского хомячка (СНО) (Вюдеи), выращенных в 96луночных планшетах для культуры ткани (Согшид ЫГе 8шеисек Ас!ои, МА, И8А), с измерениями тАЬзависимого связывания флуоресцентно меченых клеток 1игка!, трансфицированных СЭ16 (подарок Паиа ЕагЬег НгкШШе, Вок!ои, МА, И8А). Клетки СНО-СЭ154+ высевали в 96-луночные планшеты при 1х10⁵клеток/мл и выращивали до конфлюэнтности в α-МЕМ с 10% диализованной ЕВ8, 100 нМ метотрексатом, Ь-глутамином и пенициллином/стрептомицином (все реагенты из (С|Ьсо-ВКЬ КоскуШе, МО, И8А). Клетки ί.Ό16+ !игка!, растущие в КРМI с 10% ЕВ8, 400 мг/мл генетицина, 10 мМ НЕРЕ8, пируватом натрия, Ь-глутамином и пенициллином/стрептомицином (все реагенты из (йЬсо-ВКЬ), разбавляли 1:2 за один день перед выполнением этого анализа.

В анализах на рецепторы ЕсуК! и ЕсуКШ несущие Ес-рецептор клетки метили ацетоксиметиловым эфиром 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5-(и -6)карбоксифлуоресцеина (ВСЕСЕ-АМ) (Мо1еси1аг РгоЬек Еидеие, 0К, И8А) в течение 20 мин при 37°С. После промывания для удаления избытка ВСЕСЕ-АМ 1 х 10⁵ меченых клеток инкубировали в этом анализе в течение 30 мин при 37°С. Несвязанные ЕсуК+ клетки удаляли промыванием несколько раз и планшеты считывали на микропланшет-ридере Су1оПиог 2350 Е1иогексеи! М|сгор1а1е Кеайег (Мййроге Согрога!юи ВейЕогй, МА, И8А) с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны испускания 530 нм.

Пример 3. Улучшение антигенсвязывающей аффинности анти-СЬ154-антитела.

В этом примере описаны способы улучшения связывающей аффинности антитела против терапевтически релевантного антигена-мишени.

Антитело против СП 154 человека (см., например, Уатайа е! а1., Тгаикр1аи1айои, 2002, 73, 836-9; 8сЬоиЬеск е! а1., Се11, _]у^1. Ьйе 8ск, 2001, 58, 4-43; Кик е! а1., РЬйок. Тгаик. К. 8ос. Ьоий. В. 8ск, 2001, 356, 691-702; Ештага е! а1., Вг. I. Наета!о1., 2001, 113, 265-74 и В|аг1сог1е е! а1., Ш!. I. Мо1. Мей., 1999, 3, 343-53), который является членом Т№-семейства белков, участвующих в опосредовании иммунологических реакций, индуцировали созреванием аффинности в мышах. Моноклональное антитело 5с8 получали из таких исследований и определяли в отношении ингибирования патологических процессов, опосредуемых СЭ154.

В попытке увеличения аффинного взаимодействия 5с8/С.П154 способы оптимизации электростатических зарядов применяли к кристаллической структуре комплекса антитело-антиген в двухуровневой процедуре для предложения мутантов с улучшенной аффинностью. Сначала оптимизацию электростатических зарядов использовали для определения положения (положений) остатка (остатков) СОК, которые являются субоптимальными в отношении связывания. (Ьее аий Ийог, 1. СЬет. РЬук., 1997, 106, 86818690; Каидак аий Т|йог, 1. СЬет. РЬук., 1998, 109, 7522-7545). Затем ряд мутаций СОК определяли для дополнительного вычислительного анализа. На основе этих расчетов определяли вычислительным путем аффинность связывания для 23 антител, имеющих единственную мутацию (моносайтовые мутанты). Было предсказано, что 8 из этих моносайтовых мутантов могли бы быть более предпочтительными, чем антитело дикого типа, как в отношении электростатической энергии, так и в отношении функции полной энергии, включающей как компонент энергии ван-дер-Ваальсовых связей, так и компонент площади доступной поверхности растворителя. Эти компоненты не относятся к электростатическим силам, но было вычислено, что они гарантируют то, что проектируемые мутации не контактировали с другими остатками и не могли бы уменьшать значимо величину скрытой площади поверхности; увеличенная скрытая площадь поверхности в образовании комплекса обычно является предпочтительной (см. колонку Полная энергия в таблице ниже).

На основании результатов из оптимизации зарядов определяли мутации для вычислительного анализа (испытывали эти оптимальные распределения зарядов и сконструированные мутации, которые были

- 44 014226 более близкими к оптимальным, чем существующий остаток; этот процесс выполняли посредством обследования). Оптимизация зарядов давала заряды в центрах атомов, но не давала фактическую мутацию. Выполняли раунд оптимизаций зарядов с различными налагаемыми ограничениями степеней свободы для представления свойств природной боковой цепи. Например, оптимизацию выполняли для общего заряда боковой цепи -1, 0 и +1 с дополнительным ограничением, заключающимся в том, что ни один заряд атома не превышал абсолютной величины, например 0,85 единиц заряда электрона.

Кристаллическую структуру комплекса СЭ154/5с8 (РЭВ-код: 119В) получали с использованием стандартных процедур для добавления атомов водорода с использованием программы СНАВММ (Ассе1гук, 1пс., 8ап О1едо, СА). '-ацетамидный и '-метиламидный пластыри применяли к '-концам и Сконцам соответственно. С использованием модели Сопйпиит е1ес1гок(а(1ск (модели электростатических взаимодействий в водном растворе и других средах, без точного моделирования молекул растворителя), оптимизацию электростатических зарядов выполняли на каждой боковой цепи аминокислот в СОВ антитела АС.'О2. Затем определяли подходящие мутации боковых цепей на основании потенциального увеличения энергии электростатического связывания, наблюдаемого в этой оптимизации. Боковые цепи строили выполнением двухгранного сканирования ротамеров в программе СНАВММ с использованием приращений двугранного угла 60° для определения наиболее желаемого положения для каждой боковой цепи. Затем рассчитывали энергии связывания для комплексов дикого типа и мутантных комплексов с использованием электростатической энергии Пуассона-Больцманна и дополнительных компонентов для вандерваальсовой энергии и скрытой площади поверхности.

Кристаллическую структуру СЭ40-лиганда в комплексе с БаЬ-фрагментом гуманизированного нейтрализующего антитела (5с8) разрешали до 3,1 ангстрем при рН 6,50. Поскольку СО154 является в природе тримером, в этом комплексе имеются три молекулы БаЬ 5с8 и 5 молекул СО154. Они образуют три независимые границы связывания СО154/5с8 в этом комплексе. С каждым из этих БаЬ 5с8 был связан атом цинка (Ζπ) и он был включен в это вычисление. Вычисления проводили независимо для трех границ связывания и использовали аминокислотные замены, которые, как было обнаружено, являются предпочтительными в сравнении с диким типом для всех трех сайтов.

Следующая таблица показывает результаты оптимизации, полученные для вариабельной петли 1 СЭВ в легкой цепи 5с8 для всех трех молекул 5с8. Колонка Мн1 (энергия мутации) соответствует приращению свободной энергии связывания (в ккал/моль) при переходе от нативного остатка к полностью незаряженному изостеру боковой цепи, т.е. остатку той же самой формы, но без зарядов или с частичными зарядами на этих атомах. Отрицательные числа указывают предсказанное увеличение аффинности связывания. Колонка 0р1-1 соответствует приращению свободной энергии связывания, которое было получено с оптимальным распределением зарядов в боковой цепи и общим зарадом боковой цепи -1. Колонки 0рЮ и 0р11 соответствуют приращениям свободной энергии связывания с оптимальными зарядами, причем общий заряд равен 0 и +1 соответственно. На основании этих результатов и визуального обследования этой структуры конструируют мутации, которые могли бы использовать преимущество этих улучшений свободной энергии связывания. Например, мутация 8ет 31 в Уа1, который является незаряженным изостером, позволяет использовать предсказанные от -1,23 до -0,98 ккал/моль в энергии этой мутации. Мутация С1п 27 в С1и использует предсказанное максимальное приращение свободной энергии от -1,21 до -0,88 ккал/моль для мутации в боковой цепи с общим зарядом -1.

- 45 014226

Таблица 1 Результаты оптимизации, полученные для вариабельной петли 1 СОВ легкой цепи 5с8

Остаток цели	Ми!	Ορΐ-1	ΟρΐΟ	Ορίΐ
1Ь 24АКС	-0,11	0,17	-0,11	-0,37
1Ь 26 ЗЕК	-0,06	-0,59	-0,06	0,57
1Ь 27 ОШ	0,21	-1,21	-0,95	-0,26
1Ь 28 АКО	0,11	-0Д6	-0,71	-0,40
1Ь 30 ЗЕК.	-0,01	-0,14	-0,42	-0,47
1Ь 31 ЗЕК	-1,23	3,88	-2,16	-0,42
1Ь 32 ЗЕК	1,45	0,91	-0,65	-0,67
1Ь 33 ТНК	-0,02	-0,66	-0,41	0,07
1Ь 34 ТУК	-0,25	-1,00	-1,10	-0,80
1Ь 35 ЗЕК	-0,02	0,00	-0,11	0,04
1Ь 36 ТУК	0,01	-0,95	-1,31	1,74
1Ь 38Η8ϋ	-0,15	-0,48	-0,70	-0,62
2Ь 24 АКО	-0,46	-1,04	-0,46	0,13
2Ь 26 ЗЕК	-0,29	-1,60	-0,79	0,19
2Ь 27ΟΕΝ	0,26	-0,88	-0,41	0,35
2Ь 28 АКО	-0,59	-0,94	-0,46	0,08
2Ь 30 ЗЕК	0,08	-0,38	-0,55	-0,42
2Ь 31 ЗЕК	-0,98	4,04	-1,89	-0,54
2Ь 32 ЗЕК	0,74	2,31	-0,86	-0,87
2Ь 33 ТНК	0,00	-0,65	-0,38	0,09
2Ь 34 ТУК	-0,09	-0,62	-0,48	-0,12
2Ь 35 ЗЕК	0,09	0,02	0,09	0,18
2Ь 36 ТУК	0,10	-1,70	-1,24	2,37
2Ь 38Н8О	-0,23	-ио	-1,17	-0,79
ЗЬ 24 АКО	-0,35	-0,34	-0,35	-0,35
ЗЬ 26 ЗЕК	-0,27	-1,23	-0,53	0,27
ЗЬ 27ΟΕΝ	0,11	-1,07	-0,71	-0,08
ЗЬ 28 АКО	-0,30	-0,85	-0,30	0,15
ЗЬ 30 ЗЕК	0,03	0,02	-0,29	-0,36
ЗЬ 31 ЗЕК	-1,06	4,02,	-2,03	-0,90
ЗЬ 32 8ЕК	0,82	1,18	-0,85	-1,05
зь зз так	0,20	-0,32	-0,15	0,29
ЗЬ 34 ТУК	0,09	-0,80	-0,74	-0,38
ЗЬ 35 8ЕК	0,06	-0,05	-0,10	-0,02
ЗЬ 36 ТУК	0,04	-0,99	-1,30	1,66
ЗЬ 38Η8ϋ	-0,20	-0,46	-0,76	-0,72

Как описано выше, сконструированные мутанты получали ш зШсо и повторно рассчитывали энергию связывания. Результаты этих расчетов, полученных вычислением мутаций, показаны ниже. Числа представляют изменение аффинности связывания от дикого типа к мутанту (мутант с отрицательной величиной является более предпочтительным). Приведены энергии для всех трех цепей 5с8.

- 46 014226

Таблица 2

Расчеты для полученных вычислением мутаций для СЭК 5с8

Мутант цепи	Полная энергия	Электростатическая энергия
1ΗΤΥΚ33ΡΗΕ	0,197	-2,741
1ΗΑ8Ν59Α5Ρ	-0,995	-2,548
1ΗΑ8Ν59ϋΕϋ	-1,294	-2,517
1Ь 8ЕК26А8Р	-0,703	-0,712
1ЬОЬЫ270Ьи	-0,514	-0,357
1Ь8ЕК31УАЬ	8,154	-1,739
1Ь ТЖЗЗА8Р	-0,219	-0,916
1ЬТУК54ОШ	-0,999	-0,729
2Н ΙΎΚ33ΡΗΕ	0,623	-2,726
2Н Α8Ν59Α8Ρ	-0*218	-2,885
2ΗΑ8Ν59Ι£υ	-1,116	-3,067
2Ь 8ЕК26А8Р	-1,333	-1,627
2Ь ОЕЫ27ОШ	-0,658	-0,395
2Ь8ЕК31УАЬ	9,293	-0,832
2ΕΊΉΚ33Α8Ρ	-0,430	-1,359
2ЬТУК54ОЬи	-1,012	-1,030
3ΗΊΎΚ33ΡΗΕ	0,145	-1,979
3ΗΑ8Ν59Α8Ρ	-0,837	-2,267
ЗНЛ8М59ЬЕи	-1,179	-2,271
ЗЬ 8ЕК26А8Р	-0,540	-0,565
зь аьч27оьи	-0,497	-0,342
ЗЬ 8ЕК31УАЬ	8,129	-1,284
ЗЬ ТНКЗЗА8Р	-0,337	-0,676
ЗЬ ΤΥΚ54ΟΕυ	-1,123	-0,825

Как показывают эти результаты, описанный выше вычислительный способ был успешно осуществлен для предсказания усиливающих аффинность мутаций боковых цепей.

Первый тип мутации был разрешен обследованием, так как эти остатки в основном образуют водородные связи с ненасыщенными водородными партнерами антигена. Неожиданно, во многих случаях за счет десольватации, по-видимому, перевешивается полезная энергия взаимодействия. Второй тип мутации представляет менее интуитивный тип или набор мутаций, так как приращенная энергия является прежде всего результатом элиминации неблагоприятной десольватации при сохранении неполярных взаимодействий. Третий тип мутаций относится к взаимодействиям длительного действия, которые обнаруживают потенциал для значимого приращения аффинности. Эти типы мутаций представляют особенный интерес, так как они не создают прямых контактов с антигеном и, следовательно, создают меньшее нарушение в деликатных взаимодействиях на границе взаимодействия антитело-антиген.

В соответствии с описанными выше полученными вычислительными данными генерировали мутанты 5с8 (РаЬ-фрагменты), и их аффинность в отношении СЭ154 сравнивали с аффинностью РаЬ 5с8 дикого типа в конкурентном анализе связывания на основе ЕЬ18А и анализе КшЕхА™, описанных выше. Выбранные результаты некоторых из этих мутантов показаны в следующей таблице. Когда проводили анализ аффинности, эти результаты показаны в изменениях аффинности в указанное число раз в сравнении с исходным РаЬ 5с8 (дикого типа). Числа, большие чем 1,0, указывают увеличенную аффинность, числа, меньшие чем 1,0, указывают уменьшенную аффинность.

- 47 014226

Таблица 3

Наблюдаемые изменения аффинности для измененных ЕаЬ-фрагментов антитела 5с8

Мутация тяжелой цепи	Мутация легкой цепи	Улучшение ЕИ8А в указанное число раз в сравнении с диким типом	КтЕха Ка (рМ)	Номер мутанта
(дикий тип)	(дикий тип)	1,0	264
ТЗОН	-	2,3	307	1
Υ33λν	-	7,0	169	2
-	Υ36λν		420	3
554Ν	-	2,0	298	4
-	тззш	5,0	158	5
-	826ϋ	2,6	142	6
-	С/27Е	6,3	81	7
-	831У	0,02		8
-	Τ33ϋ	0,22		9
-	Υ54Ε	0,06		10
Υ33Ρ	-	0,05		11
Ν59ϋ	-	0,13		12
N591,	-	0,01		13
-	826ϋ/ς27Ε	5,6	41	14
-	826Н/О2712ТЗЗ\«/	3,8	44	15
ТЗОН	826Π/027Ε	5,8	70	16
Υ33Ψ	526η/ς»27Ε/Τ33\ν	5,9	23	17
ТЗОН	82613/(^2707133^	5,4	54	18
854Ν	826ϋΛ}27Ε		65	19
854Ν	826ϋ/()27Ε/Τ33Ψ		44	20
Τ30ΗΎ33ν/7854Ν	826ϋ/φ27Ε		101	21
Τ30Η/Υ33Ψ/854Ν	826Ο./ζ)27Ε/Τ33\ν		55	22
Υ33\ν	826Η/φ27Ε	5,2	53	23
Τ30Η/Υ33Ψ	826ϋ/(227Ε	8,0	52	24
Τ3ΟΗ/Υ33\ν	826ϋ^27Ε/Τ33ν	5,6	12	25
Τ30Η/854Ν	ЗЗбО/ОЗТЕ/ТЗЗ'Л'		63	26
Υ33λ¥7854Ν	826ϋ/(227Ε/Τ33\ν		52	27
Υ33ΧΥ/854Ν	826ОЮ27Е		77	28

Анализ отклонений от идеальных распределений зарядов на 50 аминокислотах в СОЯ антитела 5с8 привел к прогнозированию пяти мутантов, которые могли бы иметь более высокую аффинность в отношении СО 154 в сравнении с диким типом: Акп59Акр, Акт^Беи, 8ег26Акр, С1п27С1и и Туг5461и. Эти мутанты конструировали и характеризовали с использованием конкурентного ЕЫ8А. Мутанты 826Ό и О27Е с улучшенной аффинностью комбинировали в двойной мутант, который имел в 9 раз более высокую аффинность с сравнении с ЕаЬ 5с8 дикого типа.

Алгоритм измененной упаковки боковой цепи применяли к СОЯ 5с8. Для 30 остатков СОЯ 10⁴⁰ последовательностей подвергали вычислительному анализу и для последующей экспериментальной работы были отобраны 14 моносайтовых и двойных мутантов. Несколько мутантов обнаруживали более высокую аффинность в сравнении с ЕаЬ 5с8 дикого типа. Эти мутанты с измененной упаковкой боковой цепи дополнительно комбинировали с электростатическими мутантами с более высокой аффинностью. Комбинированная 5-точковая мутация имела в 25 раз более высокую аффинность в сравнении с диким типом. Кроме того, в клетках она обнаруживала лучшее ингибирование положительной регуляции 1САМ (биологическое следствие взаимодействия СП40-СИ154), которое было сравнимо с блокированием, проявляемым полноразмерным антителом 5с8. Общая степень успеха 40% в прогнозировании мутантов достигалась для обоих способов.

Выполняли анализ зависимой от Т-клеток активации В-клеток. Ингибирование зависимой от Тклеток активации В-клеток измеряли в сокультурах клеток И1.1:Яаток. Захват СЭ40 на В-клетках посредством СИ 154 приводит к активации В-клеток и положительной регуляции 1САМ-1 (СИ54). Анти

- 48 014226

СО154-тЛЬ и ЕаЬ ингибируют активацию В-клеток разрушением взаимодействия СЭ40-СЭ154. Вкратце, титрования анти-СЭ154-ЕаЬ добавляли в соотношении 1:4 клеток Э1.1:Като8 и инкубировали в течение ночи. Выполняли двухцветное РАС8-окрашивание (С^20ΡIТС/С^54ЛРС), которое делает возможным количественное определение положительной регуляции ТСАМ-!. на клетках Каток. Результаты показаны в табл. 4.

Таблица 4

Наблюдаемые активности в анализе зависимой от Т-клеток активации В-клеток

Мутация тяжелой цепи	Мутация легкой цепи	1С₅о (мкг/мл)
(дикий тип)	(дикий тип)	0,215
-	526Ό/Ω27Ε	0,287
УЗЗИ	326Ώ/027Ε/Τ33Η	0,131
Τ30Η/Υ33Η	326Э/227Е/ТЗЗИ	0,165

Эквиваленты.

Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что имеются многочисленные эквиваленты описанных здесь конкретных вариантов осуществления данного изобретения. Предполагается, что такие эквиваленты включены в следующие ниже пункты формулы изобретения.

Разнообразные модификации данного изобретения, наряду с модификациями, описанными здесь, будут очевидны специалистам с квалификацией в данной области на основании предыдущего описания. Предполагается, что такие модификации находятся в объеме прилагаемой формулы изобретения. Каждая ссылка (в том числе, но не только, журнальные статьи, патенты США и не США, публикации заявок на патент, международные публикации заявок на патент, номера доступа банков генов и т.п.), цитируемая в данной заявке, включена здесь в качестве ссылки в ее полном объеме.

- 49 014226

Список последовательностей <110> Уап Уистен, Негтап

Ьидоузкоу, А1ехеу А1ез:апйго'/1сЬ наь£, каг1 л.м.

<120> Анти-СЬ154-антитела <130> ВС100001-500ИО (Р0604) <150> из 60/591,337 <151> 2004-07-26 <160> 6 <170> РаЬепЫп νβχ·. 2.1 <210> 1 <211> 111 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223 > Описание искусственной последовательности: вариабельная область легкой цепи 5с8 дикого типа <400> 1

Авр

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

А1а

ты

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Рго

1

5

10

15

С1у

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Не

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

С51п

Агд

Уа1

Зег

20

25

30

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Туг

МеЕ.

Н1з

Тгр

Туг

<Э1п

С1п

Ьуз

Рго

<31у

35

40

45

С1п

Рго

Ьуз

Ьеи

Не

Ьуз

Туг

А1а

Зег

Азп

Ьеи

31и

Зег

50

55

60

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

рье

65

70

75

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Бег

Зег

Уа1

С1и

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

80

85

90

Туг

Сув

С1п

Н13

Бег

Тгр

С1и

Не

Рго

ТЬг

РЬе

<31у

<Э1у

С1у

95

100

105

ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз

110 <210> 2 <211> 333 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: вариабельная область легкой цепи мутантного 5с8 <220>

<221> т1зс_Ееабиге

- 50 014226 <222> (70)..(72), (76)..(84), (88)..(108), (112)..(114), (160)..(162) (169) . . (1В0), (277)..(279), (283)..(294), (298)..(303) <223> η является любым нуклеотидом <400> 2

дас Азр 1

аСс 11е

дьь Уа1

сЪс Ьеи

аса Ткг 5

сад С1п

РсР Зег

ССР Рго

дсЕ А1а

асе ТЬг 10

РРа Ьеи

РсР Зег

дра Уа1

РсР Зег

сед РГО 15

45

дда

дад

адд

дсс

асе

арс

Рса

Рдс

ппп

дсс

ппп

дрс

ппп

90

С1у

(31и

Агд

А1а

ТЬг

Не

Зег

Сув

Хаа

А1а

Хаа

Уа1

Хаа

20

25

30

шш

ппп

шш

ппп

аРд

ппп

Ьдд

Рас

саа

сад

ааа

сса

дда

135

Хаа

Мер

Хаа

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

РГО

<Э1у

35

40

45

сад

сса

ссс

ааа

СРС

аРс

аад

ппп

дса

Рас

ппп

180

01п

Рго

Ьуз

Ьеи

Не

Ьуз

Хаа

А1а

Зег

Хаа

50

55

60

ддд

дрс

ССЕ

дсс

адд

РРс

адр

ддс

адр

ддд

РсР

ддд

асР

дас

РРс

225

е1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

<31у

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

асе

сРс

асе

аЪс

РсР

дрд

дад

ссд

дад

даР

1.РР

дса

аса

РаР

270

ТЬг

Ьеи

Ткг

Не

Зег

бег

Уа1

(31и

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

80

85

90

Рас

рдр

ппп

сас

ппп

сер

ппп

РРс

ддр

еда

ддд

315

Туг

Суз

Хаа

ΗΪ3

Хаа

Рго

Хаа

РЬе

61у

В1у

С1у

95

100

105

асе аад сРс дад аРР аад 333

ТЬг Ьув Ьеи С1и Не Ьуз

110 <210> 3 <211> 111 <212> РКТ с213> искусственная последовательность <220>

<221> Н11зс_ГеаРиге <222> (24)..(24), (26)..(28), (30)..(36), (38)..(38), (54)..(54), (57)..(60), (93)..(93), (95)..(98), (100)..(101) <223> Хаа является встречающейся в природе или не встречающейся в природе аминокислотой <400> 3

Азр 1

Не ’/а!

Ьеи Ткг 5

С1п Зег

Рго А1а

ТЬг Ьеи 10

Зег

Уа1

Зег

Рго 15

<31у

б1и

Агд

А1а

Ткг

Не

Зег

Сув

Хаа

А1а

Хаа

Уа1

Хаа

20

25

30

Хаа

Мер

Хаа

Тгр

Туг

С1п

βΐη

Ьуз

Рго

С1у

35

40

45

- 51 014226

С1п Рго

Рго Ьуз

Ьеи 50

Ьеи 11е Ьуз Хаа А1а 55

Зег

Хаа

Хаа Хаа 60

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

₽Ье

Зег

(31у

Зег

<Э1у

Зег

31у

ТЬг

Азр

РЬе

€5

70

75

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Уа1

01и

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

80

85

90

Туг

Суз

Хаа

ΗΪ3

Хаа

Рго

Хаа

хаа

РЬе

С1у

О1у

51у

95

100

105

ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз

110 <210> 4 <211> 118 <212> РКТ <213> искусственная последовательность с220>

<223> Описание искусственной последовательности: вариабельная область тяжелой цепи 5с8 дикого типа <400> 4

Θ1Π Уа1 1

Ξΐη Ьеи

Уа1 <31п Зег С1у А1а 31и V»!

Уа1 Ьуз

Рго О1у 15

5

10

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

(31у

Туг

Не

РЬе

ТЬг

20

25

30

Зег

Туг

МеЬ

Туг

Тхр

Уа1

Ьуз

С1п

А1а

Рго

31у

Θΐη

С1у

Ьеи

35

40

45

С1и

Тгр

11е

<Э1у

31и

Не

АЗП

Рго

Зег

Азп

51у

Азр

ТЬг

Азп

РЬе

50

55

60

АЗП

О1и

ьуз

РНе

Ьуз

Зег

ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Авр

Ьуз

Зег

65

70

75

А1а

Зет

ТЬг

А1а

Туг

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

61и

Азр

80

85

90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

ТЬг

Агд

Зег

Азр

С1у

Агд

Азп

Азр

МеЬ

95

100

105

Авр

Зег

Тгр

е1у

С1п

31у

ТЬг

Ьеи

Уа!

ТЬг

Уа1

Зег

110

115

<210> 5

<211> 354

<212> ДНК

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: вариабельная область тяжелой цепи мутантного 5с8 <220>

<221> тпхзс_£еаЬиге

- 52 014226 <222> (82)..(84), (88),.(99), (103),.(105), (148),.(150), (154)..(165) (169)..(193), (295)..(321) <223> η является любым нуклеотидом <400> 5

сад С1п 1

дбб Уа1

сад <31п

сбд дед

сад С1п

бса Зег

ддд С1у

дсб А1а

даа дбд

дбд аад 7а1 Ьуз

ссб Рго

ддд С1у 15

45

Ьеи

Уа1 5

О1и 10

Уа1

дсб

бса

дьд

аад

ббд

бсс

бде

аад

дсб

бсб

ддс

бас

ппп

ббс

ппп

90

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

51у

Туг

Хаа

РЬе

Хаа

20

25

30

ппп

абд

ппп

бдд

дбд

аад

сад

дед

ссс

дда

саа

ддс

ебб

135

Хаа

Меб

Хаа

Тгр

νβΐ

Ьуз

Θΐη

А1а

Рго

61у

С1п

ету

Ьеи

35

40

45

дад

сдд

абб

дда

ппп

абб

ппп

ддб

ппп

180

С1и

Тгр

Не

С1у

Хаа

Не

Хаа

С1у

хаа

Хаа

хаа

50

55

60

ППП

ппп

аад

дсс

аса

сбд

асб

дба

дас

ааа

бсс

225

Хаа

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

тЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

65

70

75

дсс

аде

аса

дса

бас

абд

дад

сбс

аде

сбд

асд

бсб

дад

дас

270

А1а

Зег

ТЬг

А1а

Туг

Меб

О1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

61и

Азр

80

85

90

асе

дед

дбе

Саб

бас

бдб

аса

ада

ппп

315

тЬг

А1а

νβΐ

Туг

Суз

ТЬг

Агд

Хаа

хаа

Хаа

95

100

105

ппп

ьдд

ддс

саа

ддд

асе

ебд

дбе

асе

дбе

бсс

бса

354

Хаа

Тгр

01у

Θ1Π

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

νβΐ

Зег

110

115

<210> 6 <211? 118 <212? РЕТ <213> искусственная последовательность <220?

<223? Описание искусственной последовательности: вариабельная область тяжелой цеди мутантного 5с8 <220?

<221? ш1зс_£еабиге <222? (28)..(28), (30)..(33), (35)..(35), (50)..(50), (52)..(55), (57)..(66), (99)..(107) <223? Хаа является встречающейся в природе или не встречающейся в природе аминокислотой <400? в

е1п Уа1 1

<51п Ъеи Уа! 5

С1п Зег С51у А1а <31и Уа1 \Га1 10

ьуз

Рго

С1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Оуг

Хаа

РЬе

Хаа

20

25

30

Хаа

Меб

Хаа

Тгр

Уа1

Ьуз

<31п

А1а

Рго

С1у

С1п

О1у

Ьеи

35

40

45

- 53 014226

<51и Тгр

Не

<31у Хаа 50

11е

Хаа

Хаа Хаа 55

С1у Хаа Хаа

Хаа

Хаа 60

хаа

Хаа

хаа

Хаа

хаа

Хаа

Ьуз

А1а

ТИг

Ьеи

ТЬг

Йа1

Азр

Ьуз

Зег

65

70

75

А1а

Зег

ТЪг

А1а

Туг

Ме1:

О1и

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

80

85

90

ТНг

А1а

νβΐ

Туг

Суд

ТЬг

Агд

Хаа

95

100

105

Хаа

Тгр

<31у

<51 п

С1у

Т11Г

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

110

115

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Легкая цепь антитела к СЭ154, содержащая аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 по крайней мере одной аминокислотой в положениях 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 54, 57, 58, 59, 60, 93, 95, 96, 97, 98, 100 и 101 и которая по меньшей мере на 80% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 3, причем указанная легкая цепь способна образовывать комплекс с тяжелой цепью антитела 5с8 (АТСС НВ 10916), которое специфично к СЭ154, или фрагментом указанной тяжелой цепи, причем указанный комплекс связывается с СО 154, или фрагмент указанной легкой цепи, содержащий по меньшей мере 8 аминокислот, в том числе по крайней мере одну аминокислоту из указанных выше положений.

2. Тяжелая цепь антитела к СЭ154, содержащая аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4 по крайней мере одной аминокислотой в положениях 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и которая по меньшей мере на 80% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 6, причем указанная тяжелая цепь способна образовывать комплекс с легкой цепью антитела 5с8 (АТСС НВ 10916), которое специфично к СЭ154, или фрагментом указанной легкой цепи, причем указанный комплекс связывается с СО 154, или фрагмент указанной тяжелой цепи, содержащий по меньшей мере 8 аминокислот, в том числе по крайней мере одну аминокислоту из указанных выше положений.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая легкую цепь по п.1 или тяжелую цепь по п.2.

4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь по п.1 или тяжелую цепь по п.2.

5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.4.

6. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.4 или вектор по п.5.

7. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.4 или вектор по п.5.

8. Антитело к ί.Ό154 или его фрагмент, содержащие легкую цепь по п.1 или тяжелую цепь по п.2, которые способны связывать СЭ154 человека.

9. Применение легкой цепи по п.1, или тяжелой цепи п.2, или антитела или его фрагмента по п.8 для лечения у человека заболевания или нарушения, ассоциированного с ί.Ό154.

10. Применение легкой цепи по п.1, или тяжелой цепи по п.2, или антитела или его фрагмента по п.8 для приготовления лекарственного средства для лечения у человека заболевания или нарушения, ассоциированного с ί.Ό154.

11. Антитело, взаимодействующее с СЭ154, содержащее легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную 8Е0 ΙΌ N0: 3, и которая отличается от последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 по крайней мере одной аминокислотой в положениях 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 54, 57, 58, 59, 60, 93, 95, 96, 97, 98, 100 и 101, или фрагмент указанного антитела, который содержит по меньшей мере 8 аминокислот, в том числе по крайней мере одну аминокислоту из указанных выше положений; и тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную 8Е0 ΙΌ N0: 6, которая отличается от последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4 по крайней мере одной аминокислотой в положениях 28, 30, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 и 107, или фрагмент указанного антитела, который содержит по меньшей мере 8 аминокислот, в том числе по крайней мере одну аминокислоту из указанных выше положений.

12. Антитело или его фрагмент по п.8 или 11, причем в легкой цепи антитела:

ί) аминокислота в положении 24 выбрана из Агд, Акп, Сук, О1п, О1у, Шк, Ме!, РНе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, О1и и Ьук; аминокислота в положении 26 выбрана из 8ег, Акп, Сук, О1п, О1у, Шк, Ме!, РНе, ТНг, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и О1и; аминокислота в положении 27 выбрана из О1п, Акп, Сук, О1у, Шк, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Акр, О1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 28 выбрана из Агд, Акп, Сук, О1п, О1у, Шк, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Акр, О1и, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 30 выбрана из 8ег, Акп, Сук, О1п, О1у, Шк, Ме!, РНе, ТНг, Тгр, Туг, Акр, О1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 31 выбрана из 8ег, Акп, Сук, О1п, О1у, Шк, Ме!, РНе, ТНг, Тгр, Туг, А1а,

- 54 014226

Не, Ьеи, Рго, Уа1, Агд и Ьук; аминокислота в положении 32 выбрана из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Агд, А1а, Не, Ьеи и Ьук; аминокислота в положении 33 выбрана из ТЬг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, Тгр, Туг, Акр, С1и, Агд, А1а, Уа1 и Ьук; аминокислота в положении 34 выбрана из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1а, Агд и Ьук; аминокислота в положении 35 выбрана из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, ТЬг, Тгр и Туг; аминокислота в положении 36 выбрана из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Акр, А1а, Ьеи и С1и; аминокислота в положении 38 выбрана из Н1к, Акп, Сук, С1п, С1у, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 54 выбрана из Туг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и; аминокислота в положении 57 выбрана из Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр и С1и; аминокислота в положении 58 выбрана из Ьеи, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Акр и С1и; аминокислота в положении 59 выбрана из С1и, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг и Акр; аминокислота в положении 60 выбрана из 8ег, Акр и С1и; аминокислота в положении 93 выбрана из С1п, Акп, Сук, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 95 выбрана из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Акр и С1и; аминокислота в положении 96 выбрана из Тгр, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Туг, Акр, С1и, Агд и Ьук; аминокислота в положении 97 выбрана из С1и и Акр; аминокислота в положении 98 выбрана из Не, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр, А1а, Ьеи, Рго, Уа1 и С1и; аминокислота в положении 100 выбрана из Рго, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг, Акр и С1и; и аминокислота в положении 101 выбрана из ТЬг, Акп, Сук, С1п, С1у, Н1к, Ме!, РЬе, 8ег, Тгр, Туг, А1а, Не, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и С1и; или ίί) аминокислота в положении 26 выбрана из 8ег и Акр; аминокислота в положении 27 выбрана из С1п и С1и; аминокислота в положении 28 выбрана из Агд и С1и; аминокислота в положении 31 выбрана из 8ег, А1а, Н1к, Акп, ТЬг, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 32 выбрана из 8ег, А1а, РЬе, Не, Ьеи, Ме! и Тгр; аминокислота в положении 33 выбрана из ТЬг, А1а, РЬе, Ме!, Уа1, Тгр, Акр, Агд, Туг и С1п; аминокислота в положении 34 выбрана из Туг, А1а, Акр, С1и, РЬе, Не, Ьук, Ьеи, Ме!, Агд, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 36 выбрана из Туг, А1а, РЬе, Ьеи и Тгр; аминокислота в положении 54 выбрана из Туг и С1и; аминокислота в положении 96 выбрана из Тгр, Акр, С1и, Н1к, Агд, 8ег и ТЬг; и аминокислота в положении 98 выбрана из Не, А1а, РЬе, Н1к, Ьеи, Ме!, Акп, Рго, С1п, 8ег, ТЬг, Уа1, Тгр и Туг; или ίίί) аминокислота в положении 26 выбрана из 8ег, Акр и С1и; аминокислота в положении 27 выбрана из С1п, Акр и С1и; аминокислота в положении 31 выбрана из 8ег, Акп, Сук, С1п, С1у, ТЬг и Туг; аминокислота в положении 32 выбрана из 8ег, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РЬе, Рго, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 33 выбрана из ТЬг, Акп, Сук, С1п, С1у, 8ег и Туг; аминокислота в положении 98 выбрана из Не, Акп, Сук, С1п, С1у, 8ег, ТЬг и Туг; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или ίν) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 28 является С1и; аминокислота в положении 31 является Уа1; аминокислота в положении 33 выбрана из Акр и Агд; и аминокислота в положении 54 является С1и; или

ν) аминокислота в положении 31 выбрана из Н1к и Акп; аминокислота в положении 32 выбрана из Тгр и РЬе; аминокислота в положении 33 выбрана из Тгр, Туг и С1п; аминокислота в положении 36 выбрана из Ьеи и Тгр; аминокислота в положении 96 является Н1к; и аминокислота в положении 98 выбрана из РЬе и С1п; или νί) аминокислота в положении 26 выбрана из 8ег и Акр; аминокислота в положении 27 выбрана из С1п и С1и; аминокислота в положении 31 выбрана из 8ег и Акп; аминокислота в положении 32 выбрана из 8ег и РЬе; аминокислота в положении 33 выбрана из ТЬг, С1п и Туг; аминокислота в положении 98 выбрана из Не и С1п; аминокислота в положении 24 и в положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или νίί) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в

- 55 014226 положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или νίίί) аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или ίχ) аминокислота в положении 26 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 31 является Акп; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или

х) аминокислота в положении 26 и положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 32 является РЬе; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χί) аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 и положении 33 является С1п; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χίί) аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 является С1п; аминокислота в положении 33 является Туг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χίίί) аминокислота в положении 26, положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 27 и положении 98 является С1п; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χίν) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или

- 56 014226 χν) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 является Аки; аминокислота в положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χνί) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 32 является РЬе; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χνίί) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является С1и; аминокислота в положении 98 является Пе; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χνίίί) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 являемся 8ег; аминокислота в положении 33 является Туг; аминокислота в положении 98 является Пе; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или χίχ) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является С1и; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; или хх) аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 и положении 36 является Тгр; и аминокислота в положении 100 является Рго; или χχί) аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 101 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Пе; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Аки; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 96 и положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 100 является Рго; или χχίί) аминокислота в положении 27 и положении 93 является С1и; аминокислота в положении 26,

- 57 014226 положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 31 является Уа1; и аминокислота в положении 100 является Рго; или χχίίί) аминокислота в положении 27 и положении 93 является 01п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 101 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 33 является Акр; и аминокислота в положении 100 является Рго; или χχίν) аминокислота в положении 27 и положении 93 является 01п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34 и положении 36 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 54, положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 96 является Тгр; и аминокислота в положении 100 является Рго; или χχν) аминокислота в положении 27 и положении 93 является 01п; аминокислота в положении 26, положении 31, положении 32, положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 33 и положении 101 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 96 является Тгр; и аминокислота в положении 100 является Рго; или χχνί) аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является 01и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 93 является 01п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр, аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и/или в тяжелой цепи антитела:

ί) аминокислота в положении 28 выбрана из 11е, Акр, 01и, Агд, Ьук, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр и Туг; аминокислота в положении 30 выбрана из ТНг, Акр, 01и, Агд, Ьук, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 31 выбрана из 8ег, Агд, Н1к, Ьук, 01п и Тгр; аминокислота в положении 32 выбрана из Туг, Акр, 01и, Агд, Ьук, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 33 выбрана из Туг, Акр, 01и, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 35 выбрана из Туг, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Акр и 01и; аминокислота в положении 50 выбрана из 01и и Акр; аминокислота в положении 52 выбрана из Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Агд, А1а, Ьеи, Уа1 и Ьук; аминокислота в положении 53 выбрана из Рго, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Акр и 01и; аминокислота в положении 54 выбрана из 8ег, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, ТНг, Тгр, Туг, Агд, Ьук и 01и; аминокислота в положении 55 выбрана из Акп, 01и, Ьук, 01п, 8ег, ТНг, Ме! и Уа1; аминокислота в положении 57 выбрана из Акр, 01и, РНе и Ьеи; аминокислота в положении 58 выбрана из ТНг, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 59 выбрана из Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, А1а, 11е, Ьеи, Рго, Уа1, Акр и 01и; аминокислота в положении 60 выбрана из РНе, Акр, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, 01и, Агд, Ьук, А1а, 11е, Ьеи, Ргс и Уа1; аминокислота в положении 61 выбрана из Акп, Акр и 01и; аминокислота в положении 62 выбрана из 01и и Акр; аминокислота в положении 63 выбрана из Ьук, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Агд, 01и, Акр, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 64 выбрана из РНе, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Акр, 01и, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 65 выбрана из Ьук, Акп, Сук, 01п, 01у, Н1к, Ме!, РНе, 8ег, ТНг, Тгр, Туг, Агд, Акр, 01и, А1а, 11е, Ьеи, Рго и Уа1; аминокислота в положении 66 выбрана из 8ег, Акр и 01и; аминокислота в положении 99 выбрана из 8ег, Акр, 01и и А1а; аминокислота в положении 100 выбрана из Акр и

- 58 014226

С1и; аминокислота в положении 101 выбрана из С1у, РЬе и Ьеи; аминокислота в положении 102 выбрана из Агд, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме!, РЬе, Зег, ТЬг, Тгр, Туг и Ьуз; аминокислота в положении 103 выбрана из Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме!, РЬе, Зег, ТЬг, Тгр, Туг, Азр, С1и, А1а, Не, Ьуз, Агд и Уа1; аминокислота в положении 104 выбрана из Азр и С1и; аминокислота в положении 105 выбрана из Ме!, Азр, С1и, Агд, Н1з, Ьуз, Азп, Суз, С1п, С1у, РЬе, Зег, ТЬг, Тгр и Туг; аминокислота в положении 106 выбрана из Азр и С1и; и аминокислота в положении 107 выбрана из Зег, Азп, Суз, С1п, С1у, Н1з, Ме!, РЬе, ТЬг, Тгр, Туг, Азр, С1и, А1а, Не, Ьеи, Рго и Уа1; или ίί) аминокислота в положении 28 выбрана из Не, Н1з, Азп, С1п, Зег, ТЬг и С1и; аминокислота в положении 30 выбрана из ТЬг, Н1з, Азп, С1п, Зег, Туг и Агд; аминокислота в положении 31 выбрана из Зег, С1п и Тгр; аминокислста в положении 33 выбрана из Туг, А1а, Рго, Зег, ТЬг, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 52 выбрана из Азп, А1а, РЬе, Н1з, Ьеи, Ме!, Зег, ТЬг, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 54 выбрана из Зег, С1и, Н1з, Ьуз, Азп, С1п, Агд, ТЬг, Тгр, Туг и РЬе; аминокислота в положении 55 выбрана из Азп, С1и, Ьуз, С1п, Зег, ТЬг, Ме! и Уа1; аминокислота в положении 57 выбрана из Азр, РЬе и Ьеи; аминокислота в положении 59 выбрана из Азп, А1а, РЬе, Ьеи, Ме!, Рго, Уа1, Тгр, Азр и Туг; аминокислота в положении 99 выбрана из Зег и А1а; аминокислота в положении 101 выбрана из С1у, РЬе и Ьеи; и аминокислота в положении 103 выбрана из Азп, А1а, Азр, С1и, РЬе, Н1з, Не, Ьуз, Ме!, Агд, Зег, ТЬг, Уа1 и Туг; или ϊϊΐ) аминокислота в положении 31 и положении 54 независимо выбрана из Зег, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РЬе, Рго, Уа1, Тгр, Азп, Суз, С1п, С1у, Зег, ТЬг и Туг; аминокислота в положении 57 выбрана из Азр, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РЬе, Рго, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 101 выбрана из С1у, А1а, Не, Ьеи, Ме!, РЬе, Рго, Уа1 и Тгр; аминокислота в положении 103 выбрана из Азп, Суз, С1п, С1у, Зег, ТЬг и Туг; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении

105 является Ме!; или ίν) аминокислота в положении 31 выбрана из Зег, Тгр и С1п; аминокислота в положении 54 выбрана из Зег, РЬе и С1п; аминокислота в положении 57 выбрана из Азр, Ьеи и РЬе; аминокислота в положении 101 выбрана из С1у, Ьеи и РЬе; аминокислота в положении 103 выбрана из Азп и Туг; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении

106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или

ν) аминокислота в положении 28 является С1и; аминокислота в положении 33 является РЬе; аминокислота в положении 54 является ТЬг; и аминокислота в положении 59 выбрана из Азр и Ьеи; или νί) аминокислота в положении 30 выбрана из Н1з и Агд; аминокислота в положении 31 выбрана из С1п и Тгр; аминокислота в положении 33 выбрана из Тгр, Уа1 и Рго; аминокислота в положении 52 выбрана из Ме! и Тгр; аминокислота в положении 54 выбрана из Азп, РЬе и С1п; аминокислота в положении 55 выбрана из Ме!, Ьуз и Уа1; аминокислота в положении 57 выбрана из РЬе и Ьеи; аминокислота в положении 59 выбрана из РЬе и Туг; аминокислота в положении 101 выбрана из РЬе и Ьеи; и аминокислота в положении 103 выбрана из Н1з и Туг; или νίί) аминокислота в положении 31 является Тгр; аминокислота в положении 54 является Зег; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является Зег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или νίίί) аминокислота в положении 31 является С1п; аминокислота в положении 54 является Зег; аминокислота в положении 57 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, поло

- 59 014226 жении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является Р1е; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или ίχ) аминокислота в положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 54 является РНе; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является Р1е; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или

х) аминокислота в положении 31 является 8ег; аминокислота в положении 54 является С1п; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является Р1е; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χί) аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является РНе; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χίί) аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Ьеи; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χίίί) аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является РНе; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χίν) аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является Ьеи; аминокислота в положении 103 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в по

- 60 014226 ложении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χν) аминокислота в положении 31 и положении 54 является 8ег; аминокислота в положении 57 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103 является Туг; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χνί) аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χνίί) аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 10 5 является Ме!; или χνίίί) аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χίχ) аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 33, положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или хх) аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 59, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55 положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминоргислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме!; или χχί) аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в по

- 61 014226 ложении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 59 является Ьеи; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

13. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 59, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

14. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положггнии 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

15. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении

58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении

59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

16. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98

- 62 014226 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1з; аминокислота в положении 57 является Азп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

17. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Азр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1з; аминокислота в положении 57 является Азп; аминокислота в положении

58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении

59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

18. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Азр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1з; аминокислота в положении 57 является Азп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 54, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 55, положении 59 и положении 61 является Азп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТНг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РНе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьуз; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме1.

19. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Азр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТНг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1з; аминокислота в положении 57 является Азп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТНг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Азр; ами

- 63 014226 нокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103. положении 52. положении 54. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является 01и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

20. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12. причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является 01и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30. положении 35. положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34. положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении

58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 93 является 01п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31. положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57. положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103. положении 52. положении 54. положении 55. положении

59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является 01и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении

60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

21. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12. причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является 01и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЬг; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30. положении 35. положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34. положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 93 является 01п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31. положении 54. положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57. положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103. положении 52. положении 55. положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является Не; аминокислота в положении 58 является ТЬг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является 01и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЬе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Н1к; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

22. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12. причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является 01и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является Не; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30. положении 35. положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34. положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Н1к; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении

58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является 01и; аминокислота в положении 93 является 01п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЬг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31. положении 54. положении 66. положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57. положении 100. положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является 01у; аминокислота в положении 103. положении 52. положении 55. положении

23. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12. причем в легкой цепи антитела аминокислота в по

- 64 014226 ложении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении

58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 33 и положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЕг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении

59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 58 является ТЕг; аминокислота в положении 32, положении 33 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЕе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 30 является Шк; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

24. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении

59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЕг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЕе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

25. Антитело или его фрагмент по п.11 или 12, причем в легкой цепи антитела аминокислота в положении 26 является Акр; аминокислота в положении 27 является С1и; аминокислота в положении 31 и положении 32 является 8ег; аминокислота в положении 33 является ТЕг; аминокислота в положении 98 является 11е; аминокислота в положении 24 и положении 28 является Агд; аминокислота в положении 30, положении 35, положении 60 и положении 95 является 8ег; аминокислота в положении 34, положении 36 и положении 54 является Туг; аминокислота в положении 38 является Шк; аминокислота в положении 57 является Акп; аминокислота в положении 58 является Ьеи; аминокислота в положении 59 и положении 97 является С1и; аминокислота в положении 93 является С1п; аминокислота в положении 96 является Тгр; аминокислота в положении 100 является Рго; и аминокислота в положении 101 является ТЕг; и в тяжелой цепи антитела аминокислота в положении 31, положении 66, положении 99 и положении 107 является 8ег; аминокислота в положении 57, положении 100, положении 104 и положении 106 является Акр; аминокислота в положении 101 является С1у; аминокислота в положении 103, положении 52, положении 54, положении 55, положении 59 и положении 61 является Акп; аминокислота в положении 28 является 11е; аминокислота в положении 30 и положении 58 является ТЕг; аминокислота в положении 32 и положении 35 является Туг; аминокислота в положении 50 и положении 62 является С1и; аминокислота в положении 53 является Рго; аминокислота в положении 60 и положении 64 является РЕе; аминокислота в положении 63 и положении 65 является Ьук; аминокислота в положении 102 является Агд; аминокислота в положении 33 является Тгр; и аминокислота в положении 105 является Ме!.

26. Фрагмент антитела по любому из пп.11-25, который выбран из одноцепочечного антитела (ксРу), Р(а!')₂-фрагмента, РаЬ-фрагмента и РЕ-фрагмента.

27. Антитело или его фрагмент по любому из пп.11-26, меченые детектируемым маркером.

28. Антитело по п.27, где детектируемый маркер выбран из радиоактивного изотопа, фермента, флуорохрома, коллоидного золота, красителя и биотина.

29. Антитело или его фрагмент по любому из пп.11-28, конъюгированные с терапевтическим агентом или нерастворимой подложкой.

30. Антитело или его фрагмент по п.29, где терапевтический агент выбран из радиоактивного изотопа, токсина, токсоида и химиотерапевтического агента.

- 65 014226

31. Антитело или его фрагмент по любому из пп.11-30, содержащие по меньшей мере один высокомолекулярный полимер.

32. Антитело или его фрагмент по п.31, где полимер представляет собой полиэтиленимин или полилизин.

33. Антитело или его фрагмент по любому из пп.11-32, где по меньшей мере одна аминокислота является ПЭГилированной или гликозилированной.

34. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп.11-33.

35. Набор, содержащий антитело или его фрагмент по любому из пп.11-33.

36. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его фрагмент по любому из пп.1133.

37. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.36.

38. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.36 или вектор по п.37.

39. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.11-33 в приготовлении лекарственного средства для лечения у человека заболевания или нарушения, ассоциированного с ΟΌ154.

40. Применение по п.39, где заболеванием или нарушением у человека является воспаление, выбранное из воспаления, связанного с артритом, контактным дерматитом, гиперЛдЕ-синдромом, воспалительным заболеванием кишечника, аллергической астмой и идиопатическим воспалительным заболеванием.

41. Применение по п.40, где артрит выбран из ревматоидного артрита, неревматоидного артрита, артрита, ассоциированного с болезнью Лайма, и воспалительного остеоартрита, и где идиопатическим воспалительным заболеванием является псориаз или системная красная волчанка.

42. Применение по п.39, где заболевание или нарушение выбрано из тяжелой псевдопаралитической миастении, болезни Грейвса, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, гемолитической анемии, сахарного диабета, болезни Крона, рассеянного склероза и индуцированного лекарственным средством аутоиммунного заболевания.

43. Применение по п.39, где нарушением является отторжение субъектом трансплантированного органа, выбранного из трансплантированных сердца, почки, печени, кожи, панкреатических островковых клеток и костного мозга.

44. Применение по п.39, где нарушение выбрано из реакции трансплантат против хозяина, аллергических реакций, аутоиммунной реакции и фиброза.

45. Применение по п.44, где фиброз является фиброзом легких или фибротическим заболеванием и где аутоиммунная реакция ассоциирована с синдромом Рейтера, спондилоартритом, болезнью Лайма, ВИЧ-инфекцией, сифилисом или туберкулезом.

46. Применение по п.45, где фиброз легких выбран из фиброза легких (пневмофиброза), ассоциированного с респираторным дистресс-синдромом взрослых людей, индуцированного лекарственным средством фиброза легких, идиопатического фиброза легких или гиперчувствительного пневмонита, и где фибротическое заболевание выбрано из гепатита С, гепатита В, цирроза, цирроза печени, ассоциированного с токсическим повреждением, цирроза печени, ассоциированного с лекарственными средствами, цирроза печени, ассоциированного с вирусной инфекцией, и цирроза печени, ассоциированного с аутоиммунным заболеванием.

47. Применение по п.39, где заболеванием или нарушением является желудочно-кишечное заболевание или сосудистое заболевание.

48. Применение по п.47, где желудочно-кишечное заболевание выбрано из нарушения моторики пищевода, воспалительного заболевания кишечника и склеродермии и где сосудистым заболеванием является атеросклероз или реперфузионное повреждение.

49. Применение по п.39, где заболеванием или нарушением является Т-клеточный рак, выбранный из Т-клеточного лейкоза или Т-клеточной лимфомы.

О Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2